CN106798747A - 一种刺梨苷在制备抗缺氧药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种刺梨苷在制备抗缺氧疾病药物中的应用，属于药物制备技术领域。本发明制备的药物具有良好的临床应用前景，制备得到的抗缺氧药物能够实现缺氧类疾病的治疗。

Description

一种刺梨苷在制备抗缺氧药物中的应用

技术领域

本发明属于药物制备技术领域，尤其涉及一种刺梨苷在制备抗缺氧药物中的应用。

背景技术

细胞是人体的结构和功能单位。人体结构的老化，首先表现为细胞的衰老和细胞数量的减少。当细胞减少到一定数量时，就会使器官功能下降，甚至危及生命。21世纪的人体保健目标，就是要保护细胞，改善细胞代谢，增强细胞的抗病能力。由于空气中氧气不足(高原缺氧)或人体自身的生理、病理原因而不能摄入足够的氧，或细胞不能充分利用氧气(亚健康缺氧)，均可引起人体代谢、生理功能或形态上的改变，这种状态就是缺氧(anoxia)。急性或严重缺氧常出现呼吸困难、皮肤和黏膜发绀、精神异常，甚至意识丧失或昏迷：慢性缺氧常表现乏力、头痛、眩晕、面色苍白、食欲不振等症状；当人体细胞含氧量低于正常值的65％时，缺氧细胞甚至易癌变，导致癌症。

目前临床对于人体亚健康性缺氧多采用各种中药复方保健品用于抗缺氧。通常有红景天、冬虫夏草、银杏、沙棘、党参、黄芪、茯苓、人参、唐古特青兰、刺五加、灵芝、枸杞等等中药及其有效成分的复方制剂。对于高原缺氧常用的抗缺氧药物包括以红景天提取物为主的复方制剂；复方丹参片或复方丹参滴丸；21金维他；由地塞米松、氨茶碱和安定制成的化学药复方制剂高原康等。乙酰唑胺是FDA批准的单一成分的抗高原缺氧药物。上述药物中中药复方通常起效慢，服用时间长，适用于亚健康的保健调理，但对于高原缺氧尤其是急性高原缺氧作用不理想。而化学合成药的使用往往会在抗缺氧的同时带来其他副作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种刺梨苷在制备抗缺氧药物中的应用。本发明制备的药物具有良好的临床应用前景，制备得到的抗缺氧药物能够实现缺氧类疾病的治疗。

本发明提供了一种刺梨苷在制备抗缺氧疾病药物中的应用。

优选的是，所述抗缺氧疾病包括心肌缺氧导致的胸闷、气短、心绞痛；脑缺氧所致的头晕、头痛；高原缺氧性脑水肿、高原缺氧性肺水肿。

优选的是，所述药物的剂型包括片剂、胶囊、糖浆剂和颗粒剂。

优选的是，所述药物还包括辅料，所述辅料包括淀粉、乳糖、蔗糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、微粉硅胶、乙醇、柠檬酸、苯甲酸钠、香精和色素。

优选的是，所述药物的剂量为0.8～2.4mg/kg。

本发明提供了一种刺梨苷在制备抗缺氧药物中的应用。本发明制备的药物可通过提高机体抗氧化能力，改善细胞呼吸功能，其抗缺氧起效剂量小，且在细胞及整体动物均未观察到明显的毒性作用，可用于缓解和治疗缺氧导致的机体不适和病变，尤其适用于高原缺氧导致的高原反应和脏器损伤。具有良好的临床应用前景，制备得到的抗缺氧药物能够实现缺氧类疾病的治疗。试验结果表明，本发明制备的药物能够显著减轻急性低压缺氧大鼠脑水肿，对内皮细胞和心肌细胞缺氧损伤亦具有显著的保护作用。

附图说明

图1为本发明实施例5提供的刺梨苷对高原缺氧大鼠脑含水量的影响结果图；

图2为本发明实施例7提供的刺梨苷对缺氧心肌细胞活力影响结果图；

图3为本发明实施例7提供的刺梨苷对缺氧心肌细胞LDH外漏影响结果图；

图4为本发明实施例7提供的刺梨苷对缺氧心肌细胞CK外漏影响结果图；

图5为本发明实施例7提供的刺梨苷对缺氧心肌细胞SOD影响结果图；

图6为本发明实施例7提供的刺梨苷对缺氧心肌细胞GSH-Px影响结果图；

图7为本发明实施例7提供的刺梨苷对缺氧心肌细胞MDA影响结果图；

图8为本发明实施例7提供的刺梨苷对缺氧心肌细胞凋亡率影响结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种刺梨苷在制备抗缺氧疾病药物中的应用。

本发明对所述刺梨苷的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的刺梨苷的市售产品即可，如购自安徽芜湖甙尔塔医药科技有限公司的刺梨苷。在本发明中，所述刺梨苷的纯度优选>98％。

在本发明中，所述抗缺氧疾病包括心肌缺氧导致的胸闷、气短、心绞痛；脑缺氧所致的头晕、头痛；高原缺氧性脑水肿、高原缺氧性肺水肿。

在本发明中，所述药物的剂型包括片剂、胶囊、糖浆剂和颗粒剂。本发明对所述剂型药物的制备方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的相应剂型的常规制备方法即可。

在本发明中，所述药物还包括辅料，所述辅料包淀粉、乳糖、蔗糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、微粉硅胶、乙醇、柠檬酸、苯甲酸钠、香精和色素中的一种或多种。本发明对所述辅料的添加量没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的各辅料的常规添加量进行添加即可。本发明对所述辅料的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的上述辅料的市售产品即可。

在本发明中，所述药物的剂量为0.8～2.4mg/kg。

下面结合具体实施例对本发明提供的一种刺梨苷在制备抗缺氧药物中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

以刺梨苷为原料制成的片剂

将上述配方采用压片机进行直接压片，得到片剂。

实施例2

以刺梨苷为原料制成的胶囊

刺梨苷 20mg

淀粉 70mg

将上述组分混合，装入2号胶囊。

实施例3

以刺梨苷为原料制成的口服糖浆剂：

将上述组分加入水中调至所需量，混匀后装瓶即可。

实施例4

以刺梨苷为原料制成的颗粒剂：

将上述组分混合后加入颗粒机中，制成颗粒后进行包装。

实施例5

刺梨苷减轻大鼠高原缺氧性脑水肿实验

1、方法

(1)实验分组：将50只wister大鼠随机分为常氧对照组、急性高原缺氧模型组、阳性药地塞米松组、刺梨苷高剂量组和刺梨苷低剂量组，每组10只大鼠。在20±2℃饲养，自由饮水。高剂量组和低剂量组大鼠每次分别灌胃给予刺梨苷15mg/kg和5mg/kg，间隔12h，共给药3次；阳性药组大鼠则每次灌胃给予地塞米松6mg/kg，给药次数及间隔时间同刺梨苷组；常氧对照组和急性高原缺氧模型组大鼠以同样间隔时间和次数灌胃给予等体积1％配制药物所用溶媒。

(2)高原缺氧模型建立：除常氧对照组外，各组大鼠于末次灌胃后立即置于低压氧舱中进行缺氧实验，在15min内使氧舱达到海拔7000m高度的大气压，温度15±2℃，湿度30％±5％，缺氧18h。缺氧结束后在15min内使低压氧舱内压力降至海拔高度150m大气压(实验地区海拔高度)。常氧对照组大鼠则于相同温、湿度在舱外正常饲养。

(3)指标检测：

①生化指标检测：各组大鼠出舱后迅速用25％乌拉坦麻醉，经腹主动脉取血，肝素抗凝，3500rpm/min离心10min，吸取上层血浆样本；大鼠取血后迅速断头冰浴下取海马组织，准确称重，剪碎，按重量(g)：体积(ml)＝1:9的比例加入9倍体积生理盐水，冰浴下匀浆制成10％匀浆液，离心取上清液，按试剂盒操作步骤分别检测各组大鼠脑组织中MDA、GSH含量、LDH、SOD活性以及血浆中NO含量。

②脑含水量测定：各组大鼠出舱后迅速用25％乌拉坦腹腔注射麻醉，断头后在冰浴下取脑，用滤纸吸干全脑表面水分，左半脑放于预先称重并编号的锡纸上，称重，放入120℃烘箱中烘干，24h后再次称重。脑湿干比＝(湿重/干重)/体重。右半脑留取备用制作石蜡切片。

③H.E染色：各组大鼠断头取脑后，右半脑用4％多聚甲醛固定，制作石蜡切片，进行常规HE染色，在正置显微镜下观察各组大鼠脑组织病理学变化。

2、结果

(1)生化指标检测结果

①血浆中NO含量检测结果

与常氧对照组相比，急性高原缺氧模型组大鼠血浆中NO含量显著降低(P＜0.05)；与缺氧模型组相比，刺梨苷高、低剂量组和地塞米松组大鼠血浆中NO含量均显著上升(P＜0.01或P＜0.05)(表1)。

表1刺梨苷对高原缺氧大鼠血浆NO水平及脑组织LDH活性的影响(x±s,n＝10)

注:^**P<0.01vs常氧对照组；^##P<0.01vs缺氧模型组

②脑组织中LDH、SOD活性和MDA、GSH含量检测结果

与常氧对照组相比，急性低压缺氧后，大鼠脑海马中MDA含量和LDH活力均显著提高(P＜0.01)，GSH含量和SOD活性均显著降低(P＜0.01)；与缺氧模型组相比，刺梨苷高、低剂量组和地塞米组大鼠脑海马中MDA含量和LDH活力均显著降低(P＜0.01)；刺梨苷高剂量组和地塞米松组大鼠脑海马中GSH含量和SOD活性与低压缺氧模型组相比显著提高(P＜0.01或P＜0.05)，刺梨苷低剂量组大鼠脑海马中GSH含量和SOD活性与缺氧模型组相比无统计学差异(P＞0.05)(表1,2)。

表2刺梨苷对高原缺氧大鼠脑组织SOD,MDA,GSH的影响(x±s,n＝10)

注:^**P<0.01vs常氧对照组；^##P<0.01vs缺氧模型组

(2)脑含水量测定结果

与常氧对照组相比，急性低压缺氧模型组大鼠脑含水量显著增加(P＜0.01)；与缺氧模型组相比，刺梨苷高、低剂量组和地塞米松组大鼠脑含水量均显著减少(P＜0.01或P＜0.05)(刺梨苷对高原缺氧大鼠脑含水量的影响结果如图1所示，**P<0.01vs常氧对照组；##P<0.01vs缺氧模型组)。

(3)组织病理学改变

H.E染色结果显示：常氧对照组大鼠软脑膜与脑皮质贴合紧密，不可见或极少见红染的血红细胞；脑皮质呈均一红色淡染，细胞分布均匀，呈圆形或多边形，胞核呈蓝色淡染，胞浆呈红色淡染，毛细血管周围间隙均匀；脑海马区锥形细胞排列整齐，大小均一，胞核呈蓝色淡染，胞浆呈红色淡染。急性低压缺氧18h后，大鼠软脑膜与脑皮质间出现明显分离，间隙中可见大量红色深染的血红细胞；脑皮质明显可见红色深染的血肿部位，大部分细胞呈蓝色深染，出现明显皱缩变形，少数细胞肿胀并淡染，同时可见毛细血管变粗、周围间隙变大；大部分锥形细胞胞体明显皱缩变形并深染，部分细胞核溶解消失。给予刺梨苷高、低剂量和地塞米松处理后上述病理改变均明显改善。

实验结果表明，刺梨苷可通过提高大鼠脑组织清除自由基的能力，减轻大鼠急性高原缺氧导致的脑水肿。

实施例6

刺梨苷对EA.hy926内皮细胞缺氧损伤的保护作用研究

1、方法

(1)EA.hy926内皮细胞缺氧损伤模型建立EA.hy926内皮细胞用含10％FBS的高糖DMEM培养液(培养液含有100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)在二氧化碳培养箱中培养，将生长成单层的EA.hy926细胞换无血清无糖的DMEM培养基连续培养12小时后，用预先以95％N₂-5％CO₂混合气饱和30min的D-hanks液替代正常培养基，而后将培养板移入混合气体培养箱(95％N₂、5％CO₂、O₂浓度＜1％)，于37℃缺氧培养2h。

(2)实验分组实验设空白对照组、缺氧模型组、刺梨苷高浓度组(1×10^-11mol/L)、刺梨苷中浓度组(1×10^-12mol/L)和刺梨苷低浓度组(1×10^-13mol/L)、维拉帕米对照组(1×10^-11mol/L)，共6组，每组8孔。除空白对照组外，其他各组均缺氧处理2h，正常对照组则于37℃、5％CO₂培养箱中同步孵育2h。

(3)缺氧损伤内皮细胞MTT实验取出各组样本，每孔加入20μl MTT(5g/L)，于37℃、5％CO₂孵箱中继续孵育4h，终止培养，倒板。加入150μl DMSO振摇15min，使结晶充分溶解，于测定波长570nm、参考波长630nm处，测定各孔吸光度(A)值。

(4)生化指标检测接种于24孔板的EA.hy926内皮细胞，缺氧损伤模型组及刺梨苷干预组缺氧处理2h，正常对照组二氧化碳培养箱同步孵育，取各组细胞培养上清液200μl，按试剂盒说明用比色法测定培养基中LDH活性，细胞内MDA含量，SOD、CAT活性和GSH含量。

2、结果

与正常对照组相比，缺氧损伤模型组内皮细胞活力明显降低，MDA含量明显增高，GSH含量和SOD、CAT活性明显下降，LDH外漏增加(P<0.01)；与模型组相比，各浓度刺梨苷组内皮细胞代谢活力、SOD、CAT活性及GSH含量均提高，MDA产生及LDH外漏均减少。(P<0.01)(表3～5)。

表3刺梨苷对缺氧损伤EA.hy926细胞代谢活力及细胞外LDH活性的影响(x±s,n＝8)

^**P<0.01vs对照组；^#P<0.05，^##P<0.01vs模型组

表4刺梨苷对缺氧损伤EA.hy926细胞内SOD活性及MDA含量的影响(x±s,n＝8)

Note:^**P<0.01vs对照组；^#P<0.05，^##P<0.01vs模型组

表5刺梨苷对缺氧损伤EA.hy926细胞内CAT活性及GSH含量的影响(x±s,n＝8)

Note:^**P<0.01vs对照组；^#P<0.05，^##P<0.01vs模型组

细胞缺氧损伤时，线粒体功能异常，氧化呼吸链受损，电子传递阻断，ATP产生减少。琥珀酸脱氢酶是琥珀酸氧化呼吸链里重要的复合酶之一，可催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸，从而使FAD接受两个氢原子生成FADH₂，然后再将氢传递给C_OQ，生成C_OQH₂，继续呼吸链的电子传递过程。故琥珀酸脱氢酶的活性，可以反映细胞缺氧损伤的程度。MTT的实验原理就是利用琥珀酸脱氢酶可以催化噻唑兰(MTT)生成紫红色不溶性有色产物的特性，通过吸光度值可间接反映细胞活性。本实验检测结果显示：EA.hy926内皮细胞缺氧损伤2h，与正常对照组比较，缺氧模型组吸光度值显著降低，细胞代谢活力降低，培养液中LDH活性显著升高，表明细胞膜受缺氧损伤，胞内LDH外漏增加。刺梨苷干预组，与缺氧损伤模型组比较吸光度值均增加，培养液中LDH活性显著降低，表明刺梨苷能对抗缺氧对内皮细胞琥珀酸脱氢酶活性的损害，维持缺氧损伤细胞的呼吸功能；缺氧导致细胞膜损伤时，细胞内LDH将外漏，导致培养基中LDH活性升高，本试验显示3个剂量刺梨苷组与模型组相比培养基中LDH活性均明显降低，表明刺梨苷可在急性缺氧条件下，保持内皮细胞膜的完整性。

SOD,CAT和GSH反映了细胞清除自由基的能力，MDA则反映了细胞膜脂质过氧化损伤程度，缺氧损伤模型组EA.hy926内皮细胞与正常对照组比较，SOD,CAT活性和GSH含量下降，MDA含量显著增加；3个剂量刺梨苷干预组均可提高细胞内SOD,CAT活性和GSH含量，减少MDA的产生，表明刺梨苷可通过增强内皮细胞清除自由基的能力，对抗缺氧导致的细胞膜氧化损伤。

实施例7

刺梨苷对H9c2心肌细胞缺氧损伤的保护作用研究

1、方法

(1)H9c2心肌细胞缺氧损伤模型建立H9c2心肌细胞37℃培养于含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中，培养基中加入100IU/L青霉素及100μg/mL链霉素。取状态良好的H9c2心肌细胞消化后接入平皿中，饱和度达到90％左右，经过24h后，以提前低氧处理40min的D-Hank’s液代替正常培养基，然后将细胞立即放入混合气体培养箱(<1％O₂)中缺氧6h。

(2)实验分组实验设空白对照组(Control)、缺氧模型组(Hypxia)、缺氧+刺梨苷高浓度组(1×10^-10mol/L，H+KI 10^-10mol/L)、缺氧+刺梨苷中浓度组(1×10^-11mol/L，H+KI 10^-11mol/L)和缺氧+刺梨苷低浓度组(1×10^-12mol/L，H+KI 10^-12mol/L)、缺氧+维拉帕米对照组(1×10^-10mol/L，H+Ver 10^-10mol/L)，共6组，每组8孔。除空白对照组外，其他各组均缺氧处理6h，正常对照组则于37℃、5％CO₂培养箱中同步孵育6h。

(3)缺氧损伤心肌细胞MTT实验取出各组样本，每孔加入20μL MTT(5g/L)，于37℃、5％CO₂孵箱中继续孵育4h，终止培养，倒板。加入150μl DMSO振摇15min，使结晶充分溶解，于测定波长570nm、参考波长630nm处，测定各孔吸光度(OD)值。

(4)生化指标检测接种于24孔板的H9c2心肌细胞，缺氧损伤模型组及刺梨苷干预组缺氧处理6h，正常对照组二氧化碳培养箱同步孵育，取各组细胞培养上清液200μl，按试剂盒说明用比色法测定培养基中LDH和CK活性，细胞内MDA含量，SOD和GSH-Px活性。

(5)细胞凋亡检测取对数生长期细胞用胰酶消化并计数，调整细胞浓度为6×10⁵/ml，1ml/孔接种在6孔培养板中。培养24h后更换1％FBS高糖DMEM 24h，按分组进行缺氧。缺氧结束后，将细胞收集于EP管中，离心1200rpm，10min，再用培基重悬，离心10min，1200rpm。弃去上清液，用PBS缓冲液洗两次后加入binding buffer，调整细胞浓度，使之为10⁶个/ml，从中吸取100μl并加入5μl AnnexinⅤ和10μl PI,4℃避光孵育15min后加入400μl bindingbuffer。过300目筛网使之成为单个细胞悬液，采用流式细胞检测仪检测。使用FlowJo 7.6软件分析数据。

2、结果

刺梨苷各浓度组均可提高其缺氧损伤后的心肌细胞活性，细胞活力随刺梨苷浓度的减少而降低(P<0.01)，呈现一定的浓度依赖关系，同浓度的刺梨苷组其细胞活力明显高于维拉帕米组(P<0.05)。

与正常对照组相比较，缺氧损伤组LDH、CK、MDA水平显著升高(P<0.01)，SOD、GSH-px水平降低(P<0.01)，与缺氧损伤组比较，维拉帕米组及刺梨苷高、中、低浓度组LDH、CK、MDA降低(P<0.01)，SOD、GSH-px升高，但维拉帕米组较刺梨苷高浓度组LDH升高(P<0.05),表明维拉帕米和刺梨苷各浓度组均可明显减少缺氧引起的LDH的外漏量，降低CK水平及MDA含量，同时可升高细胞内SOD活性及GSH-px水平。实验结果如图2～8所示，^##P<0.01vscontrol；^**P<0.01vs Hypoxia；^△P<0.05，^△△P<0.01vs H+Ver 10^-10mol/L。其中图2为刺梨苷对缺氧心肌细胞活力影响结果图；图3为刺梨苷对缺氧心肌细胞LDH外漏影响结果图；图4为刺梨苷对缺氧心肌细胞CK外漏影响结果图；图5为刺梨苷对缺氧心肌细胞SOD影响结果图；图6为刺梨苷对缺氧心肌细胞GSH-Px影响结果图；图7为刺梨苷对缺氧心肌细胞MDA影响结果图；图8为刺梨苷对缺氧心肌细胞凋亡率影响结果图。

上述实验结果表明：刺梨苷可保护缺氧心肌细胞细胞膜，提高细胞活力。可通过提高H9c2心肌细胞的抗氧化酶活性减轻缺氧损伤。可明显抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡。提示刺梨苷可对抗缺氧导致的心肌细胞损伤。

经一年动物实验观察，应用本发明药物对动物未发现明显的毒副作用。

以上可看出，刺梨苷具有显著的抗缺氧损伤作用，此外动物实验证实该药物毒性较低，可以用于制备防治缺氧损伤的药物。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种刺梨苷在制备抗缺氧疾病药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗缺氧疾病包括心肌缺氧导致的胸闷、气短、心绞痛；脑缺氧所致的头晕、头痛；高原缺氧性脑水肿、高原缺氧性肺水肿。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括片剂、胶囊、糖浆剂和颗粒剂。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包括辅料，所述辅料包括淀粉、乳糖、蔗糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、微粉硅胶、乙醇、柠檬酸、苯甲酸钠、香精和色素。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂量为0.8～2.4mg/kg。