CN104523809B - 一种山茱萸色素的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及山茱萸色素的制备方法，可有效解决山茱萸天然色素的制备问题，方法是，将山茱萸研磨成粗粉，加入石油醚，水浴回流提取，除去山茱萸药渣中的石油醚，晾干，再加入乙醇，水浴回流提取，过滤，将得到山茱萸色素粗提液旋转蒸发除去乙醇，浓缩成浸膏，入AB‑8大孔吸附树脂柱中，静置，用蒸馏水及乙醇，收集乙醇洗脱液，浓缩成稠膏，加入糊精，真空干燥，即得本发明山茱萸色素，收率22.67‑28.33%，本发明原料丰富，制备方法简单，易操作，其制备的天然山茱萸色素颜色鲜艳，稳定性强，是具有抗菌、清除自由基、抗氧化等保健功能的天然色素，有效用于制备食品、保健品、化妆品，经济和社会效益显著。

Description

一种山茱萸色素的制备方法

技术领域

本发明涉及医药，特别是一种山茱萸色素的制备方法。

背景技术

我国目前还处在合成色素与天然色素并存及同时发展的状态。由于合成色素的安全性问题，不少合成色素在各国允许使用的程度被大大限制，尤其是在食品、医药和化妆品行业，所以，天然色素的提取和应用是现在和未来发展的主要方向。天然色素大多以植物资源为原料，应用提取，分离、浓缩等技术而获得的多功能天然提取物，色调较为自然。虽在色素含量和稳定性等方面不如化学合成品，但因其多来自水果、蔬菜、花卉等资源，对人体的安全性较高。此外，很多天然色素易于吸收，本身又兼具保健功能，对于癌症、心脏病、眼科疾病等具有很好的预防效果。基于以上原因，一定时期内天然色素在世界各地备受推崇。开发研制天然色素，利用天然色素代替人工合成色素已经成为食品、化妆品行业的发展趋势。

山茱萸，又名山萸肉、萸肉、枣皮等，是山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalisSieb.et Zucc.除去果核的干燥成熟果肉，具有补益肝肾、涩精固脱的功效，是我国的传统中药材。现代临床研究证明，山茱萸具有增强免疫功能、清除自由基、抗氧化性以及抗衰老作用，山茱萸保健品、添加剂及提取物有着开发前景良好，目前，对山茱萸色素提取及纯化研究的相关文献及专利尚未见到。

山茱萸色泽鲜红，含有大量的鞣质及多元酚类化合物，此类化合物在空气中容易被氧化，因此，给色素的提取和纯化带来了较大的难度。如果山茱萸红色素的稳定性问题能够解决，其突出的药理作用是其优于其他普通天然色素的特色之处。山茱萸主要分布于我国的河南、浙江、陕西等省，四川、重庆、安徽、山东亦有分布。随着近几年来我国农村种植结构的调整，山茱萸的栽培面积正在逐渐扩大。目前我国已有4个先后通过国家GAP认证的山茱萸规范化种植基地，药材资源丰富。但如何从山茱萸药材中提取山茱萸色素，至今未见有公开报导。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种山茱萸色素的制备方法，可有效解决山茱萸天然色素的制备问题。

本发明解决的技术方案是，包括以下步骤：

1、提取山茱萸天然色素

取山茱萸，45-55℃干燥3.5-4.5h，研磨成过60-80目筛的粗粉，按粗粉与石油醚重量比1︰10-15加入石油醚，在65-75℃水浴下回流提取4-6个小时，弃去石油醚提取液，得脱脂后的山茱萸药渣，除去山茱萸药渣挥中的石油醚，晾干，然后按重量比1︰10-15加入质量浓度为75％的乙醇，80-90℃水浴中回流提取5-8h，过滤，弃去药渣，得山茱萸色素粗提液；

2、对山茱萸色素粗提液纯化：

将AB-8大孔吸附树脂用蒸馏水淋洗2-3次，再用质量浓度为75％的乙醇浸泡过夜，用蒸馏水反复冲洗至无乙醇味，采用湿法装柱，以避免带入气泡；

将山茱萸色素粗提液40℃-50℃旋转蒸发除去乙醇，浓缩成相对密度1.1-1.4的浸膏，将浸膏倒入AB-8大孔吸附树脂柱中，静置4-5个小时，再用蒸馏水及不同浓度乙醇进行洗脱，洗脱顺序为8-10倍柱体积的纯水、6-8倍柱体积质量浓度95％乙醇、8-10倍柱体积质量浓度75％乙醇，洗脱流速：1倍柱体积/h，收集质量浓度75％乙醇洗脱液，质量浓度75％乙醇洗脱液50℃旋转蒸发相对密度1.3-1.5的稠膏，加入稠膏重量1/10-1/5的糊精，50℃-60℃真空干燥72-96h，得本发明山茱萸色素，收率为22.67-28.33％。

本发明原料丰富，制备方法简单，易操作，其制备的天然山茱萸色素颜色鲜艳，稳定性强，是具有抗菌、清除自由基、抗氧化等保健功能的天然色素，有效用于制备食品、保健品、化妆品，经济和社会效益显著。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。

实施例1

本发明在具体实施中，包括以下步骤：

1、提取山茱萸天然色素

将山茱萸30g，50℃烘干4个小时，研磨成过70目筛的粗粉，放入索氏提取器中，在圆底烧瓶中加入石油醚300-450ml，70℃水浴用索氏提取器回流提取4-6个小时，弃去石油醚提取液，得脱脂后的山茱萸药渣，山茱萸药渣进一步挥去石油醚，自然晾干，加入质量浓度为75％的乙醇280-420ml，90℃水浴中回流提取5-8h，过滤，滤去药渣，得山茱萸色素粗提液；

2、对山茱萸色素粗提液纯化：

将AB-8大孔吸附树脂用蒸馏水充分淋洗，除去破碎和粒度极小的树脂，用乙醇浸泡过夜(一般为12h)，用蒸馏水反复冲洗至无乙醇味，采用湿法装柱，以避免带入气泡；

将山茱萸色素粗提液40℃-50℃旋转蒸发除去乙醇，浓缩成50℃相对密度为1.25的浸膏，将浸膏倒入AB-8大孔吸附树脂柱中，饱和4-5个小时，再用蒸馏水及不同浓度乙醇进行洗脱，洗脱顺序为9倍柱体积的纯水、7倍柱体积质量浓度95％乙醇、9倍柱体积质量浓度75％乙醇，洗脱流速：1倍柱体积/h，收集质量浓度75％乙醇洗脱液，质量浓度75％乙醇洗脱液50℃旋转蒸发相对密度1.4的稠膏，加入稠膏重量1/7的糊精，55℃真空干燥80h，得本发明山茱萸色素6.8-8.5g。

本发明方法制备的山茱萸色素具有颜色鲜艳，稳定性强，具有抗菌、清除自由基、抗氧化等保健功能的天然色素，有效用于制备食品、保健品、化妆品，并经试验取得了非常满意的有益技术效果，有关试验资料如下：

1、色素稳定性实验

A、温度对山茱萸色素稳定性的影响

山茱萸色素粗提物，在不同温度条件下，加热一个小时后，取1ml，定容于250ml容量瓶中(稀释250倍量)，222nm下测定吸光度。随着温度增高，吸光度缓慢降低，色素颜色变化不大，色素具备一定的耐热性。

B、光照、湿度对山茱萸色素稳定性的影响

干燥后的色素放入高温高湿(30℃，相对湿度70％)环境中30天，颜色及吸光度均无明显变化。

C、pH对山茱萸色素稳定性的影响

当PH在1～4的范围内，色素溶液色泽明亮，呈现鲜红色，较稳定；PH值在5～9范围内，红色逐渐变为稳定紫红色，PH值>9时，色素呈不稳定趋势，色素由紫色变为紫黑色，颜色加深说明该色素在酸性条件下颜色较为稳定，在碱性条件下颜色不稳定。

不同PH值条件下山茱萸色素颜色变化

PH值	1	2	3	4	5	6	7
								色素溶液颜色	淡红色	浅红色	深红色	红色	红色	紫红色	紫红色
PH值	8	9	10	11	12	13	14
								色素溶液颜色	紫红色	紫红色	紫黑色	紫黑色	紫黑色	紫黑色	黑色

2、山茱萸色素药效及其活性的试验

山茱萸色素成分主要成分包含五环三萜酸及其酯类如齐墩果酸、熊果酸及山茱萸总皂苷类成分马鞭草苷、莫诺苷、马钱子苷、獐牙菜苷等。其主要药理活性包括：1)有明显的降血糖作用，对糖尿病肾病及糖尿病血管并发症均有良好保护作用。2)具有免疫抑制活性，能抑制小鼠淋巴细胞转化，抑制LAK细胞生成和白细胞介素-2的产生。3)能抑制抗原特异刺激的T淋巴细胞增殖而具有抗类风湿关节炎作用。另外，山茱萸色素还有保护血管内皮细胞，防治糖尿病微血管并发症的功效。

A、抑菌实验

1.材料与方法

1.1供试菌种金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC26112),购自中国医学菌种保藏中心。

1.2菌悬液的制备。从新鲜菌种斜面分别沾取少量细菌的菌苔，将其接种在牛肉膏蛋白胨液体培养基中，然后在37℃、120r/min的摇床中培养24h，备用。

1.3色素溶液的制备。取色素提取物，溶解于75％乙醇中，制成终浓度为50mg/ml的色素溶液。

1.4抑菌作用的测定采用牛津杯法。将灭菌的牛肉膏蛋白胨固体培养基倒入培养皿中，待凝固后在培养基上分别均匀地涂上0.2ml金黄色葡萄球菌菌悬液，然后在其上等距离地放上无菌牛津杯，在杯内分别注入200μl浓度为50mg/ml的提取物，无水乙醇作为对照，每组3个平行试验。37℃恒温箱中培养24h后，测量其抑菌圈直径，取其平均值。

1.5最低抑菌浓度的测定。将一定浓度的色素与培养基混合后倒平板，使色素溶液的终浓度分别为40、30、20、10、5mg/ml，然后分别于其上接种金黄色葡萄球菌供试菌，其中以不含药液的牛肉膏蛋白胨平板作为阳性对照，以含色素但不加供试菌的平板作为阴性对照，以无水乙醇与牛肉膏蛋白胨平板作为助溶剂对照，37℃恒温箱中培养24h，其中供试菌不生长的平板为该药液对供试菌的最低抑菌度，每组作3个平行试验。

1.6色素溶液抑菌作用效果色素溶液的抑菌效果明显，抑菌圈直径为22mm。对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为30mg/ml。

B、药效实验

本发明制备的山茱萸色素经实验具有降糖作用，实验资料如下：

1.实验材料

1.1实验试剂

本发明山茱萸色素；盐酸二甲双胍片：市售；生理盐水：河南双鹤华利药业有限公司；羧甲基纤维素钠：天津市恒兴化学试剂制造有限公司；链脲佐菌素：sigma公司提供；柠檬酸：天津市致远化学试剂有限公司；柠檬酸钠：天津市致远化学试剂有限公司；葡萄糖测定试剂盒：由中生北控生物科技股份有限公司生产提供；肝糖原测定试剂盒：由南京建成生物工程研究所生产；胰岛素：R&D公司生产；糖化血清蛋白：由南京建成生物工程研究所生产；甲醛：烟台市双双化工有限公司；浓硫酸：上海振企化学试剂有限公司。

1.2实验仪器

AL204系列电子天平，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司；VIS-7220N可见分光光度计，北京瑞利分析仪器有限公司；TGL-16G台式离心机，上海安亭科学仪器厂生产；HHS型电热恒温水浴锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；KDC-160HR高速冷冻离心机，科大创新股份有限公司中佳分公司生产；TES-1380PH酸度计，泰仕电子工业股份有限公司；酶标仪，美国BIO-RAD公司，型号680；可调式移液枪，上海雷勃分析仪器有限公司；OLYMPUS BX61电动显微镜，日本OLYMPUS公司生产；TES-1380PH酸度计，泰仕电子工业股份有限公司。

1.3实验动物

昆明种小鼠，雄性，体重18～22g，由山东鲁抗医药股份有限公司提供，合格证号：0017170；实验室合格证号SYXK(豫)2010-001。

2.实验方法

2.1造模与给药

取体重18-22g的昆明种小鼠108只，雄性，适应性饲养后，根据体重随机挑选12只作为空白组，其余为造模组，造模组于实验开始前称重后尾静脉注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液配制成的链脲佐菌素80mg/kg,7天后，尾部采血，测定血糖，选取16.7mmol/L<血糖值<21mmol/L，并明显具有多饮多食多尿症状的小鼠60只。随机分为5组，分别为模型组、二甲双胍组，山茱萸大、中、小剂量组，每组12只。根据组别分别灌服相应药物，空白组和模型组灌服同体积的0.5％CMC-Na(0.1ml/10g)，盐酸二甲双胍片组(375mg/kg,为临床剂量的15倍，用0.5％的CMC-Na配制，0.1ml/10g)，山茱萸色素大、中、小剂量组(400、200、100mg/kg,用0.5％的CMC-Na配制，0.1ml/10g),每天一次，连续给药30天，分别于给药后的第10、20、30天时尾部采血，测定血糖值。于第31天，灌胃后2h，取血，分离血清，测血清中胰岛素、糖基化血清蛋白的含量，取肝脏适量,测肝糖原含量；取胰脏、肾脏甲醛固定，做组织病理切片，观察病理组织变化。

柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的配制：分别称取500.4mg柠檬酸和501.2柠檬酸钠溶于50ml的容量瓶中，此溶液即为ph＝4.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。为确保其准确性可用PH计校正。临用前配制(由于链脲佐菌素不十分稳定，且对血管刺激较大，用缓冲液配制链脲佐菌素可减轻这些负面影响

3.统计方法

数据分析用SPSS 17.0for windows医用统计包进行数据资料的统计学处理，计量资料用平均数±标准差表示，各组间比较采用单因素方差分析，方差检验齐者用最小显著差数(LSD)法，方差不齐者用Games-Howell法检验，等级资料采用Ridit检验。

4.实验结果与小结

表1山茱萸色素对链脲佐菌素致小鼠糖尿病模型血糖的影响

*表示与模型组比P<0.05，**表示与模型组比P<0.01

从上表可以看出，与空白组相比，模型组在第10、20、30天时的血糖均显著性升高(P<0.01),说明模型复制成功。与模型组相比，二甲双胍组可显著降低(P<0.01)小鼠第10、20、30天的血糖值，山茱萸色素大、中、小剂量组可显著降低(P<0.01)小鼠第20、30天的血糖值。说明山茱萸色素可有效的降低模型的血糖值。

表2山茱萸色素对糖尿病模型肝糖原、胰岛素、糖化血清蛋白的影响

*表示与模型组比P<0.05，**表示与模型组比P<0.01

由上表可以看出：与空白组相比，模型组肝糖原含量和胰岛素水平均显著降低(P<0.01)，糖化血清蛋白含量显著升高(P<0.01),说明模型复制成功。与模型组相比，二甲双胍组可显著升高显著升高(P<0.01)肝糖原含量，显著降低(P<0.01)糖化血清蛋白的含量；山茱萸色素大、中剂量组均可显著升高(P<0.01)肝糖原含量以及胰岛素水平，显著降低(P<0.01)糖化血清蛋白的含量。

各组胰脏组织形态光镜观察：空白组小鼠胰岛细胞比较松散，边界清晰，细胞浆较为丰富；模型组小鼠胰岛细胞减少，细胞浆萎缩，有些甚至完全萎缩；二甲双胍组胰岛细胞胞浆得到显著改善；大、中、小山茱萸色素组均可减轻胰岛细胞的萎缩以及细胞核密集的病理变化。

表3山茱萸色素对链脲佐菌素所致小鼠糖尿病模型胰腺组织的影响

“-”：胰腺组织中胰岛在4个以上，胰岛细胞胞浆丰富，细胞核松散；“+”：胰腺组织中胰岛在4个以上，少数胰岛细胞胞浆萎缩，少数细胞核密集；“++”：胰腺组织中胰岛在2-3个，部分胰岛细胞胞浆萎缩，部分细胞核密集；“+++”：胰腺组织中胰岛在0-1个，全部胰岛细胞胞浆几乎消失，全部细胞核密集。

由上表可以看出，经Ridit检验，与空白组比，模型组出现胰岛细胞减少，细胞浆萎缩，有些甚至完全萎缩，出现显著的病理变化(P<0.01)，说明造模型成功。与模型组相比，大、中、小剂量山茱萸色素组和二甲双胍组均可显著减轻胰脏的病理变化(P<0.01)。

从各组肾脏组织形态光镜观察：空白组肾小球、肾小管均正常；模型组小鼠的肾小管上皮细胞水肿以及间质有不同程度的炎细胞浸润；(见照片9)、大、中、小剂量山茱萸色素组和二甲双胍组肾小球稍有萎缩，肾小管上皮细胞炎症减轻，中剂量组个别大鼠肾脏充血较为严重。

表4山茱萸色素对链脲佐菌素所致小鼠糖尿病模型肾组织的影响

“-”肾小球细胞正常，肾小囊正常；“+”肾小球细胞稍萎缩，肾小囊稍有扩张；“++”肾小球细胞萎缩，肾小囊腔扩张；“+++”肾小球细胞明显萎缩，肾小囊腔明显扩张

从上表可以看出，经Ridit检验，与空白组比，模型组出现显著的肾脏病理变化(P<0.01)，说明出现显著的肾脏病变。与模型组相比，大、中、小剂量组山茱萸色素组和二甲双胍组肾脏病理变化均显著减轻(P<0.01)。

上述试验资料充分表明本发明的山茱萸色素中总黄酮含量达58％以上，具有很好的降糖作用，有效用于制备降糖药物，实现山茱萸色素在制备降糖药物中的应用，并开拓了糖尿病治疗用药的新途径，并实现山茱萸色素在制备治疗糖尿病药物中的应用，因为糖尿病最突出的临床症状就是高血糖，因此，治疗糖尿病的关键在于降低血糖，而山茱萸色素正具备降低血糖的功效，并且经临床对58例高血糖糖尿病患者按常规糖尿病患者服药办法进行服用，每天3次，每次1.5-2.0g，连服10天，测定血糖，结果血糖均有不同程度的降低，表明无论是经动物试验，还是经临床验证，都证明山茱萸色素具有降糖之功效，有效用于制备保健品、化妆品、食品，开拓了山茱萸的新用途和药用价值，具有极大的实用价值，经济和社会效益显著。

Claims (3)

1.一种山茱萸色素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）、提取山茱萸天然色素

取山茱萸，45-55℃干燥3.5-4.5h，研磨成过60-80目筛的粗粉，按粗粉与石油醚重量比1︰10-15加入石油醚，在65-75℃水浴下回流提取4-6个小时，弃去石油醚提取液，得脱脂后的山茱萸药渣，除去山茱萸药渣挥中的石油醚，晾干，然后按重量比1︰10-15加入质量浓度为75%的乙醇，80-90℃水浴中回流提取5-8h，过滤，弃去药渣，得山茱萸色素粗提液；

（2）、对山茱萸色素粗提液纯化：

将AB-8大孔吸附树脂用蒸馏水淋洗2-3次，再用质量浓度为75%的乙醇浸泡过夜，用蒸馏水反复冲洗至无乙醇味，采用湿法装柱，以避免带入气泡；

将山茱萸色素粗提液40℃-50℃旋转蒸发除去乙醇，浓缩成相对密度1.1-1.4的浸膏，将浸膏倒入AB-8大孔吸附树脂柱中，静置4-5个小时，再用蒸馏水及不同浓度乙醇进行洗脱，洗脱顺序为8-10倍柱体积的纯水、6-8倍柱体积质量浓度95%乙醇、8-10倍柱体积质量浓度75%乙醇，洗脱流速：1倍柱体积/h，收集质量浓度75%乙醇洗脱液，质量浓度75%乙醇洗脱液50℃旋转蒸发相对密度1.3-1.5的稠膏，加入稠膏重量1/10-1/5的糊精， 50℃-60℃真空干燥72-96h，即得。

2.根据权利要1所述的山茱萸色素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）、提取山茱萸天然色素

将山茱萸30g，50℃烘干4个小时，研磨成过70目筛的粗粉，放入索氏提取器中，在圆底烧瓶中加入石油醚300-450ml，70℃水浴用索氏提取器回流提取4-6个小时，弃去石油醚提取液，得脱脂后的山茱萸药渣，山茱萸药渣进一步挥去石油醚，自然晾干，加入质量浓度为75%的乙醇280-420ml，90℃水浴中回流提取5-8h，过滤，滤去药渣，得山茱萸色素粗提液；

（2）、对山茱萸色素粗提液纯化：

将AB-8大孔吸附树脂用蒸馏水充分淋洗，除去破碎和粒度极小的树脂，用乙醇浸泡过夜，用蒸馏水反复冲洗至无乙醇味，采用湿法装柱，以避免带入气泡；

将山茱萸色素粗提液40℃-50℃旋转蒸发除去乙醇，浓缩成50℃相对密度为1.25的浸膏，将浸膏倒入AB-8大孔吸附树脂柱中，静置4-5个小时，再用蒸馏水及不同浓度乙醇进行洗脱，洗脱顺序为9倍柱体积的纯水、7倍柱体积质量浓度95%乙醇、9倍柱体积质量浓度75%乙醇，洗脱流速：1倍柱体积/h，收集质量浓度75%乙醇洗脱液，质量浓度75%乙醇洗脱液50℃旋转蒸发相对密度1.4的稠膏，加入稠膏重量1/7的糊精， 55℃真空干燥80h，即得。

3.权利要求1或2所述方法制备的山茱萸色素在制备食品、保健品、化妆品中的应用。