CN107865895A - 一种孔雀草总黄酮提取物在制备免疫增强药物中的应用 - Google Patents

一种孔雀草总黄酮提取物在制备免疫增强药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种孔雀草总黄酮在制备免疫增强药物的应用，方法是将孔雀草全草粉碎后，以乙醇回流提取，石油醚脱脂，然后经大孔吸附树脂纯化，获得孔雀草总黄酮，按照比色法测定总黄酮的重量含量高于30％。药理试验证明，该孔雀草总黄酮提取物具有较强的免疫增强活性，可单独或与其它药物组合作为原料药应用于免疫增强药物的制剂中。本发明提供的方法制备的孔雀草总黄酮提取物中的总黄酮的纯度高，且制备方法简便实用，适合工业化生产；本发明提供的孔雀草总黄酮提取物可用于制备具有免疫增强作用的药物。

Description

一种孔雀草总黄酮提取物在制备免疫增强药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种植物药提取方法及其应用，具体是以孔雀草总黄酮为活性成分的药物提取物及其在治疗免疫低下疾病中的用途。
背景技术
孔雀草(Tagetes patula L.)又名小万寿菊，红黄草，西番菊，臭菊花，缎子花(云南)，为菊科万寿菊属植物，为一年生草本，花期为7月～9月。原产墨西哥，在我国云南中部及西北部、四川中部和西南部及贵州西部均已归化，现我国各地均有栽培，是一种常见的观赏花卉。孔雀草有药用和保健作用，在傈僳族、彝族中均作为药物加以应用。其味苦性平，清热利湿，止咳。用于咳嗽，痢疾，顿咳，牙痛，风火眼痛；外用于痄腮，乳痛(贾敏如.中国民族药志要[M].中国医药科技出版社，2005.；张惠源.中国中药资源志要[M].科学出版社，1994.)。
从20世纪80年代开始，人们即开始对孔雀草的化学成分进行研究，分离得到万寿菊素(patuletin)，槲皮万寿菊素(quercetagetin)，槲皮万寿菊甙(quercetagitrin)等黄酮类化合物(国家中医药管理局《中华本草》编委会，中华本草[M]，上海科学技术出版社，1999年版)。孔雀草挥发油中主要成份为2-蒈烯、β-水芹烯、胡椒酮、胡椒烯酮、异松油烯、柠檬烯等(胡建安，孔雀草精油化学成分初探[J].香料香精化妆品，1992(01)：24-26.；Romagnoli C，Bruni R，Andreotti E，et al.Chemical characterization andantifungal activity of essential oil of capitula from wild IndianTagetespatula L[J].Protoplasma，2005，225(1-2)：57-65)，目前人们多对孔雀草花卉进行研究，药用价值研究较少。
多种疾病与免疫功能低下有关，如肿瘤、AIDS和老年性疾病。免疫力低下的机体易罹患癌症、肿瘤或者容易被细菌、病毒、真菌等感染，导致生病，从而使机体的消耗量更加严重，那些免疫力低下者便通常有下述表现：体质虚弱、营养不良、疲乏无力、食欲降低、睡眠障碍、精神衰弱等。随着时间推移，会导致于青少年身体和智力发育不良，使中老年人则易诱发重大疾病。
中药对免疫低下疾病的治疗具有其独特的优势，其副作用较化学药低，而疗效往往比化学药好，被广泛应用在临床上，因此寻找疗效确切、安全可靠的免疫增强药物，可以很大程度上改善人们的生活质量，减轻人民的生活负担，具有良好的应用前景。
前期我们发现孔雀草总黄酮提取物具有抗帕金森作用(蔡德成，窦德强：孔雀草总黄酮提取物、制备方法及应用，申请号：201511022920.4，申请日：2015.12.26)。近期在治疗免疫 低下小鼠药效学试验中，我们惊喜地发现孔雀草总黄酮具有较好的免疫增强药理作用。经文献检索，未有孔雀草治疗免疫低下疾病药理作用报道，于是形成本专利。所制备的孔雀草中总黄酮提取物中总黄酮的含量约30％以上，测定方法参见文献(迟玉新，窦德强.楮实子与构树叶中总黄酮含量测定[J].中国现代中药，2008，11：16-17.)。本专利孔雀草经醇提取，大孔吸附树脂纯化制备孔雀草总黄酮，使其适合开发成为治疗免疫低下疾病的药物。
发明内容
为实现上述目的而采用的技术方案如下：
1.建立制备孔雀草总黄酮提取物的方法
(1)用80％乙醇水(体积比)溶液对孔雀草全草(包括根及地上部分，粉碎成10目粉末)进行浸渍提取，每次溶剂用量为药材质量的10倍量，40℃温浸12小时，浸提2次。合并提取液后经浓缩得到浓缩液(约为药材质量的1倍量)；
(2)上述浓缩液用1/2浓缩液体积的石油醚萃取三次脱脂，得到脱脂浓缩液；
(3)上述脱脂浓缩液进一步经大孔吸附树脂HPD100分离(树脂用量为孔雀草用量的1/2倍)，先用水洗(5倍树脂体积)，再用60％乙醇水溶液洗脱，得到60％乙醇水洗脱液，经减压回收乙醇，干燥得孔雀草总黄酮提取物。
2.孔雀草总黄酮用于免疫增强作用的药理学研究
上述孔雀草总黄酮提取物用于治疗免疫低下模型小鼠的药理试验研究。
3.所得孔雀草总黄酮可单独或与其它药物组合，制成免疫增强作用的药物。
具体实施方式
本发明中，采用下述文献报道的比色法对总黄酮含量进行测定：迟玉新，窦德强.楮实子与构树叶中总黄酮的含量测定.中国现代中药2008，10(11)：16-17。该方法的简要操作过程如下：精密称取一定量的总黄酮提取物，制备样品溶液。加Al(NO3)3/NaNO2试液显色，以槲皮素为对照品，于505nm处进行比色测定。根据测定的吸光度值，即可计算得到孔雀草中总黄酮的含量。
实施例1制备孔雀草总黄酮
溶剂提取法和树脂吸附法制备孔雀草总黄酮：
将目数为10目的孔雀草粉末1kg，乙醇的体积百分含量为80％的乙醇水溶液浸渍提取2次，每次溶剂用量为药材质量的10倍量，每次40℃温浸12小时。合并提取液，回收乙醇溶液，浓缩至约为药材质量的1倍量(约1升)，经每次500毫升石油醚萃取3次后，得脱脂溶液。脱脂溶液经已预先处理过的HPD100大孔吸附树脂柱(约500毫升)，依次用水(2500 毫升)、60％的乙醇水溶液进行洗脱(2000毫升)，60％的乙醇洗脱液减压回收乙醇，减压干燥得总黄酮提取物105g，测得总黄酮为34.5g，占所述干燥后的总黄酮提取物的重量百分比为32.8％，占孔雀草原料药材总重的百分比即收率为3.45％。
实施例2：孔雀草总黄酮片剂的制备
配方：孔雀草总黄酮提取物500g
淀粉150g
5％聚乙烯吡咯烷酮的醇溶液适量
硬脂酸镁1％
制成1000片
制法：取孔雀草总黄酮粉末与淀粉混合，以5％聚乙烯吡咯烷酮的醇溶液制软材，16目筛制粒，干燥后整粒，加入1％的硬脂酸镁，混合压片，装瓶，密封贮藏。
实施例3：孔雀草总黄酮颗粒剂的制备
配方：孔雀草总黄酮提取物500g
5％聚乙烯吡咯烷酮的醇溶液适量
制成1000袋
制法：取孔雀草总黄酮粉末，以5％聚乙烯吡咯烷酮的醇溶液制软材，14目筛制粒，干燥制得，装袋，每袋1g，密封贮藏。
实施例4：孔雀草总黄酮胶囊剂的制备
配方：孔雀草总黄酮提取物500g
5％聚乙烯吡咯烷酮的醇溶液适量
制成1000粒
制法：取孔雀草总黄酮粉末，以5％聚乙烯吡咯烷酮的醇溶液制软材，14目筛制粒，干燥后，装0#胶囊，密封贮藏。
实验例1：孔雀草总黄酮提取物对免疫低下模型小鼠的治疗作用
1.1实验材料
1.1.1动物
动物：KM小鼠50只，雌性，SPF级，体重(18-22)g，购自辽宁长生生物技术有限公司，[SCXK(辽)2010-0001]。
1.1.2药物
药物的制备：取上述制备的孔雀草总黄酮提取物适量，加0.5％羧甲基纤维素钠水溶液，使配制成浓度约为20mg/ml、12mg/ml、6mg/ml的溶液，备用。
环磷酰胺(6055-19-2)购于大连美仑生物技术有限公司，生理盐水配制成8mg/ml溶液，备用；
康奇胶囊，天津药业生物技术有限公司；以0.5％羧甲基纤维素钠水溶液配制成10mg/ml。
1.1.3仪器
酶标仪(SUNRISE型，瑞士TECAN公司)；超声波清洗器(KQ-250DE型，昆山市超声仪器公司)；TDZ4-WS低速自动平衡离心机(长沙湘仪离心机仪器公司)；电子天平(沈阳龙腾电子公司)。
小鼠免疫球蛋白G(IgG)Elisa试剂盒(货号：H106)；IL-2Elisa试剂盒(货号：H003)均购于南京建成生物工程研究所。
1.2实验方法
1.2.1免疫低下小鼠模型的复制、分组及给药
KM小鼠60只，雌性，随机分成6组，每组10只，适应性喂养7天后随机分为6组：空白对照组、模型组、阳性药组、孔雀草低、中、高剂量组。孔雀草组灌胃相应浓度的孔雀草总黄酮提取物，空白对照组和模型组灌胃等体积蒸馏水，阳性药组灌胃给予康奇胶囊水溶液，灌胃体积均为0.25ml，每天一次，连续给药10天。同时，在给药的第5、6、7、10天，空白组腹腔注射生理盐水10ml/kg，其余5组在给药的第5、6、7、10均腹腔注射环磷酰胺80mg/kg，造成环磷酰胺免疫低下小鼠模型(参照文献：李荣，李俊，胡成穆，张磊，张茜.橙皮苷对免疫功能低下小鼠免疫调节作用的实验研究[J].中国药理学通报，2007，02：169-172)。
表1 孔雀草总黄酮治疗免疫低下模型小鼠各组给药剂量
1.2.2指标检测
1.2.2.1孔雀草总黄酮对小鼠体重及免疫器官的影响
末次给药24h后称量小鼠体重，取血，静置30min后，3500r/min低温离心10min，取上清，备用。脱颈椎处死小鼠后取脾和胸腺并称湿重。脾系数和胸腺系数按下列公式计算
脾系数＝小鼠脾质量/体重*100。
胸腺系数＝小鼠胸腺质量/体重*100。
1.2.2.2孔雀草总黄酮对血清IgG、IL-2水平的影响
严格地按试剂盒提供的ELISA法测定血清IgG、IL-2水平。
1.3统计学处理
经SPSS20.0统计软件处理数据，结果采用表示，两组比较时采用独立样本T检验，两组以上的同时满足正态性和方差齐性的用单因素方差分析LSD，方差不齐时用Dunnett’s T3检验。
1.4实验结果
1.4.1孔雀草总黄酮对免疫低下小鼠体重、胸腺系数和脾系数的影响
结果见表2。与空白组比较，模型组的体重和脾系数显著下降(P＜0.01)，胸腺系数也明显降低(P＜0.05)。与模型组比较，孔雀草总黄酮各剂量组小鼠体重均无统计学差异。与模型组比，孔雀草总黄酮中、高剂量组小鼠的脾系数明显升高(P＜0.05)，孔雀草总黄酮中、高剂量组小鼠的胸腺系数明显升高。
表2 孔雀草总黄酮对免疫低下小鼠体重、胸腺系数和脾系数
注数据均采用单因素方差分析Dunnett’sT3检验，与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与空白组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
1.4.2孔雀草总黄酮对免疫低下小鼠IgG、IL-2水平的影响
结果见表3，与空白组比较，模型组的IgG和IL-2浓度，均显著下降(P＜0.05)；与模型组比较，孔雀草总黄酮中、高剂量组小鼠IgG浓度均显著升高(P＜0.05)。与模型组比，孔雀草总黄酮高剂量组小鼠的IL-2浓度明显升高(P＜0.05)。
表3 孔雀草总黄酮对免疫低下小鼠IgG和IL-2的水平的影响
注数据均采用单因素方差分析LSD检验，与空白组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
脾和胸腺是机体重要的免疫器官，IgG是血清主要的抗体成分，约占血清Ig的75％。其中40～50％分布于血清中，其余分布在组织中，IgG的功能作用主要在机体免疫中起保护作用。IL-2是一种白介素，是免疫系统中的一类细胞生长因子，能调控免疫系统中白血球的细胞活性。由统计结果可知，模型组小鼠的体重、脾系数、胸腺系数、IgG和IL-2的水平均明显降低，表明造模成功。与模型组比较，孔雀草总黄酮中、高剂量组对环磷酰胺所致免疫低下小鼠均有一定的免疫增强作用，其可以单独或者与其他免疫增强药物联用来治疗各种免疫低下疾病。
上述仅为本发明的具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。

Claims (3)

1.一种孔雀草总黄酮提取物在制备免疫增强药物中的应用，取孔雀草全草，采用40％～100％乙醇提取1～3次，提取液浓缩至药材质量的1～2倍量，然后采用1/2浓缩液体积的石油醚萃取三次脱脂，脱脂后的提取液，挥至无石油醚味，继而采用2倍提取液体积的大孔吸附树脂色谱柱纯化，先用5倍树脂体积的水洗脱，然后用50～95％乙醇洗脱至颜色较淡，收集洗脱液，减压浓缩，干燥，得到孔雀草总黄酮提取物，纯度大于30％。其特征在于所得的孔雀草总黄酮，在制备治疗免疫功能低下药物中的应用。
2.如权利要求1所述，其特征在于该总黄酮提取物辅以药学上常用的辅料可以制备成各种口服剂型，包括片剂、口服剂、胶囊剂、颗粒剂等。
3.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于所得的孔雀草总黄酮可单独或与其它已知具有免疫增强作用药物合用，用于免疫功能低下疾病的治疗。
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