CN108066350A - 连翘苷、其衍生物、连翘苷与连翘脂素组合物在制备预防、治疗老年痴呆症药物中的应用 - Google Patents

连翘苷、其衍生物、连翘苷与连翘脂素组合物在制备预防、治疗老年痴呆症药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种连翘苷、连翘苷其衍生物、连翘苷与连翘脂素组合物在制备预防或/和治疗老年痴呆症药物中的新应用。试验证明连翘苷、连翘苷衍生物、连翘苷与连翘脂素组合物预防或/和治疗阿尔茨海默病的疗效显著，见效快、毒副作用小、是一种安全、高效、稳定、制备工艺简单的预防或/和治疗老年痴呆症(阿尔茨海默病)药物，适于工业化生产，易于推广。本发明为预防或/和治疗阿尔茨海默病提供了一种新的药物来源。

Description

连翘苷、其衍生物、连翘苷与连翘脂素组合物在制备预防、治 疗老年痴呆症药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药领域，涉及一种预防或/和治疗阿尔茨海默病(又称老年痴呆症)药物或保健食品，特别涉及一种中药连翘及连翘叶提取成分在缓解和/或治疗阿尔茨海默病药物或保健食品中的应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)又被称为老年痴呆症疾病，是引起痴呆最常见的疾病，临床以整体认知功能障碍尤其是记忆功能障碍，行为或人格变化以及日常生活能力损害为主要特征。其病理学特征主要是细胞外淀粉样蛋白沉积形成老年斑，细胞内tau蛋白形成神经纤维结，选择性神经元丢失和突触丢失等。据国外资料统计，65岁以上人群AD发病率是7-10％，80岁以上人群发病率高达40％，预计到2025年全球有2000万AD病人，目前我国65岁以上人群AD患病率高达10.1％，约有500万老人患痴呆，其中310万老人患AD，因此AD已经严重影响世界人口健康和生活质量，其病因和发病机制不详，治疗效果欠佳。随着老龄化的日益加剧，预防或/和治疗AD的有效药物研究已经成为当前研究热点。
虽然AD发病机制目前尚为完全清楚，但是大量的研究表明，AD的核心病理环节可能是淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)激活胶质细胞引起的中枢神经系统炎性损伤。小胶质细胞隶属于单核-吞噬细胞，是中枢神经系统(CNS)中的主要免疫细胞，被激活后以自分泌以及旁分泌等方式分泌多种具有生物活性的细胞因子，如白细胞介素(IL)，肿瘤坏死因子α(TNF-α)，集落刺激因子(CSF)，环氧合酶-2(COX-2)和前列腺素(PG)以及干扰素(IFN)等，TOLL样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)是胶质细胞和神经元表面重要的识别受体，在Aβ诱导炎性因子产生中扮演着关键的角色。肿瘤坏死因子受体相关因子6(Tumornecrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6)是TLR4下游一种重要的接头蛋白，可促使核因子-kB(nuclear factor-kB，NF-kB)发生核转位，从而诱导相关基因的转录，最终引起炎症介质的大量释放，这些细胞因子可对神经元产生强烈的毒性作用，引起神经元损伤。其中，COX-2在各种刺激如炎症因子，内毒素诱导下可迅速合成并广泛参与炎症过程。花生四烯酸(AA)在COX-2作用下产生PGE2。而PGE2产为促炎介质，具有致热，增强血管通透性，加速溶酶体释放，促进白细胞趋化作用，它参与炎症反应等多种病理生理过程，因此减轻神经炎症成为预防或/和治疗AD的潜在靶点。
连翘为中医常用的清热解毒药，近年来随着对连翘及其同属植物化学成分分析的增多，对连翘药理作用的报道也随之增多。连翘具有抗菌、抗病毒、强心利尿、保肝降压、镇吐镇痛、抗糖尿病、抗流感病毒等作用。民间调查显示连翘叶有消除便秘、预防感冒、降血脂、降血压等作用。除此之外，连翘还可用于食品保鲜、清除异味、水土保持等作用。
连翘传统以果实入药，综合近年来对连翘属植物的研究结果得知，同属植物的叶子与果实的化学成分有很好的一致性，并且连翘叶中有效成分如连翘苷、连翘酯素、齐墩果酸等在叶中的含量高于果实。为了开发利用这一天然资源，发明人对连翘叶中的连翘苷进行了大量的研究，研究了连翘苷的工业化制备工艺，并对其药理作用进行实验研究，为连翘资源的综合开发利用提供科学依据。
研究表明：连翘苷可提高小鼠吞噬碳粒的能力，吞噬指数和吞噬百分率增加，减轻小鼠迟发超敏反应时两耳重量之差，说明连翘苷可调节小鼠非特异性免疫功能。连翘苷可延长小鼠在常压缺氧条件下的存活时间，表明连翘苷茶具有一定的抗应激能力，连翘苷在细胞水平上对LPS活化的小胶质细胞表达COX-2蛋白，分泌PGE2具有抑制作用，因而对神经退行性疾病具有显著治疗作用。
本发明人通过大量的现代科学研究，采用先进的分离纯化技术从连翘及连翘叶中提取其治疗阿尔茨海默病有效成分连翘苷、连翘脂素，并经进一步研究合成制备了连翘苷衍生物。可以为阿尔茨海默病患者提供一种高效低毒的药物。
发明内容
本发明的首要目的是针对现有治疗或预防老年痴呆症的药物或保健品在应用过程中存在的技术缺陷，提供连翘苷、连翘苷衍生物、连翘苷与连翘脂素组合物(即连翘苷/连翘脂素)预防或/和治疗阿尔茨海默病的性能和功效，并提供连翘苷、连翘苷衍生物、连翘苷/连翘脂素的新的药用用途，即在制备预防或/和治疗阿尔茨海默病药物或保健食品中的新应用。
为实现上述目的，本发明一方面提供一种连翘苷、连翘苷衍生物、连翘苷/连翘脂素在制备预防或/和治疗老年痴呆症的药物或保健品中的应用。
在筛选预防或/和治疗老年痴呆症(即阿尔茨海默病)功能作用的天然活性成分的过程中，发明人发现连翘的化学成分中连翘苷、连翘苷衍生物、连翘苷/连翘脂素具有预防或/和治疗阿尔茨海默病作用。
其中，所述药物或保健品由连翘苷、连翘苷衍生物、连翘苷/连翘脂素和药学上可接受的载体组成。
特别是，所述连翘苷衍生物选择连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物。
特别是，所述连翘苷衍生物包括33-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷(33-Hydroxyphillygenin-8-O-β-D-glucuronide)、9-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷(9-Hydroxyphillygenin-8-O-β-D-glucuronide)、33，34-亚甲基二氧-连翘脂素葡萄糖醛酸苷(33,34-Methylenedioxy phillygenin-8-O-β-D-glucuronide)、连翘脂素葡萄糖醛酸甲酯((2R,3R,4R,5S)-methyl6-(5-((1R,4S)-4-(3,4-dimethoxyphenyl)hexahydrofuro[3,4-c]furan-1-yl)-2-methoxyphenoxy)-3,4,5-trihydroxyte tra hydro-2H-pyran-2-carboxylate)、连翘脂素葡萄糖醛酸钠(sodium(2R,3R,4R,5S)-6-(5-((1R,4S)-4-(3,4-dimethoxyphenyl)hexahydrofuro[3,4-c]furan-1-yl)-2-methoxyphenoxy)-3,4,5-trihydroxytetrahydro-2H-pyran-2-carboxylate)、连翘脂素葡萄糖醛酸钾(potassium(2R,3R,4R,5S)-6-(5-((1R,4S)-4-(3,4-dimethoxyphenyl)hexahydrofuro[3,4-c]furan-1-yl)-2-methoxyphenoxy)-3,4,5-trihydroxytetrahydro-2H-pyran-2-carboxylate)、连翘脂素葡萄糖醛酸((2R,3R,4R,5S)-6-(5-((1R,4S)-4-(3,4-dimethoxyphenyl)hexahydrofuro[3,4-c]furan-1-yl)-2-methoxyphenoxy)-3,4,5-trihydroxytetrahydro-2H-pyran-2-carboxylic acid)；优选为33-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷、9-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷、33，34-亚甲基二氧-连翘脂素葡萄糖醛酸苷、连翘脂素葡萄糖醛酸甲酯、连翘脂素葡萄糖醛酸钠或连翘脂素葡萄糖醛酸钾。
特别是，所述连翘苷与连翘脂素组合物中连翘苷与连翘脂素的重量份配比为2～98：2～98；优选为2-10:90-98；进一步优选为80:20或20:80，进一步优选为90:10或10:90，更进一步优选为98:2或2:98；再进一步优选为98:2。
其中，所述的连翘苷、连翘苷衍生物的含量≥1％，优选为≥30％，进一步优选为≥60％，更进一步优选为≥80％，再更进一步优选为≥98％；连翘苷与连翘脂素组合物含量≥1％，优选为≥30％，进一步优选为≥60％，更进一步优选为≥80％，再更进一步优选为≥98％。
特别是，所述的连翘苷、连翘苷衍生物含量为1％～98％；优选为30～80％；连翘苷与连翘脂素组合物含量为1％～98％；优选为30～80％。
特别是，药学上可接受的载体通常被保健专家认可用于这一目的且作为药剂的非活性成分。有关药学上可接受的载体的汇编可以在《药物赋形剂手册》(Handbook ofPharmaceutical excipients，第2版，由A.Wade和P.J.Weller编辑；AmericanPharmaceutical Association出版，Washington and The Pharmaceutical Press，London，1994)等工具书中找到。
尤其是，所述的载体包括赋形剂，如淀粉、水等；润滑剂，如硬脂酸镁等；崩解剂，如微晶纤维素等；填充剂，如乳糖等；粘结剂，如预胶化淀粉、糊精等；甜味剂；抗氧化剂；防腐剂、矫味剂、香料等；
其中，所述药物以片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂形式存在。
特别是，所述连翘苷、连翘苷衍生物含量≥1％，优选为≥30％，进一步优选为≥60％，更进一步优选为≥80％，再更进一步优选为≥98％；连翘苷与连翘脂素组合物含量≥1％，优选为≥30％，进一步优选为≥60％，更进一步优选为≥80％，再更进一步优选为≥98％。
本发明另一方面提供一种含有连翘苷、连翘苷衍生物、连翘苷与连翘脂素组合物的用于预防或/和治疗老年痴呆症的药物或保健品。
其中，所述连翘苷衍生物选择连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物。
特别是，所述连翘苷衍生物包括33-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷、9-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷、33，34-亚甲基二氧-连翘脂素葡萄糖醛酸苷、连翘脂素葡萄糖醛酸甲酯、连翘脂素葡萄糖醛酸钠、连翘脂素葡萄糖醛酸钾、连翘脂素葡萄糖醛酸；优选为33-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷、9-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷、33，34-亚甲基二氧-连翘脂素葡萄糖醛酸苷、连翘脂素葡萄糖醛酸甲酯、连翘脂素葡萄糖醛酸钠或连翘脂素葡萄糖醛酸钾。
其中，所述的连翘苷、连翘苷衍生物的含量≥1％，优选为≥30％，进一步优选为≥60％，更进一步优选为≥80％，再更进一步优选为≥98％；连翘苷与连翘脂素的组合物含量≥1％，优选为≥30％，进一步优选为≥60％，更进一步优选为≥80％，再更进一步优选为≥98％。
特别是，所述的连翘苷、连翘苷衍生物的含量≥1％，优选为1％～98％；优选为30～80％，更进一步优选为60％；连翘苷与连翘脂素的组合物含量≥1％，优选为1％～98％；优选为30～80％，更进一步优选为60％。
其中，所述连翘苷与连翘脂素组合物中连翘苷与连翘脂素的重量份配比为2～98：2～98；优选为2-10:90-98；进一步优选为80:20或20:80，进一步优选为90:10或10:90，更进一步优选为98:2或2:98；再进一步优选为98:2。
特别是，所述连翘苷、连翘苷衍生物、连翘苷与连翘脂素组合物的重量与所述药物或保健品的总重量之比为0.01-10：100，优选为0.1～10：100，进一步优选为1～10：100。
其中，所述连翘苷/连翘脂素组合物以连翘苷、连翘脂素、单体组成、或采用溶剂加热提取方法制备而成的连翘脂素-连翘苷提取组合物，或连翘脂素和连翘苷与环糊精或环糊精的衍生物组合而成连翘脂素-连翘苷-环糊精组合物。
特别是，所述连翘脂素-连翘苷-环糊精组合物选择连翘脂素和连翘苷与α-、β-或γ-环糊精或其衍生物相混合而成的混合物，或连翘脂素和连翘苷与α-、β-或γ-环糊精或其衍生物经物理、化学方法处理形成的复合物。
其中，所述连翘脂素-连翘苷-环糊精组合物中连翘苷和连翘脂素的重量之和与环糊精或环糊精的衍生物的重量之比为1：1-50。
特别是，所述环糊精为α-或β-、γ-环糊精；所述环糊精衍生物为羟乙基-环糊精、2，6-二甲基-环糊精、2，3，6-三甲基-环糊精、2，6-二乙基-环糊精、2，3，6-三乙基-环糊精、麦芽糖基-环糊精或磺丁醚β-环糊精、对甲基苯磺酰氯(p-TsCl)取代的β-环糊精、6-位取代的β-CD对甲基苯磺酸酯(β-环糊精-6-OTs)、2-氧羟丙基-β-环糊精、2-位单取代的对甲基苯磺酸酯(β-环糊精-2-OTs)、β-环糊精对甲基苯磺酸酯(Tosyl-β-CD)、β-环糊精的星形大分子PCL-(Tos)7-β-CD。
特别是，所述药物或保健品中还包括人参提取物、黄芪提取物、党参提取物、核桃仁提取物、甘草提取物、川芎提取物、薏苡仁提取物、灵芝提取物、天麻提取物、维生素C及其衍生物或维生素E及其衍生物中的一种或多种。
与现有技术相比，本发明具有如下的明显优点：
1、本发明对已知化合物连翘苷、连翘苷衍生物、连翘苷/连翘脂素组合物发掘了新的药用价值，将其用于预防或/和治疗阿尔茨海默病，并制备成预防或/和治疗阿尔茨海默病的药物或保健食品，从而为连翘及连翘叶药材的应用开拓了一个新的领域。
2、本发明的系列试验研究证明连翘苷、连翘苷衍生物、连翘苷/连翘脂素组合物具有显著预防或/和治疗阿尔茨海默病功效。
3、本发明的连翘苷、连翘苷衍生物、连翘苷/连翘脂素组合物药理作用强，用于预防或/和治疗阿尔茨海默病功效显著，见效快、毒副作用小、安全性好，能够长期服用，具有良好的药用前景。
4、本发明的产品原料来源丰富、价廉、临床使用安全，制备工艺简单，可制成各种剂型，且服量小，使用方便，因此易于推广。
5、本发明既可采用连翘苷、连翘苷衍生物、连翘苷与连翘脂素的组合物的活性成分制备成治疗或预防老年痴呆症的药物，又可采用连翘苷、连翘苷衍生物、连翘苷与连翘脂素的组合物与其它活性成分(例如与人参提取物、黄芪提取物、党参提取物、核桃仁提取物、甘草提取物、川芎提取物、薏苡仁提取物、灵芝提取物、天麻提取物、维生素C及其衍生物或维生素E及其衍生物)共同组方，制备预防或/和治疗阿尔茨海默病复方药物。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步描述本发明所述配方的有益效果，这些实施例包括了本发明的连翘苷、连翘苷衍生物的胶囊、片剂、软胶囊剂的药效学试验。这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的配方思路、用途范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明中所述连翘苷衍生物33-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷、9-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷、33,34-亚甲基二氧-连翘脂素葡萄糖醛酸苷与专利申请(申请号：201510319303.4，优先权号：201510164294.6)中所述连翘苷衍生物相同；连翘脂素葡萄糖醛酸甲酯、连翘脂素葡萄糖醛酸钠、连翘脂素葡萄糖醛酸钾、连翘脂素葡萄糖醛酸与专利申请(申请号：201510320579.4，优先权号：201410825547.5)中的相同。
实施例1 连翘苷片剂
1、按照如下配比准备原料
2、将连翘苷和淀粉混合均匀，制成颗粒，加入滑石粉和硬脂酸镁混合均匀后压制成10000片。
实施例2 连翘苷胶囊剂
1、按照如下配比准备原料
连翘苷(纯度98％) 200g
淀粉 1000g
2、将连翘苷和淀粉混合均匀后装胶囊，制成10000粒。
实施例3 连翘苷胶囊剂
1、按照如下配比准备原料
连翘苷(纯度60％) 500g
淀粉 1000g
2、将连翘苷和淀粉混合均匀后装胶囊，制成10000粒。
实施例4 连翘苷片剂
1、按照如下配比准备原料
2、将连翘苷、党参提取物、维生素C和淀粉混合均匀后制粒，加入滑石粉和硬脂酸镁混匀后压制成10000片。
实施例5 连翘苷胶囊剂
1、按照如下配比准备原料
2、将连翘苷、核桃仁提取物、维生素C和淀粉混合均匀后装胶囊，制成10000粒。
实施例6 连翘苷颗粒剂
1、按照如下配比准备原料
2、将连翘苷、人参提取物、维生素C和蔗糖粉混合均匀制成颗粒后装袋，制成10000袋。
实施例7 连翘苷口服液
1、按照如下配比准备原料
2、取连翘苷、川芎提取物、甘草提取物，用乙醇溶解后加入葡萄糖糖浆，最终加去离子水至100ml，即得。
实施例8 33-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷片剂
1、按照如下配比准备原料
2、将33-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷和淀粉混合均匀后，制成颗粒，加入滑石粉和硬脂酸镁混合均匀后压制成10000片。
实施例9 33-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷胶囊剂
1、按照如下配比准备原料
33-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷(纯度60％) 200g
淀粉 1000g
2、将33-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷和淀粉混合均匀后装胶囊，制成10000粒。
实施例10 33-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷胶囊剂
1、按照如下配比准备原料
33-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷(纯度98％) 500g
淀粉 1000g
2、将33-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷和淀粉混合均匀后装胶囊，制成10000粒。
实施例11 33-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷片剂
1、按照如下配比准备原料
2、将33-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷、黄芪提取物、维生素C和淀粉混合均匀后制粒，加入滑石粉和硬脂酸镁混匀后压制成10000片。
实施例12 33-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷胶囊剂
1、按照如下配比准备原料
2、将33-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷、党参提取物、维生素C和淀粉混合均匀后装胶囊，制成10000粒。
实施例13 33-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷颗粒剂
1、按照如下配比准备原料
2、将33-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷、核桃仁提取物、维生素C和蔗糖粉混合均匀制成颗粒后装袋，制成10000袋。
实施例14 33-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷口服液
1、按照如下配比准备原料
2、取33-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷、核桃仁提取物、黄芪提取物，用乙醇溶解后加入葡萄糖糖浆，最终加去离子水至100ml，即得。
实施例15 9-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷片剂
1、按照如下配比准备原料
2、将9-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷和淀粉混合均匀后，制成颗粒，加入滑石粉和硬脂酸镁混合均匀后压制成10000片。
实施例16 9-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷胶囊剂
1、按照如下配比准备原料
9-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷(纯度97％) 200g
淀粉 1000g
2、将9-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷和淀粉混合均匀后装胶囊，制成10000粒。
实施例17 9-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷胶囊剂
1、按照如下配比准备原料
9-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷(纯度98％) 500g
淀粉 1000g
2、将9-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷和淀粉混合均匀后装胶囊，制成10000粒。
实施例18 9-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷片剂
1、按照如下配比准备原料
2、将9-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷、黄芪提取物、维生素C和淀粉混合均匀后制粒，加入滑石粉和硬脂酸镁混匀后压制成10000片。
实施例19 9-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷胶囊剂
1、按照如下配比准备原料
2、将9-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷、党参提取物、维生素C和淀粉混合均匀后装胶囊，制成10000粒。
实施例20 9-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷颗粒剂
1、按照如下配比准备原料
2、将9-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷、核桃仁提取物、维生素C和蔗糖粉混合均匀制成颗粒后装袋，制成10000袋。
实施例21 9-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷口服液
1、按照如下配比准备原料
2、取9-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷、核桃仁提取物、川芎提取物，用乙醇溶解后加入葡萄糖糖浆，最终加去离子水至100ml，即得。
实施例22 33,34-亚甲基二氧-连翘脂素葡萄糖醛酸苷片剂
1、按照如下配比准备原料
2、将33,34-亚甲基二氧-连翘脂素葡萄糖醛酸苷和淀粉混合均匀后，制成颗粒，加入滑石粉和硬脂酸镁混合均匀后压制成10000片。
实施例23 33,34-亚甲基二氧-连翘脂素葡萄糖醛酸苷胶囊剂
1、按照如下配比准备原料
33,34-亚甲基二氧-连翘脂素葡萄糖醛酸苷(纯度97％) 200g
淀粉 1000g
2、将33,34-亚甲基二氧-连翘脂素葡萄糖醛酸苷和淀粉混合均匀后装胶囊，制成10000粒。
实施例24 33,34-亚甲基二氧-连翘脂素葡萄糖醛酸苷胶囊剂
1、按照如下配比准备原料
33,34-亚甲基二氧-连翘脂素葡萄糖醛酸苷(纯度98％) 500g
淀粉 1000g
2、将33,34-亚甲基二氧-连翘脂素葡萄糖醛酸苷和淀粉混合均匀后装胶囊，制成10000粒。
实施例25 33,34-亚甲基二氧-连翘脂素葡萄糖醛酸苷片剂
1、按照如下配比准备原料
2、将33,34-亚甲基二氧-连翘脂素葡萄糖醛酸苷、川芎提取物、维生素C和淀粉混合均匀后制粒，加入滑石粉和硬脂酸镁混匀后压制成10000片。
实施例26 33,34-亚甲基二氧-连翘脂素葡萄糖醛酸苷胶囊剂
1、按照如下配比准备原料
2、将33,34-亚甲基二氧-连翘脂素葡萄糖醛酸苷、党参提取物、维生素C和淀粉混合均匀后装胶囊，制成10000粒。
实施例27 33,34-亚甲基二氧-连翘脂素葡萄糖醛酸苷颗粒剂
1、按照如下配比准备原料
2、将33,34-亚甲基二氧-连翘脂素葡萄糖醛酸苷、核桃仁提取物、维生素C和蔗糖粉混合均匀制成颗粒后装袋，制成10000袋。
实施例28 33,34-亚甲基二氧-连翘脂素葡萄糖醛酸苷颗粒剂
1、按照如下配比准备原料
2、将33,34-亚甲基二氧-连翘脂素葡萄糖醛酸苷、核桃仁提取物、维生素C和蔗糖粉混合均匀制成颗粒后装袋，制成10000袋。
实施例29 33,34-亚甲基二氧-连翘脂素葡萄糖醛酸苷口服液
1、按照如下配比准备原料
2、取33,34-亚甲基二氧-连翘脂素葡萄糖醛酸苷、核桃仁提取物、川芎提取物，用乙醇溶解后加入葡萄糖糖浆，最终加去离子水至100ml，即得。
实施例30 连翘苷和连翘脂素组合物片剂制备
1、按照如下配比制备连翘苷/连翘脂素组合物的片剂：
2、取连翘苷490g、连翘脂素10g与淀粉混合均匀后，制成颗粒，加入滑石粉和硬脂酸镁混合均匀后压制成10000片。
实施例31 连翘苷/连翘脂素组合物颗粒剂制备
1、按照如下配比制备连翘苷/连翘脂素组合物的颗粒剂：
连翘苷/连翘脂素组合物(两者重量比为98:2) 100g
微晶纤维素 10000g
2、取连翘苷98g、连翘脂素2g与微晶纤维素混合均匀后，制成颗粒装袋，制成10000袋。
实施例32 连翘苷/连翘脂素组合物胶囊剂制备
1、按照如下配比制备连翘苷/连翘脂素组合物的胶囊剂：
连翘苷/连翘脂素组合物(两者重量比为98:2) 250g
淀粉 2500g
2、取连翘苷245g、连翘脂素5g与淀粉混合均匀后装胶囊，制成10000粒。
实施例33-36 连翘苷/连翘脂素组合物胶囊剂制备
实施例33-36中，连翘苷/连翘脂素组合物分别按下表的重量比与淀粉混合均匀后装胶囊，各制成10000粒胶囊。
实施例:37-40 连翘苷/连翘脂素组合物颗粒剂制备
实施例37-30中，连翘苷/连翘脂素组合物分别按下表的重量比与微晶纤维素混合均匀后，制成颗粒装袋，制成10000袋。
实施例41 连翘苷/连翘脂素组合物片剂制备
1、按照如下配比制备连翘苷/连翘脂素组合物的片剂：
2、称取连翘苷490g、连翘脂素10g与薏苡仁提取物粉末混合均匀，再与淀粉混合均匀后制成颗粒，加入滑石粉和硬脂酸镁混合均匀后压制成10000片。
实施例42 连翘苷/连翘脂素组合物颗粒剂制备
1、按照如下配比制备连翘苷/连翘脂素组合物的颗粒剂：
2、取连翘苷245g、连翘脂素5g与灵芝提取物、薏苡仁提取物粉末混合均匀，再与微晶纤维素混合均匀后制成颗粒装袋，制成10000袋。
实施例43 连翘苷/连翘脂素组合物胶囊剂制备
1、按照如下配比制备连翘苷/连翘脂素组合物的胶囊剂：
2、连翘苷245g、连翘脂素5g与天麻提取物、甘草提取物、核桃仁提取物粉末混合均匀，再与淀粉混合均匀后装胶囊，制成10000粒。
实施例44 连翘苷/连翘脂素组合物片剂制备
1、按照如下配比制备连翘苷/连翘脂素组合物的片剂：
2、取连翘苷490g、连翘脂素10g与甘草提取物粉末混合均匀，再与淀粉混合均匀后制成颗粒，加入滑石粉和硬脂酸镁混合均匀后压，制成10000片。
实施例45 连翘苷/连翘脂素组合物颗粒剂制备
1、按照如下配比制备连翘苷/连翘脂素组合物的颗粒剂：
2、取连翘苷900g、连翘脂素100g与上述提取物(川芎、党参)粉末混合均匀，再与微晶纤维素混合均匀后制成颗粒装袋，制成10000袋。
实施例46 连翘苷/连翘脂素组合物胶囊剂制备
1、按照如下配比制备连翘苷/连翘脂素组合物的胶囊剂：
2、连翘苷1880g、连翘脂素120g与上述提取物(川芎、人参、甘草)粉末混合均匀，再与淀粉混合均匀后装胶囊，制成10000粒。
试验例1 连翘苷、连翘苷衍生物对脂多糖激活的小胶质细胞合成环氧合酶-2和分泌前列腺素E2作用的实验研究
1、实验材料
1.1 药物与试剂
连翘苷，白色粉末，大连富生天然药物开发有限公司生产，经高效液相色谱两种检测器紫外检测器和蒸发光散射检测器面积归一化法测定，其纯度为99.5％，并用中国药品生物制品含量测定用连翘苷对照品标定和确认其含量为99.5％。批号：20130303。
33-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷(连翘苷衍生物A，含量＞98％)，白色粉末，大连富生天然药物开发有限公司生产，批号：20130301。经高效液相色谱两种检测器紫外检测器和蒸发光散射检测器面积归一化法测定，其纯度为98.5％。
9-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷(连翘苷衍生物B，含量＞98％)，白色粉末，大连富生天然药物开发有限公司生产，批号：20130302。经高效液相色谱两种检测器紫外检测器和蒸发光散射检测器面积归一化法测定，其纯度为99.2％。
33,34-亚甲基二氧-连翘脂素葡萄糖醛酸苷(连翘苷衍生物C，含量＞98％)，白色粉末，大连富生天然药物开发有限公司生产，批号：20130301。经高效液相色谱两种检测器紫外检测器和蒸发光散射检测器面积归一化法测定，其纯度为98.7％。
连翘脂素(含量＞98％)，白色粉末，大连富生天然药物开发有限公司生产，批号：20130301
连翘苷/连翘脂素组合物A，连翘苷(含量＞98％)，白色粉末，大连富生天然药物开发有限公司生产，批号：20130303；连翘脂素(含量＞98％)，白色粉末，大连富生天然药物开发有限公司生产，批号：20130301；连翘苷与连翘脂素的重量之比为98:2。
连翘苷/连翘脂素组合物B，连翘苷(含量＞98％)，白色粉末，大连富生天然药物开发有限公司生产，批号：20130303；连翘脂素(含量＞98％)，白色粉末，大连富生天然药物开发有限公司生产，批号：20130301；连翘苷与连翘脂素的重量之比为90:10。
阳性对照药：布洛芬片(山东新华制药股份有限公司，批准文号：国药准字H37020387，规格：每片重0.2g，批号20150314)。
脂多糖(LPS)购自北京擎日生物科技有限公司，批号：201511032。
BCA蛋白定量试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司，批号：21092015。；
ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，批号：EK0555。试剂盒中包含：①标准品；②预包被抗体的96孔板；③样品稀释液；④第一抗体稀释液；⑤酶标抗体工作液；⑥底物显色液；⑦洗涤缓冲液；⑧封板膜；⑨TMB终止液。
1.2 实验动物、细胞
雄性Wister大鼠，80只，体重270-300g，购自大连医科大学实验动物中心，质量合格证号：SCXK(13)2013-0003。
小鼠神经小胶质细胞BV-2购自中国医学科学基础研究所细胞中心(编号：3111C0001CCC00065)。
2、实验方法
2.1 小鼠小胶质细胞BV-2培养：
把BV-2细胞常规培养在含10％的胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中。5％CO2，37℃培养箱中培养，细胞生长至70％-80％汇合时传代培养，即培养到70％-80％的细胞汇合时细胞接种到新的培养基中继续培养。
2.2 正常大鼠血清及连翘苷含药大鼠血清的制备：
(1)雄性Wister大鼠，90只，体重270-300g，养于SPF级环境温度20-25℃，湿度(40％-70％)，光照12小时(7:00-19:00)，噪音量＜60分贝。(2)将大鼠随机分为9组，每组10只。连翘苷(LQG)组10只，连翘苷衍生物A(LQGYA)组10只，连翘苷衍生物B(LQGYB)组10只，连翘苷衍生物C(LQGYC)组10只，连翘苷/连翘脂素组合物A(HEA)组10只，连翘苷/连翘脂素组合物B(HEB)组10只，阳性对照布洛芬(BLF)组10只，连翘脂素(LQZS)组10只，空白对照组10只，在适应喂养24小时后开始灌胃给药，空白对照组灌胃给予等体积蒸馏水。每日灌胃给药2次，连续3天。(3)于末次灌胃后2小时时，颈动脉取血，分离出血清，56℃水浴内灭活30min，分装后放置-20℃冰箱保存备用，避免反复冻融，分别制得正常(空白)大鼠血清、含连翘苷含药大鼠血清、含连翘苷衍生物A含药大鼠血清、含连翘苷衍生物B含药大鼠血清、含连翘苷衍生物C含药大鼠血清、含连翘苷/连翘脂素组合物A含药大鼠血清、含连翘苷/连翘脂素组合物B含药大鼠血清、含布洛芬含药大鼠血清、含连翘脂素含药大鼠血清。
2.3 BV-2细胞培养液分组
(1)正常对照组：DMEM培养基+10％正常大鼠血清；(2)脂多糖组：DMEM培养基+10％正常大鼠血清+LPS(LPS终刺激浓度为1μg/ml)；(3)连翘苷高剂量组(LQG高)：DMEM培养基+LPS(LPS终刺激浓度为1μg/ml)+10％LQG含药血清；(4)连翘苷中剂量组(LQG中)：DMEM培养基+LPS(LPS终刺激浓度为1μg/ml)+5％LQG含药血清+5％正常大鼠血清；(5)连翘苷低剂量组(LQG低)：DMEM培养基+LPS(LPS终刺激浓度为1μg/ml)+2.5％LQG含药血清+7.5％正常大鼠血清；(6)连翘苷衍生物A高剂量组(LQGYA高)：DMEM培养基+LPS(LPS终刺激浓度为1μg/ml)+10％LQGYA含药血清；(7)连翘苷衍生物A中剂量组(LQGYA中)：DMEM培养基+LPS(LPS终刺激浓度为1μg/ml)+5％LQGYA含药血清+5％正常大鼠血清；(8)连翘苷衍生物A低剂量组(LQGYA低)：DMEM培养基+LPS(LPS终刺激浓度为1μg/ml)+2.5％LQGYA含药血清+7.5％正常大鼠血清；(9)连翘苷衍生物B高剂量组(LQGYB高)：DMEM培养基+LPS(终刺激浓度为1μg/ml)+10％LQGYB含药血清；(10)连翘苷衍生物B中剂量组(LQGYB中)：DMEM培养基+LPS(终刺激浓度为1μg/ml)+5％LQGYB含药血清+5％正常大鼠血清；(11)连翘苷衍生物B低剂量组(LQGYB低)：DMEM培养基+LPS(LPS终刺激浓度为1μg/ml)+2.5％LQGYB含药血清+7.5％正常大鼠血清；(12)连翘苷衍生物C高剂量组(LQGYC高)：DMEM培养基+LPS(LPS终刺激浓度为1μg/ml)+10％LQGYC含药血清；(13)连翘苷衍生物C中剂量组(LQGYC中)：DMEM培养基+LPS(LPS终刺激浓度为1μg/ml)+5％LQGYC含药血清+5％正常大鼠血清；(14)连翘苷衍生物C低剂量组(LQGYC低)：DMEM培养基+LPS(LPS终刺激浓度为1μg/ml)+2.5％LQGYC含药血清+7.5％正常大鼠血清；(15)连翘苷/连翘脂素组合物A高剂量组(HEA高)：DMEM培养基+LPS(LPS终刺激浓度为1μg/ml)+10％HEA含药血清；(16)连翘苷/连翘脂素组合物A中剂量组(HEA中)：DMEM培养基+LPS(LPS终刺激浓度为1μg/ml)+5％HEA含药血清+5％正常大鼠血清；(17)连翘苷/连翘脂素组合物A低剂量组(HEA低)：DMEM培养基+LPS(LPS终刺激浓度为1μg/ml)+2.5％HEA含药血清+7.5％正常大鼠血清；(18)连翘苷/连翘脂素组合物A高剂量组(HEB高)：DMEM培养基+LPS(LPS终刺激浓度为1μg/ml)+10％HEB含药血清；(19)连翘苷/连翘脂素组合物B中剂量组(HEB中)：DMEM培养基+LPS(LPS终刺激浓度为1μg/ml)+5％HEB含药血清+5％正常大鼠血清；(20)连翘苷/连翘脂素组合物B低剂量组(HEB低)：DMEM培养基+LPS(LPS终刺激浓度为1μg/ml)+2.5％HEB含药血清+7.5％正常大鼠血清；(21)布洛芬高剂量组(BLF高)：DMEM培养基+LPS(LPS终刺激浓度为1μg/ml)+10％BLF含药血清；(22)布洛芬中剂量组(HEB中)：DMEM培养基+LPS(LPS终刺激浓度为1μg/ml)+5％BLF含药血清+5％正常大鼠血清；(23)布洛芬低剂量组(HEB低)：DMEM培养基+LPS(LPS终刺激浓度为1μg/ml)+2.5％BLF含药血清+7.5％正常大鼠血清；(24)连翘脂素高剂量组(LQZS高)：DMEM培养基+LPS(LPS终刺激浓度为1μg/ml)+10％LQZS含药血清；(25)连翘脂素中剂量组(LQZS中)：DMEM培养基+LPS(LPS终刺激浓度为1μg/ml)+5％LQZS含药血清连翘脂素中剂量组(LQZS中)：DMEM培养基+LPS(LPS终刺激浓度为1μg/ml)+5％LQZS含药血清；(26)连翘脂素低剂量组(LQZS低)：DMEM培养基+LPS(LPS终刺激浓度为1μg/ml)+2.5％LQZS含药血清+7.5％正常大鼠血清。
上述各组培养液均经0.22微孔滤膜器过滤，置-20冰箱保存备用，避免反复冻融。
2.4 采用Western blot法检测小胶质细胞BV-2中COX-2蛋白的表达：
取对数生长期BV-2细胞以3.5×105/孔的密度接种于96孔培养板中，每孔加含10％FBS的DMEM完全培养剂约3ml，在5％CO2，37℃培养箱中培养过夜，在细胞贴壁后，按上述实验分组更换不同的培养液2.5ml，放置在5％CO2，37℃培养箱中继续培养24小时。
提取细胞总蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳后转印蛋白质进行免疫化学发光反应。
2.5 ELISA法检测小胶质细胞BV-2上清液中PGE2分泌量：
取对数生长期BV-2细胞以3.5×105/孔的密度接种于96孔培养板中，每孔加含10％FBS的DMEM完全培养剂约3ml，在5％CO2，37℃培养箱中培养过夜，在细胞贴壁后，按上述实验分组更换不同的培养液2.5ml，放置在5％CO2，37℃培养箱中继续培养24小时，吸取上清液，以转数1000r/离心5min，提取细胞上清液，获得细胞分泌的可溶性蛋白；
建立标准曲线，具体如下：
设ELISA试剂盒中的酶标包被板标准孔8个，每孔中各加入样品稀释液100μl，在第一孔加标准品100μl，混匀后再用加样器吸出100μl，移至第二孔。如此反复(混匀后再用加样器吸出100μl，移至下一孔)，对倍稀释(又称倍比稀释)至第七孔，最后从第七孔中吸取出100μl。第八孔为空白对照。稀释完成后，在450nm出测定吸光值(OD值)；
以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
在待测样品孔中每孔各加入细胞上清液100μl，每组设4个复孔；将反应板放置37℃环境下120min，洗板后加第一抗体工作液50μl，接着将反应板充分混均后放置37℃环境中60min，再洗板后加酶标抗体工作液，然后将反应板放置37℃环境下30min，再重复洗板，加底物显色液100μl，置37℃暗处反应10min后终止反应，最后在450nm出测定吸光值。
3、实验结果
3.1 连翘苷及相关衍生物含药血清对BV-2中COX-2蛋白表达的影响：蛋白印记方法检测各组小胶质细胞BV-2中COX-2蛋白表达的变化。以IOD比值作为COX-2蛋白表达的相对量。COX-2蛋白在正常组相对表达量为0.118±0.005，脂多糖组相对表达量为0.236±0.017，连翘苷各组与脂多糖对照组相比，不同剂量连翘苷治疗组COX-2表达水平均显著降低，实验结果见表1。
表1 各组BV-2中COX-2蛋白的表达(x±s)
与正常组比较，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01；与LPS组比较＊P＜0.01
3.2 连翘苷及相关衍生物含药血清对BV-2上清液PGE2分泌量的影响：ELISA法检测结果显示，脂多糖组BV-2S上清液中PGE2分泌量较正常对照组显著升高(P＜0.01)连翘苷及其衍生物各剂量组BV-2上清液中PGE2分泌量较脂多糖组显著降低(P＜0.01)，结果见表2。
表2 各组BV-2上清液中PGE2的分泌量(x±s)
与正常组比较，◇◇P＜0.01；与LPS组比较＊P＜0.01
4、实验结论
蛋白印记方法检测各组小胶质细胞BV-2中COX-2蛋白表达的变化。以IOD比值作为COX-2蛋白表达的相对量。由表1的实验结果可知：COX-2蛋白在正常组相对表达量为0.118±0.005，脂多糖组相对表达量为0.236±0.017，COX-2蛋白在脂多糖组表达水平升高，与正常对照组相比具有显著差异(P＜0.01)。
连翘脂素高剂量组相对表达量为0.226±0.007，连翘脂素中剂量组相对表达量为0.229±0.006，连翘脂素低剂量组相对表达量为0.232±0.004，与脂多糖对照组相比，不同剂量连翘脂素治疗组COX-2表达水平均无显著降低，其中高剂量组(P＜0.01)，中低剂量组(P＜0.05)；
连翘苷高剂量组相对表达量为0.211±0.004，连翘苷中剂量组相对表达量为0.222±0.005，连翘苷低剂量组相对表达量为0.228±0.011，与脂多糖对照组相比，不同剂量连翘苷治疗组COX-2表达水平均显著降低，其中高中剂量组(P＜0.01)，低剂量组(P＜0.05)；
连翘苷衍生物A高剂量组相对表达量为0.201±0.003，连翘苷衍生物A中剂量组相对表达量为0.212±0.007，连翘苷衍生物A低剂量组相对表达量为0.219±0.002。与脂多糖对照组相比，不同剂量连翘苷衍生物A治疗组COX-2表达水平均显著降低(P＜0.01)；
连翘苷衍生物B高剂量组相对表达量为0.202±0.005，连翘苷衍生物B中剂量组相对表达量为0.211±0.003，连翘苷衍生物B低剂量组相对表达量为0.223±0.006。与脂多糖对照组相比，不同剂量连翘苷衍生物B治疗组COX-2表达水平均显著降低(P＜0.01)；
连翘苷衍生物C高剂量组相对表达量为0.119±0.003，连翘苷衍生物C中剂量组相对表达量为0.212±0.004，连翘苷衍生物C低剂量组相对表达量为0.220±0.005。与脂多糖对照组相比，不同剂量连翘苷衍生物C治疗组COX-2表达水平均显著降低(P＜0.01)；
连翘苷/连翘脂素组合物A高剂量组相对表达量为0.208±0.002，连翘苷/连翘脂素组合物A中剂量组相对表达量为0.214±0.006，连翘苷/连翘脂素组合物A低剂量组相对表达量为0.222±0.003；与脂多糖对照组相比，不同剂量连翘苷/连翘脂素组合物A治疗组COX-2表达水平均显著降低(P＜0.01)；
连翘苷/连翘脂素组合物B高剂量组相对表达量为0.212±0.005，连翘苷/连翘脂素组合物B中剂量组相对表达量为0.219±0.004，连翘苷/连翘脂素组合物B低剂量组相对表达量为0.226±0.007；与脂多糖对照组相比，不同剂量连翘苷/连翘脂素组合物B治疗组COX-2表达水平均显著降低(P＜0.01)。
ELISA法检测结果显示(见表2)：脂多糖组BV-2上清液中PGE2分泌量较正常对照组显著升高(P＜0.01)；连翘苷及其衍生物各剂量组BV-2上清液中PGE2分泌量较脂多糖组显著降低(P＜0.01)；连翘脂素各剂量组BV-2上清液中PGE2分泌量较脂多糖组均无显著降低，连翘脂素对阿尔茨海默病、对脑痴呆等神经退行性疾病的治疗或预防作用不明显。
上述试验结果表明：连翘苷、连翘苷衍生物、连翘苷/连翘脂素组合物不同剂量均能够显著降低脂多糖刺激的BV-2中COX-2蛋白表达及显著降低上清液中PGE2分泌量，提示连翘苷、连翘苷衍生物，连翘苷/连翘脂素组合物能有效抑制脂多糖对小鼠神经小胶质细胞BV-2中环氧酶-2的产生及炎症因子的释放，从细胞水平为连翘苷及连翘苷衍生物作为脑痴呆等神经退行性疾病治疗药物提供依据，可用于缓解患者症状，阻滞痴呆进程。

Claims (10)

1.连翘苷、连翘苷衍生物、连翘苷与连翘脂素组合物在制备预防或/和治疗老年痴呆症药物或保健品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征是所述药物由连翘苷、连翘苷衍生物或连翘苷与连翘脂素组合物和药学上可接受的载体组成。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征是所述药物以片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂形式存在。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征是所述连翘苷、连翘苷衍生物的纯度为≥1％；连翘苷与连翘脂素组合物的含量≥1％。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征是所述连翘苷、连翘苷衍生物的纯度为1％～98％；连翘苷与连翘脂素组合物的含量为1％～98％。
6.一种预防或/和治疗阿尔茨海默病药物或保健品，其特征是含有连翘苷、连翘苷衍生物或连翘苷与连翘脂素组合物。
7.根据权利要求6所述的药物或保健品，其特征是所述连翘苷、连翘苷衍生物的纯度为≥1％；连翘苷与连翘脂素的组合物的含量≥1％。
8.根据权利要求6所述的药物或保健品，其特征是所述连翘苷、连翘苷衍生物或连翘苷与连翘脂素组合物的重量与所述药物或保健品的总重量之比为0.01-100：100。
9.根据权利要求6所述的药物或保健品，其特征是所述连翘苷与连翘脂素组合物选择连翘脂素和连翘苷与α-、β-或γ-环糊精或其衍生物相混合而成的混合物，或连翘脂素和连翘苷与α-、β-或γ-环糊精或其衍生物经物理、化学方法处理形成的复合物。
10.根据权利要求6所述的药物或保健品，其特征是还包括人参提取物、黄芪提取物、川芎提取物、薏苡仁提取物、灵芝提取物、天麻提取物、党参提取物、核桃仁提取物、甘草提取物、维生素C及其衍生物或维生素E及其衍生物中的一种或多种。
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