CN108310015A - 脐带间充质干细胞联合药物治疗高血糖和糖尿病肾病 - Google Patents

脐带间充质干细胞联合药物治疗高血糖和糖尿病肾病 Download PDF

Info

Publication number
CN108310015A
CN108310015A CN201810284530.1A CN201810284530A CN108310015A CN 108310015 A CN108310015 A CN 108310015A CN 201810284530 A CN201810284530 A CN 201810284530A CN 108310015 A CN108310015 A CN 108310015A
Authority
CN
China
Prior art keywords
radix
extract
umbilical cord
chinese
mesenchymal stem
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810284530.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108310015B (zh
Inventor
郭少娟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Hansheng Regenerative Medicine Technology Co ltd
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201810284530.1A priority Critical patent/CN108310015B/zh
Publication of CN108310015A publication Critical patent/CN108310015A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108310015B publication Critical patent/CN108310015B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/51—Umbilical cord; Umbilical cord blood; Umbilical stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/25—Araliaceae (Ginseng family), e.g. ivy, aralia, schefflera or tetrapanax
    • A61K36/258—Panax (ginseng)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/28—Asteraceae or Compositae (Aster or Sunflower family), e.g. chamomile, feverfew, yarrow or echinacea
    • A61K36/284—Atractylodes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/34—Campanulaceae (Bellflower family)
    • A61K36/344—Codonopsis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
    • A61K36/481—Astragalus (milkvetch)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
    • A61K36/482—Cassia, e.g. golden shower tree
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
    • A61K36/488—Pueraria (kudzu)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/53—Lamiaceae or Labiatae (Mint family), e.g. thyme, rosemary or lavender
    • A61K36/537—Salvia (sage)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/57—Magnoliaceae (Magnolia family)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/79—Schisandraceae (Schisandra family)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/80—Scrophulariaceae (Figwort family)
    • A61K36/804—Rehmannia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/81—Solanaceae (Potato family), e.g. tobacco, nightshade, tomato, belladonna, capsicum or jimsonweed
    • A61K36/815—Lycium (desert-thorn)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/88—Liliopsida (monocotyledons)
    • A61K36/896—Liliaceae (Lily family), e.g. daylily, plantain lily, Hyacinth or narcissus
    • A61K36/8969—Polygonatum (Solomon's seal)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/331—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using water, e.g. cold water, infusion, tea, steam distillation, decoction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/333—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using mixed solvents, e.g. 70% EtOH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/39—Complex extraction schemes, e.g. fractionation or repeated extraction steps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
    • A61K2236/51—Concentration or drying of the extract, e.g. Lyophilisation, freeze-drying or spray-drying
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
    • A61K2236/53—Liquid-solid separation, e.g. centrifugation, sedimentation or crystallization

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明提供一种脐带间充质干细胞联合中药提取物在制备治疗高血糖和糖尿病肾病药物中的应用。本发明中，通过将具有分化能力、且具有治疗糖尿病潜力的脐带间充质干细胞与具有降糖和改善肾脏状态并由于糖尿病引起的肾脏疾病有着抑制效果的中药提取物联用以制备用于治疗高血糖和糖尿病肾病的药物，从而可以有效控制血糖，并改善肾脏功能。

Description

脐带间充质干细胞联合药物治疗高血糖和糖尿病肾病
技术领域
本发明涉及高血糖和糖尿病肾病药物领域，具体而言，涉及脐带间充质干细胞联合多种与糖尿病治疗相关中药材在制备治疗高血糖和糖尿病肾病药物中的应用。
背景技术
根据世界卫生组织(WHO)预计，到2030年，糖尿病患者将从2010年的两亿八千五百万人增至四亿三千九百万。糖尿病也是对我国人群健康危害最为严重的疾病之一,糖尿病的各种急慢性并发症是导致糖尿病患者死亡的主要原因。糖尿病肾病是糖尿病患者最主要的微血管病变并发症之一,也是引起终末期肾功能衰竭的主要原因,如何有效防止和治疗糖尿病肾病仍然是糖尿病研究所面临的重要课题之一。
糖尿病肾病的病理生理学特征：微量蛋白尿是糖尿病肾病肾脏损伤的最早的临床表现，其形成主要与肾脏在组织学改变，如细胞外基质沉积、肾小球基底膜增厚以及肾小球系膜扩张有关。糖尿病肾病病程后期将出现大量蛋白尿，肾小球滤过率将进行性降低，肾脏组织学改变包括肾小球硬化、肾小管间隙纤维化以及动脉透明样变性。
目前糖尿病肾病的治疗方法有很多，包括控制血糖、血压和减少蛋白尿等。终末期患者可行肾脏替代治疗，包括血液透析和肾脏移植，而肾脏移植只有在同时进行胰岛B细胞移植的情况下才有效，否则肾衰竭将再次出现。血液透析对患者的生活质量有较大的影响，肾脏移植是现今治疗终末期肾脏疾病最有效的手段。然而肾源的短缺大大限制了肾移植的推广。肾脏是一种终末分化的器官，其再生潜能远远低于人体其他器官。肾脏功能并非由单个细胞执行，而是由不同功能的细胞组成一个单位来行使功能，这也使得肾脏的再生十分困难。
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)也称为多潜能间充质基质细胞，它为一种非造血成体干细胞，组织分布广，具有自我更新和分化能力。MSCs首先从骨髓中分离得到，随后从其他组织和器官也能获得，这些组织和器官包括毛囊、牙齿根、脑骨膜、软骨膜、真皮、脐血、脐带、胎盘、脂肪肌肉、肺、肝和脾脏。多项研究已经表明，体外培养的MSCs特异性表达造血细胞不表达的113种转录产物和17种蛋白。根据国际细胞治疗协会(ISCT)下属间充质和组织干细胞委员会所提出的定义人MSCs最低标准：a)在标准培养条件下，MSCs必须具有对塑料底物的黏附性；b)CD105、CD73、CD90呈阳性，CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19和HLA-DR呈阴性；c)在体外标准分化条件下，MSCs能分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。
间充质干细胞在各学科有很多探索性研究，近期也有基础研究证实肾脏细胞有再生潜能，干细胞治疗肾损伤，包括糖尿病肾病均有一些探索性研究。近来，脐带间充质干细胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,UCMSCs)越来越受到研究者的重视。脐带间充质干细胞具有自我更新和分化成不同细胞的能力。脐带间充质干细胞来源于脐带。脐带是胎儿分娩后的废弃物,来源广泛,不存在伦理学问题。另外,由于胎血屏障的存在,脐带受病毒污染的几率明显降低且取材过程无痛苦。更重要的是,脐带间充质干细胞连续多次传代仍可保持干细胞特性,易于长期培养并可冻存,增殖能力高,且安全有效。人脐带间充质干细胞可以在小鼠体内存在相当长的一段时间,单次注射不引起宿主的免疫反应。利用脐带间充质干细胞分化成特定功能性细胞的特性进行移植，可以替代体内不可逆丧失功能细胞，从而在一些目前尚无有效治疗手段的疾病如肿瘤、糖尿病、血液病、心肌坏死、帕金森氏病、脊髓损伤等的治疗方面，具有广阔的临床应用前景。应用干细胞技术治疗实验性糖尿病肾病已经在实验动物取得了较大的进展,并有可能成为未来治疗糖尿病的有效方法之一。
而传统中药材中多有扶正补气功效，现代药学研究表明，黄芪、枸杞、葛根、五味子、丹参等多种中药材具有各类活性成分，他们药用历史悠久，为历代中医中治疗糖尿病的常用的中药种类。
我国中医药防治糖尿病的研究理念，从传统的临床经验的经验医学向更加注重科学证据的医学发展。目前，从天然中药植物中发现了大量降血糖物质，主要包括多糖、黄酮和生物碱等。生物碱类化合物因其良好的降血糖作用而备受关注，在过去的二十年中，大量植物生物碱被提取分离，目前分离的生物碱有数千种，多数具有降血糖药理活性，已广泛应用于医学领域。然而，对其生理功能的吸收和代谢机制、活性基团抑制机理及稳定机制等还缺乏全面深入的了解。
目前糖尿病的西药治疗针对其病因，改善胰岛素抵抗，以及对胰腺β细胞功能的保护，选用能改善胰岛素抵抗的药物。这些药物主要是胰岛素增敏剂，可是长期服用这些增敏剂会引起患者水肿以及体重增加，极少数患者还会出现严重的肝损坏。而中药制剂则副作用较小，利于被患者接受，同时疗效显著。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明提供一种脐带间充质干细胞联合多种中药提取物在制备治疗高血糖和糖尿病肾病药物中的应用。本发明中，通过将具有分化能力、且具有治疗糖尿病潜力的脐带间充质干细胞与具有降糖和改善肾脏状态并由于糖尿病引起的肾脏疾病有着抑制效果的多种中药提取物联用以制备用于治疗高血糖和糖尿病肾病的药物，从而可以有效控制血糖水平，并改善肾脏功能。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
脐带间充质干细胞联合多种中药提取物在制备治疗高血糖和糖尿病肾病药物中的应用。
本发明中，通过将间充质干细胞与多种中药提取物联用，从而可以利用间充质干细胞的分化能力从而对损伤细胞进行补充；同时本发明中，通过使用多种中药提取物也能够进一步有效控制血糖水平，同时还能够对肾脏起到一定的保护作用，有效改善肾脏功能。
本发明中，所述脐带间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。
可选的，本发明中，所述应用还进一步包括培养脐带间充质干细胞，然后再将培养得到的脐带间充质干细胞与多种中药提取物联合应用的步骤。
可选的，本发明中，所述培养为将脐带间充质干细胞原代，或者冻存脐带间充质干细胞复苏后，在培养基中进行培养，然后再进行传代培养。
可选的，本发明中，所述培养基为含有FBS、青霉素以及链霉素的DMEM/F12培养基。
可选的，本发明中，所述FBS的含量为10％，青霉素和链霉素的浓度为100U/ml。
可选的，本发明中，所述传代培养是在5％CO2的培养箱中进行的。
可选的，本发明中，所述传代培养的温度为35～38℃；优选的，本发明中，所述传代培养的温度为36～37℃。
可选的，本发明中，所述应用还进一步包括将传代培养得到的脐带间充质干细胞消化后，得到稳定增殖细胞，并检测，然后再与多种中药提取物联合应用的步骤。
可选的，本发明中，所述消化为采用胰蛋白酶进行消化。
可选的，本发明中，所述胰蛋白酶的浓度为0.20％～0.25％；优选的，本发明中，所述胰蛋白酶的浓度为0.24％～0.25％。
可选的，本发明中，所述多种中药提取物是黄芪、人参、党参、丹参、三七、枸杞、葛根、五味子、白术、决明子、生地黄、黄精中的一种或多种的提取物。
可选的，本发明中，所述多种中药提取物是黄芪、人参、党参、丹参、三七、枸杞、葛根、五味子、白术、决明子中的一种或多种的提取物。
可选的，本发明中，其特征在于，所述多种中药提取物是黄芪、人参、丹参、三七、白术、五味子中的一种或多种的提取物。
可选的，本发明中，所述多种中药提取物是黄芪、人参、丹参、三七、白术、五味子上述任意6、5、4、3、2种的提取物。
可选的，本发明中，所述多种中药提取物是黄芪、人参、丹参三者中的一种或多种，再添加三七、白术的提取物。
可选的，本发明中，所述多种中药提取物是黄芪、人参、丹参三者中的一种或多种，再添加三七、白术、五味子的提取物。
可选的，本发明中，其特征在于，所述多种中药提取物是丹参、三七、白术的提取物。
适宜huMSCs和HMC增殖的中药提取物浓度为：黄芪0.1-10mg/ml、丹参0.1-10mg/ml、人参0.1-10mg/ml；优选的，黄芪、丹参、人参也可分别选用0.2、0.5、0.8、1、1.5、2、3、4、5、7、9mg/ml的添加浓度用于培养huMSCs或/和HMC增殖。上述中药提取物培养试剂可以分别使用培养细胞也可混合使用。上述中药提取物培养试剂还可与以下中药提取物混合使用培养细胞：添加五味子20-150ul/ml或/和白术10-50ul/ml用于培养huMSCs增殖；优选的五味子还可选用20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140ul/ml以及其他相似浓度作为中药提取物添加剂量，白术可选用20、30、40ul/ml以及其他相似浓度作为中药提取物添加剂量，与huMSCs或/和HMC共培养。
上述中药提取物加入的量及浓度均是采用如下提取方法获得的：
取人参、丹参、黄芪，切片，过滤，烘干研末，过80-120目筛，得细粉，备用；
五味子、三七粉碎，放入容器中，浸入6-16倍量体积浓度50-80％的乙醇溶液浸泡1-10小时，加热回流提取3次，每次1-6小时，滤过，合并滤液，减压蒸馏除去乙醇并浓缩至60℃相对密度为1.10-1.13的浓缩液备用；
白术以12倍、10倍和8倍量的水，分别煎煮提取三次，每次2h，合并三次水提液，真空减压浓缩至1g药材/ml提取液备用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明中，通过将具有分化能力、且具有治疗糖尿病潜力的脐带间充质干细胞与具有降糖和改善肾脏状态并由于糖尿病引起的肾脏疾病有着抑制效果的多种中药提取物联用以制备用于治疗高血糖和糖尿病肾病的药物，从而可以有效控制血糖水平，并改善肾脏功能。
从治疗糖尿病相关的传统中药组方中挑选十余味主药，将其中药提取物组合，筛选出能够与脐带间充质干细胞配合使用的，具有降糖和改善肾脏状态的中药提取组合物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为不同阶段的人间充质干细胞在显微镜下的细胞形态以及染色情况，其中A为未经诱导分化处理的人间充质干细胞在25×显微镜下观察到的细胞形态；B为经成脂诱导试剂诱导分化处理后人间充质干细胞在10×显微镜下观察到的细胞染色情况；C为经成骨诱导试剂诱导分化处理后人间充质干细胞在10×显微镜下观察到的细胞染色情况。
图2为人脐带间充质干细胞(huMSCs)在不同浓度的不同中药提取物条件下的增殖图。a为黄芪；b为人参；c为丹参；d为三七；e为白术；f为五味子。
图3为肾小球细胞(HMC)不同浓度的不同中药提取物条件下的增殖图。a为黄芪；b为人参；c为丹参；d为三七；e为白术；f为五味子。
图4为不同组合中药提取物条件下人脐带间充质干细胞与HMC共同培养的增殖图。
图5为空白对照组、人脐带间充质干细胞组和多种中药提取物混合处理huMSCs培养时，ELISA检测上清液FN和IV胶原蛋白含量图。
图6为不同组在0、30、60、120min下不同处理组小鼠血糖值。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1人脐带间充质干细胞培养及传代方法
将huMSCs(即人脐带间充质干细胞)经原代培养后置于含10％FBS、100U/ml青霉素和链霉素的DMEM/F12培养基中；然后，在37℃、5％CO2的培养箱中常规培养传代；将传代培养得到的细胞用0.25％胰蛋白酶消化，并收集稳定增殖细胞。
将106个收集得到的人脐带间充质干细胞悬浮在100ml含1％牛血清白蛋白的PBS缓冲溶液中,并用流式细胞术检测阳性抗体(CD90,CD105，CD73)和阴性抗体(CD45,CD34,CD11b,CD19和HLA-DR)表达情况。结果见图1，显示培养得到的人脐带间充质干细胞符合干细胞标准。
实施例2、中药提取物的制备
各中药提取物依据以下方法制备：
取人参、丹参、黄芪，切片，过滤，烘干研末，过80-120目筛，得细粉，备用。
五味子、三七粉碎，放入容器中，浸入6-16倍量体积浓度50-80％的乙醇溶液浸泡1-10小时，加热回流提取3次，每次1-6小时，滤过，合并滤液，减压蒸馏除去乙醇并浓缩至60℃相对密度为1.10-1.13的浓缩液备用。
白术以12倍、10倍和8倍量的水，分别煎煮提取三次，每次2h，合并三次水提液，真空减压浓缩至1g药材/ml提取液备用。
实验例3中药提取物对人脐带间充质干细胞和肾小球细胞生长的作用
选取生长状态良好的huMSCs(人脐带间充质干细胞)和HMC(肾小球细胞)分别以3×103个/孔接种于96孔板中，待细胞贴壁后，加入不同浓度的中药提取物共同培养，对照组不加中药提取物，调零孔不含细胞，只加100μL培养液，每组平行做5个复孔，各组培养达4h,24h,48h,72h后各加10μLCCK8溶液，37℃孵育4h后，选择490nm波长测定各孔吸光度(OD)值。根据cck-8结果测出的有效浓度。测试结果如图2、图3所示。
由检测结果可知黄芪、丹参、人参中药提取物能够有效促进huMSCs和HMC增殖，并不会对huMSCs和HMC产生抑制或者毒性作用；而五味子和白术对huMSCs和HMC增殖几乎没有影响，三七却意外发现对huMSCs和HMC增殖相比于对照组有明显的抑制作用。
实施例4、不同中药提取物混合组合对人脐带间充质干细胞生长的作用
培养和检测方法同实施例3，将不同中药提取物混合按下表的终浓度比例添加到100μL含有生长状态良好的huMSCs培养液中，观察人脐带间充质干细胞生长状况。
表1.不同中药提取物组合配比终浓度比例
结果如图4，三七抑制细胞生长效果明显，而黄芪、丹参、人参在浓度0.1-5mg/ml下与细胞生长速度呈正相关。
实施例5、huMSCs与HMC(肾小球细胞)共培养体系的建立及人脐带间充质干细胞联合中药提取物治疗实验
将HMC制成1xl06ml的细胞悬液接种于6孔培养板内,每孔2ml,待细胞贴附在6孔板并更换培养基后,用无菌镊子在6孔板中放入上层小室。
将实施例1中传代培养的人脐带间充质干细胞用0.25％胰蛋酶消化,制成人脐带间充质干细胞悬液,调整细胞浓度为1x106个/ml,接种到已预先在培养液中浸湿的套皿中,并置37℃、5％CO2培养箱中共培养,用无血清培养基饥饿细胞24h使其同步化,将培养后的人脐带间充质干细胞联合表1浓度的A-H组中药提取物组合处理。经以上处理48h后,收集各组细胞,同时收取细胞培养上清液于-20℃保存。
ELISA检测上清液FN、Ⅳ型胶原含量：提取各组上清液,在微孔反应板相应孔中分别加入待测样本,再加生物素化抗体工作液50txl。振荡混匀,置20-25℃环境中温育120min。将孔内液体吸干,用洗涤液充分洗涤5次,干燥。除空白孔外,加入酶结合物工作液l00ul。振荡混匀,置20-25℃环境中温育30min。将孔内液体吸干,洗涤液充分洗涤5次,干燥。每孔加入显色剂A、B各50ul,轻轻振荡混匀,37℃环境中避光显色l0min。加入终止液50ul后,轻轻振荡混匀。用酶标仪(450nm波长)测定各孔吸光度值。
结果如图5所示，在细胞水平上huMSCs能够对肾脏病变有改进作用，呈现FN和COL4的显著降低，且中药混合物的添加能够对huMSCs对肾脏病变的改善有促进作用。特别值得注意的是，在前述试验中验证了三七对于huMSCs细胞增殖有抑制作用，而低浓度三七提取液(终浓度10-30ul/ml)的添加可能在中药提取物组合中能够达到抑制纤维结合蛋白和Ⅳ型胶原生成的效果。
实验例6人脐带间充质干细胞联合多种中药提取物治疗实验
1)动物饲养
清洁级雄性Wistar大鼠60只，体重200～220g，由山东大学国家糖工程技术研究中心提供。
所有大鼠同室分笼饲养，自然光照，自由进食进水，饲养温度18～25℃，相对湿度40～50％，避免高分贝噪声；确保通风良好，1h/次，3次/d；勤换垫料，2-3次/周。饲养一周适应试验环境后开始做实验。造模前禁食12h，不禁水。
2)糖尿病模型制备
大鼠适应性饲养7d后，禁食不禁水12h，单次腹腔注射STZ(50mg·kg-1)诱发糖尿病，对照组动物腹腔注射等体积0.1mol/L枸橼酸盐缓冲液。注射STZ 3d后用血糖测定仪检测血糖，用尿糖试纸检测尿糖。血糖≥16.7mmol·L-1，尿糖≥+++列入糖尿病动物。
3)动物随机分组并给药干预治疗观察
实验动物随机分组，分别为对照组、模型组、A-H中药提取物组合联合治疗组，每组各6只。为了了解三七的添加对中药提取物组合是否能进一步提高huMSCs对肾脏病变的改进作用，添加D0和G0组进行对比。
其中，对照组为正常大鼠；模型组的实验对象为实验步骤2)中糖尿病模型大鼠，并不予治疗；MSC治疗组的实验对象为实验步骤2)中糖尿病模型大鼠，并予以人脐带间充质干细胞治疗；D0、G0治疗组的实验对象为实验步骤2)中糖尿病模型大鼠，并予以D、G中药提取物组合治疗，不使用人脐带间充质干细胞治疗；A-H中药提取物组合联合治疗组的实验对象为实验步骤2)中糖尿病模型大鼠，并予以人脐带间充质干细胞和多种中药提取物联合治疗；
每天分别给各组大鼠灌胃给药，给药剂量为中药组合物混合液：10ml/kg、MSC：2×106个/只。中药组合物混合液按照与表1相同的浓度配置。
4)葡萄糖耐量试验
于实验第6周末，将大鼠禁食6小时后，灌胃给予20％葡萄糖1ml·100g-1体重(相当2g·kg-1体重)，用JPS-3+型血糖仪分别测定空腹(0min)及服糖后30、60及120min的血糖含量，结果如下表2所示：
表2各组动物不同时间点的血糖值(mmol·L-1)(x±s)
由表2中结果可知，空白对照组大鼠具有正常糖调节能力。糖尿病组大鼠于给予葡萄糖后30～60min血糖一直处于高水平，到120min时血糖水平稍有下降，表明糖尿病大鼠的糖耐量明显降低，糖调节机能受损。在给药组中，D0和G0仅使用中药提取物处理，血糖值比糖尿病组降低显著；但使用huMSCs降低血糖效果更显著，说明分化的huMSCs相比单纯的中药提取物具有更好的潜在的改善糖尿病肾病效果。而A-H组配合huMSCs则治疗效果最佳，数据也明显体现了A-H的中药提取物组合配合huMSCs对血糖水平降低的显著效果。特别是G、H中药提取物组合，虽然证明三七提取物抑制huMSCs细胞水平增殖，但是三七与黄芪、丹参、人参及五味子和白术中药提取物的组合可以明显促进huMSCs对肾脏病变的改善作用。
结合以上检测结果可知，本发明中，使用A-H组中药提取物以及huMSCs均可以改善受损的大鼠调控血糖能力；与中药提取物以及huMSCs单独使用相比，中药提取物与huMSCs联合用药降血糖、改善肾功能效果更优；特别是发现了低浓度三七提取物在中药提取物组合中具有明显的改善辅助huMSCs减缓肾损伤，提高调解血糖能力。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (8)

1.脐带间充质干细胞联合多种中药提取物在制备治疗高血糖和糖尿病肾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用还进一步包括培养脐带间充质干细胞，然后再将培养得到的脐带间充质干细胞与多种中药提取物联合应用的步骤。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述多种中药提取物是黄芪、人参、党参、丹参、三七、枸杞、葛根、五味子、白术、决明子、生地黄、黄精中的一种或多种的提取物。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述多种中药提取物是黄芪、人参、丹参、三七、白术、五味子中的一种或多种的提取物。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述多种中药提取物是黄芪、人参、丹参、三七、白术、五味子的提取物。
6.根据权利要求3-5所述的应用，其中多种中药提取物组合的中药提取物方法是，取人参、丹参、黄芪，切片，过滤，烘干研末，过80-120目筛，得细粉，备用；
五味子、三七粉碎，放入容器中，浸入6-16倍量体积浓度50-80％的乙醇溶液浸泡1-10小时，加热回流提取3次，每次1-6小时，滤过，合并滤液，减压蒸馏除去乙醇并浓缩至60℃相对密度为1.10-1.13的浓缩液备用；
白术以12倍、10倍和8倍量的水，分别煎煮提取三次，每次2h，合并三次水提液，真空减压浓缩至1g药材/ml提取液备用。
7.根据权利要求6所述的应用，其中多种中药提取物组合配比是黄芪1-10mg/ml、丹参1-10mg/ml、人参1-10mg/ml，五味子20-150ul/ml和白术10-50ul/ml，以及三七0.1-30ul/ml。
8.根据权利要求6所述的应用，其中多种中药提取物组合配比是黄芪1-10mg/ml、丹参1-10mg/ml、人参1-10mg/ml，五味子20-50ul/ml和白术10-30ul/ml，以及三七10-30ul/ml。
CN201810284530.1A 2018-04-02 2018-04-02 脐带间充质干细胞联合药物治疗高血糖和糖尿病肾病 Active CN108310015B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810284530.1A CN108310015B (zh) 2018-04-02 2018-04-02 脐带间充质干细胞联合药物治疗高血糖和糖尿病肾病

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810284530.1A CN108310015B (zh) 2018-04-02 2018-04-02 脐带间充质干细胞联合药物治疗高血糖和糖尿病肾病

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108310015A true CN108310015A (zh) 2018-07-24
CN108310015B CN108310015B (zh) 2020-06-26

Family

ID=62899769

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810284530.1A Active CN108310015B (zh) 2018-04-02 2018-04-02 脐带间充质干细胞联合药物治疗高血糖和糖尿病肾病

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108310015B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108210518A (zh) * 2018-04-02 2018-06-29 郭少娟 脐带间充质干细胞联合药物治疗高血糖和糖尿病肾病

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106265740A (zh) * 2016-08-29 2017-01-04 吉林省中科生物工程股份有限公司 脐带间充质干细胞联合黄芪多糖在制备治疗高血糖和糖尿病肾病药物中的应用
CN106479968A (zh) * 2016-10-11 2017-03-08 海南博鳌龄迈迪精准医学研究院有限公司 脐带间充质干细胞的培养方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106265740A (zh) * 2016-08-29 2017-01-04 吉林省中科生物工程股份有限公司 脐带间充质干细胞联合黄芪多糖在制备治疗高血糖和糖尿病肾病药物中的应用
CN106479968A (zh) * 2016-10-11 2017-03-08 海南博鳌龄迈迪精准医学研究院有限公司 脐带间充质干细胞的培养方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108210518A (zh) * 2018-04-02 2018-06-29 郭少娟 脐带间充质干细胞联合药物治疗高血糖和糖尿病肾病
CN108210518B (zh) * 2018-04-02 2020-05-22 北京诺赛启研再生医学研究院有限公司 脐带间充质干细胞联合药物治疗高血糖和糖尿病肾病

Also Published As

Publication number Publication date
CN108310015B (zh) 2020-06-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106265740B (zh) 脐带间充质干细胞联合黄芪多糖在制备治疗高血糖和糖尿病肾病药物中的应用
CN108823156A (zh) 用于修复的临床级人脐带间充质干细胞复合因子及冻干粉的制备方法
CN105861430A (zh) 一种外泌体、外泌体的制备方法及其在制备治疗脓毒症药物或者制剂中的应用
CN105132369B (zh) 一种将间充质干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导剂及诱导培养基
CN103266081A (zh) 从脐带中分离培养间充质干细胞的高效方法
CN102676452A (zh) 一种含人脐带间充质干细胞分泌液的培养基及其制备方法和应用
CN104622902B (zh) 一种用于治疗肝纤维化的干细胞制剂
CN104988110A (zh) 脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法
CN106539821A (zh) 一种干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用
CN105833277A (zh) 治疗类风湿性关节炎的干细胞制剂及其制备方法和应用
US20210147797A1 (en) Cell line consecutively expressing hla g protein and method for preparing the same
CN106929470A (zh) 一种用于间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基
CN108865986A (zh) 用于修复关节软骨损伤/缺损的间充质干细胞制剂及其制备方法和应用
CN106566803A (zh) 一种培养液及其应用和培养脐带间充质干细胞的方法
CN106244521A (zh) 一种人羊膜上皮细胞、分离培养方法及用途
CN105456293A (zh) 一种用于治疗糖尿病的干细胞制剂及其制备方法
CN107779430A (zh) 脐带间充质干细胞上清液的收集方法
CN108310015A (zh) 脐带间充质干细胞联合药物治疗高血糖和糖尿病肾病
CN108324737A (zh) 脐带间充质干细胞联合药物治疗高血糖和糖尿病肾病
CN110292629B (zh) 己糖激酶1在延缓衰老中的应用
CN108210518A (zh) 脐带间充质干细胞联合药物治疗高血糖和糖尿病肾病
CN107320516A (zh) 白术在制备促进骨髓间充质干细胞增殖药物中的应用及药物
CN106282101A (zh) 一种促进人羊膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法及应用
CN101554422B (zh) 陈皮提取物在制备治疗肺纤维化药物中的应用
CN110731969A (zh) 一种间充质干细胞的制备及在制备疼痛药中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20200529

Address after: 518000 5th floor, building C1, Nanshan Zhiyuan, Xueyuan Avenue, Nanshan District, Shenzhen City, Guangdong Province

Applicant after: Shenzhen Hansheng Huirong Regenerative Medicine Technology Co.,Ltd.

Address before: 518000 Guangdong Shenzhen Longgang District Jinyun road Jinyun home 2 A block 3 unit 1005

Applicant before: Guo Shaojuan

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP03 Change of name, title or address

Address after: 518000, Building C1, Nanshan Zhiyuan, No. 1001 Xueyuan Avenue, Changyuan Community, Taoyuan Street, Shenzhen, Guangdong Province, China

Patentee after: Shenzhen Hansheng regenerative medicine Technology Co.,Ltd.

Address before: 518000, 5th floor, Building C1, Nanshan Zhiyuan, Xueyuan Avenue, Nanshan District, Shenzhen, Guangdong Province

Patentee before: Shenzhen Hansheng Huirong Regenerative Medicine Technology Co.,Ltd.

CP03 Change of name, title or address