CN105132369B - 一种将间充质干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导剂及诱导培养基 - Google Patents
一种将间充质干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导剂及诱导培养基 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于干细胞诱导分化技术领域，具体涉及间充质干细胞的定向分化诱导剂及培养基。一种将间充质干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导剂，含有阿司匹林、地塞米松、孕酮、白藜芦醇、胰岛素、甲状旁腺激素、维生素C、半胱氨酸。本发明的诱导培养基，以人间充质干细胞无血清培养基为基质，每1000ml诱导培养基中含有：阿司匹林1～2mmol、地塞米松0.1～0.3μmol、孕酮2～3μg、白藜芦醇30～50μmol、胰岛素10～30mg、甲状旁腺激素0.5～1.5nmol、维生素C 2～4mmol、半胱氨酸0.4～0.8mmol，余量为人间充质干细胞无血清培养基。本发明的将间充质干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导剂及诱导培养基诱导分化效率高；诱导后细胞活性强，可诱导间充质干细胞转化为睾酮分泌细胞，安全性高。
Description
技术领域
本发明属于干细胞诱导分化技术领域，具体涉及一种间充质干细胞定向分化诱导剂及培养基。
背景技术
睾酮又称睾丸素、 睾丸酮或睾甾酮，是一种类固醇荷尔蒙，由男性的睾丸间质细胞（Leydig细胞）或女性的卵巢分泌，肾上腺亦分泌少量睾酮，Leydig细胞分泌了男性睾酮总量的95%，睾酮在体内具有维持肌肉强度及质量、维持骨质密度及强度、提神及提升体能等作用。在胎儿出生后11天左右，睾丸中Leydig细胞从其干细胞（stem Leydig cells，SLCs）分化为成年型Leydig细胞，此时，在睾丸间质区可以检测到3β-羟类固醇脱氢酶（3β-HSD）的表达。3β-HSD是类固醇激素合成酶之一，也是Leydig细胞的标准物。
人类睾丸间质细胞功能下降时，睾酮分泌不足，造成成年男性性功能障碍、性欲减退、乏力、容易失眠、记忆力下降等。目前，对于人类睾丸间质细胞功能下降，有三种治疗方法：1、传统的雄激素替代疗法：存在一些缺点，如服用不便，患者难以长期坚持规律服用；药物作用时间短；血液中雄激素水平波动大，尤其是对于大多数的青少年病人；肝肾毒性大，被迫中断的病人多等。2、睾丸移植术：能在一定程度上能解决男性无睾症、小睾丸和性功能障碍等疾病，但睾丸是性器官，是能产生精子的器官，产生伦理学问题。3、睾丸间质细胞移植：虽能避免产生精子，基本上不受伦理学的限制，但是来源太少，提取及培养困难，临床应用受限。
随干细胞的研究与发展，人们都把目光转移到了干细胞上。间充质干细胞（MSC）是一种具有多向分化潜能的干细胞，在胚胎发育中来源于中胚层，在胚胎发育中期开始出现，之后几乎分布于机体的所有器官与组织中。成体MSC主要存在于骨髓，脂肪，骨膜下以及各个器官和组织中的血管周围。MSC具有分化为多种中胚层细胞系的潜能，包括成骨细胞，脂肪细胞，软骨细胞，基质细胞，成纤维细胞，肌腱细胞等。在机体正常的损伤修复过程中，MSC可以在趋化因子的诱导下，招募至损伤部位，在局部增殖、分化，并通过旁分泌作用参与损伤修复与组织再生。MSC来源广泛且没有伦理限制，易于分离和体外扩增，在经过多次分裂传代后仍保持多向分化潜能，至今为止的临床试验研究未发现MSCs有严重副作用，因此，MSC是一种非常理想的细胞治疗和再生医学的种子细胞。
目前，骨髓、脐带、胎盘、脂肪、羊膜等等都含有丰富的MSC。其中，脐带间充质干细胞来源广泛，无伦理问题，易于采集存储。而脂肪干细胞作为间充质干细胞的一种，是一种多能前体细胞，在体外可以被诱导向成骨，成软骨，成脂肪细胞分化。脂肪MSC不但来源广泛，容易取材，而且不存在伦理学问题和免疫排斥反应等问题，自体干细胞移植治疗睾丸间质细胞功能下降逐渐被人接受。
但是对于MSC向睾酮分泌细胞的分化方法目前研究的并不多，主要方法是：1、通过转染技术向细胞内引入固醇生成因子1（SF-1）或肝脏受体类似物1（LRH-1）并辅以维甲酸（RA）来诱导MSC分泌睾酮。SF-1在睾酮分泌中起到重要的调控作用，但是SF-1为孤儿核受体家族成员，其调控转录元件位于细胞核中，在调控过程中是以单体的形式结合于DNA上，属于胞内调控元件。 2、MSC与Leydig细胞共培养诱导为睾酮分泌细胞，Leydig细胞在培养过程中可以分泌多种因子及激素，整个诱导过程十分复杂，目前还无法确切得知诱导过程中涉及的信号转导途径。3、MSC注射到大鼠睾丸内，并对大鼠持续灌胃给药，淫羊藿苷可以诱导睾丸内的MSC向Leydig细胞分化，并分泌睾酮。淫羊藿苷是从淫羊藿的干燥茎叶中提取的有效成分，作为一种黄酮类化合物，具有增加心脑血管血流量、促进造血功能、免疫功能及骨代谢，还具有补肾壮阳、抗衰老等功效。研究发现雄性小鼠灌胃淫羊藿水煎液可升高血浆睾丸酮的含量，增加睾丸和提肛肌的重量。4、有研究者发现只用RA就可以诱导MSC分泌睾酮和雌二醇，但是文献中的实验组分泌量和对照组没有明显差异。在体内，Leydig细胞在人绒毛促性腺激素（HCG）的脉冲刺激下分泌睾酮，但是对体外培养的Leydig细胞加以刺激时50IU/ml的效果最好。
综上，目前诱导MSC分化睾酮分泌细胞（Leydig细胞）的诱导剂包括：RA、HCG、淫羊藿苷等的单独应用或者组合应用，但存在诱导效率不高，诱导后细胞活性不强等问题。
阿司匹林也叫乙酰水杨酸，分子式C9H8O4是一种历史悠久的解热镇痛药，诞生于1899年，具有解热、镇痛、抗炎、抗风湿和抗血小板聚集等多方面的药理作用，发挥药效迅速，药效肯定，超剂量易于诊断和处理，很少发生过敏反应。常用于感冒发热,头痛、神经痛关节痛、肌肉痛、风湿热、急性内湿性关节炎、类风湿性关节炎及牙痛等。其可能的机制为抑制COX2活性、抑制NF-κB和调整DNA错配，尤以抑制和调整COX2活性最为重要。与其他非甾体消炎药不同，阿司匹林在抑制COX2活性从而减少前列腺素合成的同时，还能激活该酶的另一功能，合成脂氧素。
白藜芦醇（resveratrol，Res）,化学名称为反式-3,4,5-三羟基-1,2-二苯乙烯，分子式C12H14O3，广泛存在于葡萄科、百合科植物中，具有抗氧化，保护血管，抗炎，调节血脂等等作用。
本发明人经过反复试验，意外发现阿司匹林和白藜芦醇联合，可以诱导间充质干细胞分化为leydig细胞。本发明首次证实阿司匹林和白藜芦醇联合可以大幅度提高间充质干细胞向Leydig细胞分化的效率。
半胱氨酸是谷胱甘肽（GSH）的关键氨基酸成分，是细胞内的一种巯基化合物，在氨基酸转运，蛋白质合成，细胞增殖和氧化还原方面起着重要作用。白藜芦醇、半胱氨酸、维生素C等等都是很好的抗氧化剂，可以很好保持诱导后细胞的活性。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种将间充质干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导剂，该诱导剂能够将间充质干细胞定向诱导分化为睾酮分泌细胞。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种将间充质干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导剂，含有阿司匹林、地塞米松、孕酮、白藜芦醇、胰岛素、甲状旁腺激素、维生素C、半胱氨酸。
本发明的另一个目的是提供一种将间充质干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导培养基，以人间充质干细胞无血清培养基为基质，每1000ml所述诱导培养基中含有：阿司匹林1～2 mmol、地塞米松0.1～0.3μmol、孕酮2～3μg、白藜芦醇30～50μmol、胰岛素10～30mg、甲状旁腺激素0.5～1.5nmol、维生素C 2～4mmol、半胱氨酸0.4～0.8mmol，余量为人间充质干细胞无血清培养基。
作为本发明的一种优选方式，所述的将间充质干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导培养基，每1000ml所述诱导培养基中含有：阿司匹林1.5mmol、地塞米松0.2μmol、孕酮2.5μg、白藜芦醇40μmol、胰岛素20mg、甲状旁腺激素1nmol、维生素C 3mmol、半胱氨酸0.6mmol，余量为人间充质干细胞无血清培养基。
本发明的将间充质干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导培养基，按上述组分配比混匀后过滤除菌即可。
本发明提供的将间充质干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导剂及诱导培养基，具有如下优点：1、无需细胞转染，故无基因改变及罹患癌症风险；2、诱导分化效率高，诱导后获得睾酮分泌细胞活性强；3、发扬中医中药的特色，可诱导间充质干细胞转化为睾酮分泌细胞，该睾酮分泌细胞移植后无排斥，无伦理问题，安全性高。
附图说明
图1 是3β-HSD染色阳性的细胞，细胞内可见棕黄色颗粒,（×200）。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实验所用器具仪器试剂皆可通过商业途径获得。
实施例1 一种将间充质干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导剂，含有：阿司匹林、地塞米松、孕酮、白藜芦醇、胰岛素、甲状旁腺激素、维生素C、半胱氨酸。
实施例2 本实施例的将间充质干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导培养基，将下列原料按其各自特性进行溶解，以人间充质干细胞无血清培养基为基质（LONZA，货号00190632），使各组分含量如下列定容至1000ml：阿司匹林（Sigma，A2093-100G）2 mmol、地塞米松（Sigma，D4902-25MG）0.1μmol、孕酮（Sigma，V900699-5g）2μg、白藜芦醇（Sigma，R5010-100MG）30μmol、胰岛素（Sigma， I0908）10mg、甲状旁腺激素（Sigma，P7036）0.5nmol、维生素C（Sigma，A5960-10mg）2mmol、半胱氨酸（Sigma ,861677-10G）0.4mmol。
实施例3 本实施例的将间充质干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导培养基，将下列原料按其各自特性进行溶解，以人间充质干细胞无血清培养基为基质（LONZA，货号00190632），使各组分含量如下列定容至1000ml：阿司匹林（Sigma，A2093-100G）1.5 mmol、地塞米松（Sigma，D4902-25MG）0.2μmol、孕酮（Sigma，V900699-5g）2.5μg、白藜芦醇（Sigma，R5010-100MG）40μmol、胰岛素（Sigma， I0908）20mg、甲状旁腺激素（Sigma，P7036）1nmol、维生素C（Sigma，A5960-10mg）3mmol、半胱氨酸（Sigma ,861677-10G）0.6mmol。
实施例4 采用实施例3制备的诱导培养基，对脂肪来源间充质干细胞（AD-MSC）进行睾酮分泌细胞诱导分化实验
1、脂肪间充质干细胞制备：
（1）接收脂肪组织，用75%的酒精擦拭装脂肪组织的容器外壁；
（2）分装脂肪组织，每一个T175 培养瓶分装脂肪组织为50ml。10ml移液管，去吸头，于脂肪采集瓶先吸取下层红色液体弃掉，剩余上层脂肪混匀后进行分装。
（3）洗涤脂肪组织，除去血细胞。向T175培养瓶中加入100ml氯化钠注射液，拧紧盖子，剧烈晃动3分钟以充分洗涤脂肪组织，接着静止3～5 分钟，使不同相分离，吸去下层水相；重复以上操作三次，直到下层液较为清澈。
（4）胶原酶I消化：加入等量新配制的预热（提前半小时于37℃的气浴摇床预热）的胶原酶I溶液（0.1%胶原酶I配制方法：称取0.1g胶原酶I粉末溶解于100ml未加任何因子的人间充质干细胞无血清培养基（LONZA， 00190632）中，用之前37℃预热），封口膜封口，剧烈晃动培养瓶5～10秒，置于振动气浴锅中，37℃，70rpm，消化60分钟，每隔15分钟剧烈晃动培养瓶5～10秒，直到看起来较为平滑。
（5）分离基质血管组分（SVF）：将消化后的组织用无菌40目滤网分装到50ml的离心管中，室温400g离心10分钟，得到的沉淀即为SVF。
（6）净化沉淀：离心后，SVF沉积于离心管底部，用移液管自上而下小心除去上层油脂和下层的胶原酶溶液。注意：在SVF沉淀上方留下少量的溶液，以免扰动沉淀细胞。适量生理盐水重悬细胞，吹散，室温400g，10分钟离心。离心完毕，小心吸去上清液，不能直接倒掉。吸取时移液管头应该置于离心管的上部以便于彻底的出去油。10ml培养基悬浮细胞，然后将细胞汇总到50ml离心管中，过100目筛，再次室温300g，10分钟离心。
（7）细胞种植：离心后加20ml培养基充分混匀。基于组织块法：根据培养瓶的面积进行细胞种植。按照每平方厘米接种0.16ml抽脂得到的脂肪量进行接种，即每个T75培养瓶中接种12ml抽脂脂肪量。即每100ml脂肪组织，最终可以接种8个T75培养瓶。进行未处理脂肪量和最终得到的细胞悬液换算，进而接种细胞。
（8）原代细胞培养：平置培养瓶，将培养瓶放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱。培养条件： (37±0.5)℃，二氧化碳体积分数为(5±0.2)% 。培养基：人间充质干细胞无血清培养基（LONZA， 00190632）。
（9）换液：原代培养第24小时，进行全量换液。此后每隔3天全量换液，放置二氧化碳恒温恒湿培养箱进行培养。
（10）原代细胞收获：7天左右，原代培养的细胞克隆团的面积百分比到达70%～80%时，消化收获。
（11）原代细胞收获：在培养瓶中加入消化酶（消化酶为0.125%Trypsin～0.01％EDTA溶液，使用前室温（20～25℃）放置15～25min，每75 cm2加入2ml消化酶溶液），消化时间为1.5～2.5min，加入培养基2～3ml反复吹打瓶底至细胞大部分脱落,移入50ml离心管中，原培养瓶中加入4～5ml氯化钠注射-液冲洗瓶壁，加入离心管中定容至50ml，移液管吹打悬浮后，100目无菌滤网过滤，过滤液收集到50ml离心管中，1000rpm，10min离心洗涤。
（12）原代细胞传代：观察单个离心管内余下细胞沉淀量，适当合并数个离心管中细胞沉淀至1个离心管中，加入适量培养基，轻轻吹打重悬浮细胞，定容至30ml，吹打混匀，取样计数。计数后1000rpm，10min二次离心。去除上清液，在离心管中加入培养基适量，轻轻吹打重悬浮细胞，定容后接种至新的培养容器中，传代细胞密度为5000～6000个/cm2，即（3.75～4.5）×105个cells/T75，按照4.5×105个cells/T75进行传代。在培养容器上标示细胞代数与培养时间等信息。将培养容器放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱开始培养。培养条件：二氧化碳恒温恒湿培养箱。条件：（37±0.5）℃，二氧化碳体积分数为（5±0.2）%。培养至细胞融合达85%～90%。
2、脂肪间充质干细胞的鉴定
（1）取P3代脂肪间充质干细胞，流式检测细胞表面标记，流式结果如表1。
表1 脂肪间充质干细胞表面标记物的检测
其中，阳性标记物CD29、CD73、CD90、CD49d表达大于95%，阴性标记物CD14、CD34、CD45、HLA-DR表达低于2%，证明为该细胞为脂肪间充质干细胞。
3、脂肪间充质干细胞向睾酮分泌细胞诱导分化：取P3的脂肪间充质干细胞以5*105/孔接种于6孔板中，过夜贴壁后换成本发明的诱导培养基连续诱导5d,同时设置空白对照组和阳性对照组。分组如表2所示。
表2 诱导分化分组
4、仔细观察细胞在诱导过程中的形态变化，在1d，2d，3d,4d,5d时取各个组的培养液，1100r/min离心5min，取上清液于-20℃保存，检测其中睾酮含量，并做统计学分析。按照睾酮（TES）ELISA试剂盒（德国DRG：EIA-1559）使用说明规定的操作，检测其中睾酮含量，结果见表3。
表3不同诱导剂的诱导效果比较
从表3的诱导结果可以看出，采用含有本发明诱导剂的培养基诱导脂肪间充质干细胞效率最高，诱导获得的细胞分泌睾酮最多。加入本发明诱导剂后，2d后开始缓慢持续分泌睾酮，且分泌量逐渐增加，约诱导第3～4d时即可达到睾酮每日分泌量最大，并且可以持续分泌。
5、免疫细胞化学染色：蒸馏水漂洗细胞爬片3 min，再以PBS液浸泡5 min。3%过氧化氢作用10 min，抑制内源性过氧化物酶；PBS漂洗后滴加1 ：100 比例稀释的鼠抗人3β-HSD，4℃过夜。次日，PBS冲洗3次，滴加生物素标记抗鼠IgG，室温孵育30min；PBS漂洗后加入50μL DAB显色10min，显微镜下控制显色。PBS冲洗，苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片。兔免疫前血清作为一抗阴性对照。结果判定是以胞浆内出现棕黄色为阳性细胞，空白组，实验组一和实验组二（阳性对照组）组每组细胞爬片均随机选取5个光镜下(×200)视野下计数3β-HSD染色阳性的细胞数目。试验重复3次。
结果：免疫细胞化学染色发现，空白对照组无3β-HSD染色阳性的细胞，本发明诱导分行培养基，3β-HSD染色阳性的细胞数目明显多于实验组二(阳性对照)，结果有统计学意义。图1示3β-HSD染色阳性的细胞，细胞内可见棕黄色颗粒。
实施例5 采用实施例3制备的诱导培养基，对脐带来源间充质干细胞（UC-MSC）进行睾酮分泌细胞诱导分化实验
1、脐带MSC的分离培养（组织块培养法）
（1）向脐带采集瓶中加入30ml生理盐水，初步洗涤脐带
（2）无菌镊子转移脐带至10cm无菌培养皿中，无菌手术剪将脐带剪成约2cm数段，加入生理盐水洗涤血凝块，直至基本去除血渍洗涤液较清澈。
（3）剔除血管：按血管螺旋走式剔除两条动脉，一条静脉。
（4）分离华通氏胶：位于羊膜与血管之间的白色结缔组织即为华尔通氏胶，用长柄有齿镊将其撕下，放入无菌平皿中。
（5）洗涤红细胞：向无菌平皿中加入10ml注射用水，洗涤胶体1min，共洗涤2次。
（6）胶体称重：将洗涤后的华通氏胶移入到50ml离心管中，称重记录。
（7）组织匀浆：用无菌长柄手术剪，在离心管中将组织剪切成1mm3左右的组织匀浆块，剪切时间15～20分钟。
（8）定容种瓶：根据胶体重量，加入适量脐带MSC专用培养基，定容组织匀浆浓度为0.4g/ml，电动移液器吹打匀浆均匀后，每75cm2接种1ml组织匀浆（即0.4g/75cm2），T75培养瓶中加入15ml脐带MSC无血清培养基（LONZA， 00190632），晃动培养瓶混匀后培养。
（9）培养条件：二氧化碳恒温恒湿培养箱，参数：（37±0.5）℃，二氧化碳体积分数为（5±0.2）%。
（10）原代培养：原代4～5天半量换液一次，（拟采用平板离心机，在培养瓶中初步离心后，移除半量培养基，加入半量新鲜培养基，重悬浮组织块培养），原代培养14～16天之后，P0代细胞密度达到80%～90%，消化传代。
（11）P0代细胞传代：消化酶为0.125%Trypsin-0.01％ EDTA溶液，每75 cm2加入1～1.5ml消化酶溶液，消化时间为40～60sec，加入无血清培养基2～3ml反复吹打瓶底，移入50ml离心管中，原培养瓶中加入5ml生理盐水冲洗瓶壁，加入离心管中定容至50ml，统计细胞总量。
（12）洗涤接种传代：离心参数，250g/min*15min，去除上清液后，加入新鲜培养液定容后接种新培养瓶中，传代细胞密度为(6～8) ×105/75cm2。
（13）细胞培养与传代：P1代后，每周换液2次，每3～4天传代，传代时细胞融合应在80%～90%，传代细胞密度为（6～8）×105/75cm2。
2、脐带间充质干细胞的鉴定
（1）取P3代脐带间充质干细胞，流式检测细胞表面标记，流式结果如表4。
表4 脐带间充质干细胞表面标记物的检测
其中，阳性标记物CD29、CD73、CD90、CD105表达大于95%，阴性标记物CD14、CD34、CD45、HLA-DR表达低于2%，证明该细胞为脐带间充质干细胞。
3、脐带间充质干细胞向睾酮分泌细胞诱导分化：取P3的脐带间充质干细胞以5*105/孔接种于6孔板中，过夜贴壁后换成本发明的诱导培养基连续诱导5d。同时设置空白对照组和阳性对照组。分组如表5所示。
表5 诱导分化分组
其中睾丸细胞条件培养液制备方法：将5～7d新生雄性昆明小鼠处死，无菌条件下取出睾丸组织，PBS液清洗2次，将睾丸组织剪碎成0.5mm3大小的组织块，并均匀装在含100ml/L胎牛血清H-DMEM的细胞培养瓶中，培养2周后收集细胞上清液，以后每隔3 d收集1次，培养到1个月时停止收集，收集的上清液1200 r/min离心10 min，去除少量组织碎块，微孔滤膜过滤，置无菌瓶中，置－20℃冰箱保存备用。
4、仔细观察细胞在诱导过程中的形态变化，在1d，2d，3d,4d,5d时取各个组的培养液，1100r/min离心5min，取上清液于-20℃保存，检测其中睾酮含量，并做统计学分析。按照睾酮（TES）ELISA试剂盒（德国DRG：EIA-1559）使用说明规定的操作，检测其中睾酮含量，结果见表6。
表6不同诱导剂的诱导效果比较
从表6的诱导结果可以看出，采用含有本发明诱导剂的培养基诱导脐带间充质干细胞效率最高，诱导获得的细胞分泌睾酮最多。加入本发明诱导剂后，2d开始缓慢持续分泌睾酮，且分泌量逐渐增加，约诱导第3～4d时可达到睾酮分泌量最大，并且可以持续分泌。本发明诱导剂睾酮分泌量明显优于睾酮条件培养液组。
5、同实施例4的方法，对各组进行免疫细胞化学染色。
结果：免疫细胞化学染色发现，空白对照组无3β-HSD染色阳性的细胞，本发明诱导分行培养基，3β-HSD染色阳性的细胞数目明显多于实验组二(即阳性对照)，结果有统计学意义。
Claims (3)
1.一种将间充质干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导剂，其特征在于：所述诱导剂含有阿司匹林、地塞米松、孕酮、白藜芦醇、胰岛素、甲状旁腺激素、维生素C、半胱氨酸；所述的诱导剂用于制备将间充质干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导培养基，其中各组分的配比为：以人间充质干细胞无血清培养基为基质，每1000mL所述诱导培养基中含有：阿司匹林1 ～2mmol、地塞米松0.1 ～ 0.3μmol、孕酮2 ～ 3μg、白藜芦醇30 ～ 50μmol、胰岛素10 ～30mg、甲状旁腺激素0.5 ～ 1.5nmol、维生素C 2 ～ 4mmol、半胱氨酸0.4 ～ 0.8mmol，余量为人间充质干细胞无血清培养基。
2.一种将间充质干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导培养基，以人间充质干细胞无血清培养基为基质，其特征在于：每1000mL所述诱导培养基中含有：阿司匹林1 ～ 2mmol、地塞米松0.1 ～ 0.3μmol、孕酮2 ～ 3μg、白藜芦醇30 ～ 50μmol、胰岛素10 ～ 30mg、甲状旁腺激素0.5 ～ 1.5nmol、维生素C 2 ～ 4mmol、半胱氨酸0.4 ～ 0.8mmol，余量为人间充质干细胞无血清培养基。
3.根据权利要求2 所述的将间充质干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导培养基，其特征在于：每1000mL所述诱导培养基中含有：阿司匹林1.5mmol、地塞米松0.2μmol、孕酮2.5μg、白藜芦醇40μmol、胰岛素20mg、甲状旁腺激素1nmol、维生素C 3mmol、半胱氨酸0.6mmol，余量为人间充质干细胞无血清培养基。
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Denomination of invention: The invention relates to an inducer and an induction medium for transforming mesenchymal stem cells into testosterone secreting cells Effective date of registration: 20220325 Granted publication date: 20180626 Pledgee: Qingdao Huitong Chinese financing Company limited by guarantee Pledgor: QINGDAO RESTORE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2022370010040 |
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Denomination of invention: An Inducing Agent and Inducing Medium for Transforming Mesenchymal Stem Cells into Testosterone Secreting Cells Effective date of registration: 20230329 Granted publication date: 20180626 Pledgee: Qingdao Huitong Chinese financing Company limited by guarantee Pledgor: QINGDAO RESTORE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2023370010033 |
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Granted publication date: 20180626 Pledgee: Qingdao Huitong Chinese financing Company limited by guarantee Pledgor: QINGDAO RESTORE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2023370010033 |
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Denomination of invention: An inducer and culture medium for transforming mesenchymal stem cells into testosterone secreting cells Granted publication date: 20180626 Pledgee: Qingdao Huitong Chinese financing Company limited by guarantee Pledgor: QINGDAO RESTORE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2024370010043 |