CN102925409A - 尿液间充质干细胞的提取及扩增培养方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种尿液间充质干细胞的提取及扩增培养方法和应用。通过从人的尿液中分离间充质干细胞，并在含有细胞生长因子的培养基中培养和扩增尿液间充质干细胞。用本发明提取及扩增培养的尿液间充质干细胞可修复多种组织器官损伤。本发明的优点是干细胞的来源广泛，简单易行，易于推广和实施。本发明尿液间充质干细胞的提取方法具有无创伤及来源广的特点，并且能诱导分化成多种细胞，在组织工程和再生医学中具有广泛的应用前景。

Description

尿液间充质干细胞的提取及扩增培养方法和应用

技术领域

本发明涉及细胞生物学及再生医学，特别涉及一种尿液间充质干细胞的提取及扩增培养方法和应用。

背景技术

再生医学和组织工程技术的发展为组织的再生和修复提供了新的手段和方法，但是其仍然面对很多挑战，其中选择合适的细胞来源就一直困扰着研究人员。目前再生医学和组织工程的种子细胞主要包括：自体或异体组织特异性细胞、成体多能干细胞、全能干细胞及诱导性多能干细胞等。自体细胞移植具有组织相容性高、安全等特点，但其来源有限，获取方法有创，并且可能会造成供区的功能障碍。异体细胞移植容易获取，避免了供区手术，但潜在的免疫排斥和疾病传播风险仍限制其应用。全能干细胞增殖潜能较高，但研究发现全能干细胞存在成瘤风险，并且很难控制其增殖分化。诱导性全能干细胞治疗无伦理和法律纷争，但对其技术要求较高，推广难度较大，其安全性尚有待进一步评估。

间充质干细胞是一类具有多向分化潜能及自我更新能力的成体干细胞，人们最早在骨髓中分离提取了间充质干细胞，后相继从脂肪、脐带、脐血等组织提取出间充质干细胞。在一定的诱导培养基中可分化为多种组织细胞：成骨细胞、软骨细胞、脂肪、神经细胞、血管内皮、肝细胞等。骨髓来源的间充质干细胞是研究得最多和应用最广泛的成体干细胞，但分离提取方法有创，成本较高，制约了其在临床和研究中的广泛应用。从尿液中分离提取间充质干细胞具有干细胞的多向分化和自我更新能力，其分离方法无创，容易获取，且便于自体移植从而避开免疫排斥问题，易于推广应用，为细胞治疗和组织工程提供了理想的种子细胞来源。

发明内容

本发明的目的之一，在于提供一种尿液间充质干细胞的提取及扩增培养方法。

本发明的另一目的，是提供尿液间充质干细胞的应用，将尿液间充质干细胞应用于骨和软骨缺损、中枢和周围神经损伤、股骨头缺血坏死、皮肤及血管损伤等的细胞治疗中。

为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案：一种尿液间充质干细胞的提取及扩增培养方法，包括以下步骤：

(1)尿液的获取：在无菌条件下，取健康人的清洁中段尿液200-250ml，加入5ml抗生素，立即进行下一步骤；

(2)初步离心：将清洁尿液分装至50ml离心管中，400g离心10min，弃上清；

(3)洗涤：用PBS洗涤沉淀后以400g离心10min，并重复该步骤一次；

(4)细胞计数、活性检测和培养：取100μL细胞重悬液并应用台盼蓝检测细胞活性并计数，调整细胞密度，接种至含有无血清培养基的六孔板中，置于细胞培养箱中培养；

(5)细胞扩增：在培养3-7天后在相差显微镜下观察，如观察到细菌污染则弃去，无污染则继续培养，可发现单个细胞贴壁生成，标记单个细胞在六孔板中的位置，再连续观察7-10天后，吸取原培养液，PBS洗涤尿液中的残渣，继续培养14-21天后，可以陆续观察到克隆逐渐向四周延伸，克隆逐渐变大，待细胞达到80％左右的融合度后，胰蛋白酶消化离心，重悬后得到间充质干细胞，传至另一六孔板中继续培养；

(6)细胞诱导分化：分别取5-10代的尿液间充质干细胞加入不同的细胞诱导分化培养基，诱导其向骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞或血管内皮细胞分化。

上述尿液间充质干细胞的提取及扩增培养方法，其中，所述抗生素为含有青霉素100U/ml和链霉素0.1mg/ml的抗生素。

上述尿液间充质干细胞的提取及扩增培养方法，其中，所述细胞培养箱的培养条件是：温度37℃，5％CO₂饱和湿度。

上述尿液间充质干细胞的提取及扩增培养方法，其中，所述无血清培养基为含有人表皮生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子-β、碱性成纤维细胞生长因子、皮质醇、硫酸庆大霉素-两性霉素B、胰岛素、转铁蛋白、肾上腺素或三碘甲状腺氨酸的培养基。

上述尿液间充质干细胞的提取及扩增培养方法，其中，所述的细胞诱导分化培养基包括成骨分化培养基、成软骨分化培养基、成脂肪分化培养基、神经分化培养基和成血管内皮分化培养基；成骨分化培养基诱导尿液间充质干细胞向骨细胞分化；成软骨分化培养基诱导尿液间充质干细胞向软骨细胞分化；成脂肪分化培养基诱导尿液间充质干细胞向脂肪细胞分化；神经分化培养基诱导尿液间充质干细胞向神经细胞分化；成血管内皮分化培养基诱导尿液间充质干细胞向血管内皮细胞分化。

上述尿液间充质干细胞的提取及扩增培养方法，其中，所述的成骨分化培养基为含有10-100mg/L维生素C、2-20mmol/L β-甘油磷酸钠、1-10nmol/L地塞米松的细胞诱导分化培养基；所述的成软骨分化培养基为含有10-100ng/ml转化生长因子-1(TGF-β1)、10-100ng/ml胰岛素生长因子-1(IGF-1)和4-40ng/ml地塞米松的细胞诱导分化培养基；所述的成脂肪分化培养基为含有10-100nmol/L地塞米松、50-500μmol/L异丁基甲基黄嘌呤、10-100μmol/L吲哚美辛的细胞诱导分化培养基；所述的神经分化培养基为含有2％二甲亚砜和200μmol/L羟基丁酸苯甲醚的细胞诱导分化培养基；所述的成血管内皮分化培养基为含有10-100μg/L血管内皮生长因子、5-50μg/L表皮生长因子、0.1-1μmol/L地塞米松的细胞诱导分化培养基。

尿液间充质干细胞的应用是，用于修复骨缺损或股骨头坏死、关节软骨损伤、中枢或外周神经损伤、皮肤损伤、血管损伤，以及由心脑血管疾病、呼吸系统疾病、消化系统疾病或泌尿系统疾病造成的相应组织器官损伤。

间充质干细胞具有自我更新和多向分化能力，是目前研究和使用最多的细胞。人间充质干细胞多来自骨髓、脂肪、脐血等组织，提取过程有创或来自异体，容易造成新的医源性损伤或免疫排斥。

本发明着重解决从尿液中分离、提取、扩增间充质干细胞并对其鉴定，并使用尿液间充质干细胞来修复骨、软骨、中枢神经及皮肤组织的缺损或损伤。

本发明提供的分离培养尿液间充质干细胞的方法包括尿液离心离心和利用含有细胞因子的培养基扩增尿液间充质干细胞。使用的细胞因子包括：人表皮生长因子(human epidermal growth factor，hEGF)、胰岛素样生长因子(insulin-like growthfactor，IGF)，转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、皮质醇(hydrocortisone)、硫酸庆大霉素-两性霉素B、胰岛素(insulin)、转铁蛋白(transferrin)、肾上腺素(epinephrine)、三碘甲状腺氨酸(triiodothyronine，T3)等。在上述细胞因子的作用下，单个贴壁的细胞逐渐形成克隆，并逐渐增大。

本发明原代培养所获取的原代细胞可能具有多个细胞形态，其中选取长梭形的单个细胞形成的克隆并培养扩增，传代消化后细胞仍保持原来的细胞形态。

本发明中的尿液来源的干细胞类型具有明显的间充质干细胞的表面标志物，包括强表达间充质干细胞表面标志物CD73、CD29、CD90、CD44和CD105；不表达造血干细胞和内皮细胞的表面标志物CD45、CD34和CD133。

本发明分离培养得到的尿液来源的间充质干细胞在特殊的诱导分化培养基的诱导下能分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和神经细胞等多个细胞系，具有多向分化潜能。本发明获得的间充质干细胞经过冷冻保存复苏后仍保存多向分化潜能。

本发明的尿液间充质干细胞的一个显著优点是自体移植时，无免疫排斥反应的疾病传播的风险。尿液间充质干细胞在显示出良好的扩增能力，能满足细胞治疗时所需的细胞数量，且本发明提供的方法简单易行，可操作性强，本行业内具有普通技能的人士能按照本发明提供的方案很容易的掌握尿液间充质干细胞的培养扩增方法。因此，尿液间充质干细胞在组织工程和再生医学中具有广阔的应用前景。

本发明另一个突出优势是尿液来源广泛，提取过程无需特殊仪器，并且完全无创。自体来源的尿液提取分离得到的细胞移植后无免疫排斥反应，又能避免胚胎干细胞面临的伦理和道德争议。

本发明利用多个生长因子来扩增尿液间充质干细胞。同时，本发明采用多个生长因子来诱导分化尿液间充质干细胞为多系细胞。本发明所使用的生长因子包括：人表皮生长因子(human epidermal growth factor，hEGF)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)，转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、皮质醇(hydrocortisone)、硫酸庆大霉素-两性霉素B、胰岛素(insulin)、转铁蛋白(transferrin)、肾上腺素(epinephrine)、三碘甲状腺氨酸(triiodothyronine，T3)、维生素C、β-甘油磷酸钠、地塞米松(Dexamethasone)、转化生长因子-1(TGF-β1)、胰岛素生长因子-1(IGF-1)、地塞米松(Dexamethasone)、异丁基甲基黄嘌呤(Isobutylmethylxanthine)、吲哚美辛(Indomethacin)、2％二甲亚砜(Dimethyl sulfoxide)、羟基丁酸苯甲醚(Hydroxybutyrate anisole)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor)和地塞米松(Dexamethasone)。

本发明通过慢病毒将绿色荧光蛋白(GFP)转染至尿液间充质干细胞中，通过免疫荧光技术可以示踪在尿液间充质干细胞在体内存活和功能状态，可以更好的监测或跟踪尿液间充质干细胞在体内的游走和迁移。经测定转染慢病毒后细胞的增殖和活性未受明显影响。

本发明的尿液间充质干细胞可以用来治疗骨或软骨缺损、中枢或周期神经损伤、股骨头缺血坏死、皮肤缺损或溃疡以及包括心脑血管疾病、呼吸系统疾病、消化系统疾病、泌尿系统疾病等造成的相应组织器官损伤。在多组织多系统的再生和修复中都能发挥很好的作用，是组织工程和再生医学中种子细胞的理想选择。

本发明分离提取过程简易，原料来源广泛，获得的尿液间充质干细胞具有良好的增殖和多向分化潜能，在多个组织和器官的再生和修复中都显示出广阔的应用前景。

本发明尿液间充质干细胞的提取方法的一个显著优点是分离和提取的过程完全无创，因此能避免了从骨髓、脂肪、胎盘、滑膜液中提取间充质干细胞造成供区缺损和损伤，便于自体取材移植，因此也能避免免疫排斥反应和疾病传播的风险。体外和体内的实验都证实了尿液间充质干细胞具有很强的扩增能力，在加入了特殊的培养基后能分化成多种细胞系，在多个系统和组织疾病的治疗当中都显示出广阔的应用前景。从尿液中提取间充质干细胞简单易行，学习曲线较短，组织工程和再生医学的初级的研究人员都能很容易将其应用到科研和临床当中。

本发明无需复杂操作，仅仅需要清洁中段尿就能分离到间充质干细胞，细胞来源广泛，又无胚胎干细胞所面临的伦理和法律争议。本发明中所涉及的专业术语都是本行业规范和通用术语，具备本行业初级技能的人士都能理解。常用的术语在医学和分子生物学的书中都能查询到。

附图说明

图1显示人尿液间充质干细胞在培养基中5天后出现单个贴壁细胞；

图2显示人尿液间充质干细胞在培养基中10-14天后逐渐呈克隆样生长；

图3、图4显示原代细胞传代后，细胞增殖旺盛，呈长梭形生长，形态与成纤维细胞相似，其中，图3为P3代培养细胞，图4为P4代培养细胞；

图5、图6、图7、图8、图9、图10、图11为流式细胞仪检查细胞表面特异性标志物结果；其中，图5为CD73，图6为CD29，图7为CD90，图8为CD44，图9为CD45，图10为CD34，图11为CD133；

图12显示成骨诱导21天后尿液间充质干细胞出现成骨细胞的形态改变，茜素红染色显示尿液间充质干细胞成骨诱导后出现大量骨结节；

图13显示成脂诱导28天后，油红O染色示细胞内有大量的脂肪颗粒；

图14显示成神经诱导7天后荧光显微镜示神经样细胞形态；

图15显示经慢病毒将绿色荧光蛋白GFP转染到尿液间充质干细胞内，荧光显微镜示荧光表达稳定。

具体实施方式

实施例1

从清洁中段尿液中分离和提取尿液间充质干细胞：

在无菌条件下，取健康志愿者清洁中段尿液200-250ml，为防止感染，加入含有青霉素100U/ml+链霉素0.1mg/ml的双抗5ml，并立即分离提取。将清洁尿液分装至50ml离心管中，400g离心10min，弃上清。经PBS以400g离心10min洗涤两次。取100μL细胞重悬液并应用台盼蓝检测细胞活性并计数，调整细胞密度，接种至含有无血清培养基的六孔板中，置于37℃下5％CO₂饱和湿度的孵箱中培养。

在培养3-7天后在相差显微镜下观察，如观察到细菌污染则弃去，无污染则继续培养，可发现单个细胞贴壁生成，标记单个细胞在六孔板中的位置，以便连续观察。7-10天后，吸取原培养液，PBS洗涤尿液中的残渣。继续培养，14-21天后，可以陆续观察到克隆逐渐向四周延伸，克隆逐渐变大。待细胞达到80％左右的融合度后，胰蛋白酶消化离心，重悬后得到尿液间充质干细胞，传至另一六孔板中。如此传代培养十余代的尿液间充质干细胞仍然保持旺盛的增殖能力。光镜下观察，原代培养的尿液间充质干细胞呈克隆样生长(见图1、图2)，传代培养的尿液间充质干细胞呈成纤维状(见图3、图4)。经流式细胞术分析，传代培养的尿液间充质干细胞均表达CD73、CD29、CD90、CD44，不表达CD34、CD45、CD133，表达阳性率见图5至图11。结果表明所分离培养的尿液细胞完全符合间充质干细胞的特征，为尿液间充质干细胞。

实施例2

尿液间充质干细胞向骨细胞的分化：

(1)取实施案例1所获得的尿液间充质干细胞第四代培养

(2)向尿液间充质干细胞中加入含有地塞米松0.1μmol/L，维生素D310nmol/L，β-磷酸甘油10mmol/L的诱导培养基进行诱导培养，1周两次换液。

(3)经过诱导分化后21天后，行茜素红染色观察钙结节，RT-PCR检测骨桥蛋白、骨钙蛋白、骨形态发生蛋白等的表达。

结果显示，诱导后的细胞出现大量钙结节(见图12)，骨桥蛋白、骨钙蛋白、骨形态发生蛋白等基因表达水平明显上升，表明尿液间充质干细胞可以向成骨细胞分化。

实施例3

尿液间充质干细胞向软骨细胞的分化：

(1)取实施案例1所获得的尿液间充质干细胞第四代培养

(2)向尿液间充质干细胞中加入含有转化生长因子β110ng/ml、胰岛素样生长因子100ng/ml和地塞米松0.1μmol/L的诱导培养基

(3)诱导培养28天后，阿尔新蓝染色细胞细胞外基质，免疫组化检测II型胶原表达情况。

结果显示，诱导培养后的尿液间充质干细胞大部分阿尔新蓝着色，II型胶原表达增强，表明尿液间充质干细胞可以向软骨细胞分化。

实施例4

尿液间充质干细胞向脂肪细胞分化：

(1)取实施案例1所获得的尿液间充质干细胞第四代培养

(2)向尿液间充质干细胞中加入含有3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5Mm、地塞米松1μM、胰岛素10μM、吲哚美辛200μM的诱导培养基进行诱导培养。

(3)培养21天后，油红O染色，RT-PCR检测成脂相关基因。

结果油红O染色可见大量脂肪颗粒(见图13)，成脂相关基因显著上调，表明尿液间充质干细胞可以向脂肪细胞分化。

实施例5

尿液间充质干细胞向神经细胞分化：

(1)取实施案例1所获得的尿液间充质干细胞第四代培养

(2)向尿液间充质干细胞中加入含有20ng/ml上皮生长因子，40ng/ml成纤维细胞生长因子，1％非必需氨基酸，1％左旋谷氨酸盐，2％B27补充液，1％胰岛素-转铁蛋白的诱导培养基进行培养。

(3)培养7天后，显微镜下观察细胞形态变化，RT-PCR检测成神经相关基因nestin、GFAP等的表达变化。

结果经诱导培养后的尿液间充质干细胞形态发生明显改变，细胞边缘折光度明显增强，生长轴突，呈神经细胞样(见图14)。经PCR测定，诱导后的尿液间充质干细胞nestin及GFAP等基因表达显著上调。表明尿液间充质干细胞可以向神经细胞分化。

实施例6

复合尿液间充质干细胞的组织工程骨修复大段骨缺损

制作30只SD大鼠5mm股骨缺损模型，并随机分为A、B组：A组，单纯植入β-TCP；B组，植入复合有尿液间充质干细胞的β-TCP。术后4、8、12周分批处死动物，行一般情况、缺损区大体观察、X线、micro-CT、组织学染色分析及免疫组织化学染色检测骨折愈合情况，比较各组修复骨缺损的效果。结果显示复合尿液间充质干细胞材料组的骨缺损能完全愈合，能明显促进大段骨缺损的修复。

实施例7

复合尿液间充质干细胞的水凝胶制备组织工程化软骨：

将传代培养的、细胞终浓度为1×10⁷/mL的尿液间充质干细胞种植到水凝胶，于体外成软骨诱导培养1周后移植到裸鼠背部，培养3周后取出水凝胶行HE染色、阿尔新蓝染色，免疫荧光检测，了解尿液间充质干细胞生长分化情况。结果显示尿液间充质干细胞在水凝胶中生长良好，且在4周时出现类软骨变化。因此尿液间充质干细胞在体外3D条件下可用于构建组织工程化软骨。

实施例8

复合尿液间充质干细胞的神经组织工程修复中枢神经损伤：

取第四代培养的尿液间充质干细胞进行携带绿色荧光蛋白GFP的慢病毒转染，获得稳定表达GFP的尿液间充质干细胞(见图15)，将带有GFP标志终浓度为1×10⁷/mL的尿液间充质干细胞种植到水凝胶，在水凝胶3D培养的条件下向神经细胞诱导培养一周后，植入皮质缺损的大鼠脑缺损处，2周后进行脑组织切片，HE染色，免疫荧光检测，了解尿液间充质干细胞在脑组织中的生长、迁移及分化情况。结果显示尿液间充质于细胞在脑缺损部位能够存活、增殖并表达神经细胞标志。表明尿液间充质干细胞可用于修复中枢神经系统损伤。

实施例9

尿液间充质干细胞治疗股骨头缺血坏死：

建立30只新西兰大白兔激素性股骨头缺血性坏死模型，并随机分为A、B、C三组，A组为对照组无任何治疗措施，B组行单纯髓芯减压组，C组行单纯髓芯减压联合植入尿液间充质干细胞组。术后4周、8周和12周对股骨头行组织学检查。结果：组织形态学检测发现术后8周和12周C组坏死修复区新骨面积比和新生血管数量显著高于两个对照组，差异有统计学意义(P＜0.05，p＝0.034)。结论：尿液间充质干细胞可促进股骨头缺血性坏死的骨修复，对股骨头缺血性坏死有治疗作用。

实施例10

复合尿液间充质干细胞的材料修复皮肤缺损

建立新西兰大白兔皮肤缺损模型，随机将其分为对照组和治疗组。治疗组采用尿液间充质干细胞局部注射移植皮肤缺损处，4、8、12、16天分别从大体观察、组织切片、免疫组织化学等进行研究，分析尿液间充质干细胞对新西兰大白兔皮肤缺损处伤口愈合的作用。结果发现治疗组创面愈合时间比对照组短，两组新西兰大白兔伤口愈合时间分别为16天和20天，结果显示局部移植尿液间充质干细胞的新西兰大白兔创面面积在4、8、12、16天明显小于对照组的(p＜0.05)。结果证实尿液间充质干细胞能促进新西兰大白兔皮肤全层缺损后伤口的愈合。

Claims (7)

1.一种尿液间充质干细胞的提取及扩增培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)尿液的获取：在无菌条件下，取健康人的清洁中段尿液200-250ml，加入5ml抗生素，立即进行下一步骤；

(2)初步离心：将清洁尿液分装至50ml离心管中，400g离心10min，弃上清；

(3)洗涤：用PBS洗涤沉淀后以400g离心10min，并重复该步骤一次；

(4)细胞计数、活性检测和培养；取100μL细胞重悬液并应用台盼蓝检测细胞活性并计数，调整细胞密度，接种至含有无血清培养基的六孔板中，置于细胞培养箱中培养；

(5)细胞扩增：在培养3-7天后在相差显微镜下观察，如观察到细菌污染则弃去，无污染则继续培养，可发现单个细胞贴壁生成，标记单个细胞在六孔板中的位置，再连续观察7-10天后，吸取原培养液，PBS洗涤尿液中的残渣，继续培养14-21天后，可以陆续观察到克隆逐渐向四周延伸，克隆逐渐变大，待细胞达到80％左右的融合度后，胰蛋白酶消化离心，重悬后得到间充质干细胞，传至另一六孔板中继续培养；

(6)细胞诱导分化：分别取5-10代的尿液间充质干细胞加入不同的细胞诱导分化培养基，诱导其向骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞或血管内皮细胞分化。

2.根据权利要求1所述的尿液间充质干细胞的提取及扩增培养方法，其特征在于：所述抗生素为含有青霉素100U/ml和链霉素0.1mg/ml的抗生素。

3.根据权利要求1所述的尿液间充质干细胞的提取及扩增培养方法，其特征在于：所述细胞培养箱的培养条件是：温度37℃，5％CO₂饱和湿度。

4.根据权利要求1所述的尿液间充质干细胞的提取及扩增培养方法，其特征在于：所述无血清培养基为含有人表皮生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子-β、碱性成纤维细胞生长因子、皮质醇、硫酸庆大霉素-两性霉素B、胰岛素、转铁蛋白、肾上腺素和三碘甲状腺氨酸的培养基。

5.根据权利要求1所述的尿液间充质干细胞的提取及扩增培养方法，其特征在于：所述的细胞诱导分化培养基包括成骨分化培养基、成软骨分化培养基、成脂肪分化培养基、神经分化培养基和成血管内皮分化培养基；成骨分化培养基诱导尿液间充质干细胞向骨细胞分化；成软骨分化培养基诱导尿液间充质干细胞向软骨细胞分化；成脂肪分化培养基诱导尿液间充质干细胞向脂肪细胞分化；神经分化培养基诱导尿液间充质干细胞向神经细胞分化；成血管内皮分化培养基诱导尿液间充质干细胞向血管内皮细胞分化。

6.根据权利要求5所述的尿液间充质干细胞的提取及扩增培养方法，其特征在于：所述的成骨分化培养基为含有10-100mg/L维生素C、2-20mmol/L β-甘油磷酸钠、1-10nmol/L地塞米松的细胞诱导分化培养基；所述的成软骨分化培养基为含有10-100ng/ml转化生长因子-1(TGF-β1)、10-100ng/ml胰岛素生长因子-1(IGF-1)和4-40ng/ml地塞米松的细胞诱导分化培养基；所述的成脂肪分化培养基为含有10-100nmol/L地塞米松、50-500μmol/L异丁基甲基黄嘌呤、10-100μmol/L吲哚美辛的细胞诱导分化培养基；所述的神经分化培养基为含有2％二甲亚砜和200μmol/L羟基丁酸苯甲醚的细胞诱导分化培养基；所述的成血管内皮分化培养基为含有10-100μg/L血管内皮生长因子、5-50μg/L表皮生长因子、0.1-1μmol/L地塞米松的细胞诱导分化培养基。

7.尿液间充质干细胞的应用，其特征在于：用于修复骨缺损或股骨头坏死、关节软骨损伤、中枢或外周神经损伤、皮肤损伤、血管损伤，以及由心脑血管疾病、呼吸系统疾病、消化系统疾病或泌尿系统疾病造成的相应组织器官损伤。

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