CN109224129B

CN109224129B - 一种皮肤缺损修复材料

Info

Publication number: CN109224129B
Application number: CN201811157541.XA
Authority: CN
Inventors: 解慧琪; 张修儒; 黄益洲
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2018-09-30
Filing date: 2018-09-30
Publication date: 2021-09-24
Anticipated expiration: 2038-09-30
Also published as: CN109224129A

Abstract

本发明公开了一种皮肤损伤的修复材料，它是以小肠黏膜下层膜为基质复合尿源性干细胞后，经低氧处理形成的修复材料；所述低氧处理是在氧气浓度为1％‑5％的条件下培养。本发明修复材料具有良好的皮肤修复效果，临床应用前景良好。

Description

一种皮肤缺损修复材料

技术领域

本发明涉及医学组织工程领域，尤其是皮肤修复领域。

技术背景

在全球范围，由创伤、烧伤和慢性疾病导致的皮肤创口仍然是一个巨大的临床挑战。目前在临床中，自体刃厚皮片(split-thickness skin grafting，STSG)和全层皮片(full-thickness skin grafting)均常规应用在巨大皮肤缺损的治疗，但是这些方式存在许多问题，例如：来源有限，供区并发症。目前组织工程化皮肤替代物被广泛的进行研究，近年来研究者关注运用以干细胞为基础的组织工程化皮肤治疗全层皮肤缺损。组织工程化皮肤一般包含两部分：支架材料和种子细胞。支架材料需要具有较好的生物相容性、低免疫原性和可靠的机械性能，目前已经发展出了很多能满足要求的支架材料，包括猪小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)。

然而，无论是传统的自体刃厚皮片等修复材料，还是组织工程化皮肤替代物，都存在难以产生皮肤附属器，无法有效恢复皮肤功能的问题。皮肤附属器包括毛、皮脂腺、汗腺、指(趾)甲等，对维持正常的皮肤功能具有重要作用。比如，皮脂腺所分泌的皮脂对皮肤及毛发起柔润保护作用。在实际的皮肤修复过程中，皮肤附属器的产生是目前遇到的一大难题，现有修复方法几乎难以有效地产生皮肤附属器。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的全层皮肤缺损修复材料及其制备方法。

本发明一种皮肤损伤的修复材料，它是以小肠黏膜下层膜为基质复合尿源性干细胞后，经低氧处理形成的修复材料；所述低氧处理是在氧气浓度为1％-5％的条件下培养。

小肠黏膜下层膜：是指小肠经过去除浆膜层、肌层，再经清洗、消毒、脱脂、脱细胞、去垢、冻干制得的膜材料。

所述小肠黏膜下层膜每平方毫米上复合1000～100000个细胞；优选为每平方毫米上复合6000～13000个细胞；进一步优选为每平方毫米上复合6369～12739个细胞。

其中，低氧氧处理的方法为：所述低氧处理的时间为12h-72h，优选为24h；和/或，所述氧气浓度为1％。

其中，所述培养采用的培养基为USCs培养基。其中，所述小肠黏膜下层膜按照如下方法制备：取小肠，去除浆膜层、和肌层，脱脂，脱细胞，去垢，冻干。

其中，所述脱脂是用体积比为1:1的甲醇和氯仿的混合溶液浸泡6-24小时，去离子水冲洗；

和/或，所述脱细胞采用酶消化，在24-40℃环境中，于胰蛋白酶和乙二胺四乙酸混合溶液中孵育6-24小时，生理盐水冲洗去除胰酶；优选地，所述混合溶液中，胰蛋白酶和乙二胺四乙酸的浓度均为0.01～10％w/v，进一步优选为0.05％w/v；

所述去垢是在含有过氧乙酸的乙醇水溶液中处理20～40分钟，所述含有过氧乙酸的乙醇水溶液中，过氧乙酸含量为0.01％-1％w/v，乙醇含量为10％-35％v/v,优选过氧乙酸含量为0.1％w/v，乙醇含量为20％v/v。

其中，所述尿源性干细胞采用如下方法制备：取尿液，离心富集，培养基培养。

其中，离心富集的方法是：在离心管中进行400g离心10min，弃去上层尿液，加入尿液0.16～0.8倍含1％青链霉素的PBS溶液中，与底部尿液混匀并400g离心5min；重复PBS溶液洗涤的步骤两遍；

所述培养基为USCs培养基。

本发明还提供了一种制备前述修复材料的方法，其特征在于：步骤如下：

取尿源干细胞和小肠黏膜下层膜，在氧气浓度为1％-5％的条件下培养12h-72h；优选地，所述培养基为USCs培养基。

本发明还提供了一种制备前述修复材料在制备皮肤损伤的修复材料中的用途。

本发明修复材料(复合了人尿源性干细胞的猪小肠黏膜下层)可以快速恢复皮肤各项指标，修复后几乎接近天然皮肤，特别是可以快速产生皮肤附属器，恢复皮肤各项功能，效果优良，实现更好的全层皮肤缺损修复，为皮肤修复提供了一种更为优良的选择，具有较好的应用前景。并且，本发明提供的修复材料实现了种子细胞无创提取，更能为患者接受。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1a是尿源干细胞培养第7天和第14天的显微图；

图1b是对尿源干细胞进行茜红素或油红O染色的图；

图2是尿源干细胞一些表面抗原分布情况的图，检测抗原包括CD29、CD34、CD45、CD73、CD90、HLA-DR和CD44；

图3是修复材料的活死细胞染色显示图，钙黄绿素(Calcein-AM)的绿色信号表示活细胞，碘化丙啶(PI)的红色信号表示死细胞，标尺为50μm；

图4a是修复材料的HE染色图，标尺为50μm；

图4b是修复材料的电镜扫描图，标尺为50μm；

图5是修复材料的生长因子检测图；A为24h的检测结果，所检测生长因子为VEGF、EGF和bFGF，^*表示差异有统计学意义，p＜0.05；B、C、D为24、48、72h的检测图，D1为24h、D2为48h、D3为72h；

图6a是裸鼠全层皮肤缺损的修复大体观察图；

图6b是四组愈合率定量分析图；

图6c是SIS+USCs(缺氧)组第21天修复细节放大图；

图7是皮肤愈合4天的HE染色图，左侧标尺为2000μm，右侧标尺为50μm；

图8是皮肤愈合7天的HE染色图，左侧标尺为2000μm，右侧标尺为50μm；

图9是皮肤愈合14天的HE染色图，左侧标尺为2000μm，右侧标尺为50μm；

图10是皮肤愈合21天的HE染色图，左侧标尺为2000μm，右侧标尺为50μm；

图11是移植修复材料的CD31染色图，其中蓝色为DAPI染色，红色为CD31阳性，绿色为CM-DiI标记USCs细胞，标尺为50μm；

图12是移植修复材料的血管数量和血管覆盖面积统计图，^*表示差异有统计学意义，p＜0.05；

图13是移植修复材料的CK14染色图，其中，蓝色为DAPI染色，红色为CK14染色，绿色为CM-DiI标记USCs细胞，标尺为50μm；

图14是移植修复材料的上皮厚度统计图，^*表示差异有统计学意义，p＜0.05；

图15是移植修复材料的天狼星红(Sirus Red)染色图，其中标尺为50μm；

图16是移植修复材料的胶原占组织比例和I、III型胶原相对比例图，^*表示差异有统计学意义，p＜0.05；

图17a是正常皮肤的HE染色图，标尺为50μm；

图17b是正常皮肤的CD31染色图，标尺为50μm；

图17c是正常皮肤的CK14染色图，标尺为50μm；

图17d是正常皮肤的天狼星红(Sirus Red)染色图，标尺为50μm；

图18a是胶原占组织的比例图；

图18b是I型胶原和III型胶原相对比例图；

图18c是血管数统计图；

图18d是血管覆盖面积占比图；

图18e是上皮厚度图。

材料：

USCs培养基：50ML KSFM,26.25ML DMEM,13.75ML F-12,10ML FBS,1ml双抗(青链霉素)，5ng/ml表皮生长因子EGF,50ng/ml BPE,0.4ug/ml氢化可的松，5ng/ml胰岛素，5ug/ml转铁蛋白。

制备方法：

具体实施方式

实施例1本发明修复材料的制备

1、尿源干细胞分离培养

取清洁中段尿液50mL-250mL，在离心管中进行400g离心10min，弃去上层尿液，加入40mL含1％双抗(青链霉素)的PBS，与底部尿液混匀并400g离心5min。重复PBS洗涤尿液的步骤两遍。弃上清后加入5mL USCs培养基将离心管底部细胞重悬并置于细胞孵箱中培养，每三天更换培养基，细胞融合率达到80％-90％时传代。

2、猪小肠黏膜下层的制备

去猪小肠，首先物理去除浆膜层和肌层，并用生理盐水持续冲洗；之后用甲醇和氯仿(1:1，V/V)浸泡12小时然后用去离子水冲洗干净；将黏膜置于37℃环境中，在0.05％胰蛋白酶/0.05％乙二胺四乙酸溶液中孵育12小时，之后在生理盐水中持续冲洗以去除胰酶；最后黏膜下层浸润在0.1％过氧乙酸和20％乙醇的溶液(溶液中，过氧乙酸含量为0.1％w/v，乙醇含量为20％v/v)中30分钟并且在生理盐水中冲洗；用冻干机(CHRIST,GAMMA 2-16LSC,Germany)冻干，用环氧乙烷低温灭菌，得猪小肠黏膜下层。

3、复合：人尿源性干细胞在猪小肠黏膜下层的生长

用打孔器将猪小肠黏膜下层(实施例1制备)制备成直径10mm的圆形，取p3代人尿源性干细胞(实施例1制备)按照106细胞/孔接种在材料(相当于每平方毫米上复合了12739个细胞)上，孵育6h后加入低氧(1％)孵箱培养24小时，吸弃培养基，PBS洗3遍，加入预先配制好的浓度为1ug/ml的钙黄绿素(AM)和1ug/ml的碘化丙啶(PI)，孵育30min后在共聚焦显微镜下观察。

本实施例低氧(1％)：是指氧气含量为1％v/v、二氧化碳含量为5％v/v，氮气含量为94％v/v。

实施例2本发明修复材料的制备

1、尿源干细胞分离培养

2、猪小肠黏膜下层的制备

去猪小肠，首先物理去除浆膜层和肌层，并用生理盐水持续冲洗；之后用甲醇和氯仿(1:1，V/V)浸泡12小时然后用去离子水冲洗干净；将黏膜置于37℃环境中，在0.05％胰蛋白酶/0.05％乙二胺四乙酸溶液中孵育12小时，之后在生理盐水中持续冲洗以去除胰酶；最后黏膜下层浸润在0.1％过氧乙酸和20％乙醇的溶液中30分钟并且在生理盐水中冲洗；用冻干机(CHRIST,GAMMA 2-16 LSC,Germany)冻干，用环氧乙烷低温灭菌，得猪小肠黏膜下层。

3、复合：人尿源性干细胞在猪小肠黏膜下层的生长

用打孔器将猪小肠黏膜下层(实施例1制备)制备成直径10mm的圆形，取p3代人尿源性干细胞(实施例1制备)按照2*10⁵细胞/孔接种在材料(相当于每平方毫米上复合了6369个细胞)上，孵育6h后加入低氧(5％)孵箱培养72小时，吸弃培养基，PBS洗3遍，加入预先配制好的浓度为1ug/ml的钙黄绿素(AM)和1ug/ml的碘化丙啶(PI)，孵育30min后在共聚焦显微镜下观察。

本实施例低氧(5％)：是指氧气含量为5％v/v、二氧化碳含量为5％v/v，氮气含量为90％v/v。

实施例3本发明修复材料的制备

1、尿源干细胞分离培养

2、猪小肠黏膜下层的制备

3、复合：人尿源性干细胞在猪小肠黏膜下层的生长

用打孔器将猪小肠黏膜下层(实施例1制备)制备成直径10mm的圆形，取p3代人尿源性干细胞(实施例1制备)按照10⁶细胞/孔接种在材料(相当于每平方毫米上复合了12739个细胞)上，孵育6h后加入低氧(3％)孵箱培养12小时，吸弃培养基，PBS洗3遍，加入预先配制好的浓度为1ug/ml的钙黄绿素(AM)和1ug/ml的碘化丙啶(PI)，孵育30min后在共聚焦显微镜下观察。

本实施例低氧(3％)：是指氧气含量为3％v/v、二氧化碳含量为5％v/v，氮气含量为92％v/v。

以下用实验例的方式来验证本发明的有益效果：

实验例1人尿源性干细胞(USCs)干性能力检测

1.方法

1.1细胞分离培养

按实施例1进行。

1.2干性检测

成骨诱导：取第3代USCs，以1.0×10⁵个细胞/孔的密度接种于6孔培养板，培养24h后，换成骨诱导培养基(Gibco，A1007201)进行诱导，每3天换液，连续诱导28天后，用茜素红染色进行鉴定。

成脂诱导：取第3代USCs，以1.0×10⁵个细胞/孔的密度接种于6孔培养板，培养24h后，换成脂诱导液(Gibco，A1007001)进行诱导，每3天换液，连续诱导14天。清洗固定，采用油红O染色进行鉴定。

1.3流式细胞术检测细胞表面抗原表达

取第3代USCs，TNE(胰酶细胞消化液，trypsin-EDTA solution)消化后将细胞浓度调整至1×10⁶个/mL，每个流式细胞管中加0.1mL的细胞悬液。阴性对照管中不加抗体，其余分别加入CD29-APC，CD34-APC，CD44-FITC，CD45-PE，CD73-PE，CD90-FITC，CD105-PE，HLA-DR-FITC各2μL，室温避光孵育30min，PBS洗涤离心，吸弃上清液，加入200μL PBS轻弹混匀底部细胞沉淀，流式细胞仪检测相关表型的表达情况。

2.结果

如图1a所示，培养7天可以看到原代人尿源性干细胞团落，在14天细胞增殖情况良好，即可进行传代，以后当细胞融合达到80％-90％对细胞进行传代。

图1b展示了阳性的茜素红和油红O染色结果，表明USCs有良好的成骨及成脂分化能力。

如图2所示，尿源干细胞CD29,CD44,CD73,CD90呈阳性表达；CD34,CD45,HLA-DR呈阴性表达。这些结果和间充质干细胞的表面标记物的表达类似。

实验例2人尿源性干细胞与猪小肠黏膜下层的复合

1.实验方法

1.1人尿源性干细胞与猪小肠黏膜下层复合后活死染色

用打孔器将猪小肠黏膜下层(实施例1制备)制备成直径10mm的圆形，取p3代人尿源性干细胞(实施例1制备)按照10⁶细胞/孔接种在材料上，孵育6h后加入完全培养基分别置于常氧(21％)孵箱和低氧(1％)孵箱培养24小时，吸弃培养基，PBS洗3遍，加入预先配制好的浓度为1ug/ml的钙黄绿素(AM)和1ug/ml的碘化丙啶(PI)，孵育30min后在共聚焦显微镜下观察。

1.2人尿源性干细胞与猪小肠黏膜下层复合后HE检测

取直径为10mm的猪小肠黏膜下层，取p3代人尿源性干细胞按照10⁶细胞/孔接种在材料上，孵育6小时后将加入完全培养基的材料分别置于常氧(21％)孵箱和低氧(1％)孵箱培养24h，吸弃培养基，PBS洗3遍，加入4％多聚甲醛固定48h，石蜡包埋，切片厚度4μm并进行HE染色。

1.3人尿源性干细胞与猪小肠黏膜下层复合后扫描电镜

取直径为10mm的猪小肠黏膜下层，取p3代人尿源性干细胞按照10⁶细胞/孔接种在材料上，孵育6小时后将加入完全培养基的未接种细胞及接种细胞的的猪小肠黏膜下层分别置于常氧(21％)孵箱和低氧(1％)孵箱培育24小时，吸弃培养基，PBS洗3遍，加入浓度为2.5％的戊二醛固定48小时，在常温下采用梯度酒精(60％，70％，80％，90％，95％，100％)进行脱水，每次5min，冷冻干燥，喷金后进行扫面电镜检测。

1.4人尿源性干细胞与猪小肠黏膜下层复合后生长因子检测

取直径为10mm的猪小肠黏膜下层，取p3代人尿源性干细胞按照10⁶细胞/孔接种在材料上，孵育6小时后加入完全培养基的材料分别置于常氧孵箱和低氧孵箱培养24、48、72小时，收集培养基并保存在-80℃冰箱。用ELISA试剂盒分别检测细胞上清液中的VEGF(P15692，Ray biotech)，EGF(P01133，Ray biotech)，bFGF(P09038，Ray biotech)。

2.结果

2.1USC在猪小肠黏膜下层(SIS)的生长情况及相容性评价

活死细胞染色结果显示，在常氧和低氧环境培养，支架材料上细胞均以绿染的活细胞为主，红染的死细胞极少，且活细胞形态良好，外形轮廓清晰(图3)。HE结果显示，在SIS表面能形成一层细胞(图4a)。扫描电镜结果显示，USCs和SIS融合良好(图4b)。

用CCK-8试剂盒(Dojindo,Japan)检测细胞增殖，也发现细胞增殖效果优良。

2.2生长因子分泌

将细胞上清液收集并进行生长因子测定结果显示，低氧(1％)环境明显促进了USCs细胞分泌VEGF、bFGF和EGF(图5)。

结果显示培养24h时，细胞分泌生长因子含量最高，随着处理时间进一步延长，其生长因子反而降低。

实验结果证明，本发明复合了人尿源性干细胞的猪小肠黏膜下层中，人尿源性干细胞与猪小肠黏膜下层良好，且人尿源性干细胞分泌的VEGF、bFGF和EGF高。

实验例3裸鼠皮肤缺损修复实验

1.方法

1.1实验动物皮肤缺损模型的准备

选择5-6周龄的裸鼠(18g-24g)，以75mg/kg戊巴比妥钠麻醉裸鼠，裸鼠完全麻醉后用8mm打孔器以裸鼠背部正中线对称做直径8mm的裸鼠皮肤全层缺损，用3-0丝线将内直径为10mm的硅胶圈缝合至缺损皮肤的周围以防止裸鼠皮肤收缩。用无菌性自粘性弹力绷带(3M，Healthcare)覆盖伤口。

1.2材料移植

材料：

SIS+USCs(缺氧)：本发明复合了人尿源性干细胞的猪小肠黏膜下层，按照实施例1的方法制备)；

SIS+USCs(常氧)：按照实施例1的方法制备人尿源性干细胞、猪小肠黏膜下层，在常氧条件下复合，复合的培养基和其他培养条件同实施例1；

单纯SIS(单纯猪小肠黏膜下层)：按照实施例1制备。

将p3代人尿源性干细胞预先用CM-DiI(Invitrogen,1913932)染料在37℃孵育5分钟，然后在4℃孵育15分钟。之后将标记细胞按照10⁶细胞/孔接种在材料上，孵育6小时后加入完全培养基分别在常氧孵箱和低氧孵箱培养24小时。所有动物随机分为2组，每组16只，其中一组背部双侧分别作为未处理组和单纯猪小肠黏膜下层组，另外一组背部双侧分别作为猪小肠黏膜下层复合常氧(21％)培养人尿源性干细胞组(SIS+USCs(常氧))和低氧培养组(SIS+USCs(缺氧))。在0天，4天，7天，14天，21天分别用相机记录伤口愈合情况并用imageJ(NIH,Bethesda,MD)软件分析伤口愈合率。伤口愈合率计算方法为(初始伤口大小-末次伤口大小)/初始伤口大小×100％。

1.3组织学染色

在植入后的4天，7天，14天，21天收集损伤皮肤，将损伤皮肤均分为两半，一半固定在4％多聚甲醛24小时后用石蜡包埋并切成厚度为4μm的切片进行HE染色观察修复情况及天狼星红染色观察胶原生成，另一半取下后立即储存在-80℃冰箱，用冰冻切片包埋剂包埋后用冰冻切片机切成4μm切片进行CD31(1:500)和CK14(Abcam，ab181595,1:1000)免疫荧光染色。CD31，CK14定量分析，每个标本选取4个高倍视野(200×)用image pro plus进行分析。天狼星红染色定量分析，每组检测4个标本，每组检测4个标本，每个标本选取5个高倍视野(400×)用image pro plus进行分析。对称取双侧裸鼠正常皮肤进行组织学和免疫荧光染色，对CD31、CK14选取4个高倍视野(200×)，对天狼星红染色取5个高倍视野(400×)用image pro plus进行分析。

2.结果

2.1裸鼠皮肤修复的大体观察

分别在第4天，7天，14天，21天对修复区域拍照，结果显示随着时间的推移各组皮肤愈合率逐渐增加(图6a)。从大体观察，对照组在第4天没有形成痂壳，而其他三组均形成痂壳。在第14天，空白组与单纯SIS组的修复区域有坏死，泛红，而SIS+USCs(常氧)和SIS+USCs(缺氧)的修复区域平坦并且和正常皮肤的颜色类似，在第21天，SIS+USCs(缺氧)组已经完全和正常皮肤类似并且出现毛发(图6c)，SIS+USCs(常氧)组仍有少部分修复区域异于正常皮肤，对照组和单纯SIS组并没有完全修复。对愈合面积的定量分析结果显示，SIS+USCs(缺氧)组的皮肤愈合率明显高于其余三组，在21天时SIS+USCs(缺氧)组已经完全愈合而其余三组均没有完全愈合(图6b)。

2.2修复区域肉芽组织的形成

HE染色可以进一步评价修复区域的愈合质量。在损伤后的第四天(图7)，肉芽组织开始填充在修复区域，肉芽组织中包含大量的细胞，细胞因子，血管和细胞外基质。在第7天，各组在修复区域均形成了连续的肉芽组织，除了对照组没有痂壳形成，其余均已形成覆盖修复区域的痂壳，而且所有组中均有明显的炎性细胞浸润。值得注意的是，在SIS+USCs(缺氧)组已经观察到了明显的毛细血管生成(图8)。在第14天，SIS+USCs(缺氧)组的伤口愈合区域出现皮肤附属器，而在其余三组中没有在修复区域观察到新生皮肤附属器(图9)。在第21天，SIS+USCs(缺氧)出现大量皮肤附属器并且皮肤结构接近正常皮肤，在SIS+USCs(常氧)组在修复区域边缘观察到新生皮肤附属器，在对照组和单纯SIS组没有观察到新生皮肤附属器(图10和图17a)。

2.3修复区域血管的生成和成熟

CD31免疫荧光染色可以评价修复区域的血管化(图11)。正常皮肤区域的CD31染色见图17b，统计其血管数量为17.32±2.33个/视野，血管面积百分数为0.28±0.10％(见图18c和图18d)。

修复区域CD31荧光结果显示在所有组均有新生血管的形成。在第4天，SIS+USCs(缺氧)组的血管数量明显多于SIS+USCs(常氧)组、SIS组和对照组，并且在第7天，这种趋势依然维持。从第14天开始，SIS+USCs(缺氧)和SIS+USCs(常氧)组的血管数量均明显降低，而SIS组和对照组的血管数量继续增加并且超过了SIS+USCs(缺氧)和SIS+USCs(常氧)组。在21天，对照组和SIS组的血管数量继续增加而SIS+USCs(缺氧)和SIS+USCs(常氧)组的血管数量进一步减少，值得注意的是在21天SIS+USCs(缺氧)组的血管数量是最接近正常皮肤血管数量(图12和图18c)。和血管数量定量分析的结果相似，在4,7天SIS+USCs(缺氧)组血管化显著增加并且明显比其余各组高，在14天和21天，SIS+USCs(缺氧)组和SIS+USCs(常氧)组的血管化下降明显而SIS组和对照组继续增加，在第21天的时候，SIS+USCs(缺氧)组的血管化是最接近正常皮肤血管化水平(图12和图18d)。

2.4修复区域上皮化

CK14免疫荧光染色用以评价修复区域的上皮化程度(图13)。正常皮肤进行CK14免疫荧光结果显示上皮和皮肤附属器的表皮均能被荧光标记，正常皮肤厚度定量分析结果为19.6±4.2um(图17c和图18e)。

对修复区域的染色结果显示：在4天和7天，所有组均未完全上皮化，SIS+USCs(缺氧)组的上皮和其他组相比较厚，但是在SIS+USCs(常氧)组和SIS+USCs(缺氧)组均没有看到USCs直接参与上皮化(图13)。在第14天，所有组均完全上皮化。对第21天上皮厚度定量分析结果显示，SIS+USCs(缺氧)组的上皮厚度明显比其他组薄并且最接近正常皮肤厚度(图14和图18e)。

2.5修复区域胶原含量，结构以及成熟程度

天狼星红(Sirus Red)染色能够有效的评价皮肤重塑期的愈合和再生情况。在偏振光显微镜下观察显示I型胶原红色或者黄色，III型胶原绿色。结果显示在第4天，SIS+USCs(缺氧)组的胶原生成量是最高的而对照组的胶原含量非常稀少，并且所有组的胶原形态均是零散分布，没有形成结构排列；在7天所有组的胶原含量明显增加，对照组的胶原形态仍是零散分布，在SIS组和SIS+USCs(常氧)组胶原形态呈平行的细的束样结构(parallelsmall bundles)，在SIS+USCs(缺氧)组的胶原呈现平行和垂直排列的细的束样结构(parallel vertical small bundles)；在14天，所有组胶原含量继续增加，在对照组和SIS组可见粗大的平行排列的胶原纤维，在接细胞两组中可见胶原纤维结构开始接近正常胶原结构，但是整体胶原排列结构仍紊乱；在21天，SIS+USCs(缺氧)组的胶原含量明显降低且接近正常皮肤胶原含量而其余三组的胶原继续增加。在对照组观察到胶原纤维呈粗的波浪样束样结构(flatter，arranged in parallel wavy pattern)，在SIS组观察到胶原纤维呈结节样结构(thin collagen thin fibers organized into nodules)，在SIS+USCs(常氧)组观察到少量结节样胶原纤维(nodules)，和不同方向的正常的纤维束(different orientedbundles)，在SIS+USCs(缺氧)组观察到正常胶原纤维束而且组成结构接近正常皮肤(图15，图17d)。

I型胶原/III型胶原不同比例不仅反映伤口修复的不同时期，而且能够评价创面修复后期的效果。结果显示，在4天III型胶原占主要，随着修复时间延长，III型胶原比例逐渐降低，I型胶原比例显著增加(图16)。在第4天，没有细胞的对照组和单纯SIS组的III型胶原比例最高；而在第7天，SIS+USCs(缺氧)的I型胶原占比增加水平没有其余三组高；在第14天，所有组的I型胶原/III型胶原比例相似；第21天，对照组的I型胶原比例非常高而其余三组的胶原比例基本稳定且和正常皮肤胶原比例相似(图16，图18b)。

实验结果证明，本发明修复材料(复合了人尿源性干细胞的猪小肠黏膜下层)，可以快速促进皮肤创面愈合，快速形成皮肤附属器，第14天伤口愈合区域出现皮肤附属器，第21出现大量皮肤附属器并且皮肤结构接近正常皮肤，还可以促进皮肤上皮化，修复后皮肤上皮厚度接近正常皮肤厚度，还可以快速恢复区域胶原含量。总而言之，本发明修复材料(复合了人尿源性干细胞的猪小肠黏膜下层)可以快速恢复皮肤各项指标，修复后几乎接近天然皮肤，特别是可以快速产生皮肤附属器，恢复皮肤各项功能，效果优良。

Claims

1.一种皮肤损伤的修复材料，其特征在于：它是以小肠黏膜下层膜为基质复合尿源性干细胞后，经低氧处理形成的修复材料；所述低氧处理是在氧气浓度为1%-5%的条件下培养；所述小肠黏膜下层膜每平方毫米上复合 6369~12739个细胞。

2.根据权利要求1所述的修复材料，其特征在于：低氧处理的方法为：所述低氧处理的时间为12h-72h；和/或，所述氧气浓度为1%。

3.根据权利要求2所述的修复材料，其特征在于：所述低氧处理的时间为24h。

4.根据权利要求1所述的修复材料，其特征在于：所述小肠黏膜下层膜按照如下方法制备：取小肠，去除浆膜层和肌层，脱脂，脱细胞，去垢，冻干。

5.根据权利要求4所述的修复材料，其特征在于：

所述脱脂是用体积比为1:1的甲醇和氯仿的混合溶液浸泡6-24小时，去离子水冲洗；

和/或，所述脱细胞采用酶消化，在24-40℃环境中，于胰蛋白酶和乙二胺四乙酸混合溶液中孵育6-24小时，生理盐水冲洗去除胰蛋白酶；

所述去垢是在含有过氧乙酸的乙醇水溶液中处理20~40分钟，所述含有过氧乙酸的乙醇水溶液中，过氧乙酸含量为0.01%-1%w/v，乙醇含量为10%-35%v/v。

6.根据权利要求5所述的修复材料，其特征在于：所述混合溶液中，胰蛋白酶和乙二胺四乙酸的浓度均为0.01~10%w/v。

7.根据权利要求6所述的修复材料，其特征在于：所述混合溶液中，胰蛋白酶和乙二胺四乙酸的浓度均为0.05%w/v。

8.根据权利要求5所述的修复材料，其特征在于：所述过氧乙酸含量为0.1%w/v，乙醇含量为20%v/v。

9.根据权利要求1所述的修复材料，其特征在于：所述尿源性干细胞采用如下方法制备：取尿液，离心富集，培养。

10.根据权利要求9所述的修复材料，其特征在于：

离心富集的方法是：在离心管中进行400 g离心10 min，弃去上层尿液，加入尿液0.16~0.8倍含1%青链霉素的PBS溶液，与底部尿液混匀并400 g离心5 min；重复PBS溶液洗涤的步骤两遍。

11.根据权利要求1或9所述的修复材料，其特征在于：所述培养采用的培养基为USCs培养基。

12.一种制备权利要求1~11任意一项所述修复材料的方法，其特征在于：步骤如下：

取尿源性干细胞和小肠黏膜下层膜，在氧气浓度为1%-5%的条件下培养12h-72h。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述培养基为USCs培养基。

14.权利要求1~11任意一项所述修复材料在制备皮肤损伤的修复材料中的用途。