CN107810014A - 包含间充质干细胞的组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含生物相容性基质和基本上纯的间充质干细胞群体的组合物。本发明还涉及其用于治疗软组织损伤的用途。

Description

包含间充质干细胞的组合物及其用途

技术领域

本发明涉及生物医学产品及其用于治疗软组织损伤的用途。特别地，本发明涉及包含间充质干细胞群体和生物相容性基质的组合物。

发明背景

每年有数百万人寻求软组织急性或过劳性损伤，例如皮肤损伤(如不愈合皮肤创伤)或肌肉损伤(如外伤或手术创伤)的医学治疗。创伤愈合的过程遵循严格的模式，其包括三个阶段：炎症阶段，其由释放细胞因子用于改善炎症反应组成；修复或增殖阶段，其特征为在生长因子和细胞因子的影响下以及通过血管生成使祖细胞活化和增殖；以及重塑或成熟阶段，其特征为瘢痕组织以及胶原蛋白彼此和与蛋白质分子的交联，这增加了瘢痕的抗张强度。

虽然提出了几种再生医学方法，但是仍然受到其临床应用的限制：生长因子的局部注射仍伴随着局部浓度的快速消耗、不适当的梯度和生物活性的丧失(Borselli等人，Proc Natl Acad Sci USA 2010，107：3287-3292)；去细胞的细胞外基质的直接移植(含有天然VEGF和bFGF)伴随着生长因子的不受控释放和主要由于异种来源的生物相容性缺乏(Keane等人，Biomaterials.2012，33：1771-1781)；分化的肌肉细胞的移植例如受到在移植后的早期阶段中由于低氧应激的低细胞移植的限制(Turner和Badylak，Cell TissueRes.2012，347：759-774)。

然后，提出了干细胞以通过高速率的增殖和自我更新、抵抗氧化或低氧应激(Camassola等人，Methods Mol Biol Clifton NJ.2012,879:491-504)、肌生成、血管生成和局部细胞免疫调节(Hong等人，Curr Opin Organ Transplant.2010,15:86-91)来改善缺血性肌肉组织的重塑。

此外，先前已经证明，与接种含有胶原基质的组织产品上的非干细胞相比，在相同的含有胶原蛋白基质的组织产品上接种的干细胞增强了创伤修复(Lafosse等人，Plasticand Reconstructive Surgery 2015,136(2)：279-95)。

最近的研究描述了接种有间充质干细胞的三维支架，如在欧洲专利申请EP2374485和美国专利申请US 2013/0121973中公开的。然而，这些专利申请涉及分化的特别是分化为成纤维细胞的间充质干细胞。相似地，国际专利申请WO 2014/150784描述了用于治疗软组织损伤的组合物，其包含胶原蛋白基质和含有间充质干细胞和非间充质干细胞的细胞悬浮液。

然而，这些替代物或组合物并没有在体内测试，特别是在人体中。

因此，仍然存在改善目前治疗软组织损伤功效的需求。本申请人出人意料地证明了与不是基本上纯的间充质干细胞群体相比，基本上纯的间充质干细胞群体可以增强损伤部位的修复和再生。

因此，本发明涉及包含基本上纯的间充质干细胞群体和生物相容性基质的组合物及其用于治疗软组织损伤的用途。

发明内容

本发明涉及包含生物相容性基质和间充质干细胞(MSC)群体的组合物，其中所述间充质干细胞群体基本上是纯的。

根据一个实施方案，本发明的间充质干细胞群体包含少于25％的成纤维细胞。

根据一个实施方案，本发明的间充质干细胞是未分化的。

在一个实施方案中，本发明的间充质干细胞来源于脂肪组织、骨髓、脐带组织、华顿氏胶、羊水、胎盘、外周血、输卵管、角膜基质、肺、肌肉、皮肤、骨、牙组织或胎肝。优选地，组合物的间充质干细胞来源于脂肪组织，更优选来源于皮下脂肪组织。

根据一个实施方案，本发明的生物相容性基质是无细胞的。

在一个实施方案中，本发明的生物相容性基质包含胶原蛋白。

在一个实施方案中，本发明的生物相容性基质是人、猪、牛或马。

根据一个实施方案，本发明的间充质干细胞来源于待治疗的对象。

本发明还涉及如上所述的包含生物相容性基质和间充质干细胞群体的组合物用于治疗需要其的对象的软组织损伤。

根据一个实施方案，本发明中待治疗的软组织选自皮肤组织、肌肉组织、真皮组织、腱组织、韧带组织、半月板组织和膀胱组织。

在一个实施方案中，软组织损伤是急性或慢性创伤。

根据一个实施方案，待治疗的软组织损伤选自软组织的撕裂或破裂、皮肤创伤、皮肤烧伤、皮肤溃疡、手术创伤、血管疾病、肌肉疾病、疝气和辐射创伤。在具体的实施方案中，皮肤创伤是糖尿病创伤。

根据一个实施方案，用于本发明用途的组合物被局部施用或通过手术移植施用。

本发明还涉及用于制备包含生物相容性基质和间充质干细胞群体的组合物的方法，其包括与生物相容性基质一起孵育基本上纯的间充质干细胞群体。

定义

在本发明中，以下术语具有以下含义：

-“间充质干细胞”或MSC是多能干细胞，其能够分化成多于一种特定类型的间充质组织或结缔组织，包括成骨的、软骨形成的、脂肪形成的、骨髓支持性基质、肌源性或神经源性谱系。间充质干细胞可以从包括但不限于脂肪组织、骨髓、脐带组织、华顿氏胶、羊水、胎盘、外周血、输卵管、角膜基质、肺、肌肉、皮肤、骨、牙组织、月经前液、包皮和胎肝等的组织分离。

-“晚期传代间充质干细胞”指与较早传代的细胞相比表现出较少免疫原性特征的细胞。间充质干细胞的免疫原性对应于传代次数。优选地，细胞已经传代到至少第四代，更优选地，细胞已经传代到至少第六代，最优选地，细胞已经传代到至少第八代。

-“常氧”指组织或生理学的氧水平。在本发明的一个实施方案中，常氧或生理学的氧水平下的细胞培养指在约3％至约6％，优选约5％的氧水平下培养。

-“低氧”指降低的氧水平。在本发明的一个实施方案中，低氧下的细胞培养指在约0％至约1％的氧水平下，优选约0.1％的氧水平下培养。

-“正常血糖”指葡萄糖的正常水平。在本发明的一个实施方案中，正常血糖下的细胞培养指在约0.5g/l至约1.5g/l的葡萄糖浓度下，优选约1g/l的葡萄糖浓度下培养。

-“高血糖”指提高的葡萄糖水平。在本发明的一个实施方案中，高血糖下的细胞培养指在约2g/l至约10g/l，优选约3g/l至约6g/l的葡萄糖浓度下，更优选约4.5g/l的葡萄糖浓度下培养。

-“生物相容性”指对身体，特别是对软组织不具有毒性或有害作用的性质。在一个实施方案中，材料的生物相容性指所述材料能够实现其期望功能而不引起对象中任何不期望的局部或全身效应，但产生最适当的有益的细胞响应或组织响应的能力。

-“生物相容性基质”也被称为基质或支架，指由生物相容性材料形成的三维支架。

-关于生物相容性基质，“无细胞”或“去细胞的”指基本上所有内源性细胞已被从其中除去的基质，例如至少约60％的内源性细胞(其中该百分比相对于内源性细胞的数目)，优选约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的内源性细胞或更多。基质的去细胞化可以通过活细胞计数来评估，例如通过DAPI染色。

-“软组织”指连接、支撑或包围身体中不是骨的其他结构和器官的组织。在一个实施方案中，软组织包括但不限于腱、韧带、筋膜、皮肤、纤维组织、脂肪和滑膜(其为结缔组织)、肌肉、神经和血管(其不是结缔组织)。在另一个实施方案中，软组织是除骨、牙齿、指甲、头发和软骨之外的身体组织。

-“对象”指哺乳动物，优选人。在一个实施方案中，对象可以是“患者”，即温血动物，更优选人，其等待接受或正在接受医疗护理或者是医疗程序过去/现在/将来的目标，或被监测软组织损伤的发展或愈合。在一个实施方案中，对象是成年人(例如18岁以上的对象)。在另一个实施方案中，对象是儿童(例如18岁以下的对象)。在一个实施方案中，对象是男性。在另一个实施方案中，对象是女性。

-“治疗”或“减轻”指为改善患者的状况而采取的治疗行为和避免采取的行为，其中目标是减缓(减轻)或逆转进展，或减轻软组织损伤的一种或更多种症状，例如未闭合的创伤、纤维化发展、缺乏血管形成和炎症。如果在接受根据本发明的组合物后，患者显示出一种或更多种以下情况的可观察到的和/或可测量的降低或不存在一种或更多种以下情况，则对象或哺乳动物的软组织损伤被成功“治疗”：与软组织损伤有关的一种或更多种症状在一定程度上的缓解、降低的发病率、降低的死亡率或生活质量的改善。用于评价损伤的成功治疗和改善的上述参数通过医生熟悉的常规程序可容易地测量。

-“传代”也称为传代培养或分裂细胞，指当细胞融合或接近融合时，将少量细胞转移到新的容器中，以延长培养细胞的寿命和/或扩大细胞数量。在一个实施方案中，传代0(P0)是最初放置到培养中的细胞的点。

-当涉及例如化合物的量、剂量、时间、温度等可测量的值时，本文所使用的“约”和“大约”指包括所指定的量的20％、10％、5％、1％、0.5％或甚至0.1％的变化。

-“和/或”指并且包括一个或更多个相关的列举项目的任何和所有可能的组合，以及替代选择(“或”)所表明的组合的缺少。

-本文所使用的“衍生物”指物质、衍生物、亚家族等或其混合物的任何部分，其为单独的或与其他衍生物或其他成分组合。

-如本文所使用的“分离的”表示将细胞置于不是其自然环境的条件中。

具体实施方式

先前描述的间充质干细胞(MSC)群体包含除间充质干细胞外其他类型的细胞，特别地它们可以包含成纤维细胞，或部分地分化为成纤维细胞。本申请人证明了相比成纤维细胞，间充质干细胞能够更好的在低氧和/或高血糖中存活和增殖。此外，间充质干细胞能够比成纤维细胞分泌更多VEGF，尤其是间充质干细胞在低氧和高血糖条件(即糖尿病患者的创伤条件)下比常氧和正常血糖中分泌更多的VEGF(参见实施例2)。

申请人还证明了在生物相容性基质上接种间充质干细胞可以恢复真皮组织(参见实施例3)，并且可以用于治疗受伤的肌肉(参见实施例4)。

此外，在生物相容性基质上接种的MSC群体证明了在低氧和/或高血糖下存活的能力，通过氧敏感机制改善促血管生成因子的释放并减少纤维化瘢痕的能力。这些性质可以促进软组织重建，例如在糖尿病状况下。

因此，本发明涉及包含生物相容性基质和间充质干细胞(MSC)群体的组合物。

本发明的组合物被用于动物的组织工程和再生中。本发明的确切组合物可以根据所期望的用途而变化。本发明的修改方案和其他实施方案对于受益于在前面的描述和相关附图中所提供的教导的本发明所属领域的技术人员是明显的。应理解的是本发明不限于所公开的具体实施方案，且修改方案和其他实施方案旨在被包括在所附权利要求的范围内。

在一个实施方案中，本发明的组合物是生物医学产品。

根据实施方案，MSC群体可以包含除MSC以外的其他类型细胞，例如成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞、树突细胞、成骨细胞、造血干细胞、脐带血干细胞、淋巴细胞或自然杀伤细胞。

细胞可以从供体(活的或尸体的)获得或来源于已确立的细胞株或细胞系。例如，使用本领域已知的标准活组织检查技术可以从供体获得细胞。

在一个实施方案中，MSC从人供体中获得。

在一个实施方案中，MSC从人供体中获得，条件是它们不是胚胎干细胞。

在本发明的一个实施方案中，MSC群体是分离的MSC群体。

在本发明的一个实施方案中，MSC群体基本上是纯的。如本文所使用的，术语“基本上纯的MSC群体”指MSC群体包含小于25％其他类型的活细胞，特别是成纤维细胞。在一个实施方案中，本发明基本上纯的MSC群体包含至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的MSC，其中百分比是相对于活细胞的总数。

在另一个实施方案中，本发明的基本上纯的MSC群体包含小于约25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的成纤维细胞，其中百分比是相对于活细胞的总数。

根据一个实施方案，本发明的基本上纯的MSC群体分泌至多100pg/ml，优选至多50pg/ml、40pg/ml、30pg/ml、25pg/ml、20pg/ml、19pg/ml、18pg/ml、17pg/ml、16pg/ml、15pg/ml、14pg/ml、13pg/ml、12pg/ml、11pg/ml、10pg/ml、9pg/ml、8pg/ml、7pg/ml、6pg/ml、5pg/ml、4pg/ml、3pg/ml、2pg/ml或1pg/ml的SDF-1α。

根据一个实施方案，当在约21％的O₂下培养MSC群体至少24小时时，本发明的基本上纯的MSC群体分泌至多50pg/ml，优选至多40pg/ml、30pg/ml、25pg/ml、20pg/ml、19pg/ml、18pg/ml、17pg/ml、16pg/ml、15pg/ml、14pg/ml、13pg/ml、12pg/ml、11pg/ml、10pg/ml、9pg/ml、8pg/ml、7pg/ml、6pg/ml、5pg/ml、4pg/ml、3pg/ml、2pg/ml或1pg/ml的SDF-1α。

根据另一个实施方案，当在生理学的氧水平、优选约5％的O₂下培养MSC群体至少24小时时，本发明的基本上纯的MSC群体分泌至多50pg/ml，优选至多40pg/ml、30pg/ml、25pg/ml、20pg/ml、19pg/ml、18pg/ml、17pg/ml、16pg/ml、15pg/ml、14pg/ml、13pg/ml、12pg/ml、11pg/ml、10pg/ml、9pg/ml、8pg/ml、7pg/ml、6pg/ml、5pg/ml、4pg/ml、3pg/ml、2pg/ml或1pg/ml的SDF-1α。

根据另一个实施方案，当在低氧中、优选约0.1％的O₂下培养MSC群体至少24小时时，本发明的基本上纯的MSC群体分泌至多50pg/ml，优选至多40pg/ml、30pg/ml、25pg/ml、20pg/ml、19pg/ml、18pg/ml、17pg/ml、16pg/ml、15pg/ml、14pg/ml、13pg/ml、12pg/ml、11pg/ml、10pg/ml、9pg/ml、8pg/ml、7pg/ml、6pg/ml、5pg/ml、4pg/ml、3pg/ml、2pg/ml或1pg/ml的SDF-1α。

根据另一个实施方案，当在正常血糖、优选在约1g/l的葡萄糖浓度下培养MSC群体至少24小时时，本发明的基本上纯的MSC群体分泌至多100pg/ml，优选至多50pg/ml、40pg/ml、30pg/ml、25pg/ml、20pg/ml、19pg/ml、18pg/ml、17pg/ml、16pg/ml、15pg/ml、14pg/ml、13pg/ml、12pg/ml、11pg/ml、10pg/ml、9pg/ml、8pg/ml、7pg/ml、6pg/ml、5pg/ml、4pg/ml、3pg/ml、2pg/ml或1pg/ml的SDF-1α。

根据另一个实施方案，当在高血糖、优选在约4.5g/l的葡萄糖浓度下培养MSC群体至少24小时时，本发明的基本上纯的MSC群体分泌至多50pg/ml，优选至多40pg/ml、30pg/ml、25pg/ml、20pg/ml、19pg/ml、18pg/ml、17pg/ml、16pg/ml、15pg/ml、14pg/ml、13pg/ml、12pg/ml、11pg/ml、10pg/ml、9pg/ml、8pg/ml、7pg/ml、6pg/ml、5pg/ml、4pg/ml、3pg/ml、2pg/ml或1pg/ml的SDF-1α。

在一个实施方案中，当在约21％的O₂和低浓度的葡萄糖、优选在约1g/l的葡萄糖下培养MSC群体至少24小时时，本发明的基本上纯的MSC群体分泌至多100pg/ml，优选至多50pg/ml、40pg/ml、30pg/ml、25pg/ml、20pg/ml、19pg/ml、18pg/ml、17pg/ml、16pg/ml、15pg/ml、14pg/ml、13pg/ml、12pg/ml、11pg/ml、10pg/ml、9pg/ml、8pg/ml、7pg/ml、6pg/ml、5pg/ml、4pg/ml、3pg/ml、2pg/ml或1pg/ml的SDF-1α。

在另一个实施方案中，当在约21％的O₂和高浓度的葡萄糖、优选在约4.5g/l的葡萄糖下培养MSC群体至少24小时时，本发明的基本上纯的MSC群体分泌至多50pg/ml，优选至多40pg/ml、30pg/ml、25pg/ml、20pg/ml、19pg/ml、18pg/ml、17pg/ml、16pg/ml、15pg/ml、14pg/ml、13pg/ml、12pg/ml、11pg/ml、10pg/ml、9pg/ml、8pg/ml、7pg/ml、6pg/ml、5pg/ml、4pg/ml、3pg/ml、2pg/ml或1pg/ml的SDF-1α。

在另一个实施方案中，当在生理学的氧水平、优选在约5％的O₂，以及低浓度的葡萄糖、优选在约1g/l的葡萄糖下培养MSC群体至少24小时时，本发明的基本上纯的MSC群体分泌至多100pg/ml，优选至多50pg/ml、40pg/ml、30pg/ml、25pg/ml、20pg/ml、19pg/ml、18pg/ml、17pg/ml、16pg/ml、15pg/ml、14pg/ml、13pg/ml、12pg/ml、11pg/ml、10pg/ml、9pg/ml、8pg/ml、7pg/ml、6pg/ml、5pg/ml、4pg/ml、3pg/ml、2pg/ml或1pg/ml的SDF-1α。

在另一个实施方案中，当在生理学的氧水平、优选在约5％O₂，以及高浓度的葡萄糖、优选在约4.5g/l的葡萄糖下培养MSC群体至少24小时时，本发明的基本上纯的MSC群体分泌至多50pg/ml，优选至多40pg/ml、30pg/ml、25pg/ml、20pg/ml、19pg/ml、18pg/ml、17pg/ml、16pg/ml、15pg/ml、14pg/ml、13pg/ml、12pg/ml、11pg/ml、10pg/ml、9pg/ml、8pg/ml、7pg/ml、6pg/ml、5pg/ml、4pg/ml、3pg/ml、2pg/ml或1pg/ml的SDF-1α。

在另一个实施方案中，当在低氧、优选在约0.1％O₂中，以及低浓度的葡萄糖、优选在约1g/l的葡萄糖下培养MSC群体至少24小时时，本发明的基本上纯的MSC群体分泌至多100pg/ml，优选至多50pg/ml、40pg/ml、30pg/ml、25pg/ml、20pg/ml、19pg/ml、18pg/ml、17pg/ml、16pg/ml、15pg/ml、14pg/ml、13pg/ml、12pg/ml、11pg/ml、10pg/ml、9pg/ml、8pg/ml、7pg/ml、6pg/ml、5pg/ml、4pg/ml、3pg/ml、2pg/ml或1pg/ml的SDF-1α。

在另一个实施方案中，当在低氧、优选在约0.1％O₂中，以及高浓度的葡萄糖、优选在约4.5g/l的葡萄糖下培养MSC群体至少24小时时，本发明的基本上纯的MSC群体分泌至多50pg/ml，优选至多40pg/ml、30pg/ml、25pg/ml、20pg/ml、19pg/ml、18pg/ml、17pg/ml、16pg/ml、15pg/ml、14pg/ml、13pg/ml、12pg/ml、11pg/ml、10pg/ml、9pg/ml、8pg/ml、7pg/ml、6pg/ml、5pg/ml、4pg/ml、3pg/ml、2pg/ml或1pg/ml的SDF-1α。

在一个实施方案中，当在低氧、优选约0.1％的O₂中，以及在高血糖、优选在约4.5g/l的葡萄糖浓度下培养MSC群体至少24小时时，本发明的基本上纯的MSC群体分泌至少200pg/ml的VEGF，优选至少约250pg/ml、260pg/ml、270pg/ml、280pg/ml、281pg/ml、282pg/ml、283pg/ml、284pg/ml、285pg/ml、286pg/ml、287pg/ml、288pg/ml、299pg/ml或290pg/ml的VEGF。

在另一个实施方案中，当在生理学的氧水平、优选约5％的O₂中，以及在高血糖、优选在约4.5g/l的葡萄糖浓度下培养MSC群体至少24小时时，本发明的基本上纯的MSC群体分泌至少约90pg/ml的VEGF，优选至少约95pg/ml、100pg/ml、105pg/ml、110pg/ml、111pg/ml、112pg/ml、113pg/ml、114pg/ml、115pg/ml、116pg/ml、117pg/ml、118pg/ml、119pg/ml或120pg/ml的VEGF。

在另一个实施方案中，当在生理学的氧水平、优选约5％O₂中，以及在正常血糖、优选在约1g/l的葡萄糖浓度下培养MSC群体至少24小时时，本发明基本上纯的MSC群体分泌至少约160pg/ml的VEGF，优选至少约161pg/ml、162pg/ml、163pg/ml、164pg/ml、165pg/ml、166pg/ml、167pg/ml、168pg/ml、169pg/ml或170pg/ml的VEGF。

在一个实施方案中，当在低氧、优选在约0.1％的O₂中，以及高血糖、优选在约4.5g/l的葡萄糖浓度下培养MSC群体至少24小时时，本发明的基本上纯的MSC群体分泌至多50pg/ml，优选至多40pg/ml、30pg/ml、25pg/ml、20pg/ml、19pg/ml、18pg/ml、17pg/ml、16pg/ml、15pg/ml、14pg/ml、13pg/ml、12pg/ml、11pg/ml、10pg/ml、9pg/ml、8pg/ml、7pg/ml、6pg/ml、5pg/ml、4pg/ml、3pg/ml、2pg/ml或1pg/ml的SDF-1α；和至少约200pg/ml的VEGF，优选至少约250pg/ml、260pg/ml、270pg/ml、280pg/ml、281pg/ml、282pg/ml、283pg/ml、284pg/ml、285pg/ml、286pg/ml、287pg/ml、288pg/ml、299pg/ml或290pg/ml的VEGF。

在另一个实施方案中，当在生理学的氧水平、优选在约5％的O₂中，以及高血糖、优选在约4.5g/l的葡萄糖浓度下培养MSC群体至少24小时时，本发明的基本上纯的MSC群体分泌至多50pg/ml，优选至多40pg/ml、30pg/ml、25pg/ml、20pg/ml、19pg/ml、18pg/ml、17pg/ml、16pg/ml、15pg/ml、14pg/ml、13pg/ml、12pg/ml、11pg/ml、10pg/ml、9pg/ml、8pg/ml、7pg/ml、6pg/ml、5pg/ml、4pg/ml、3pg/ml、2pg/ml或1pg/ml的SDF-1α；和至少约90pg/ml的VEGF，优选至少约95pg/ml、100pg/ml、105pg/ml、110pg/ml、111pg/ml、112pg/ml、113pg/ml、114pg/ml、115pg/ml、116pg/ml、117pg/ml、188pg/ml、119pg/ml或120pg/ml的VEGF。

在另一个实施方案中，当在生理学的氧水平、优选在约5％的O₂中，以及正常血糖、优选在约1g/l的葡萄糖浓度下培养MSC群体至少24小时时，本发明的基本上纯的MSC群体分泌至多100pg/ml，优选至多50pg/ml、40pg/ml、30pg/ml、25pg/ml、20pg/ml、19pg/ml、18pg/ml、17pg/ml、16pg/ml、15pg/ml、14pg/ml、13pg/ml、12pg/ml、11pg/ml、10pg/ml、9pg/ml、8pg/ml、7pg/ml、6pg/ml、5pg/ml、4pg/ml、3pg/ml、2pg/ml或1pg/ml的SDF-1α；和至少约160pg/ml的VEGF，优选至少约161pg/ml、162pg/ml、163pg/ml、164pg/ml、165pg/ml、166pg/ml、167pg/ml、168pg/ml、169pg/ml或170pg/ml的VEGF。

根据一个实施方案，在测量SDF-1α和/或VEGF表达水平前，在常氧、优选在约21％的O₂中，以及正常血糖、优选在约1g/l的葡萄糖下培养MSC群体直到至少1次、2次、3次或4次传代。根据一个实施方案，在测量SDF-1α和/或VEGF表达水平前，培养MSC群体直到MSC融合。在另一个实施方案中，在测量SDF-1α和/或VEGF表达水平前，培养MSC群体直到至少约80％、85％、90％、95％、99％或100％的MSC融合。

在一个实施方案中，间充质干细胞是未分化或不分化的，即MSC不分化为细胞型，特别是分化为成纤维细胞。

根据一个实施方案，MSC从选自脂肪组织、骨髓、脐带血、华顿氏胶(例如在脐带内发现的华顿氏胶)、羊水、胎盘、外周血、输卵管、角膜基质、肺、肌肉、皮肤、骨、牙组织和胎肝等的组织中分离。在具体的实施方案中，MSC从脂肪组织中分离。在优选的实施方案中，MSC是脂肪干细胞(称为ASC，或称为AMSC)。

在一个实施方案中，MSC从任何温血动物组织，优选从人、猪、牛或马组织，更优选从人组织中分离。在具体的实施方案中，MSC是人ASC。

在一个实施方案中，细胞是培养中的细胞，优选地是细胞系和/或来源于原代细胞，即从组织中直接分离的细胞。在一个实施方案中，从例如通过活组织检查获得的来自个体的样本中复苏细胞。优选地，获得来自个体的样本的步骤不是本发明方法的一部分。

间充质干细胞的分离可以通过本领域普通技术人员已知的任何可接受方法来完成。分离MSC的方法的实例包括但不限于胶原酶消化、胰蛋白酶消化或分离物培养。

在具体的实施方案中，间充质干细胞通过组织消化，例如通过胶原酶的组织消化从脂肪组织中分离。

在一个实施方案中，使用合适的质粒、病毒或替代的载体策略，用感兴趣的核酸可以稳定或瞬时地转染或转导本发明的MSC。感兴趣的核酸包括但不限于编码增强待修复的组织类型中发现的细胞外基质组分的产生的基因产物的那些核酸。

根据本发明的一个实施方案，在分离后，MSC群体在设计为支持细胞生长的本领域普通技术人员已知的任何培养基中培养。如本文所使用的，这种培养基被称为“增殖培养基”或“生长培养基”。生长培养基的实例包括但不限于MEM、DMEM、CMRL、IMDM、RPMI 1640、FGM或FGM-2、199/109培养基、HamF10/HamF12或McCoy's 5A，优选DMEM或RPMI。

在一个实施方案中，培养基可以进一步包含任何补充因子。补充因子的实例包括但不限于FBS；血小板裂解物；甘氨酸；氨基酸，例如谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸，脯氨酸或丙氨酸，优选L-构型氨基酸；和抗生素，例如链霉素或青霉素。

根据一个实施方案，MSC群体在标准培养条件中培养。如本文所使用的，“标准培养条件”指在37℃的温度下和5％的CO₂中。

在一个实施方案中，本发明的MSC群体不分化为特定的组织。因此，在一个实施方案中，本发明的MSC群体不在诱导分化的条件下培养，例如不在分化培养基中培养。在具体的实施方案中，本发明的MSC群体不在成骨分化培养基、肌肉分化培养基或真皮分化培养基中培养。

在一个实施方案中，通过培养MSC群体直到至少3次传代来获得基本上纯的MSC群体，优选在常氧和正常血糖中培养。

在一个实施方案中，可以将MSC群体冷冻，优选至少在第3次传代之后冷冻。例如，可以将细胞群体冷冻并储存在液氮或任何温度下，优选约-0℃至-196℃，只要细胞在其解冻后能够被用作干细胞。在一个实施方案中，MSC群体可以被解冻并扩增以进一步获得新鲜细胞。

在一个实施方案中，生物相容性基质由生物可吸收的生物材料形成。如本文所使用的，术语“生物可吸收的”指生物材料可以被同化回到身体中、溶解或吸收在身体中，且不需要机械或手动移除。

在一个实施方案中，本发明的生物相容性基质由为细胞的生长和增殖提供结构支持的材料形成。在一个实施方案中，生物相容性基质包括天然材料或合成材料，或其化学衍生物，其选自琼脂/琼脂糖、海藻酸盐壳聚糖、硫酸软骨素、胶原蛋白、弹性蛋白或弹性蛋白样肽(ELP)、纤维蛋白原、纤维蛋白、纤连蛋白、明胶、硫酸类肝素蛋白多糖、透明质酸、聚酸酐、聚乳酸(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚环氧乙烷/聚乙二醇(PEO/PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、基于富马酸的聚合物，例如聚(富马酸丙二醇酯)(PPF)或聚(富马酸丙二醇酯-共-乙二醇)(P(PF-co-EG))、低聚(聚(乙二醇))富马酸酯)(OPF)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPPAAm)、聚(古罗糖醛酸)(poly(aldehyde guluronate)，PAG)、聚酸酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(PNVP)、自组装的寡肽凝胶和/或任何其他适合作为细胞载体补充组织生长的水凝胶材料。在具体的实施方案中，本发明的生物相容性基质包含胶原蛋白，例如I型胶原蛋白。

根据一个实施方案，本发明的生物相容性基质来源于任何胶原组织。胶原组织的实例包括但不限于皮肤、真皮、腱、韧带、肌肉、羊膜、半月板、小肠黏膜下层、心瓣、血管和膀胱。在具体的实施方案中，本发明的生物相容性基质来源于腱，优选来源于阔筋膜。

在一个实施方案中，生物相容性基质从个体中获得。在一个实施方案中，生物相容性基质从人体中获得。在另一个实施方案中，生物相容性基质从非人的动物中恢复。这种生物相容性基质是可商购获得的。可商购获得的生物相容性基质的实例包括但不限于(Integra LifeSciences Corporation)、(Skin&Health Care)、(Life Cell)和(3-D Matrix Medical Technology)。优选地，从个体中获得生物相容性基质的步骤不是本发明方法的一部分。

在本发明的具体实施方案中，生物相容性基质来源于人阔筋膜腱。

在一个实施方案中，本发明的生物相容性基质具有低免疫原性或无免疫原性。在一个实施方案中，通过任何生物学、化学和/或物理的手段来处理生物相容性基质以降低其免疫原性。在减少免疫原性的处理之后，与未处理的相同类型的生物相容性基质相比，本发明的生物相容性基质具有较低的免疫原性。

在一个实施方案中，为了降低免疫原性，处理生物相容性基质以除去细胞膜、核酸、脂质和细胞质成分。在减少免疫原性的处理后，生物相容性基质包含完整的通常与基质相关的成分，例如胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖和蛋白聚糖。

在一个实施方案中，处理生物相容性基质以降低免疫原性。在一个实施方案中，本发明的生物相容性基质比未处理的相同类型的生物相容性基质的免疫原性小至少约50％、60％、70％、80％或90％。用于评价基质的免疫原性的参数可以通过医生熟悉的常规程序容易地测量。

减少免疫原性的处理的实例包括但不限于生物相容性基质的去细胞化和生物相容性基质的细胞破裂。

在一个实施方案中，本发明的生物相容性基质已经用细胞破裂方法处理过。细胞破裂方法的实例包括但不限于深低温保藏、冷冻/解冻循环和暴露于辐射。

在另一个实施方案中，本发明的生物相容性基质已经用去细胞方法处理过。如本文所使用的，“去细胞方法”指通过使用物理、化学或生物化学工具从生物相容性基质中除去内源性细胞的方法。工具的实例包括但不限于酶，例如蛋白酶和/或核酸酶；化学品，例如酸、碱、离子型洗涤剂、非离子洗涤剂、表面活性剂和/或两性离子洗涤剂；脱脂剂，例如丙酮；和/或冷冻干燥法。

在一个实施方案中，本发明的生物相容性基质是无细胞的。在一个实施方案中，与没有进行去除内源性细胞的相同类型的生物相容性基质相比，生物相容性基质包含至多约40％、35％、30％、25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的内源性细胞。

去细胞化可以根据本领域技术人员已知的任何方法来定量。定量去细胞化的方法的实例包括但不限于用40,6-二脒基-苯基吲哚(DAPI)染色，或者测量处理的生物相容性基质中的DNA浓度，使其与处理前的生物相容性基质或与未处理的相同类型的生物相容性基质相比。

在优选的实施方案中，生物相容性基质是无细胞胶原蛋白基质，优选人的无细胞胶原基质(HACM)。

在一个实施方案中，制备生物相容性基质以获得不包含可检测的化学残留物例如丙酮或H₂O₂，且具有小于约10％、优选小于8％的残留水分的基质。生物相容性基质的这种制备可以通过本领域普通技术人员已知的任何可接受的方法来完成。因此，在本发明的一个实施方案中，生物相容性基质不包含化学残留物如丙酮或H₂O₂，并具有小于约10％、优选小于8％的残留水分。

在另一个实施方案中，将生物相容性基质灭菌以避免传染性疾病，例如HIV、丙型肝炎病毒和乙型肝炎病毒(HCV、HBV)和细菌感染的传播。灭菌方法的实例包括但不限于化学品、热、UV和电离辐射，例如γ辐照。

在一个实施方案中，本发明的生物相容性基质和MSC群体来自相同的物种。在另一个实施方案中，本发明的生物相容性基质和MSC群体来自不同的物种。在另一个实施方案中，本发明的生物相容性基质和MSC群体来自相同的供体对象，其可以是或可以不是受体对象。在另一个实施方案中，本发明的生物相容性基质和MSC群体来自不同的对象，其中一个可以是受体对象或两个都不是受体对象。

在一个实施方案中，用生物相容性基质培养间充质干细胞群体。如本文所使用的，术语“孵育”指间充质干细胞群体接触生物相容性基质。

在一个实施方案中，将间充质干细胞群体接种在生物相容性基质上。在另一个实施方案中，将间充质干细胞群体接种在生物相容性基质中。在另一个实施方案中，将间充质干细胞群体接种在生物相容性基质上和生物相容性基质中。

在一个实施方案中，组合物中的细胞以任何排布接种。例如，细胞可以均匀地遍及生物相容性基质分布或分布在生物相容性基质内的限定区、区域或层中。

细胞的接种优选地在合适的温度、pH、离子强度和剪切条件下进行以保持细胞活性。

在一个实施方案中，在与生物相容性基质一起孵育MSC群体前，培养MSC群体直到至少传代2、传代3、传代4或传代5。如本文所使用的，术语“培养直到至少传代4”指将细胞群体分离并转移到新的容器中直到至少4次。在具体的实施方案中，在与生物相容性基质一起孵育MSC群体前，培养MSC群体直到传代4。

在一个实施方案中，与生物相容性基质一起孵育的间充质干细胞是晚期传代的间充质干细胞。

在一个实施方案中，当MSC群体达到约70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％融合时，将MSC群体传代。

在另一个实施方案中，在与生物相容性基质一起孵育前，将MSC群体培养至少24小时，优选至少36小时、48小时、60小时或72小时。在另一个实施方案中，在与生物相容性基质一起孵育前，将MSC群体培养至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、35天、40天。

在一些实施方案中，在12孔板或24孔板中，或在25cm²、75cm²或150cm²的细胞培养瓶中孵育MSC群体与生物相容性基质。

在一个实施方案中，对MSC群体计数，且最初以至少0.5×10⁵、1×10⁵、2×10⁵或3×10⁵个细胞每孔的密度与生物相容性基质一起孵育。在另一个实施方案中，最初以约0.5×10⁵至约5×10⁵个细胞/孔(每孔)，优选约1×10⁵至约4×10⁵个细胞/孔，更优选约2×10⁵至约3×10⁵个细胞/孔的密度与生物相容性基质一起孵育MSC群体。在优选的实施方案中，最初以约2×10⁵个细胞每孔的密度与生物相容性基质一起孵育MSC群体。

在一个实施方案中，对MSC群体计数，且最初以至少1×10⁴、2.5×10⁴、5×10⁴或8×10⁴个细胞每cm²培养皿或培养板的密度与生物相容性基质一起孵育。在另一个实施方案中，最初以约1×10⁴至约15×10⁴个细胞/cm²培养皿或培养板，优选约2.5×10⁴至约12.5×10⁴个细胞/cm²，更优选约5×10⁴至约8×10⁴个细胞/cm²的密度与生物相容性基质一起孵育MSC群体。在优选的实施方案中，最初以约5×10⁴个细胞每cm²培养皿或培养板的密度与生物相容性基质一起孵育MSC群体。

在一个实施方案中，对MSC群体计数，且最初以至少0.25×10⁵、0.5×10⁵、1×10⁵或1.5×10⁵个细胞每cm²培养皿或培养板的密度与生物相容性基质一起孵育。在另一个实施方案中，最初以约0.25×10⁵至约2.5×10⁵个细胞/每cm²培养皿或培养板，优选约0.5×10⁵至约2×10⁵个细胞/cm²，更优选约1×10⁵至约1.5×10⁵个细胞/cm²的密度与生物相容性基质一起孵育MSC群体。在优选的实施方案中，最初以约1×10⁵个细胞每cm²培养皿或培养板的密度与生物相容性基质一起孵育MSC群体。

在一个实施方案中，在如上所述的培养基中实施本发明的间充质干细胞群体与生物相容性基质的孵育。在一些实施方案中，培养在37℃下，5％的CO₂中进行。

在一个实施方案中，一旦MSC群体接触生物学基质，组合物便被培养。在一个实施方案中，将本发明的组合物培养至MSC融合。在另一个实施方案中，将本发明的组合物培养至至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的MSC融合。

在另一个实施方案中，在MSC群体和生物学基质接触后，将本发明的组合物培养至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天。在另一个实施方案中，将本发明的组合物培养多于30天。在另一个实施方案中，将本发明的组合物培养3至30天、5至25天、5至20天、5至15天或5至10天。

在一个实施方案中，在培养后，洗涤本发明的组合物以除去培养基。在具体的实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤组合物。

根据一个实施方案，当在低氧、优选约0.1％的O₂中培养组合物至少24小时时，本发明的组合物分泌至多100pg/ml的SDF-1α，优选至多50pg/ml、40pg/ml、30pg/ml、25pg/ml、20pg/ml、19pg/ml、18pg/ml、17pg/ml、16pg/ml、15pg/ml、14pg/ml、13pg/ml、12pg/ml、11pg/ml、10pg/ml、9pg/ml、8pg/ml、7pg/ml、6pg/ml、5pg/ml、4pg/ml、3pg/ml、2pg/ml或1pg/ml的SDF-1α。

根据另一个实施方案，当在正常血糖，优选在约1g/l的葡萄糖浓度下培养组合物至少24小时时，本发明的组合物分泌至多100pg/ml的SDF-1α，优选至多50pg/ml、40pg/ml、30pg/ml、25pg/ml、20pg/ml、19pg/ml、18pg/ml、17pg/ml、16pg/ml、15pg/ml、14pg/ml、13pg/ml、12pg/ml、11pg/ml、10pg/ml、9pg/ml、8pg/ml、7pg/ml、6pg/ml、5pg/ml、4pg/ml、3pg/ml、2pg/ml或1pg/ml的SDF-1α。

根据另一个实施方案，当在高血糖，优选在约4.5g/l的葡萄糖浓度下培养组合物至少24小时时，本发明的组合物分泌至多50pg/ml的SDF-1α，优选至多40pg/ml、30pg/ml、25pg/ml、20pg/ml、19pg/ml、18pg/ml、17pg/ml、16pg/ml、15pg/ml、14pg/ml、13pg/ml、12pg/ml、11pg/ml、10pg/ml、9pg/ml、8pg/ml、7pg/ml、6pg/ml、5pg/ml、4pg/ml、3pg/ml、2pg/ml或1pg/ml的SDF-1α。

在一个实施方案中，当在低氧、优选约0.1％的O₂中，以及在高血糖、优选在约4.5g/l的葡萄糖浓度下培养组合物至少24小时时，本发明的组合物分泌至少200pg/ml的VEGF，优选至少约250pg/ml、260pg/ml、270pg/ml、280pg/ml、281pg/ml、282pg/ml、283pg/ml、284pg/ml、285pg/ml、286pg/ml、287pg/ml、288pg/ml、299pg/ml或290pg/ml的VEGF。

在另一个实施方案中，当在生理学的氧水平、优选约5％的O₂下，以及在高血糖、优选在约4.5g/l的葡萄糖浓度下培养组合物至少24小时时，本发明的组合物分泌至少约90pg/ml的VEGF，优选至少约95pg/ml、100pg/ml、105pg/ml、110pg/ml、111pg/ml、112pg/ml、113pg/ml、114pg/ml、115pg/ml、116pg/ml、117pg/ml、118pg/ml、119pg/ml或120pg/ml的VEGF。

在另一个实施方案中，当在生理学的氧水平，优选约5％的O₂下，以及在正常血糖，优选在约1g/l的葡萄糖浓度下培养组合物至少24小时时，本发明的组合物分泌至少约160pg/ml的VEGF，优选至少约161pg/ml、162pg/ml、163pg/ml、164pg/ml、165pg/ml、166pg/ml、167pg/ml、168pg/ml、169pg/ml或170pg/ml的VEGF。

在一个实施方案中，当在低氧、优选在约0.1％的O₂中，以及在高血糖、优选在约4.5g/l的葡萄糖浓度下培养组合物至少6小时时，本发明的组合物分泌至多50pg/ml的SDF-1α，优选至多40pg/ml、30pg/ml、25pg/ml、20pg/ml、19pg/ml、18pg/ml、17pg/ml、16pg/ml、15pg/ml、14pg/ml、13pg/ml、12pg/ml、11pg/ml、10pg/ml、9pg/ml、8pg/ml、7pg/ml、6pg/ml、5pg/ml、4pg/ml、3pg/ml、2pg/ml或1pg/ml的SDF-1α；和至少约200pg/ml的VEGF，优选至少约250pg/ml、260pg/ml、270pg/ml、280pg/ml、281pg/ml、282pg/ml、283pg/ml、284pg/ml、285pg/ml、286pg/ml、287pg/ml、288pg/ml、299pg/ml或290pg/ml的VEGF。

在另一个实施方案中，当在生理学的氧水平、优选在约5％的O₂中，以及在高血糖、优选在约4.5g/l的葡萄糖浓度下培养组合物至少6小时时，本发明的组合物分泌至多50pg/ml的SDF-1α，优选至多40pg/ml、30pg/ml、25pg/ml、20pg/ml、19pg/ml、18pg/ml、17pg/ml、16pg/ml、15pg/ml、14pg/ml、13pg/ml、12pg/ml、11pg/ml、10pg/ml、9pg/ml、8pg/ml、7pg/ml、6pg/ml、5pg/ml、4pg/ml、3pg/ml、2pg/ml或1pg/ml的SDF-1α；和至少约90pg/ml的VEGF，优选至少约95pg/ml、100pg/ml、105pg/ml、110pg/ml、111pg/ml、112pg/ml、113pg/ml、114pg/ml、115pg/ml、116pg/ml、117pg/ml、118pg/ml、119pg/ml或120pg/ml的VEGF。

在另一个实施方案中，当在生理学的氧水平、优选在约5％的O₂中，以及在正常血糖、优选在约1g/l的葡萄糖浓度下培养组合物至少24小时时，本发明的组合物分泌至多100pg/ml的SDF-1α，优选至多50pg/ml、40pg/ml、30pg/ml、25pg/ml、20pg/ml、19pg/ml、18pg/ml、17pg/ml、16pg/ml、15pg/ml、14pg/ml、13pg/ml、12pg/ml、11pg/ml、10pg/ml、9pg/ml、8pg/ml、7pg/ml、6pg/ml、5pg/ml、4pg/ml、3pg/ml、2pg/ml或1g/l的SDF-1α；和至少约160pg/ml的VEGF，优选至少约161pg/ml、162pg/ml、163pg/ml、164pg/ml、165pg/ml、166pg/ml、167pg/ml、168pg/ml、169pg/ml或170pg/ml的VEGF。

根据一个实施方案，在测量SDF-1α和/或VEGF表达水平前，将本发明的组合物培养至MSC群体融合。在另一个实施方案中，在测量SDF-1α和/或VEGF表达水平前，将组合物培养直到至少约80％、85％、90％、95％、99％或100％的MSC群体融合。

在一个实施方案中，本发明的组合物是装置(例如医学装置)、膜、三维结构、敷料、复合移植物、软组织替代物、药物组合物等。

在一个实施方案中，为适合的激素、蛋白质、核酸、脂质和/或碳水化合物的其他成分可以被添加到本发明的组合物中，所添加的量为允许所添加的成分是本发明组合物中MSC群体的贴壁、生长、分化、增殖、血管形成、移植和三维塑造的正效应物或负效应物的任何量。适合用于组合物中的这些成分的实例包括但不限于天然存在的免疫刺激剂、免疫抑制剂和/或免疫佐剂、或免疫刺激剂、免疫抑制剂和/或免疫佐剂的变体或碎片，例如细胞因子、淋巴因子、单核因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、甲状旁腺素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、黄体生成素(LH)、肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、OB蛋白质、转化生长因子(TGF)、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子(IGF)、红细胞生成素、血小板生成素、肿瘤坏死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、苗勒抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、整合素，白介素(IL)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、SI因子、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、kit配体、FLT-3、血管抑素、血小板反应蛋白、内皮抑素、LT、皮质类固醇、环孢素、氨甲蝶呤等，不论任意所述成分是否为特异性或非特异性的。产生变体的方法在本领域中是众所周知的，并且可以包括例如进行保守的氨基酸改变，或者通过诱变和分析产生的变体用于所需功能。

在一个实施方案中，本发明组合物中可以存在其他成分，其量为允许添加的成分提供改善的可用性或操作特性，同时不显著地改变本发明组合物的稳定性或形式的任何量。适合用于组合物中的这些成分的实例包括但不限于消毒剂、抗生素、抗病毒剂、抗氧化剂、麻醉剂、增塑剂、防腐剂、细胞生长介质和/或冷冻保护剂。

本发明还涉及用于制备包含生物相容性基质和间充质干细胞群体的组合物的方法，其包括：

a.分离间充质干细胞(MSC)，优选脂肪干细胞，

b.获得基本上纯的MSC群体，和

c.与生物相容性基质一起孵育MSC群体。

在一个实施方案中，用于制备包含生物相容性基质和间充质干细胞群体的组合物的方法包括与生物相容性基质一起孵育基本上纯的MSC群体。

在一个实施方案中，用于制备包含生物相容性基质和间充质干细胞群体的组合物的方法包括：

a.分离间充质干细胞(MSC)，

b.获得包含少于25％的成纤维细胞的MSC群体，和

c.与生物相容性基质一起孵育MSC群体。

在另一个实施方案中，用于制备包含生物相容性基质和间充质干细胞群体的组合物的方法包括与生物相容性基质一起孵育包含少于25％的成纤维细胞的MSC群体。

在一个实施方案中，用于制备包含生物相容性基质和脂肪干细胞群体的组合物的方法包括：

a.分离脂肪干细胞(ASC)，

b.获得基本上纯的ASC群体，和

c.与含胶原蛋白的生物相容性基质一起孵育ASC群体。

在另一个实施方案中，用于制备包含生物相容性基质和脂肪干细胞群体的组合物的方法包括与含胶原蛋白的生物相容性基质一起孵育基本上纯的ASC群体。

在一个实施方案中，用于制备包含生物相容性基质和脂肪干细胞群体的组合物的方法包括：

a.分离脂肪干细胞(ASC)，

b.获得包含少于25％的成纤维细胞的ASC群体，和

c.与含胶原蛋白的生物相容性基质一起孵育ASC群体。

在另一个实施方案中，用于制备包含生物相容性基质和脂肪干细胞群体的组合物的方法包括与含胶原蛋白的生物相容性基质一起孵育包含少于25％的成纤维细胞的ASC群体。

本发明的另一个方面是用于治疗需要其的对象中软组织损伤的如上所述的本发明的组合物，其用于治疗需要其的对象中软组织损伤的用途。

在一个实施方案中，软组织损伤可能由例如疾病、创伤或组织正常发展的失效引起。

在一个实施方案中，可以通过本发明组合物治疗的软组织选自皮肤组织、肌肉组织、真皮组织、腱组织、韧带组织、半月板组织、心瓣膜组织、血管组织、胃黏膜、鼓膜组织、羊膜和膀胱组织。

在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗皮肤损伤，或用于治疗皮肤损伤的用途。在另一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗肌肉损伤，或用于治疗肌肉损伤的用途。

在一个实施方案中，可以通过组合物治疗的软组织损伤选自皮肤创伤、皮肤烧伤、皮肤溃疡、肌肉疾病(例如，炎症性肌肉疾病、神经源性肌肉疾病、肌源性肌肉疾病、肌肉营养不良症、先天性肌病或重症肌无力)、疝气、外科创伤(例如，术后创伤)，或血管疾病(例如，外周动脉疾病、腹主动脉瘤、颈动脉疾病、静脉疾病或血管损伤)。

在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗皮肤创伤、皮肤烧伤或皮肤溃疡，或用于治疗皮肤创伤、皮肤烧伤或皮肤溃疡的用途。在具体的实施方案中，组合物用于治疗由于镰状细胞病的皮肤溃疡，或用于治疗由于镰状细胞病的皮肤溃疡的用途。在另一个实施方案中，组合物用于治疗由于血管炎的皮肤溃疡，或用于治疗由于血管炎的皮肤溃疡的用途。在另一个实施方案中，组合物用于治疗糖尿病患者的创伤，例如糖尿病患者的溃疡，或用于治疗糖尿病患者的创伤的用途，例如用于治疗糖尿病患者的溃疡的用途。在另一个实施方案中，组合物用于治疗放射性坏死，或用于治疗放射性坏死的用途。在另一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗肌肉疾病，或用于治疗肌肉疾病的用途。

在一个实施方案中，软损伤是急性创伤(即，在损伤后约2至4天前)。在另一个实施方案中，软损伤是亚急性创伤(即，在损伤后约2至4天至6周)。在另一个实施方案中，软损伤是晚期创伤(即，损伤后约6周)。在另一个实施方案中，软损伤是慢性创伤。在一个实施方案中，慢性创伤定义为在3个月后未能实现完全愈合。在另一个实施方案中，软损伤是不愈合创伤。

在另一个实施方案中，本发明的组合物提供了用于研究根据前述方面的软组织损伤的离体模型。

在一个实施方案中，对象受如上所述的至少一种软组织损伤的影响。在一个实施方案中，对象是糖尿病患者。在一个实施方案中，对象被诊断为患有糖尿病，例如I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、隐匿性自身免疫糖尿病、1.5型糖尿病、脂肪萎缩性糖尿病、年轻人发病的成年型糖尿病、新生儿糖尿病(例如，永久性新生儿糖尿病或暂时性新生儿糖尿病)、前驱糖尿病、类固醇诱导的糖尿病。根据一个实施方案，施用组合物的对象患有I型糖尿病或II型糖尿病。

在一个实施方案中，对象事先未用其他用于软组织损伤的治疗处理。在另一个实施方案中，对象事先接受至少一次用于软组织损伤的治疗。用于治疗软组织损伤的其他治疗的实例包括但不限于用缝合线、钉或胶带或胶的创伤闭合、抗炎药、感染引流、手术、皮肤自体移植、超声疗法、高压氧疗法、护理、局部生长因子应用和角质形成细胞的细胞喷雾。

在一个实施方案中，本发明的生物相容性基质对于施用组合物的对象是异种的。一个非限制性实例是猪的生物相容性基质和人对象。

在另一个实施方案中，本发明的生物相容性基质对于施用组合物的对象是同种异体的。一个非限制性实例是人的生物相容性基质和人对象。

在一个实施方案中，本发明的MSC群体对于施用组合物的对象是异种的，即来自不同物种的成员。在另一个实施方案中，本发明的MSC群体对于施用组合物的对象是同种异体的，即来自相同物种的非相同基因的成员。在另一个实施方案中，本发明的MSC群体对于施用组合物的对象是同基因的，即基因相同或密切相关，以使组织移植排斥最小化。同基因的MSC群体包括自体的(即来自待治疗的对象)和同基因的(即基因相同但不同的对象，例如来自相同的双胞胎之一)那些。

在一个实施方案中，本发明的生物相容性基质和MSC群体对于施用组合物的对象都是异种的。在另一个实施方案中，本发明的生物相容性基质和MSC群体中的至少一种对于施用组合物的对象是同种异体的。在另一个实施方案中，本发明的生物相容性基质和MSC群体对于施用组合物的对象都是同种异体的。

在一个实施方案中，本发明的组合物可以根据本领域已知的任何方法向对象施用。施用方法的实例包括但不限于植入(例如，手术植入)、局部施用、注射和用其他组织移植。

在一个实施方案中，将本发明的组合物向对象局部施用。在另一个实施方案中，本发明的组合物通过手术植入至对象。在另一个实施方案中，将本发明的组合物被注射至对象。

在一个实施方案中，将本发明的组合物施用至对象的软组织损伤部位。在一些实施方案中，本发明的组合物被配置为待治疗的组织的形状和/或大小。在一些实施方案中，本发明的组合物在施用至对象前被调整为待治疗的组织的形状和/或大小。

本发明还涉及用于治疗软组织损伤的方法，其包括施用如上所述的组合物。在一个实施方案中，局部施用组合物或通过手术植入施用组合物。在一个实施方案中，在软组织损伤部位施用组合物。

在一个实施方案中，用于治疗软组织损伤的方法包括将本发明的组合物施用至需要其的对象。在具体的实施方案中，用于治疗软组织损伤的方法包括将本发明的组合物施用至糖尿病患者对象。

本发明的另一个目的是用于增强或改善创伤闭合，例如不愈合皮肤创伤闭合的方法。本发明还涉及用于促进软组织再生，例如真皮再生或肌肉再生的方法。

本发明的另一个方面是用于促进或增强血管生成的方法，优选地促进或增强在软组织损伤部位的血管生成的方法。本发明的另一个方面是用于促进或增强肉芽组织合成的方法，优选地用于促进或增强在软组织损伤部位的肉芽组织合成的方法。本发明的又一个方面是用于减少纤维化瘢痕的方法，优选地用于减少在软组织损伤部位的纤维化瘢痕的方法。

本发明还涉及用于减少软组织坏死，例如骨骼肌坏死的方法。

本发明的另一个目的是用于改善自体移植物，例如皮肤自体移植物的功效的方法，其包括在进行自体移植前施用本发明的组合物。在一个实施方案中，自体移植物的功效改善与溃疡的减少(频率和大小)相关。

本发明的另一个目的是用于筛选化合物对本发明组合物的作用的方法，其中所述方法包括使化合物与本发明的组合物接触，并确定化合物对组合物中存在的细胞的作用。

确定化合物对组合物中存在的细胞的作用的实例包括但不限于用于表皮重塑的KGF的分泌和用于真皮血管生成的VEGF，这两者均用于皮肤再生；在祖细胞的活化、增殖和分化中隐含的用于骨骼肌再生的VEGF、IGF-1、HGF、FGF和TGF-β的分泌；和组织氧合功能中VEGF的分泌。

本发明的另一个目的是用于筛选化合物对本发明的膜、三维结构、敷料、复合移植物或软组织替代物的形成的作用的方法，其中所述方法包括使化合物与本发明的组合物接触，并确定化合物对本发明的膜、三维结构、敷料、复合移植物或软组织替代物的形成的作用。

确定化合物对本发明的膜、三维结构、敷料、复合移植物或软组织替代物的形成的作用的实例包括但不限于3D支架的纯干细胞体外再定殖；和用于支架表面恢复的体外干细胞铺展。

本发明的另一个目的是用于筛选化合物对如上所述的软组织损伤的治疗效果的方法，其中所述方法包括：

-使化合物与用来自待治疗的对象或具有待治疗的病理或病症的对象的MSC获得的本发明的组合物接触，和

-确定化合物对本发明组合物的治疗效果，以确定化合物是否可以用于治疗需要其的患者的软组织损伤。

确定化合物对本发明组合物的治疗效果的实例包括但不限于根据创伤组织而为选择性的生长因子分泌模式，例如用于皮肤表皮再生的KGF；和纯干细胞(从糖尿病患者或非糖尿病患者对象获得)治愈糖尿病患者的皮肤创伤的能力。

本发明的另一个目的是确定本发明的组合物是否适合用于治疗软组织损伤的测试或效力测试，其中：

-如上所述制备本发明的组合物，

-分析本发明的组合物或膜、三维结构、敷料、复合移植物或软组织替代物以确定其是否呈现待治疗的软组织的至少一种特征。

确定待治疗的软组织的至少一种特征的实例包括但不限于在低氧中的3D组合物中，来自纯干细胞的VEGF分泌增加。

附图说明

图1是显示定量在去细胞方法的不同阶段从阔筋膜中提取的总蛋白的图。

图2是显示定量在去细胞方法的不同阶段从阔筋膜中提取的生长因子SDF-1α(A)、VEGF(B)、bFGF(C)和IGF(D)的图组。

图3是显示定量在去细胞方法之前和之后从阔筋膜中提取的总DNA的图。

图4是显示定量在去细胞方法的不同阶段从真皮组织中提取的总蛋白的图。

图5是显示定量在去细胞方法的不同阶段从真皮组织中提取的生长因子SDF-1α(A)、VEGF(B)和bFGF(C)的图组。

图6是显示定量在去细胞方法之前和之后从真皮组织中提取的总DNA的图。

图7是显示定量在去细胞方法的不同阶段从骨松质中提取的总蛋白的图。

图8是显示定量在去细胞方法的不同阶段从骨松质中提取的生长因子SDF-1α(A)、VEGF(B)、bFGF(C)和IGF(D)的图组。

图9是显示定量在去细胞方法之前和之后从骨松质中提取的总DNA的图。

图10是显示定量在去细胞方法的不同阶段从骨皮质中提取的总蛋白的图。

图11是显示定量在去细胞方法的不同阶段从骨皮质中提取的生长因子SDF-1α(A)、VEGF(B)和bFGF(C)的图组。

图12是显示定量在去细胞方法之前和之后从骨皮质中提取的总DNA的图。

图13是显示增殖培养基(A)和成骨分化培养基(B)中ASC和DF的照片。

图14是显示根据传代次数ASC和DF的细胞增殖的图。

图15是显示在0.1％或5％的O₂下，无FBS的增殖培养基中ASC和DF的细胞存活的柱状图。

图16是显示在4.5g/l的葡萄糖，0.1％或5％的O₂的增殖培养基中，5种不同ASC/DF稀释物的KGF分泌(A)、b-FGF分泌(B)、IGF-1分泌(C)和HGF分泌(D)的柱状图组。

图17是显示在4.5g/l的葡萄糖，0.1％的O₂的增殖培养基中，5种不同ASC/DF稀释物的VEGF分泌(A)和SDF-1α分泌(B)的柱状图组。

图18是显示在4.5g/l的葡萄糖，5％的O₂的增殖培养基中，5种不同ASC/DF稀释物的VEGF分泌(A)和SDF-1α分泌(B)的柱状图组。

图19是显示在4.5g/l的葡萄糖，21％的O₂的增殖培养基中，5种不同ASC/DF稀释物的SDF-1α分泌的柱状图。

图20是显示在1g/l的葡萄糖，0.1％的O₂的增殖培养基中，5种不同ASC/DF稀释物的VEGF分泌(A)和SDF-1α分泌(B)的柱状图组。

图21是显示在1g/l的葡萄糖，5％的O₂的增殖培养基中，5种不同ASC/DF稀释物的VEGF分泌(A)和SDF-1α分泌(B)的柱状图组。

图22是显示在1g/l的葡萄糖，21％的O₂的增殖培养基中，5种不同ASC/DF稀释物的SDF-1α分泌的柱状图。

图23是显示在1g/l的葡萄糖和5％的O₂(浅灰色)或0.1％的O₂(深灰色)下，来自AMSC、真皮成纤维细胞(FD)和角质形成细胞(Kc)的VEGF分泌(A)、SDF-1α分泌(B)和KGF分泌(C)的图组。

图24是显示在5％的O₂和1g/l(浅灰色)或4.5g/l(深灰色)的葡萄糖浓度下，来自AMSC、真皮成纤维细胞(FD)和角质形成细胞(Kc)的VEGF分泌(A)、SDF-1α分泌(B)和KGF分泌(C)的图组。

图25是显示在生理学条件下(5％的O₂和1g/l的葡萄糖，浅灰色)和糖尿病患者的创伤条件下(0.1％的O₂和4.5g/l地葡萄糖，深灰色)，来自AMSC、真皮成纤维细胞(FD)和角质形成细胞(Kc)的VEGF分泌(A)、SDF-1α分泌(B)和KGF分泌(C)的图组。

图26是显示在0.1％的O₂和1g/l的葡萄糖(0.1％nmglc)、0.1％的O₂和4.5g/l的葡萄糖(0.1％Hglc)、5％的O₂和1g/l的葡萄糖(5％nmglc)、以及5％的O₂和4.5g/l的葡萄糖(5％Hglc)中，来自糖尿病患者或非糖尿病患者的人类供体的AMSC(A)和真皮成纤维细胞(B)的VEGF分泌的图组。

图27是显示在0.1％的O₂和1g/l的葡萄糖(0.1％nmglc)、0.1％的O₂和4.5g/l的葡萄糖(0.1％Hglc)、5％的O₂和1g/l的葡萄糖(5％nmglc)、以及5％的O₂和4.5g/l的葡萄糖(5％Hglc)中，来自糖尿病患者或非糖尿病患者的人类供体的AMSC(A)和真皮成纤维细胞(B)的KGF分泌的图组。

图28是显示ASC的间充质谱系分化的照片：分别通过茜素红染色(钙沉积)(A)、阿尔辛蓝染色(葡糖胺聚糖沉积)(B)和油红(细胞内脂滴)(C)证明软骨形成和脂肪形成的分化能力(放大率×20)。

图29是显示相比塑料孔板上的ASC，在HACM上的ASC的铺展(A)和贴壁(B)的图。

图30是显示在裸鼠中植入复合移植物(HACM+ASC)和单独的支架(HACM，对照)后1个月和3个月的组织学分析和宏观分析的照片。

图31是显示在常氧(21％的O₂)或低氧(0.1％的O₂)期间由ASC分泌的VEGF的图。

图32是显示与单独地HACM相比，皮下植入HACM+ASC后1个月裸鼠的真皮血管密度(血管计数/2.56cm²)(p＝0.002；每个载玻片分析5个感兴趣的区域)的图。

图33是显示患有放射性坏死的患者1的临床演化的照片。

图34是显示植入前(1)、植入时(2)以及植入后22个月、4个月和2个月后(分别为患者1、患者2和患者3)(3)的患者1(A)、患者2(B)和患者3(C)的临床演化的照片。

图35是显示在植入时和植入后3天、13天和28天C-反应蛋白(CRP)和纤维蛋白原浓度的图。

图36是显示患者1在植入后第0天(A)和第56天(B)的创面床组织的Masson三色染色的宏观组织学照片。

图37是显示患者1在植入之前(浅灰色)和之后(深灰色)的VEGF和因子VIII(A)以及CD3和CD68(B)的组织形态学计量半定量分析的图。

图38是显示在患者2中，在第0天，在宏观上(1)和在真皮组织水平上(2)，单独地皮肤自体移植物(A)、在复合移植物HACM+ASC植入后的皮肤自体移植物(B)和单独地HACM植入后的皮肤自体移植物(C)的创伤闭合演化的图组；以及在创伤闭合的最大持续时间(分别为28天、65天和16天)(3)，单独地皮肤自体移植物(A)、在复合移植物HACM+ASC植入后的皮肤自体移植物(B)和单独地HACM植入后的皮肤自体移植物(C)的创伤闭合演化的图组。

图39是显示相对于常氧(21％的O₂)，在低氧(0.1％的O₂)中的BM-MSC和ASC存活的图。

图40是显示在常氧(21％的O₂)和低氧(0.1％的O₂)中BM-MSC和ASC的VEGF(A)、FGF-β(B)、IGF-1(C)、TGF-β(D)和HGF(E)分泌的图组。结果以平均值±SEM表示。

图41是显示与在塑料孔(直线)上的细胞铺展相比，在HACM(分别为三角形和正方形)上BM-MSC和ASC的细胞铺展的图(*p＜0.05)。

图42是显示与在塑料孔(直线)上的细胞铺展相比，在HACM(分别为三角形和正方形)上BM-MSC和ASC的细胞生长的图(*§p＜0.05)。

图43是用ASC或BM-MSC再细胞化的HACM，或单独地用HACM处理的肌肉坏死的血管生成(A)和纤维化厚度(B)的图组。结果表示为与未经处理的肌肉坏死(空白组)比较的比率。

图44是显示在植入后30天，分离移植物，即用ASC或用BM-MSC再细胞化的HACM或单独的HACM的血管生成的图(p＜0.05)。

实施例

通过以下实施例进一步说明本发明。

实施例1：去细胞基质的生物活性

材料和方法

人体组织的去细胞化

根据欧洲肌肉骨骼移植协会(EAMST，维也纳，1997)的通用标准获得人的阔筋膜和真皮组织。

将人的阔筋膜在纯的丙酮中处理最多24小时，在乙醚中处理15小时，然后在70℃的乙醇中处理最多8小时。在每个步骤之间，将组织在连续的软化水流中强烈地洗涤。然后用1N的NaOH和NaCl的组合处理人的阔筋膜1小时，并用15％的H₂O₂处理其最多8小时。用软化水进一步强烈地洗涤组织最多68小时。

将人的真皮组织在乙醚中处理8小时，然后在70℃乙醇中处理最多16小时，并用软化水洗涤7小时。然后将人的真皮组织用1N的NaOH和NaCl的组合处理1小时，然后用软化水洗涤16小时，然后用15％的H₂O₂处理最多15小时。用软化水进一步强烈地洗涤组织最多16小时。

人的骨松质由胫骨获得，骨皮质来自跟骨。

骨组织(骨松质和骨皮质)的处理以离心开始以除去骨髓和血液。离心后，切割移植物并用软化水清洗。然后将骨组织在丙酮中处理最多68小时，然后洗涤5小时。然后将骨组织用1N的NaOH和NaCl的组合处理1小时，然后用软化水洗涤3小时，然后用15％的H₂O₂处理最多15小时。进一步用软化水强烈洗涤组织最多72小时。

在去细胞化方法的每个阶段，取样用于蛋白质提取。此外，在天然组织上即在去细胞化前和在去细胞组织上即在去细胞化方法结束时定量总DNA。

蛋白质提取和纯化

根据Wolf等人(Biomaterials.2012,33(10):2916-2925)的方案，从人的阔筋膜和真皮组织提取蛋白质。简言之，用pH7.4的5ml尿素-肝素缓冲液(2M的尿素、50mM的三羟甲基氨基甲烷、5mg/ml的肝素、10mM的N-乙基马来酰亚胺、5mM的苯甲脒和1mM的苯甲基磺酰氟)孵育300mg组织，在4℃的温度下搅拌最长24小时。以3000g的速度离心30分钟后，除去上清液，并根据相同的提取方案处理。然后通过排阻色谱纯化第二上清液并通过ELISA定量。

根据Pietrzal等人(Radiat Oncol.2007,2(1):5)的方案提取来自人的骨组织的蛋白质。简言之，将骨松质和骨皮质机械地压碎以获得骨粉末。将300mg湿重的骨粉末用5ml包含4M胍和5mM苯甲脒的溶液在4℃的温度下孵育最长24小时。然后添加5ml三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液并在4℃下孵育最长5小时。离心10分钟后，除去上清液，通过排阻色谱纯化并通过ELISA定量。

根据供应商的说明，用BCA分析试剂盒进行总蛋白的确定。

对于每个样品，通过ELISA试剂盒定量生长因子水平。

结果

对于人的阔筋膜和真皮组织，总蛋白的定量显示蛋白质水平随着去细胞化方法而减少(图1和图4)。对于骨组织，骨松质和骨皮质二者，在最后阶段的增加前，在处理的每个阶段总蛋白质均减少(图7和图10)。这可能是由于γ辐照会促进降解蛋白质的片段间的氢相互作用和/或二硫键形成。

细胞因子定量的结果也显示生长因子水平在治疗过程中剧烈减少(图2、图5、图8和图11)。特别地，在去细胞化方法的每个阶段，VEGF和IGF水平剧烈减少(图2B和图2D、图5B、图8B和图8D以及图11B)。在组织中未发现PDGFBB和BMP2。

对于所有测试的组织，DNA定量也显示相比于在天然组织中的DNA，在去细胞的基质中存在的DNA剧烈减少(图3、图6、图9和图12)。结果显示，阔筋膜的DNA含量去除82％，真皮组织的DNA含量去除35％，骨松质的DNA含量去除69％，骨皮质的DNA含量去除65％。

总之，这些结果显示了剧烈的蛋白质降解，特别是细胞因子的降解和DNA去除。因此，通过本发明的方法获得的去细胞的基质是惰性材料，并且可以向患者施用，而不必担心排斥或出现新的病理。

实施例2：ASC生长因子分泌

材料和方法

该研究是根据比利时卫生部的指南进行的。所有程序得到了医学院的伦理委员会(鲁汶天主教大学)批准用于组织获得和临床研究(B40320108280)。除非另外指出，否则所有材料均从Lonza(韦尔维耶，瑞士)、Sigma-Aldrich(圣路易斯，密苏里州，美国)或Invitrogen(卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)获得。

ASC和DF的分离和培养

在知情同意和血清学筛选后，通过分别使用Coleman技术的脂肪抽吸和皮肤活组织检查在经历选择性整形手术的8位患者(表1)中进行人脂肪(平均：7.4g)和真皮(平均：1.5cm²)组织的组合收获。在脂肪衍生的干细胞(ASC)和真皮成纤维细胞(DF)分离前，将脂肪组织和皮肤样品在4℃的无菌条件下保持最长60分钟。

表1：结合的ASC/DF供体特征

在37℃的水浴中将脂肪组织用胶原酶(1/2重量/体积)消化60分钟。胶原酶在补充有10％胎牛血清的Dulbecco改进Eagle培养基(DMEM)中失活。收集的组织在室温下以1500rpm离心10分钟。将团块悬浮于在增殖培养基中，并通过500-μm筛网过滤，增殖培养基由补充有10％胎牛血清、L-谷氨酰胺(2mM)和抗生素(100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和1μl/ml两性霉素B)的DMEM形成。然后将收集的悬浮液接种在具有增殖培养基的25cm²培养瓶中。

通过从去表皮化的真皮活组织标本中提取来分离DF，切碎为2mm×2mm的碎片并放置在塑料孔中。添加小体积的增殖培养基以避免从塑料表面分离。

在37℃和5％的CO₂下培养24小时后，增殖培养基被替换。原代细胞的该最初传代被称为传代0。当贴壁细胞在组织碎片周围的塑料表面上可见时，从培养皿中除去真皮片。在连续的胰蛋白酶消化后，将细胞维持在增殖培养基(更换2次/周)直至传代4。培养来自3个供体的细胞直到传代15以研究在标准培养条件(37℃，21％的O₂，5％的CO₂，4.5g/l的葡萄糖)下的增殖模式。

膜标志物模式的表征

在传代4时，通过荧光激活细胞分选术(FACScan；BD Biosciences，圣何塞，加利福尼亚州)，对于标准细胞表面标志物(CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、stro-1、CD106、CD146、CD166、CD19、CD31、CD11b、CD79α、CD13、HLA-DR、CD14、CD34)[Dominici等人，Cytotherapy.2006；8(4):315-317；Bourin等人，Cytotherapy.2013；15:641-648]表征ASC和DF。

简单地说，将ASC用饱和量的以下单克隆抗体染色：抗-Stro-1、抗CD90、抗CD106、抗CD105、抗CD146、抗CD166、抗CD44、抗CD19、抗CD45(人间充质干细胞标志物抗体组，R&DSystem，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国)、抗CD44(PE小鼠抗人CD44，BD Bioscience，富兰克林湖，新泽西州，美国)、抗CD73(FITC小鼠抗人CD73，BD Bioscience)、抗CD31(FITC，小鼠抗人，Abcam，剑桥，英国)、抗CD11b(FITC，小鼠抗人，Abcam，剑桥，英国)、抗CD79α(PE，小鼠抗人，Abcam，剑桥，英国)、抗CD13(FITC，小鼠抗人，Abcam，剑桥，英国)、抗HLA-DR(FITC，小鼠抗人，Abcam，剑桥，英国)、抗CD14(FITC，小鼠抗人，Abcam，剑桥，英国)、抗CD34(PE，小鼠抗人，Abcam，剑桥，英国)。使用CellquestPro软件通过流式细胞术分析至少10000个门控事件。结果以平均荧光强度(MFI)表示，并表示为阳性细胞的百分比(阈值：同种型的95％)。

分化能力

在特定培养基中在传代4时测试ASC和DF，以评估向成骨谱系分化的能力。在特定的分化培养基中(补充有地塞米松(1μM)、抗坏血酸钠(50μg/ml)和磷酸二氢钠(36mg/ml)的增殖培养基)培养细胞3周的时间后，通过茜素红染色来评估分化[Qu等人，In Vitro CellDev Biol Anim.2007；43:95-100]。福尔马林固定后，通过用茜素红染色磷酸钙确认成骨分化。此外，进行骨钙蛋白的免疫组织化学法以确认骨表型。

氧张力和胎牛血清(FBS)对细胞增殖的影响：EdU试验

使用 EdU Alexa 488流式细胞术试验试剂盒(LifeTechnology，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)通过5-乙炔基-2'-脱氧尿苷并入的直接DNA合成测量来测试细胞增殖能力。将ASC(n＝3)和DF(n＝3)以5000个细胞/cm²的密度接种在21.5cm²培养皿中，并在10％的FBS，21％的O₂中培养24小时。然后通过用不含FBS的相同增殖培养基替换增殖培养基24小时来终止细胞增殖。最后在特定的条件下放置细胞48小时：在补充有1％的FBS或5％的FBS和EdU(5-乙炔基-2'-脱氧尿苷，其是胸苷的核苷类似物，并在活性DNA合成期间并入DNA中)的增殖培养基中添加0.1％的O₂、5％的O₂和21％的O₂。用Alexa488显示后，通过流式细胞术(FACScan；BD Biosciences,圣何塞，加利福尼亚州)对阳性细胞计数。

生长因子分泌模式

胰蛋白酶消化后，计数细胞(传代3之后)并获得5个渐进的稀释度：100％ASC+0％DF；75％ASC+25％DF；50％ASC+50％DF；25％ASC+75％DF；和0％ASC+100％DF，并在12孔培养板中接种，细胞处于约80％至95％融合的密度，一式三份用于在0.1％的O₂和5％的O₂的低氧室(Modular Incubator Chamber MIC-101；Billups-Rothenberg，德尔玛，加利福尼亚州，美国)中培养，0.1％的O₂和5％的O₂分别对应于高度低氧环境和组织的氧张力。将细胞(对于每种稀释度和氧张力)暴露于正常血糖(1g/L)或高血糖(4.5g/L)的增殖培养基。在这些受控的条件下孵育24小时后；单独地收集细胞培养上清液并储存在-20℃下，用于进一步的通过酶联免疫吸附测定法(通过Quantikine ELISA试剂盒提供的VEGF、HGF、IGF-1、SDF-1α和基础FGF；R&D System，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国)来定量生长因子。通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑溶液(MTS；Promega，莱顿，荷兰)试验在低氧应激后立即评估细胞存活。低氧/血糖应激测试和生长因子定量分别一式三份和一式两份地进行。结果以皮克每毫米表示。

统计学分析

使用单样本Kolmogorov测试和Q-Q图来评估值的正态分布。通过成对的t测试和使用Bonferroni事后检验的单向方差分析来测试组间(具有正态分布)的统计学显著性差异。统计学测试用PASW 18(SPSS；IBM，纽约，纽约州，美国)进行；p<0.05被认为是显著的。

结果

表面标志物模式并不允许两种细胞群体间的区分(表2)。

表2：人类ASC和DF的表面标志物表征

ASC和DF对于间充质细胞标志物(CD13、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166)为阳性(阳性细胞>90％)，对于内皮细胞(CD31)、骨髓衍生的基质细胞(CD106、Stro-1、CD146)和造血标志物(CD14、CD45、CD11b、CD34)，以及对HLA-DR、CD79α和CD19是阴性的。在特异性分化培养基中培养后(图13)，通过茜素红染色和骨钙蛋白免疫组织化学法证实了ASC和DF二者的成骨分化能力。

ASC和DF直到传代15具有相似的增殖模式(图14，NS)。

在不含FBS的0.1％的O₂和5％的O₂下培养24小时后，ASC和DF的存活没有被显著地影响(图15)。在5％的O₂下，当与ASC相比时，DF存活降低(ASC存活为87.04％，p<0.05)。

来自ASC和DF的连续稀释的HGF、IGF-1、bFGF和KGF分泌(在0.1％和5％的O₂，4.5g/l的葡萄糖)的研究没有表明任何显著的曲线(图16)。

然而，对于VEGF和SDF-1α，观察到ASC被DF“污染”后的线性回归。事实上，SDF-1α分泌水平随着ASC比例的增加而降低。这个结果在不同的氧张力(21％、5％或0.1％)或葡萄糖浓度(1g/l或4.5g/l)条件下发现(图17至图22)。此外，在高葡萄糖培养条件下，在0.1％的O₂和5％的O₂下，VEGF分泌水平随着ASC比例的增加而增加(图17A和18A)。在低葡萄糖条件下的相同测量表明在5％的O₂下VEGF分泌的显著线性回归(图20A)。

由于DF释放较高水平的SDF-1α，且ASC以较高速率产生VEGF，因此该关系是颠倒的，这允许测量细胞比例(ASC纯度)。

实施例3：在低氧和高血糖中的ASC行为

材料和方法

该研究是根据比利时卫生部的指南进行的。所有程序通过了医学院的伦理委员会(鲁汶天主教大学)批准。

ASC、DF和角质形成细胞的分离和培养

在知情同意和血清学筛选后，分别通过使用Coleman技术的脂肪抽吸和皮肤活组织检查在经历选择性整形手术的8位患者(表1)中进行人脂肪(平均：7.4g)和真皮(平均：1.5cm²)组织的组合收获。在脂肪衍生的干细胞(ASC)和真皮成纤维细胞(DF)分离前，将脂肪组织和皮肤样品在无菌条件下在4℃下保持最长60分钟。

将脂肪组织用胶原酶(1/2重量/体积)在37℃的水浴中消化60分钟。胶原酶在补充有10％的胎牛血清的Dulbecco改进Eagle培养基(DMEM)中失活。收集的组织在室温下以1500rpm离心10分钟。将团块悬浮于由补充有10％的胎牛血清、L-谷氨酰胺(2mM)和抗生素(100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和1μl/ml两性霉素B)的DMEM组成的增殖培养基中，并通过500-μm筛网过滤。然后将收集的悬浮液接种在具有增殖培养基的25cm²培养瓶中。

通过从去表皮化的真皮活组织标本中提取来分离DF，切碎为2mm×2mm的碎片并放置在塑料孔中。添加小体积的增殖培养基以避免从塑料表面分离。

根据供应商的说明，从ATCC(PCS-200-011)购买角质形成细胞，并用角质形成细胞生长试剂盒(ATCC，PCS-200-040^TM)培养。

在37℃和5％的CO₂下培养24小时后，增殖培养基被替换。原代细胞的该最初传代被称为传代0。当贴壁细胞在组织碎片周围的塑料表面上可见时，从培养皿中除去真皮片。在连续的胰蛋白酶消化后，将细胞维持在增殖培养基(更换2次/周)直至传代4。

生长因子分泌模式

在胰蛋白酶消化后，在12孔培养板中接种细胞(传代4后)，细胞处于导致约80％至95％融合的密度，一式三份用于在0.1％的O₂和5％的O₂的低氧室(Modular IncubatorChamber MIC-101；Billups-Rothenberg，德尔玛，加利福尼亚州，美国)中培养，0.1％的O₂和5％的O₂分别对应于高度低氧环境和组织的氧张力。将细胞(对于每种稀释度和氧张力)暴露于正常血糖(1g/L)或高血糖(4.5g/L)的增殖培养基。在这些受控的条件下孵育24小时后；单独地收集细胞培养上清液并储存在-20℃下，用于进一步通过酶联免疫吸附测定法(通过Quantikine ELISA试剂盒提供的VEGF、SDF-1α和KGF；R&D System，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国)来定量生长因子。低氧/血糖应激测试和生长因子定量分别一式三份和一式两份地进行。结果以皮克每毫米表示。

统计学分析

使用单样本Kolmogorov测试和Q-Q图来评估值的正态分布。通过成对的t测试和使用Bonferroni事后检验的单向方差来分析测试组间(具有正态分布)的统计学显著性差异。统计学测试用PASW 18(SPSS；IBM，纽约，纽约州，美国)进行；p<0.05则被认为是显著的。

结果

当细胞暴露于低氧条件即0.1％的O₂时，相比生理学O₂张力即在5％的O₂下，它们分泌更高水平的VEGF(图23A)。与常氧相比，只有角质形成细胞在低氧中表现出SDF-1α和KGF表达的显著增加，然而水平仍然非常低(图23B和图23C)。

相比于正常血糖(1g/l)，在高血糖即4.5g/l的葡萄糖中培养的ASC显示出VEGF分泌的略微减少，而成纤维细胞的VEGF分泌下降大于70％(图24A)。ASC和成纤维细胞二者的SDF-1α表达水平均减少，且对于所有细胞类型，KGF分泌基本相似(图24B和图24C)。

在低氧和高血糖中，其对应于糖尿病患者的创伤条件，ASC比在常氧和正常血糖下分泌显著更多的VEGF(在0.1％的O₂和4.5g/L的葡萄糖下为283.94pg/ml，相比之下在5％的O₂和1g/l的葡萄糖下为171.13pg/ml；图25A)。相比之下，成纤维细胞在低氧和高血糖中比在常氧和正常血糖中分泌更低水平的VEGF。

这些结果显示，在低氧中、在高血糖中、以及在低氧和高血糖中，ASC比成纤维细胞分泌更多的生长因子VEGF。此外，与生理学条件相比，糖尿病患者的创伤条件导致来自ASC的VEGF分泌增加。因此，ASC可以在糖尿病患者的环境中释放VEGF来促进新血管生成，并因此可以促进糖尿病患者创伤的修复。

另外，来自非糖尿病人供体的ASC或来自糖尿病人供体的ASC的VEGF分泌模式是相似的(图26A)。具体来说，来自糖尿病人供体的ASC的VEGF分泌与来自非糖尿病人供体的ASC的VEGF分泌一样高或更高。相比之下，来自糖尿病人供体的成纤维细胞比来自非糖尿病人供体的成纤维细胞分泌更少的VEGF(图26B)。

与VEGF分泌相比，来自非糖尿病人供体的ASC的KGF分泌不同于来自糖尿病人供体的ASC的KGF分泌(图27A)。此外，对于ASC和成纤维细胞，无论其是来自非糖尿病人供体还是来自糖尿病人供体，均发现相似的KGF分泌模式(图27)。

总之，这些结果显示了来自糖尿病患者对象的MSC也可以释放VEGF以促进新生血管形成，并因此可以促进创伤修复，例如糖尿病患者的创伤修复。

因此，本发明的MSC群体可以来源于待治疗的对象的组织。

实施例4：真皮再生

材料和方法

所有程序通过医学院的伦理委员会(鲁汶天主教大学)批准用于组织获得和临床研究(B40320108280)，并通过当地的动物护理伦理委员会批准用于人体和临床前研究。

人的ASC

分离和表征

在知情同意和血清学筛选后，使用科尔曼技术(Coleman，Clin Plast Surg.2001；28：111-119)，通过脂肪抽吸在选择性整形手术期间在八位患者中收获人的ASC，(腹壁皮肤脂肪切除术(n＝3)或乳房整形术(n＝5)，平均6.2g(1.4至14.6g)的脂肪组织)。

将脂肪组织用GMP胶原酶(0.075g；Serva Electrophoresis GmbH，海德尔堡，德国)在37℃的水浴中消化60分钟。组织消化后，在离心后收集细胞，并在连续的胰蛋白酶消化后保持在增殖培养基中直至传代4(或更多传代用于遗传研究)，以获得纯的ASC群体(在4次传代后ASC＞90％)。通过荧光激活细胞分选(FACScan；BD Biosciences，圣何塞，加利福尼亚州)，对于膜标志物模式(CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19、HLA-DR)(Dominici等人，Cytotherapy 2006；8(4):315-317)来表征细胞，并在特定的培养基中测试以评估间充质分化能力(脂肪生成、软骨形成、骨生成)(Schubert等人，Biomaterials.2011；32：8880-8891；Cui等人，Biomaterials.2009；30：2683-2693)。

将ASC也接种在12孔培养板中，分别用于在0.1％(如在坏死组织中的高度低氧环境)或21％的O₂水平(大气常氧，正常的培养条件)的低氧室(Modular Incubator ChamberMIC-101；Billups-Rothenberg，德尔玛，加利福尼亚州，美国)中孵育72小时。孵育后，单独收获细胞培养上清液并储存在-20℃下用于VEGF定量(Quantikine ELISA试剂盒VEGF；R&DSystem，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国)。

通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑溶液(MTS；Promega，莱顿市，荷兰)(Vériter等人，Biomaterials 2011；32:5945-5956)评估细胞存活。

ASC的离体遗传稳定性

通过核型和荧光原位杂交(FISH)分析，在不同次传代后研究细胞遗传的稳定性，以评估生物学敷料的细胞成分的致癌安全性。根据标准方案从5个供体的ASC获得中期染色体。简单地说，在1次、4次、10次、12次和16次传代后，用0.02μg/ml的Colcemid(Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)处理处于指数生长期的经培养的细胞4小时。在胰蛋白酶消化后，将来自烧瓶的收获细胞在低渗的0.055M KCl中在37℃下孵育30分钟并固定在3:1的甲醇：冰醋酸中。根据标准程序(Duhoux等人，PLoS ONE.2011；6：e26311)进行染色体收获和中期染色体载玻片制备。分析11至20个反胰蛋白酶-Wright G带状(GTW)中期染色体，并根据用于人类细胞遗传学术语的2013年国际系统(ISCN 2013)报告核型。根据标准方案(Vériter等人，Biomaterials.2011；32:5945-5956)进行FISH分析以使用TelVysion 5q(SpectrumOrange)、CEP7/D7Z1(SpectrumGreen或SpectrumOrange)、CEP8/D8Z2(SpectrumOrange或SpectrumGreen)和CEP18/D18Z1(SpectrumGreen)探针(AbbotMolecular，奥蒂尼/新鲁汶，比利时)来检测染色体5、7、8和18的非整倍性。对传代1、传代4和传代16计数200个细胞核，对传代10计数120个细胞核，对传代12计数73个细胞核(根据Beta法计算阈值，置信区间为99.9％)。

生物学敷料的开发

在传代4时，在人的无细胞胶原蛋白基质上和在作为对照的塑料孔上比较ASC贴壁和铺展的能力(Dufrane等人，Biomaterials 2008；29：2237-2248)(HACM：冻干的去细胞同种异体的人阔筋膜，来自Tissue Bank，圣吕克大学医院，布鲁塞尔，比利时)。如已经描述的(Bacallao和Stelzer，Methods Cell Biol.1989；31：437-452)，通过共聚焦激光扫描显微术(CLSM)评估细胞贴壁。

简单地说，将人的ASC以2×10⁵个细胞/孔的密度接种在24孔中经处理的阔筋膜上。在接种后，每2天直到第15天和每3天直到第30天，将HACM在磷酸盐缓冲盐水中洗涤以除去培养基，然后将它们浸入2μM的钙黄绿素乙酰氧基甲基酯(AM；Molecular Probes EuropeBV，莱顿市，荷兰)约3小时以通过CLSM检查。使用Scion Image Beta 4.02n获得物和分析软件(Scion Corporation，托伦斯，加利福尼亚州)确定总的细胞覆盖面积、细胞周长和形状因子[(面积/周长²)×4π]。

为了评估生物学敷料在体内的肿瘤学安全性和功效，生物学敷料片(10mm×10mm)和单独的支架片(10mm×10mm)被植入裸鼠皮下(n＝10；Charles River LaboratoriesInternational，威明顿，马萨诸塞州，美国)。

在全身麻醉下(异氟烷3％)，在每个脊柱旁区域中抬起三角皮瓣以形成两个皮下袋，以允许放置移植物(HACM+ASC在右侧，单独的HACM在左侧)。在每个皮瓣的内侧施加热损伤(真皮坏死)以再现低氧创伤环境。将生物学敷料(HACM+ASC)植入，使细胞与右侧烧伤的真皮接触，而将单独的HACM植入左侧脊椎旁区域。放置5至8个酞菁锂(LiPC晶体)晶体后，用不可吸收的缝线闭合皮瓣以允许进一步测量植入后组织内的氧合过程。

使用电子顺磁共振血氧定量法(EPR光谱仪；Magnettech，柏林，德国)以追踪组织内PO₂过程，并评估复合移植物改善裸鼠中组织氧合的能力。在气体麻醉(异氟烷)下植入后，每周一次地研究损伤真皮中的PO₂至4周。结果以植入后第6天的组织氧合的百分比表示。

在植入后1个月(n＝5)或3个月(n＝5)，对移植物以及周围组织进行完全切除用于宏观和组织学的分析(用于局部肿瘤发展和血管生成的苏木精伊红染色和马松三色染色)。

用于真皮重建的临床应用

对三名具有未愈合创伤的患者提供生物学敷料(表3)。收获脐周的脂肪组织(分别为22g、8g和21g)(使用局部麻醉下的科尔曼技术)用于符合药品生产质量管理规范(GoodManufacturing Practices)建议的ASC分离和培养。

表3：患者特征

在传代3时，胰蛋白酶消化ASC，在DMEM中重悬浮，并装载在冷冻干燥的HACM上(对应于传代4)。当ASC覆盖大于90％的HACM时获得生物学敷料。最后，用CMRL(Mediatec，马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国)冲洗复合移植物并将其转移至手术室用于植入(ASC装载在HACM的上侧)。

在这三名患者中，在植入前通过水动力清创进行创伤清创以确保创伤床污染的最小化。将复合移植物切割成理想大小，其方向为使细胞层与创伤表面直接接触，并用不可吸收的缝线固定。跟踪炎症参数(C反应蛋白、纤维蛋白原)，以及临床和组织学过程。每天应用并更换凡士林敷料。在植入之前和之后进行活组织检查用于免疫组织化学和组织形态测定，以研究炎症反应、血管生成和组织重塑(分别为CD3/CD68、VEGF/因子VIII和马松三色)。

统计学分析

使用单样本Kolmogorov-Smirnov测试和Q-Q图来评估值的正态分布。通过配对的t测试和使用Bonferroni事后检验的单向方差分析来测试组间的统计学显著性差异(具有正态分布)。使用Systat 8.0版(Cranes Software International，班加罗尔，印度)或PASW18(SPSS；IBM，纽约，纽约州，美国)进行统计学测试；p<0.05则被认为是显著的。

结果

ASC+HACM的体外和体内安全性

在第4次传代时，ASC的特征为间充质基质细胞表面标志物的模式、对于矿化的阳性标志物、透明沉积物和脂质液泡，间充质基质细胞表面标志物的模式为：CD44+(>95％的细胞)、CD73+(>90％)、CD90+(>95％)、CD105+(>95％)、CD45-(<5％)、CD34-(<7％)、CD14-(<7％)、CD11b-(<7％)、CD79α-(<7％)、CD19-(<5％)和HLA-DR-(<7％)(表4)。

表4：通过未分化的ASC的流式细胞术表征膜标志物表型

还在特定的培养基中表征ASC以评估间充质分化能力(脂肪生成、软骨形成、骨生成)(图28)。

接种后一天，大多数ASC在两种细胞支持物上呈现圆形(平均形状因子：0.93±0.13)，平均表面覆盖为4.8％(不显著)。

在接种后第3天至第18天，与HACM相比，发现塑料孔的显著更高的细胞膨胀区域(p<0.005)。在HACM上发现完整的表面覆盖率比在塑料孔上晚1周。与塑料孔相比，在HACM上发现相似的ASC铺展(形状因子)的延迟(p<0.005)(图29)。覆盖被延迟，但在HACM上和在塑料孔上达到相同的细胞生长。

体外安全性研究显示：在传代1、传代4和晚期传代(传代10、传代12或传代16)中，ASC的核型上没有克隆结构染色体畸变。在所有传代中，通过间期细胞上的FISH分析(截止值：4.5％)，检测至少两个测试染色体的边界四倍体(1.5％至5.5％)。该技术还显示了在传代16时在15％的间期细胞中具有疑似单体性7的克隆。这些非整倍体细胞似乎不具有增殖优势，因为它们在中期细胞中未被检测到。

宏观和微观分析没有从免疫低下的大鼠(植入后的1个月和3个月)的分离组织中发现任何局部肿瘤发展(图30)。

ASC+HACM(生物学敷料)的体外和体内功效

比较孵育72小时后在0.1％的O₂张力下的细胞活力与在21％的O₂张力下的细胞活力(p＝0.034)。低氧对ASC活力不具有有害影响，而与21％的O₂张力相比，在低氧条件下(0.1％的O₂张力)VEGF的分泌显著更高(p<0.001；n＝8)(图31)。

在真皮损伤后第6天(对于每个个体的接受者)的真皮氧合被认为是基线。使用HACM加ASC在深处真皮(热损伤后)的氧张力比率比使用单独的HACM显著更高(P<0.05，在植入后第13天、第21天和第27天)。与和HACM单独接触的真皮相比，在用HACM加ASC重建的真皮中一致地发现显著更高的血管密度(p＝0.002)(图32)。

临床应用

ASC在第3次传代结束时被胰蛋白酶消化，然后接种在HACM上以在胶原支架上获得第4次传代。当90％的HACM表面覆盖ASC时(5.8×10⁵个细胞每cm²)获得植入物。从细胞分离直到传递，平均133天实现整个敷料的制造(表5)。

表5：生物学敷料的临床级生产的时间设定

植入后，在第3天发生移植物的最初结合，然后逐渐再吸收胶原蛋白基质，这在植入后大约第28天完成，在创伤床表面留下充分血管化的肉芽组织(图33)。

在患者1中，植入后第60天实现完全的创伤闭合并保持(大于22个月)。在患者2和患者3中，在ASC植入后6周对血管化的肉芽组织进行皮肤自体移植。3天后(第一次敷料打开)，皮肤自体移植物完全整合并伴有疼痛缓解；患者2和患者3分别在植入6个月和3个月后停止日常护理(图34)。在这两名患者中发生了溃疡复发，可能是因为创伤的全身性病因(镰状细胞病和血管炎)。

尽管植入后1周出现显著增加的C反应蛋白和纤维蛋白原，但没有观察到慢性炎症；手术后1个月发现C反应蛋白和纤维蛋白原减少至基础值(图35)。

与敷料植入前的强纤维化相比，植入后活组织检查结果显示有序的血管化组织(图36)。在植入后的组织中发现显著增加的VEGF(p<0.001)和因子VIII(p<0.05)(图37A)。植入后发现显著的巨噬细胞补充(p<0.05)，没有淋巴细胞渗透的改变(图37B)。在患者2中单独的HACM(无细胞)不提供有益的作用(图38)。

总之，这些结果表明，在HACM上的ASC可以支持真皮愈合的生理学恢复；ASC可以在高度低氧环境中存活并释放VEGF以促进新血管生成、肉芽组织的合成，并因此促进愈合的演化。

实施例5：骨骼肌再生

材料和方法

除非另外规定，否则所有材料均从Lonza(巴塞尔，瑞士)、Sigma-Aldrich(圣路易斯，密苏里州，美国)或Invitrogen(卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)获得。所有程序均通过当地鲁汶天主教大学的动物护理伦理委员会批准(2013/UCL/MD/022)。

BM-MSC和ASC的分离和表征

比利时长白猪(雌性，重量<100kg，年龄小于6个月；Rattlerow Seghers Ltd，洛克伦，比利时)被用作BM-MSC和ASC的供体。

收获肝素化的BM并与双倍体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)混合。以450g离心10分钟后，将细胞以10⁷个细胞/ml重悬浮，细胞悬浮液在Ficoll-Hypaque柱(密度1.077；淋巴细胞分离液，Nycomed，奥斯陆，挪威)上分层并以1250g离心30分钟。从界面收集单核细胞，并在PBS中以450g洗涤10分钟。将细胞放置在补充有10％的热灭活的胎牛血清(FBS)和抗生素(Vériter等人，Biomaterials.2011；32：5945-5956)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)的培养瓶中。

将脂肪组织(平均15g)用9％的NaCl洗涤3次，在Petri培养皿中切割以除去血管和纤维结缔组织，并置于在Hank平衡盐溶液(具有钙离子和镁离子)中重构的胶原酶(0.075g；Sigma-Aldrich)中，在37℃的振荡水浴中连续摇动60分钟。消化后，胶原酶在补充有10％的热灭活的FBS、L-谷氨酰胺(2mM)和抗生素(青霉素100U/ml、链霉素100mg/ml)的DMEM中灭活。收集的组织在室温下以450g离心10分钟。然后将团块重悬浮在由补充有10％FBS和抗生素(青霉素100U/ml和链霉素100mg/ml)的DMEM制成的增殖培养基(MP)中。通过500mm筛网过滤后，将组织在室温下以450g离心10分钟，然后重新悬浮在MP培养基中。原代细胞的该最初传代被称为传代0(P0)。在37℃下、5％的CO₂中培养24至48小时后，将培养物用PBS洗涤并保持在MP培养基中直至传代4(P4)，然后在特定培养基中分化(Schubert等人，Biomaterials.2011；32：8880-8891)。

通过显示与藻红蛋白(PE)结合的CD44、CD73、CD90和CD105抗体(BD Pharmigen，BDBiosciences)的平均荧光强度的阳性位移，而CD45抗原表达是阴性的，荧光激活细胞分选(通过流式细胞术用CellquestPro软件分析至少10000个事件；FACScan，BD Biosciences，富兰克林湖，新泽西州，美国)证实了间充质干细胞谱系。相反，外周血单核细胞(阴性对照)证明了对于CD45的阳性染色和对于CD44、CD73、CD90和CD105的阴性染色。在P4处，分别通过红油、茜素红和阿尔辛蓝染色证实了细胞向脂肪、成骨和软骨形成表型的分化。

低氧对BM-MSC和ASC的体外影响

将ASC和BM-MSC接种在12孔培养板中，并按先前描述的方案(Schubert等人，Biomaterials.2011；32:8880-8891)在低氧室(Modular Incubator Chamber MIC-101；Billups-Rothenberg,德尔玛，加利福尼亚州，美国)中孵育。将细胞在0.1％和21％的O₂水平下孵育72小时，这分别对应于高度低氧环境和大气常氧。在每种条件下72小时后，分别收获细胞培养上清液，离心，并储存在-20℃下用于之后的生长因子定量。

通过酶联免疫吸附试验(ELISA Quantikine Kit；R&D System，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国)获得VEGF、IGF-1、FGF、HGF和TGF-β1定量。不稀释样品，并遵循供应商的说明。通过设置在450nm且校正波长设定在690nm的Multiskan EX Labsystems分光光度计(Thermo Scientific，布雷达，荷兰)测量每个孔的光学密度。通过低氧和常氧之间的比率表示生长因子释放。

如先前所述(Schubert等人，Biomaterials.2011；32：8880-8891)，也通过MTS细胞增殖分析(MTS；Promega，莱顿市，荷兰)在常氧和低氧条件下评估细胞活力。培养后，通过设置在450nm且校正波长设定在690nm的Multiskan EX Labsystems分光光度计(ThermoScientific)测量每个孔的光学密度。

人的无细胞胶原蛋白基质(HACM)

在基于临床病史、血清学测试和微生物学测试的人组织供体筛选后，根据欧洲和比利时关于人体材料的立法获得选定供体的阔筋膜。通过使用由圣吕克大学医院的TissueBank(布鲁塞尔，比利时)的开发的方法如所述的制备人的阔筋膜腱，以获得不含化学残留物(丙酮/H₂O₂)且含有少于5％的残留水分的HACM。其通过在25000Gy下的γ射线(Sterigenics，弗勒吕斯，比利时)灭菌。然后将同种异体移植物储存在室温下(Dufrane等人，Biomaterials.2008,29：2237-2248)。

首先在来自天然组织(n＝4)的多聚甲醛固定(4％)切片和来自单独供体的经处理HACM(n＝4)上通过40,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；1μg/ml)染色(Abbot Molecular Inc.美国)评估(HACM的)去细胞化过程。使用荧光显微镜(Zeiss，扎芬特姆，比利时)用Infinity照相机和Delta Pix观察器程序观察组织切片。其次，用QIAamp kit DNA Mini Kit(Qiagen，希尔登，德国)对来自冷冻的天然基质(n＝4)和后处理基质(n＝4)的等体积石蜡样品进行DNA分离。使用波长设置在260nm的Qubit^TM荧光计(Invitrogen)通过荧光测定测量DNA浓度。结果以μg/ml的DNA分离溶液来表示。

MSC在HACM上的离体贴壁和铺展

在传代3(P3)结束时，比较MSC在HACM上铺展的细胞能力与在塑料孔上培养的细胞(作为对照)的细胞能力。如已经描述的(Dufrane等人，Biomaterials.2002,23：2979-2988)，通过共聚焦激光扫描显微术(CLSM)评估支架上的细胞贴壁。

在接种后第1天至第30天，通过CLSM研究(在塑料孔和HACM上)细胞贴壁和铺展。将两组MSC以2×10⁵个细胞/孔的密度接种在HACM和24-孔簇上。接种后，在第1天至第30天，将复合移植物从培养基中除去，在PBS中洗涤以除去培养基，并浸入钙黄绿素乙酰氧基甲酯(AM)2mm(Molecular Probes Europe BV，莱顿市，荷兰)大约3小时。然后，使用氰基丙烯酸酯胶将移植物(细胞加HACM)附着于载玻片，并使用×10空气透镜和来自氩离子激光器的488nm的激发波长线在CLSM(Bio-Rad MRC 1024)中检查。活细胞通过存在无处不在的细胞内酯酶活性来区分，该活性通过将实际上非荧光的细胞可渗透钙黄绿素AM转化为强烈的荧光钙黄绿素来确定。观察塑料孔中相同样品的细胞增殖情况。

在第30天的前一天，培养基被提取。将孔用PBS冲洗并浸入钙黄绿素AM中。使用Scion Image Beta 4.02获得数据和分析软件确定总的细胞面积和细胞周长。由于铺展引起的细胞形状变化，根据底物和时间还计算形状因子[(面积/周长²)×4π]。

复合移植物(HACM加MSC)的机械性能

机械地评估用MSC对HACM体外再细胞化的影响。在天然的人阔筋膜(n＝5)、再水合的冷冻干燥的HACM(n＝4)、在培养基中孵育4周的单独HACM(无MSC)(n＝4)、以及用MSC再细胞化的HACM(孵育4周后；n＝4)的一式三份的样品上进行单轴机械阻力测试。使用Instronbluehill软件(Model5600；Instron，坎顿，马萨诸塞州，美国)，用Instron牵引系统进行机械测试，负载-失效测试的伸长率为4mm×分钟^-1。对于每个测试，两个夹子间的距离为26.5mm。将样品切割成45mm的恒定长度和15mm的宽度。记录每个样品的厚度。记录基质的载荷-伸长行为和失效模式。基质的结构性质通过刚度(Nm×m^-1)和极限荷载(N)表示。刚度(k)以k＝ΔF/ΔL来计算，其中F是施加在样品上的力，L是沿相同自由度的力产生的位移(例如，被拉伸的弹簧的长度变化)。比较在每个实验组间的这些参数。

复合移植物HACM加MSC的体内功效

对于体重200g至300g(5周龄至8周龄)的裸鼠(n＝20；Charles RiverLaboratories International，威明顿，马萨诸塞州，美国)研发了两种骨骼肌缺陷的实验模型。通过吸入异氟醚引起麻醉并维持(Abbvie，瓦夫尔，比利时)以进行纵向腹部切开以暴露腹部的骨骼肌肉组织。

1.电凝法肌肉缺陷

在每只动物(n＝6)中，通过在腹腔肌肉上的电凝产生四个16mm²的坏死面积。电凝缺陷被：MSC加HACM(两个区，细胞与坏死区直接接触)；单独的HACM(一个区)；和空白(无移植物，一个区)覆盖。通过四个5.0针将植入物直接放置到与缺陷紧密接触。动物接受由HACM加ASC(n＝3)或BM-MSC(n＝3)制成的复合移植物。在HACM上孵育MSC21天至28天后，植入复合移植物。

2.腹壁的全厚度肌肉缺陷

在腹部肌肉壁(n＝14只裸鼠)中进行全厚度缺陷(1.5×2.5cm²)，使得内脏暴露。通过复合移植物(HACM加ASC，n＝4；HACM加BM-MSC，n＝4)或单独的HACM(n＝6)来处理缺陷。

在两种模型中，使用不可吸收的缝线闭合皮肤以覆盖植入部位。裸鼠在术后第30天通过在全身麻醉下心内注射T61(Intervet，博克斯梅尔，荷兰)杀死。然后进行移植物移出，并处理植入物用于组织形态测定。

宏观地评估在全厚度缺陷模型中移植物整合的炎症反应、移植整合、组织重塑、与内脏贴壁和疝气发生。

在植入后4周进行组织形态测定分析，以评估血管生成和组织重构。立即将植入物在4％的甲醛中固定过夜并石蜡包埋。将连续切片(5μm厚)固定在玻片上，并在37℃下干燥12小时。进行苏木精和伊红染色以及马松三色染色以评估血管增殖和重塑过程。另外，通过免疫染色抗肌萎缩蛋白来研究肌肉再定植(以1:450稀释并由EnVision抗兔单克隆抗体显示；Abcam，剑桥，英国)。

在马松染色后，在标准千分尺标度内的×12.5放大率下，通过测量天然完整的肌肉与植入物之间的距离(分别为HACM或不含MSC的HACM皮肤或含MSC的HACM皮肤和空白皮肤)来从组织形态学上定量(在电凝模型中)组织重塑。在每张载玻片上分析最少五个感兴趣区域(ROI)。通过用HACM(单独的或含MSC的)与空白的厚度的比率来计算组织重塑。在腹壁缺陷模型中，进行肌萎缩蛋白染色以研究植入物的肌肉再定植。

通过计数在马松三色载玻片上代表0.16mm²的表面的标准网格内在×25放大率下的血管来研究血管密度。在每张载玻片上最少分析五个ROI。

统计学分析

使用单样本Kolmogorov-Smirnov测试和QQ图以确保值的正态分布。除非另外提及，结果以平均值±SD表示。使用Student t测试或用Bonferroni事后检验的单向方差分析来测试实验组间的统计学显著性差异。统计学测试用PASW18(SPSS；Westlands Centre,鰂鱼涌，香港)进行。p<0.05则认为差异是显著的。

结果

低氧对用于肌肉再生的MSC生长因子释放的影响

在低氧(与常氧相比)下，ASC与BM-MSC相比被发现显著更好的存活率，其细胞活力分别为119.5±6.1％相比于86.8±1.5％(p<0.05；图39)。在0.1％和21％的O₂下，与BM-MSC相比，通过AMSC获得FGF和VEGF的显著更高的释放(p<0.05)(图40，A和B)。此外，低氧改善了ASC的VEGF释放(+37％；p<0.05)，而对BM-MSC没有任何影响。

在低氧以及常氧中，与BM-MSC相比，ASC分泌显著更低量的IGF(p<0.005)。对于两种MSC都没有发现氧张力对TGF和HGF的释放有显著影响(图40，D和E)。

MSC在HACM上的贴壁和铺展

HACM去细胞化首先通过在经处理的基质进行DAPI染色后与天然基质比较而检测到稀少的荧光核来确认(数据未显示)。通过Qubit荧光计没有测量到DNA(与在四个独立的天然阔筋膜中发现的平均值1.45μg/ml相比，为<0.01μg/ml)。

对于ASC和BM-MSC(0.22±0.001)二者，在第13天观察到塑料孔上的最佳铺展(接近0的由形状因子表示的细胞伸长)。对于ASC(0.31±0.03)和BM-MSC(0.48±0.02)，分别在27天和30天后观察到在HACM上获得最大细胞铺展的显著延迟。在第5天至第18天发现显著较低的MSC铺展(与塑料孔相比；p<0.05；图41)。另外，在HACM上接种11天至30天后发现MSC(ASC相对BM-MSC)铺展的显著性差异(p<0.05；图41)。

用两种来源的MSC孵育后2周内获得塑料孔的全部恢复，对于ASC和BM-MSC，分别在第21天和第30天在HACM上延迟获得(p<0.05)。分别对于ASC和BM-MSC，相比于塑料孔在第3天至第18天以及第3天至第27天的恢复面积百分比，HACM恢复面积的百分比显著更低(p<0.05)。与孵育后第13天至第28天的ASC相比，用BM-MSC获得HACM恢复的显著延迟(p<0.05)(图42)。

复合移植物HACM加MSC的体内功效

1.电凝法肌肉缺陷

在植入后4周，与用BM-MSC和HACM以及用单独的HACM相比，通过ASC和HACM处理的区域中的血管生成显著更高(与空白的比率为434±108％、215±13％、144±57％；p<0.001)(图43A)。

4周后，通过苏木精和伊红以及马松三色证实，与单独的HACM相比，在宏观上发现用复合移植物(HACM加MSC)使骨骼肌更好的整合，与单独的HACM比较，ASC或BM-MSC加HACM的残留纤维化(与空白的比率)显著更低(分别为23±9％和24±10％相对于49±17％，p<0.05)。ASC和BM-MSC之间没有区别(图43B)。

2.腹壁的全厚度肌肉缺陷

使用单独的HACM或补充有MSC的HACM没有观察到腹疝发病，没有任何与腹腔器官的腹腔内黏连。尽管在HACM和MSC的每个受试者的缝合边缘附近检测到一些阳性的肌萎缩蛋白细胞，但在腹部植入物的核心中没有发现阳性细胞。植入4周后，与BM-MSC加HACM和单独的HACM相比，由ASC和HACM制成的植入物中的血管生成显著改善(21.4±1.0血管/格、11.2±2.3血管/格、11.8±3.1血管/格；p<0.05)(图44)。

由ASC制成的复合移植物证明了脂肪干细胞在离体低氧下存活的能力、通过去细胞化胶原蛋白基质支架而获得最佳细胞递送的能力、通过氧敏感性机制来改善促血管生成因子释放的能力、移植后早期应激阶段体内血管补充的能力、以及最后与无细胞支架相比减少纤维化瘢痕的能力。所有这些性质都可以促进骨骼肌再生。

此外，这些结果证明，ASC在低氧中发挥更好的离体和体内促血管生成作用，并具有精确控制，同时BM-MSC发挥特异性的抗纤维化作用。HACM是用于MSC贴壁、铺展和细胞递送的理想支架，其保持对于骨骼肌坏死和临界性尺寸缺陷的机械要求。

Claims (16)

1.一种包含生物相容性基质和间充质干细胞群体的组合物，其中所述间充质干细胞群体是基本上纯的。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述间充质干细胞群体包含少于25％的成纤维细胞。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述间充质干细胞是未分化的。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述间充质干细胞来源于脂肪组织、骨髓、脐带组织、华顿氏胶、羊水、胎盘、外周血、输卵管、角膜基质、肺、肌肉、皮肤、骨、牙组织和胎肝。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述间充质干细胞来源于脂肪组织，优选来源于皮下脂肪组织。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述生物相容性基质是无细胞的。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述生物相容性基质包含胶原蛋白。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述生物相容性基质是人、猪、牛或马。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中间充质干细胞来源于待治疗的对象。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其用于治疗需要其的对象中的软组织损伤。

11.根据权利要求10所述用途的组合物，其中所述软组织选自皮肤组织、肌肉组织、真皮组织、腱组织、韧带组织、半月板组织和膀胱组织。

12.根据权利要求10或11所述用途的组合物，其中所述软组织损伤是急性或慢性创伤。

13.根据权利要求10至12中任一项所述用途的组合物，其中所述软组织损伤选自软组织的撕裂或破裂、皮肤创伤、皮肤烧伤、皮肤溃疡、手术创伤、血管疾病、肌肉疾病、疝气和辐射创伤。

14.根据权利要求13所述用途的组合物，其中所述皮肤创伤是糖尿病患者的创伤。

15.根据权利要求10至13中任一项所述用途的组合物，其中所述组合物被局部施用或通过手术移植施用。

16.一种用于制备包含生物相容性基质和间充质干细胞群体的组合物的方法，其包括与生物相容性基质一起孵育基本上纯的间充质干细胞群体。