JP2018515211A - 間葉系幹細胞を含む組成物およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。
a.間葉系幹細胞(MSC)、好ましくは脂肪幹細胞を単離する工程と、
b.実質的に純粋なMSC集団を得る工程と、
c.MSC集団を生体適合性マトリックスと共にインキュベートする工程
とを含む、生体適合性マトリックスおよび間葉系幹細胞集団を含む組成物の調製方法にも関する。
a.間葉系幹細胞(MSC)を単離する工程と、
b.25%未満の線維芽細胞を含むMSC集団を得る工程と、
c.MSC集団を生体適合性マトリックスと共にインキュベートする工程と
を含む。
a.脂肪幹細胞(ASC)を単離する工程と、
b.実質的に純粋なASC集団を得る工程と、
c.ASC集団をコラーゲン含有生体適合性マトリックスと共にインキュベートする工程と
を含む。
a.脂肪幹細胞(ASC)を単離する工程と、
b.25%未満の線維芽細胞を含むASC集団を得る工程と、
c.ASC集団をコラーゲン含有生体適合性マトリックスと共にインキュベートする工程と
を含む。
当該化合物を治療される対象または治療される病状または病気を有する対象のMSCにより得られた本発明の組成物と接触させる工程と、
当該化合物をそれを必要とする患者における軟組織傷害を治療するために使用することができるか否かを決定するために、本発明の組成物に対する当該化合物の治療的効果を決定する工程と
を含む。
本発明の組成物を上記のように調製し、
本発明の組成物またはフィルム、3次元構造体、包帯、複合移植片または軟組織代用物を分析して、治療される軟組織の少なくとも1つの特性を提供するか否かについて決定する。
材料および方法
ヒト組織の脱細胞
欧州筋骨格移植協会(European Association of Musculoskeletal Transplantation)の共通基準(EAMST、ウィーン、1997年)に従って、ヒト大腿筋膜および真皮組織を得た。
Wolfらのプロトコルに従って(Biomaterials.2012,33(10):2916-2925)、ヒト大腿筋膜および真皮組織からタンパク質を抽出した。簡単に言うと、300mgの組織を5mLの尿素−ヘパリン緩衝液(pH7.4)(2Mの尿素、50mMのトリス、5mg/mlのヘパリン、10mMのN−エチルマレイミド、5mMのベンズアミジンおよび1mMのフッ化フェニルメチルスルホニル)と共に撹拌しながら4℃の温度で最長24時間インキュベートした。3000gの速度で30分間遠心分離した後、上澄みを除去し、同じ抽出プロトコルに従って処理した。次いで、第2の上澄みを排除クロマトグラフィーで精製し、ELISAで定量化した。
ヒト大腿筋膜および真皮組織では、総タンパク質の定量化は脱細胞方法によるタンパク質レベルの減少を示している(図1および図4)。骨組織(海綿骨および皮質骨の両方)では、総タンパク質は処理の各段階で減少した後、最終段階で増加している(図7および図10)。これは、分解されたタンパク質の断片間での水素相互作用および/またはジスルフィド結合形成を促進するγ照射に起因していると思われる。
材料および方法
この研究をベルギーの保健省(Belgian Ministry of Health)のガイドラインに従って行った。全ての手順は、組織入手および臨床研究のために医学部(ルーヴァン・カトリック大学)の倫理委員会によって認可されていた(B40320108280)。特に断りのない限り、全ての材料をLonza社(スイスのヴェルビエ)、Sigma−Aldrich社(米国ミズーリ州セントルイス)またはInvitrogen社(米国カリフォルニア州カールズバッド)から得た。
インフォームドコンセントおよび血清学的スクリーニング後に、それぞれコールマン法を用いる脂肪吸引および皮膚生検により、選択的美容整形手術を受ける8人の患者(表1)においてヒトの脂肪組織(平均:7.4g)および皮膚組織(平均:1.5cm2)の組み合わせ採取を行った。脂肪組織および皮膚試料を4℃で最長60分間無菌状態に維持した後、脂肪由来の幹細胞(ASC)および皮膚線維芽細胞(DF)を単離した。
4継代において、ASCおよびDFを蛍光活性化細胞分類(FACScan、BD Biosciences社、カリフォルニア州サンノゼ)によって標準的な細胞表面マーカー(CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、stro−1、CD106、CD146、CD166、CD19、CD31、CD11b、CD79α、CD13、HLA−DR、CD14、CD34)[Dominiciら, Cytotherapy. 2006; 8(4):315-317; Bourinら, Cytotherapy. 2013; 15:641-648]について特性評価した。
ASCおよびDFを骨細胞系への分化能力を評価するために特異的培地で4継代において試験した。細胞を特異的分化培地(デキサメタゾン(1μM)、アスコルビン酸ナトリウム(50μg/ml)およびジヒドロリン酸ナトリウム(36mg/ml)を添加した増殖培地)で3週間培養した後、その分化をアリザリンレッド染色によって評価した[Quら, In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2007; 43:95-100]。ホルマリン固定後にリン酸カルシウムをアリザリンレッドで染色して骨分化を確認した。また、オステオカルシンの免疫組織化学的検査を行って骨表現型を確認した。
Click-iT(登録商標)EdU Alexa Fluor(登録商標)488フローサイトメトリーアッセイキット(Life Technology社、米国マサチューセッツ州ウォルサム)を用い、5−エチニル−2’−デオキシウリジンの取り込みによる直接的なDNA合成測定によって細胞増殖能を試験した。ASC(n=3)およびDF(n=3)を5000細胞/cm2の密度で21.5cm2の培養皿に播種し、10%FBSおよび21%O2で24時間培養した。次いで、増殖培地をFBSを含まない同じもので交換して、細胞増殖を24時間止めた。こられの細胞を最後に1%FBSまたは5%FBSを添加した増殖培地において特定の条件下、すなわち0.1%O2、5%O2および21%O2に48時間置き、EdU(チミジンのヌクレオシド類似体である5−エチニル−2’−デオキシウリジン、活性DNA合成中にDNAに取り込まれる)を添加した。Alexa Fluor(登録商標)488での顕色後に、フローサイトメトリー(FACScan、BD Biosciences社、カリフォルニア州サンノゼ)で陽性細胞を計数した。
トリプシン処理後に細胞(3継代後)を計数し、5種類の漸増的希釈物、すなわち100%ASC+0%DF、75%ASC+25%DF、50%ASC+50%DF、25%ASC+75%DFおよび0%ASC+100%DFを得、それぞれ高度な低酸素環境および組織酸素圧に対応する0.1%O2および5%O2の低酸素チャンバー(Modular Incubator Chamber MIC-101、Billups-Rothenberg社、米国カリフォルニア州デル・マー)内でのインキュベーションのために、約80%〜95%の集密状態が得られる密度で細胞を含む12ウェル培養プレートに3連で播種した。これらの細胞を(各希釈および酸素圧で)正常血糖(1g/L)または高血糖(4.5g/L)増殖培地に曝露した。これらの制御された条件下での24時間のインキュベーション後に、細胞培養上澄みを個々に採取し、酵素結合免疫吸着法によるさらなる増殖因子定量化(Quantikine ELISAキット(R&D system社、米国ミネソタ州ミネアポリス)によるVEGF、HGF、IGF−1、SDF−1αおよび塩基性FGF)のために−20℃で貯蔵した。3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−5−(3−カルボキシメトキシフェニル)−2−(4−スルホフェニル)−2H−テトラゾリウム溶液(MTS、Promega社、オランダのライデン)アッセイにより、低酸素ストレスの直後に細胞生存率を評価した。低酸素/血糖ストレス試験および増殖因子定量化をそれぞれ3連および2連で行った。結果をピコグラム/ミリメートルで表す。
1標本コルモゴロフ検定およびQ−Qプロットを使用して値の正規分布を評価した。対応のあるt検定および一元配置分散分析をボンフェローニ事後検定と共に用いて群間の統計的有意差(正規分布に従う)を試験した。PASW18(SPSS、IBM社、米国ニューヨーク州ニューヨーク)を用いて統計的検定を行った。p<0.05を有意とみなした。
材料および方法
ベルギーの保健省のガイドラインに従ってこの研究を行った。全ての手順は医学部(ルーヴァン・カトリック大学)の倫理委員会によって認可されていた。
インフォームドコンセントおよび血清学的スクリーニング後に、それぞれコールマン法を用いる脂肪吸引および皮膚生検により、選択的美容整形手術を受ける8人の患者(表1)においてヒトの脂肪組織(平均:7.4g)および皮膚組織(平均:1.5cm2)の組み合わせ採取を行った。脂肪組織および皮膚試料を4℃で最長60分間無菌状態に維持した後、脂肪由来の幹細胞(ASC)および皮膚線維芽細胞(DF)を単離した。
トリプシン処理後に、細胞(4継代後)をそれぞれ高度な低酸素環境および組織酸素圧に対応する0.1%O2および5%O2の低酸素チャンバー(Modular Incubator Chamber MIC-101、Billups-Rothenberg社、米国カリフォルニア州デル・マー)内でのインキュベーションのために、約80%〜95%の集密状態が得られる密度で細胞を含む12ウェル培養プレートに3連で播種した。これらの細胞を(各希釈および酸素圧で)正常血糖(1g/L)または高血糖(4.5g/L)増殖培地に曝露した。これらの制御された条件下での24時間のインキュベーション後に、細胞培養上澄みを個々に採取し、酵素結合免疫吸着法(Quantikine ELISAキットによるさらなる増殖因子定量化(R&D system社、米国ミネソタ州ミネアポリス)によるVEGF、SDF−1αおよびKGF)のために−20℃で貯蔵した。低酸素/血糖ストレス試験および増殖因子定量化をそれぞれ3連および2連で行った。結果をピコグラム/ミリメートルで表す。
1標本コルモゴロフ検定およびQ−Qプロットを使用して値の正規分布を評価した。対応のあるt検定および一元配置分散分析をボンフェローニ事後検定と共に用いて群間の統計的有意差(正規分布に従う)を試験した。PASW18(SPSS、IBM社、米国ニューヨーク州ニューヨーク)を用いて統計的検定を行った。p<0.05を有意とみなした。
細胞を低酸素条件、すなわち0.1%O2に曝露した場合、細胞は生理的O2分圧、すなわち5%O2の場合よりも高いレベルのVEGFを分泌する(図23A)。ケラチノサイトのみが酸素正常状態と比較して低酸素でのSDF−1αおよびKGFの発現の有意な増加を示すが、レベルは非常に低いままである(図23Bおよび図23C)。
材料および方法
全ての手順は、組織入手および臨床研究のために医学部(ルーヴァン・カトリック大学)の倫理委員会ならびにヒトおよび前臨床試験のための地方動物実験倫理委員会によって認可されていた(B40320108280)。
単離および特性評価
選択的美容整形手術(腹部脂肪除去術(n=3)または乳房形成術(n=5)、平均して6.2gの脂肪組織(1.4〜14.6g))の間ならびにインフォームドコンセントおよび血清学的スクリーニング後に、8人の患者においてコールマン法(Coleman, Clin Plast Surg. 2001; 28:111-119)を用いた脂肪吸引によってヒトのASCを採取した。
異なる継代後の核型および蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)解析により細胞遺伝的安定性を調べて生体包帯の細胞成分の腫瘍学的安全性を評価した。標準的なプロトコルに従って5人のドナーのASCから中期染色体を得た。簡単に言うと、1、4、10、12および16継代後の指数増殖段階における培養された細胞を0.02μg/mLのコルセミド(Invitrogen社、カリフォルニア州カールズバッド)で4時間処理した。トリプシン処理後にフラスコから採取した細胞を低張性の0.055MのKCl中、37℃で30分間インキュベートし、3:1のメタノール:氷酢酸で固定した。標準的な手順(Duhouxら, PLoS ONE. 2011;6:e26311)に従って染色体の採取および中期スライド調製を行い、11〜20のリバース−トリプシン−ライトGバンド染色(GTW)した中期を分析し、かつヒト細胞遺伝学的命名法に関する2013国際システム(2013 International System for Human Cytogenetics Nomenclature)(ISCN2013)に従って核型を報告した。標準的なプロトコル(Veriterら, Biomaterials. 2011; 32:5945-5956)に従ってFISH解析を行い、TelVysion 5q(SpectrumOrange)、CEP7/D7Z1(SpectrumGreenまたはSpectrumOrange)、CEP8/D8Z2(SpectrumOrangeまたはSpectrumGreen)およびCEP18/D18Z1(SpectrumGreen)プローブ(Abbot Molecular社、ベルギーのオティニー=ルヴァン=ラ=ヌーヴ)を用いて染色体5、7、8および18の異数性を検出した。1継代、4継代および16継代では200の核が計数され、10継代では120の核が計数され、12継代では73の核が計数された(閾値は99.9%の信頼区間によりβ法に従って計算した)。
4継代において、ヒトの無細胞コラーゲンマトリックス(Dufraneら, Biomaterials 2008;29:2237-2248)(HACM:サンリュック大学病院(ベルギーのブリュッセル)の組織銀行から入手した凍結乾燥した脱細胞化同種異系ヒト大腿筋膜)および対照としてのプラスチックウェルにおいてASCの接着および拡散能力を比較した。既に記載されているように(BacallaoおよびStelzer, Methods Cell Biol. 1989; 31:437-452)、共焦点レーザー走査型顕微鏡法(CLSM)で細胞接着を評価した。
非治癒性創傷を有する3人の患者に生体包帯が提案された(表3)。優良医薬品製造基準の推奨に沿って、ASCの単離および培養のために臍周囲の脂肪組織(それぞれ22g、8gおよび21g)を採取した(局所麻酔下でコールマン法を用いた)。
1標本コルモゴロフ・スミルノフ検定およびQ−Qプロットを使用して値の正規分布を評価した。対応のあるt検定および一元配置分散分析をボンフェローニ事後検定と共に用いて群間の統計的有意差(正規分布に従う)を試験した。Systatバージョン8.0(Cranes Software International社、インドのバンガロール)またはPASW18(SPSS、IBM社、米国ニューヨーク州ニューヨーク)を用いて統計的検定を行った。p<0.05を有意とみなした。
生体外および生体内におけるASC+HACMの安全性
間葉間質細胞表面マーカープロファイルであるCD44+(>95%の細胞)、CD73+(>90%)、CD90+(>95%)、CD105+(>95%)、CD45−(<5%)、CD34−(<7%)、CD14−(<7%)、CD11b−(<7%)、CD79α−(<7%)、CD19−(<5%)およびHLA−DR−(<7%)(表4)ならびに石灰化、ヒアリン沈着および脂質胞の陽性標識により、第4継代におけるASCを特性評価した。
0.1%O2分圧での72時間のインキュベーション後の細胞生存率を21%O2分圧と比較した(p=0.034)。低酸素はASC生存率に対して有害な影響を有しておらず、21%O2分圧と比較して低酸素条件(0.1%O2分圧)においてVEGFの有意により高い分泌が認められた(p<0.001、n=8)(図31)。
第3継代の終了時のASCをトリプシン処理し、次いでHACM上に播種してコラーゲン足場において第4継代を得た。HACM表面の90%がASCで被覆されたとき(5.8×105細胞/cm2)に移植組織が得られた。細胞単離から送達までの包帯の完全な製造は平均して133日で達成された(表5)。
材料および方法
特に定めがない限り、全ての材料をLonza社(スイスのバーゼル)、Sigma−Aldrich社(米国ミズーリ州セントルイス)またはInvitrogen社(米国カリフォルニア州カールズバッド)から得た。全ての手順はルーヴァン・カトリック大学の地方動物実験倫理委員会によって認可されていた(2013/UCL/MD/022)。
ベルギー在来種のブタ(雌、体重:<100kg、年齢:6ヶ月齢未満、Rattlerow Seghers社、ベルギーのローケレン)をBM−MSCおよびASCのドナーとして使用した。
以前に記載されたプロトコル(Schubertら, Biomaterials. 2011; 32:8880-8891)に従って、ASCおよびBM−MSCを12ウェル培養プレートに播種し、低酸素チャンバー(Modular Incubator Chamber MIC-101、Billups−Rothenberg社、米国カリフォルニア州デル・マー)内でインキュベートした。細胞を高度な低酸素環境および大気の酸素正常状態にそれぞれ関連する0.1%および21%O2レベルで72時間インキュベートした。各状態で72時間後に、細胞培養上澄みを個々に採取し、遠心分離し、かつその後の増殖因子定量化のために−20℃で貯蔵した。
人体材料に関する欧州およびベルギーの法律に従い、病歴、血清学的検査および微生物学的試験に基づくヒト組織ドナーのスクリーニング後に、選択されたドナーから大腿筋膜を得た。サンリュック大学病院(ベルギーのブリュッセル)の組織銀行によって開発されたプロセスを用い、記載されているようにヒト大腿筋膜張筋を調製して、化学残留物(アセトン/H2O2)を含まず、かつ5%未満の残留水分を含むHACMを得た。これを25,000Gyのγ照射(Sterigenics社、ベルギーのフルリュース)で滅菌した。次いで、同種移植片を室温で貯蔵した(Dufraneら, Biomaterials. 2008, 29: 2237-2248)。
3継代(P3)の終了時に、HACM上に拡散するMSCの細胞能力をプラスチックウェル(対照として)上で培養された細胞の能力と比較した。既に記載されているように(Dufraneら, Biomaterials. 2002, 23: 2979−2988)、足場への細胞接着を共焦点レーザー走査型顕微鏡法(CLSM)で評価した。
生体外でのMSCによるHACMの再細胞化の影響を機械的に評価した。天然のヒト大腿筋膜(n=5)、再水和させた凍結乾燥HACM(n=4)、培地で4週間インキュベートしたHACMのみ(MSCを含まない)(n=4)、およびMSCで再細胞化されたHACM(インキュベーションの4週間後、n=4)の3連の試料に対して一軸機械抵抗試験を行った。Instron bluehillソフトウェアを備えたInstron牽引システム(モデル5600、Instron社、米国マサチューセッツ州カントン)を用いて、4mm×min−1の伸長速度での破壊荷重試験により機械的試験を行った。2つのグリップ間の距離は各試験で26.5mmであった。試料を45mmの一定の長さおよび15mmの幅に切断した。各試料の厚さを記録した。マトリックスの荷重伸長挙動および破壊モードを記録した。マトリックスの構造特性は剛性(Nm×m−1)および最大負荷(N)によって表した。剛性(k)はk=ΔF/ΔLとして計算した(式中、Fは本体にかけられる力であり、Lは同じ自由度に沿ってその力によって生じる変位(例えば、引き伸ばされたバネの長さの変化)である)。これらのパラメータを各実験群の間で比較した。
200〜300gの体重(5〜8週齢)のヌードラット(n=20、Charles River Laboratories International社、米国マサチューセッツ州ウィルミントン)の骨格筋欠損の2種類の実験モデルを開発した。麻酔を導入し、イソフルラン(Abbvie社、ベルギーのワーヴル)吸入で維持して長手方向の腹部の切開を行い、腹壁の骨格筋系を露出させた。
各動物(n=6)において、腹部の体壁筋に対する電気凝固により4箇所の16mm2の壊死面積を作り出した。電気凝固させた欠損部をMSC+HACM(2つのゾーン、細胞が壊死面積と直接接触)、HACMのみ(1つのゾーン)および対照(移植片なし、1つのゾーン)で覆った。これらの移植組織を4本の5.0プロリーン(登録商標)縫合糸により欠損部に密接に接触させて直接置いた。動物にHACM+ASC(n=3)またはBM−MSC(n=3)からなる複合移植片のいずれかを移植した。HACM上での21〜28日間のMSCのインキュベーション後に複合移植片を移植した。
腹部の筋肉壁(n=14のヌードラット)において全層欠損(1.5×2.5cm2)を行い、内臓を露出させた。欠損部を複合移植片(HACM+ASC、n=4;HACM+BM−MSC、n=4)またはHACMのみ(n=6)で処理した。
1標本コルモゴロフ・スミルノフ検定およびQ−Qプロットを使用して値の正規分布を評価した。特に言及しない限り、結果を平均±SDとして表した。スチューデントのt検定または一元配置分散分析をボンフェローニ事後検定と共に用いて実験群間の統計的有意差を試験した。PASW18(SPSS、Westlands Centre、Quarry Bay、香港)を用いて統計的検定を行った。差はp<0.05において有意であると見なした。
筋肉の再生のためのMSC増殖因子放出に対する低酸素の影響
低酸素では(酸素正常状態と比較)、ASCではBM−MSCと比較して有意により良好な生存率が認められ、それぞれ119.5±6.1%および86.8±1.5%の細胞生存率であった(p<0.05、図39)。0.1%および21%O2でのBM−MSCと比較してAMSCによりFGFおよびVEGFの有意により高い放出が得られた(p<0.05)(図40Aおよび図40B)。また、低酸素はBM−MSCに全く影響を与えず、ASCではVEGF放出を改善した(+37%、p<0.05)。
天然のマトリックスと比較して処理済マトリックス上ではDAPI染色後の蛍光性の核の検出が稀であること(データは示さず)により、HACMの脱細胞を最初に確認した。Qubit蛍光光度計によりDNAは検出されなかった(4種類の独立した天然の大腿筋膜に認められた平均して1.45μg/mlと比較して<0.01μg/ml)。
1.電気凝固による筋肉欠損
移植後4週目では、ASCおよびHACMで処理した領域における血管新生は、BM−MSC+HACMおよびHACMのみと比較して有意により高かった(対照に対して434±108%対215±13%対144±57%の比、p<0.001)(図43A)。
HACMのみまたはMSCが添加されたHACMによる腹部の臓器との腹腔内癒着がなく、腹部ヘルニアの発生は観察されなかった。HACMおよびMSCを有する各レシピエントにおいて縫合縁近くにいくつかの陽性ジストロフィン細胞が検出されたが、腹部移植組織の芯部では陽性細胞は認められなかった。移植後4週目に、ASCおよびHACMからなる移植組織において、BM−MSC+HACMおよびHACMのみと比較して血管新生は有意に向上した(21.4±1.0対11.2±2.3対11.8±3.1の血管/格子、p<0.05)(図44)。
Claims (16)
- 生体適合性マトリックスおよび実質的に純粋な間葉系幹細胞集団を含む組成物。
- 前記間葉系幹細胞集団は25%未満の線維芽細胞を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記間葉系幹細胞は未分化である、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記間葉系幹細胞は脂肪組織、骨髄、臍帯組織、ホウォートンゼリー、羊水、胎盤、末梢血、卵管、角膜実質、肺、筋肉、皮膚、骨、歯の組織および胎児肝臓に由来している、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記間葉系幹細胞は脂肪組織、好ましくは皮下脂肪組織に由来している、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記生体適合性マトリックスは無細胞である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記生体適合性マトリックスはコラーゲンを含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記生体適合性マトリックスはヒト、ブタ、ウシまたはウマのものである、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記間葉系幹細胞は治療される対象に由来する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の組成物。
- それを必要とする対象における軟組織傷害を治療するために使用される、請求項1〜9のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記軟組織は皮膚組織、筋肉組織、真皮組織、腱組織、靱帯組織、半月板組織および膀胱組織を含む群から選択される、請求項10に記載の使用のための組成物。
- 前記軟組織傷害は急性もしくは慢性創傷である、請求項10または11に記載の使用のための組成物。
- 前記軟組織傷害は、軟組織の裂傷または断裂、皮膚創傷、皮膚火傷、皮膚潰瘍、手術創傷、血管疾患、筋肉疾患、ヘルニアおよび放射線創傷を含む群から選択される、請求項10〜12のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
- 前記皮膚創傷は糖尿病性創傷である、請求項13に記載の使用のための組成物。
- 前記組成物は局所投与されるか外科的移植によって投与される、請求項10〜13のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
- 実質的に純粋な間葉系幹細胞集団を生体適合性マトリックスと共にインキュベートする工程を含む、生体適合性マトリックスおよび間葉系幹細胞集団を含む組成物の調製方法。
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