CN112760293B - 一种无异源血清3d培养msc干细胞制备高活性外泌体的方法 - Google Patents

一种无异源血清3d培养msc干细胞制备高活性外泌体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于天然生物纳米材料领域，具体涉及一种培养MSC干细胞的HPL培养基及无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法。本发明提供的培养MSC干细胞的HPL培养基，采用人源性血小板裂解物来代替动物血清FBS用于细胞培养。本发明提供的无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法，制备工艺简单、高效、成本低；其外泌体产量比常规2D细胞培养方法高得多，所制备外泌体的抗癌活性也更高，且使用更安全，为MSC干细胞来源生物纳米载药治疗癌症等潜在的临床应用铺垫了良好的基础。

Description

一种无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法
技术领域
本发明属于天然生物纳米材料领域，具体涉及一种培养MSC干细胞的HPL培养基及无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一类成体干细胞，可从成人骨髓和脂肪等组织或从新生儿附属组织如脐带和胎盘中分离培养而得。MSC细胞易于体外扩增，天然具有肿瘤趋向性，以及抑制肿瘤生长、消炎和保护机体免受损伤的特点，是一种良好的细胞治疗资源。已发现，MSC展现生物活性的主要机制是通过旁分泌途径向细胞外环境释放一类小的细胞外囊泡(EV)，其直径大小在50～130nm，可向靶细胞传输生物活性分子，诸如蛋白质、活性脂和核酸分子(mRNA、miRNA、lncRNA)，影响或调控靶细胞的功能。根据2018国际EV研究协会指南建议，这类小的EV属于细胞通过内体途径产生的外泌体。越来越多的研究表明，MSC来源的EV具有可媲美于MSC细胞本身的治疗活性，潜在地可用于诸多疾病的治疗，包括癌症、心脑血管病、急性肾损伤、肝脏纤维化和创伤愈合等。所以，现在MSC来源的EV已逐渐成为替代MSC本身的无细胞治疗试剂，被称为细胞治疗的第二代(2G)产品。EV制剂替代MSC用于疾病治疗，具有更好的安全性，可操作性更强，易于保存，还可以多重载药实现联合治疗，以及可以进行靶向修饰、免疫逃逸修饰和药物可控释放修饰，具有非常好的应用前景。
通常采用贴壁方式培养MSC细胞，使用的培养基是添加10～17％FBS的α-MEM或DF12。这种培养细胞的方式，MSC以单细胞层紧贴在培养容器的底部，可称为二维(2D)培养。而在体内环境中，MSC存在的微环境是三维(3D)的，细胞与细胞外基质(如胶原蛋白纤维或透明胶质酸)紧密结合。已有研究发现，体外3D培养的MSC细胞，其分泌某些治疗性因子，如抗癌活性蛋白或消炎因子的水平更高。
众所周知，开发外泌体用于疾病治疗的一个瓶颈就是产量不够高，迫切需要找到提高外泌体产量的方法。已发现低氧培养和饥饿培养等方法可增加MSC细胞的外泌体产量。此外，3D培养环境也有可能增加MSC的外泌体产量。已发现可用于MSC 3D培养的支架材料包括胶原蛋白、壳聚糖、透明质酸和藻元酸钠等。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种培养MSC干细胞的HPL培养基，该HPL培养基采用人源性血小板裂解物(human platelet lysate，HPL)代替FBS；HPL中含有大量的生长因子，足以支持MSC干细胞的体外生长和扩增，且HPL中含有大量的血纤维蛋白原，在细胞培养过程中可迅速水解为纤维蛋白而形成水凝胶，产生一个3D的培养环境，与含有FBS的培养基相比，该HPL培养基不仅能更好地支持细胞生长和体外扩增，而且HPL含有的血纤维蛋白形成的水凝胶3D环境显著增加了MSC外泌体的产量，且EV携带的TRAIL的表达水平也显著增加，其抗癌效应相应得到增强。
本发明的另一目的在于提供一种无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法，该方法利用上述HPL培养基，通过3D培养TRAIL基因工程修饰的MSC干细胞(MSCflT)，制得的表达TRAIL的外泌体(EV-T)的产量和抗癌蛋白TRAIL的表达水平均显著高于2D培养来源的EV-T，并且EV-T的生物活性也更高，具有更好的治疗潜力。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种培养MSC干细胞的HPL培养基，包含人源血小板裂解物(HPL)和基础DF-12培养基；其中，人源血小板裂解物(HPL)的含量为5％(v/v)；
所述的人源血小板裂解物(HPL)可通过冻融循环法制备；
所述的人源血小板裂解物(HPL)的制备方法，包含如下步骤：
(1)将人源血小板进行冷冻/解冻处理，并重复操作一次；然后1500g离心10min，收集上清，得到人源血小板裂解液；将血小板裂解液在4℃条件下10000g离心10min，收集上清并过滤，得到人源血小板裂解物(HPL)；
所述的冷冻/解冻处理的具体操作优选为：在-80℃下冷冻48h，然后在37℃水浴中融化2h；
所述的过滤优选采用0.22μm滤膜过滤；
所述的人源血小板裂解物中纤维蛋白原的含量为2.0mg/mL；
一种无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法，包含如下步骤：
(1)将上述人源血小板裂解物(HPL)和基础培养基混合，得到培养MSC干细胞的HPL培养基；
2)将表达TRAIL的病毒转染MSC干细胞，得到TRAIL基因工程化的MSC干细胞(MSCflT)；
3)采用上述培养MSC干细胞的HPL培养基对MSCflT进行3D培养，然后分离外泌体；
步骤(2)中所述的病毒包括但不限于慢病毒、逆转录病毒和腺病毒等；
步骤(2)中所述的MSC干细胞包括但不限于脐带来源间充质干细胞(UC-MSC)、骨髓间充质干细胞(BM-MSC)、脂肪间充质干细胞(AD-MSC)、牙髓间充质干细胞、胎盘和羊水以及羊膜间充质干细胞中的至少一种；
步骤(2)中所述的表达TRAIL的病毒，优选通过如下方法制备得到：
将TRAIL表达质粒pCCL-CMV-flT与慢病毒包装质粒pCMV-dR8.74和pMD2.G共转染293T细胞，收集细胞培养上清，通过超速离心沉淀病毒，最后将病毒沉淀重新悬浮溶解于PBS溶液，得到表达TRAIL的慢病毒溶液；
步骤(2)中所述的转染的具体操作优选为：
采用表达TRAIL的慢病毒溶液转染MSC干细胞，并采用终浓度为8μg/mL的polybrene增强转染，孵育6～24h；孵育后将培养基换成含有10％FBS的DMEM新鲜培养基，继续培养2～3天；待细胞长满后，进行增殖传代培养，得到TRAIL基因工程化的MSC干细胞(MSCflT)；
所述的表达TRAIL的慢病毒溶液的浓度优选为MOI＝3；
所述的孵育时间优选为10h；
步骤(3)中所述的分离方法包括但不限于超速离心、外泌体沉淀试剂沉淀、密度梯度离心、超滤离心、PEG-base沉淀法和大小排阻色谱法等中的至少一种。
一种高活性外泌体，通过上述制备方法制备得到；
所述的高活性外泌体在制备抗癌产品中的应用。
本发明的原理：
为了避免动物血清(FBS)来源蛋白被摄入细胞而造成临床应用中免疫排斥的安全问题，本发明采用人源性血小板裂解物(human platelet lysate，HPL)代替FBS用于细胞培养；其中，HPL中含有大量的生长因子，足以支持MSC干细胞的体外生长和扩增；并且，HPL培养的MSC干细胞已被临床试验证明是安全的，不会引起免疫排斥反应。此外，HPL中含有大量的血纤维蛋白原；本发明首次发现，如果在细胞培养时没有预先去除掉血纤维蛋白原，在细胞培养过程中可迅速水解为纤维蛋白而形成水凝胶，产生一个3D的培养环境。本发明利用这种新颖的3D基质培养MSC干细胞，以期增加其外泌体分泌和生物活性分子的表达水平，同时确保所制备外泌体未来临床应用的安全性。
本发明提供的培养MSC干细胞的HPL培养基3D培养MSC干细胞后，检测其培养上清来源的表达抗癌蛋白TRAIL的外泌体EV-T，其产量以及抗癌活性与2D培养相比均显著提高；抗癌活性增加原因在于外泌体的TRAIL表达水平也增加了。该策略的关键是使用人源性血小板裂解物HPL代替常规的胎牛血清FBS用于细胞培养，HPL中含有大量的生长因子可以支持MSC干细胞生长，同时HPL中含有的纤维蛋白原在培养过程中迅速转变激活为纤维蛋白，形成水凝胶，产生一种3D培养环境。这种3D培养环境更接近于体内MSC干细胞生长的微环境，更有利于MSC干细胞进行外泌体的生物合成，以及将抗癌转基因表达产物装载到外泌体并分泌到细胞外环境。同时，该方法避免了异种FBS因子进入外泌体，因而所获得的外泌体用于疾病治疗的安全性更好。
研究结果表明，此基于HPL的3D培养，与使用FBS的2D培养相比，可以提高外泌体产量5倍，增加外泌体中TRAIL的表达水平2倍，因此其抗癌活性也显著增加。此3D培养产生的表达TRAIL的外泌体EV-T，与重组可溶性TRAIL(rTRAIL)相比，其杀死肺癌细胞H727的活性提高10倍。另外，与致敏药剂(诸如CDK抑制剂Dina)联用，可进一步提高对H727杀死效率20倍。体内实验肯定了这些治疗效应。这些数据显示了3D培养来源的细胞外泌体良好的抗癌活性和治疗前景，具有较大的应用潜力。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供的培养MSC干细胞的HPL培养基，采用人源性血小板裂解物(HPL)来代替动物血清FBS用于细胞培养；其中，HPL中含有的纤维蛋白原在细胞作用下水解为纤维蛋白，与培养基中的水分结合形成水凝胶，产生一个3D培养环境；此3D环境培养的MSCflT细胞的外泌体产量提高了大约5倍，且外泌体TRAIL的表达水平提高了大约2倍。相应地，此3D培养来源的外泌体杀死癌细胞的活性和体内治疗肿瘤的效应也都得到显著增强。
(2)本发明提供的无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法，制备工艺简单、高效、成本低；其外泌体产量比常规2D细胞培养方法高得多，所制备外泌体的抗癌活性也更高，且使用更安全，为MSC干细胞来源生物纳米载药治疗癌症等潜在的临床应用铺垫了良好的基础。
(3)本发明提供了一种无异源血清3D培养MSC干细胞以增强其外泌体产量、治疗活性和应用安全性的方法，该方法通过3D培养TRAIL基因工程化的MSC干细胞(MSCflT)，制备的表达TRAIL的外泌体(EV-T)，其产量和抗癌蛋白TRAIL的表达水平均显著高于2D培养来源的EV-T，并且EV-T的生物活性也更高，具有更大的治疗潜力。
(4)本发明为MSC干细胞外泌体用于肿瘤治疗奠定了良好的基础。
附图说明
图1是流式细胞仪检测TRAIL基因工程化的MSC干细胞的TRAIL阳性转染率和共聚焦荧光显微镜检测TRAIL在MSC干细胞的表达及分布的结果图，其中，A：TRAIL阳性转染率，B：共聚焦荧光显微镜检测结果。
图2是MSCflT细胞的2D与3D培养形态图，其中，A：2D培养，B：3D培养。
图3是3D培养MSCflT细胞后制得的表达TRAIL的外泌体(EV-T)的透射电子显微镜图。
图4是2D和3D培养MSCflT细胞后制得的表达TRAIL的外泌体(EV-T)总蛋白定量、TRAIL表达量和颗粒产量分析比较图，其中，A：总蛋白定量，B：TRAIL表达量，C：EV颗粒产量。
图5是2D与3D培养MSCflT细胞后制得的表达TRAIL的外泌体(EV-T)的癌细胞特异性细胞毒性比较分析图。
图6是以动物皮下A549移植肿瘤模型研究比较2D与3D培养MSCflT细胞来源外泌体的治疗效应结果分析图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中除特别说明外，所涉及的百分比都为体积百分比。
实施例1人源血小板裂解物(HPL)的制备
(1)从血液制品中心获取人源血小板，并进行冷冻/解冻处理：-80℃下冷冻48h，在37℃水浴中融化2h，重复冷冻/解冻处理操作一次；然后1500g离心10min，收集上清经0.22μm滤膜过滤，得到无菌的人源血小板裂解液，将其保存在-20℃；或直接购买人源血小板裂解液用于下述步骤；
(2)使用前将人源血小板裂解液在37℃条件下解冻，然后在4℃条件下10000g离心10min，收集上清；上清用0.22μm滤膜过滤，得到人源血小板裂解物(HPL)；
(3)使用测定人纤维蛋白原的ELISA试剂盒(Molecular Innovations)对步骤(2)制得的人源血小板裂解物(HPL)进行测定，其中，纤维蛋白原的含量为2.0mg/mL。
实施例2TRAIL基因工程化MSC干细胞的制备与表征
(1)TRAIL基因工程化MSC干细胞的制备
①表达TRAIL的慢病毒的制备：
将TRAIL表达质粒pCCL-CMV-flT(此质粒构建方法参见文献Yuan et al.,2015.Cytotherapy；17:885-896)与慢病毒包装质粒pCMV-dR8.74和pMD2.G(获赠于伦敦大学学院Thrasher博士，或从Addgene购买)按照常规方法共转染293T细胞；转染48小时后，收集细胞培养上清(内含细胞合成释放的TRAIL表达慢病毒)，通过超速离心(使用贝克曼公司Optima LE80K离心机，SW28转头，4℃、17000rpm离心2h)沉淀病毒，最后将病毒沉淀重新悬浮溶解于PBS溶液，分装后在-80℃保存，得到表达TRAIL的慢病毒溶液；
②通过传代培养，得到P2～P4脐带来源间充质干细胞(UC-MSC)(PreGeneBiotechnology Company,Ltd.,Shenzhen,China)，将状态良好的MSC干细胞以1×106个/孔的密度接种于细胞培养六孔板，37℃、5％CO2细胞培养箱过夜；对MSC的基因工程化修饰使用上述表达TRAIL的慢病毒转染MSC干细胞；
③采用①制得的表达TRAIL的慢病毒溶液转染步骤②中的MSC干细胞，得到TRAIL基因工程化的MSC干细胞(MSCflT)。具体方法为：采用MOI＝3的病毒浓度转染MSC干细胞，采用终浓度为8μg/mL的polybrene增强转染，孵育6-24h(最优为10h)；孵育后将培养基换成含有10％FBS(胎牛血清)的DF12新鲜培养基，继续培养2～3天；待细胞长满后，将细胞转移到培养瓶进行增殖传代培养，得到TRAIL基因工程化的MSC干细胞(MSCflT)；
(2)TRAIL基因工程化的MSC干细胞(MSCflT)的表征
①将六孔板转染后的MSC干细胞(MSCflT)消化，离心沉淀；经PE标记的小鼠抗人TRAIL单克隆抗体(Abcam，Cambridge，USA)避光染色1h，然后2000g、5min离心，经PBS重悬洗涤两次，最后重悬浮与0.5mL PBS，以流式细胞仪检测TRAIL表达阳性细胞率。
②免疫荧光染色法检测TRAIL在MSC干细胞内分布状况：将MSCflT接种于载玻片培养2天后，用体积分数为4％的多聚甲醛固定，再用含0.1％的tween-20缓冲液穿孔细胞膜，接着用含有10％FBS和0.1％tween-20的PBS溶液封闭细胞；再然后用PE标记的小鼠抗人TRAIL单克隆抗体对细胞进行染色；用鬼笔环肽-FITC(Solarbio，Beijing，China)标记纤维状肌动蛋白细胞骨架；再用DAPI(Solarbio，Beijing，China)标记细胞核。加入一点PBS保证细胞处于湿润状态，然后用共聚焦显微镜观察和成像。以免疫印迹检测MSCflT细胞的TRAIL表达。
结果见图1，从图中可以看出，MSC干细胞被表达TRAIL的慢病毒高效率转染，组成型持续表达TRAIL蛋白，其中，免疫荧光染色结合流式细胞分析测定细胞的TRAIL阳性转染率为97.8％(图1A)；图1B为共聚焦荧光显微镜检测TRAIL在MSC干细胞的表达及分布情况，红色为PE-偶联的抗人的TRAIL抗体染色，绿色为细胞骨架蛋白F-actin染色，蓝色为细胞核DAPI标记；通过不同颜色标记，可以清晰地看到TRAIL在MSC干细胞的表达集中在细胞内内质网以及细胞膜上。
实施例3无异源血清3D培养MSCflT细胞
本实施例以含有10％FBS的DF-12培养基(Gibco,Life Technologies,Gaithersburg,MD，USA)为对照，与含有5％实施例1制得的HPL的DF-12培养基比较细胞外泌体的产量，具体方法如下：
(1)在10％FBS的DF-12培养基中复苏冻存的MSCflT细胞(实施例2制得)，培养至80％密度时，再换成不含任何血清的DF-12培养基培养24小时；等细胞消耗掉FBS来源蛋白，再以胰蛋白酶消化解离细胞，以PBS洗涤2次；
(2)将实施例1制得的人源血小板裂解物(HPL)和DF-12培养基混合，得到培养MSC干细胞的HPL培养基，其中，HPL含量为5％；将步骤(1)洗涤后的细胞用培养MSC干细胞的HPL培养基重悬浮，以11400/cm2的细胞密度接种于含HPL培养基的细胞培养瓶中，培养大约8小时后，在细胞分泌的酶的作用下，HPL中的血纤维蛋白原水解为纤维蛋白单体，发生聚集反应，结合培养基中的水形成水凝胶，产生了3D培养环境；MSCflT细胞在培养HPL培养基中每培养24h后收集上清，即为MSCflT培养上清，其中，上清内含细胞分泌到胞外的EV外泌体，将上清冻存于-20℃备用。另，MSCflT细胞在含有10％FBS的DF-12培养基中2D培养后收集上清制备外泌体，作为对照。
结果如图2所示，MSCflT细胞在含有10％FBS的DF-12培养基中属于2D培养，细胞呈单细胞层生长；MSCflT细胞在培养5％HPL培养基中属于3D培养，细胞呈现3D球形生长。
实施例4表达TRAIL的外泌体(EV-T)的制备
将实施例3中冻存的MSCflT培养上清(3D培养)于4℃下解冻，先低速离心(4℃、1000g离心10min)去除死细胞和细胞碎片；然后采用0.22μm滤膜(Merck Milipore，Darmstadt，Germany)过滤除去大于220nm的EV或其它细胞残片和颗粒等物质；接着用100kD超滤离心(4℃、3000g离心10min)将EV溶液浓缩5倍；最后进行超速离心(4℃、120000g离心2h)沉淀外泌体EV，最后以PBS溶液(经0.22μm滤膜过滤)重悬外泌体沉淀，得到表达TRAIL的外泌体(EV-T)溶液，分装并冻存于-80℃保存备用。
实施例5外泌体鉴定
(1)采用纳米流式仪观察实施例4制得的表达TRAIL的外泌体(EV-T，3D培养)的粒径分布，结果显示其直径80～140nm。
(2)采用透射电子显微镜考察实施例4制得的表达TRAIL的外泌体(EV-T，3D培养)形态，从图3中可以看出，3D培养MSCflT细胞后制得的表达TRAIL的外泌体(EV-T)呈现典型的外泌体膜囊泡结构。
(3)将实施例4制得的表达TRAIL的外泌体(EV-T)溶液用RIPA裂解液裂解后，用BCA试剂测定总蛋白含量，以ELISA测量外泌体(EV-T)中TRAIL的表达量，结果显示3D培养MSCflT细胞后制得的表达TRAIL的外泌体总蛋白产量为15.4mg/mL，而2D培养MSCflT细胞后制得的表达TRAIL的外泌体总蛋白产量为3.1mg/mL，前者为后者的5倍(图4A)；以ELISA方法测定外泌体TRAIL表达量，结果表明，3D培养MSCflT所产每微克外泌体表达0.39ng TRAIL，而2D培养MSCflT所产每微克外泌体(蛋白定量)表达0.21ng TRAIL，前者是后者的1.9倍(图4B)。
(4)以免疫印迹(WB)检测细胞和外泌体中TRAIL的表达：结果表明，无论是2D培养还是3D培养后的MSCflT细胞及其EV-T都表达TRAIL，但MSC干细胞(不转染表达TRAIL的慢病毒)及其EV均不表达TRAIL。
(5)将实施例4制得的表达TRAIL的外泌体(EV-T)溶液用DiI标记后，与癌细胞混合培养，结合细胞的荧光共聚焦显微镜观察，考察外泌体进入细胞的情况，以明确所制备外泌体是否可载药输送进入癌细胞。结果发现，无论是2D还是3D培养MSCflT细胞后制得的外泌体均可在2小时之内将DiI载送输入癌细胞。
(6)采用商业化EV定量试剂盒(EXOCET Exosome Quantitation Kit)，通过测量EV富含的乙酰胆碱酯酶(AChE)活性来确定每1百万个MSC干细胞在1小时释放的EV-T的数目。图4C显示2D和3D培养MSCflT细胞后制得的外泌体颗粒产量比较图；从图中可以看出，3D培养细胞的外泌体产量是2D培养的5倍。呈递数值为4次实验的平均值±均值标准差；统计分析采用Student‘s-t试验，***代表P<0.001。
实施例6外泌体活性的细胞模型评估
本实施例采用细胞活性和增殖检测试剂CCK8以及凋亡分析试剂盒考察实施例4制得的EV-T杀死癌细胞的活性。具体方法如下：
每孔1×104接种肺癌细胞系H727细胞(Cancer Research United kingdom，London，UK)，人永生化角质形成细胞HaCat作为正常细胞对照(Cancer Research Unitedkingdom，London，UK)，37℃、5％CO2培养箱孵育12h，然后换上新鲜的含有EV-T(0～40ng/mlTRAIL)或重组可溶性TRAIL(rTRAIL，购自北京义翘神州公司)的培养基，作用细胞24h，随后采用CCK-8试剂检测细胞存活率。
图5是以CCK8方法检测细胞活性受治疗试剂的影响；结果表明，3D来源的EV-T杀死肺癌H727细胞的活性不仅高于rTRAIL，也显著高于2D来源的EV-T，3D来源的EV-T杀死肺癌H727细胞的活性是2D的1.75倍。
实施例7以动物皮下肿瘤模型评估外泌体活性
本实施例使用动物皮下A549肿瘤模型考察实施例4制得的EV-T在动物模型中治疗肿瘤的效应。具体方法如下：
(1)皮下肿瘤模型建立：将购于北京斯贝福3-5周龄的雌性Balb/c裸鼠饲养于SPF级别的动物培养房中，以5×106个的浓度将A549细胞(ATCC)接种于裸鼠右前侧，建立皮下实体瘤模型，待其肿瘤长至100mm3大小，随机分为4组，每组5只，分别为对照组(Ctrl)，单独EV-T组，单独Dina组和联合用药组(EV-T+Dina)。
(2)治疗：用胰岛素针瘤内注射对照PBS缓冲液或各种治疗试剂各100μL，分别含20ng rTRAIL、50μg实施例4制得的EV-T(携带20ng TRAIL)、160μg Dinaciclib(简称Dina)和联合用药(50μg EV-T+160μg Dina)。每48h注射一次，共注射3次；注射结束后，每两天对肿瘤体积及老鼠体重进行测量并记录，待治疗结束后继续饲养观察7天，最后处死裸鼠，取出肿瘤对其体积和大小进行测量，并绘制肿瘤生长曲线图。
图6是以动物皮下A549移植肿瘤模型研究比较2D与3D培养MSCflT细胞来源外泌体的治疗效应结果分析图。其中，皮下接种5百万个A549肺癌细胞到裸鼠，生长21天后肿瘤长到大约100mm3时，静脉给药治疗3次，每次间隔2天，治疗结束7天后处死动物，取出肿瘤称重。结果表明，3D来源EV-T不管是单独使用还是与致敏化疗药物组合，其抑制肿瘤生长的效率均显著高于2D来源的EV-T。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法，其特征在于包含如下步骤：
（1）将人源血小板裂解物和基础培养基混合，得到培养MSC干细胞的HPL培养基，其中，人源血小板裂解物的含量为5%v/v；
（2）将表达TRAIL的病毒转染MSC干细胞，得到TRAIL基因工程化的MSC干细胞即MSCflT；
（3）采用步骤（1）制得的培养MSC干细胞的HPL培养基对MSCflT进行3D培养，然后分离外泌体；
所述的人源血小板裂解物的制备方法，包含如下步骤：
将人源血小板进行冷冻、解冻处理，并重复操作一次；然后1500g离心10min，收集上清，得到人源血小板裂解液；将血小板裂解液在4℃条件下10000g离心10min，收集上清并过滤，得到人源血小板裂解物；
步骤（2）中所述的MSC干细胞为脐带来源间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法，其特征在于：
步骤（2）中所述的病毒包括但不限于慢病毒、逆转录病毒和腺病毒。
3.根据权利要求1所述的无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法，其特征在于：
步骤（2）中所述的表达TRAIL的病毒，通过如下方法制备得到：
将TRAIL表达质粒pCCL-CMV-flT与慢病毒包装质粒pCMV-dR8.74 和 pMD2.G共转染293T细胞，收集细胞培养上清，通过超速离心沉淀病毒，最后将病毒沉淀重新悬浮溶解于PBS溶液，得到表达TRAIL的慢病毒溶液。
4.根据权利要求3所述的无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法，其特征在于：
步骤（2）中所述的转染的具体操作为：
采用表达TRAIL的慢病毒溶液转染MSC干细胞，并采用终浓度为8μg/mL的polybrene增强转染，孵育 6~24 h；孵育后将培养基换成含有10% FBS的DF12新鲜培养基，继续培养 2~3天；待细胞长满后，进行增殖传代培养，得到TRAIL 基因工程化的MSC干细胞。
5.根据权利要求1所述的无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法，其特征在于：
步骤（3）中所述的分离方法包括但不限于超速离心、外泌体沉淀试剂沉淀、密度梯度离心、超滤离心、PEG-base沉淀法和大小排阻色谱法中的至少一种。
6.一种高活性外泌体，其特征在于通过1~5任一项所述的制备方法制备得到。
7.权利要求6所述的高活性外泌体在制备抗癌产品中的应用。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113322230B (zh) * 2021-05-31 2024-03-12 重庆医科大学附属口腔医院 一种牙髓干细胞外泌体及其制备方法和应用
CN113201491B (zh) * 2021-06-01 2021-12-07 四川美科奇生物科技有限公司 一种促进干细胞体外增殖和分化的培养方法
CN115537384A (zh) * 2021-06-30 2022-12-30 西比曼生物科技（上海）有限公司 一种促使间充质干细胞产生外泌体的试剂盒
CN113881627A (zh) * 2021-10-21 2022-01-04 焕生汇生物基因技术(北京)有限公司 一种提高细胞外泌体产量的方法
CN114369565A (zh) * 2021-12-31 2022-04-19 清华大学深圳国际研究生院 高效生产细胞外囊泡的方法
CN115463154A (zh) * 2022-10-21 2022-12-13 上海君益禾生物医学科技有限公司 一种血小板裂解液和外泌体复合凝胶的制备方法及应用
CN115957179A (zh) * 2022-12-13 2023-04-14 四川康克俞生物科技有限公司 一种负载淫羊藿苷的3d培养间充质干细胞外泌体水凝胶的制备方法和应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105950550A (zh) * 2016-07-21 2016-09-21 四川新生命干细胞科技股份有限公司 一种间充质干细胞无血清培养基、细胞分离培养方法
CN107810014A (zh) * 2015-05-08 2018-03-16 卢万天主教大学 包含间充质干细胞的组合物及其用途
CN109097328A (zh) * 2018-08-24 2018-12-28 深圳市浊安认证生物技术有限公司 一种特异性的间充质干细胞外泌体提取方法
CN111454893A (zh) * 2020-03-16 2020-07-28 北京全式金生物技术有限公司 一种无血清、无异源成分的间充质干细胞培养基及其应用
CN111527199A (zh) * 2017-11-16 2020-08-11 得克萨斯大学体系董事会 用于制备来源于msc的外泌体的方法
CN111840513A (zh) * 2020-06-12 2020-10-30 广东工业大学 一种负载促肿瘤凋亡蛋白和抗癌小分子的复合外泌体及其制备方法和应用
CN112755370A (zh) * 2021-01-06 2021-05-07 山东美毅生物技术有限公司 一种间充质干细胞外泌体子宫内膜制剂、制取方法及宫腔灌注管

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107810014A (zh) * 2015-05-08 2018-03-16 卢万天主教大学 包含间充质干细胞的组合物及其用途
CN105950550A (zh) * 2016-07-21 2016-09-21 四川新生命干细胞科技股份有限公司 一种间充质干细胞无血清培养基、细胞分离培养方法
CN111527199A (zh) * 2017-11-16 2020-08-11 得克萨斯大学体系董事会 用于制备来源于msc的外泌体的方法
CN109097328A (zh) * 2018-08-24 2018-12-28 深圳市浊安认证生物技术有限公司 一种特异性的间充质干细胞外泌体提取方法
CN111454893A (zh) * 2020-03-16 2020-07-28 北京全式金生物技术有限公司 一种无血清、无异源成分的间充质干细胞培养基及其应用
CN111840513A (zh) * 2020-06-12 2020-10-30 广东工业大学 一种负载促肿瘤凋亡蛋白和抗癌小分子的复合外泌体及其制备方法和应用
CN112755370A (zh) * 2021-01-06 2021-05-07 山东美毅生物技术有限公司 一种间充质干细胞外泌体子宫内膜制剂、制取方法及宫腔灌注管

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Human Platelet Lysate Gel Provides a Novel Three Dimensional-Matrix for Enhanced CultureExpansion of Mesenchymal Stromal Cells;Gudrun Walenda et al;《TISSUE ENGINEERING》;20121231;第18卷(第12期);摘要，第925页左栏倒数第2段 *
Mesenchymal stromal cell delivery of full-length tumor necrosis factorerelated apoptosis-inducing ligand is superior to soluble type for cancer therapy;ZHENGQIANG YUAN et al;《Cytotherapy》;20151231;第17卷(第7期);第886页右栏第2、3段，第887页左栏第1段6、7、9、10 *
血小板裂解液对大鼠骨髓间充质干细胞生长的影响;宋会平等;《中国组织工程研究与临床康复》;20080520;第12卷(第21期);第1、3小节 *

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