CN111527199A - 用于制备来源于msc的外泌体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了制备临床级别的来源于间充质干细胞(MSC)的外泌体的方法。还提供了用治疗剂诸如siRNA装载外泌体的方法。本发明还提供了通过施用所述临床级别的外泌体治疗疾病的方法。

Description

用于制备来源于MSC的外泌体的方法

本申请要求于2017年11月16日提交的美国临时专利申请No.62/587,408的权益，该临时专利申请通过引用完整地结合于此。

背景技术

1.技术领域

本发明一般地涉及分子生物学和医学领域。更具体地，它涉及用于大规模产生符合良好生产规范-(GMP)的外泌体的方法。

2.相关领域描述

胞外囊泡(EV)，包括外泌体(exosome)和微泡，是纳米尺寸的细胞间通讯媒介，其参与数个生理过程。具体地，外泌体是由细胞释放的纳米尺寸的囊泡并且它们构成细胞组分和产物的细胞间交换的一种方式，其已经刺激了将它们用作治疗剂递送剂的更新的兴趣。与它们的人工对应物不同，这些天然生成的专门化的细胞间穿梭服务的特征可以为有效递送治疗剂有效负载提供独特的优势。外泌体的这些特征和与外泌体产生和细胞摄取相关的调节机构仍然有待进一步研究。然而，使用外泌体用于治疗性控制疾病(包括癌症)已经显示了有前景的结果。

由于它们的生物学性质，外泌体是有希望的候选物，用于治疗免疫病症和用于系统递送治疗剂化合物，诸如细胞因子、化疗药物、核酸和病毒载体。然而，它们的低产生收率限制了它们在临床中的应用潜力。因此，存在对于产生可以用于治疗剂的外泌体的有效方法的未满足的需求。

发明内容

在第一实施方案中，提供了从间充质干细胞(MSC)制备外泌体的方法，包括：在功能封闭的生物反应器中在包含人血小板裂解物(PLT)的培养基中培养MSC至汇合(例如，75-95％或80-90％汇合,诸如约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％)；在基本上不含PLT(例如，不含PLT)的培养基中进一步培养细胞；从生物反应器中收集条件培养基级分；和从所述条件培养基级分中分离外泌体。

在一些方面，每个条件培养基级分在收集后被保存在-80℃。在某些方面，将条件培养基级分解冻并且合并，之后分离。

在某些方面，MSC进一步限定为骨髓来源的MSC。在特定方面，MSC进一步限定为脂肪来源的MSC。

在另外的方面，所述方法进一步包括用至少1x10⁷个MSC接种生物反应器，之后在生物反应器中培养MSC。在一些方面，将MSC以约400-500个细胞/cm²的密度接种。

在某些方面，封闭的生物反应器是中空纤维生物反应器。在一些方面，中空纤维生物反应器是Terumo细胞扩增系统。

在一些方面，在MSC培养物的培养基中PLT的浓度为5％。PLT的浓度可以是约2-10％，诸如3、4、5或6％。在某些方面，将新鲜培养基连续添加到生物反应器中的MSC。在具体方面，将细胞在5％氧下培养。在某些方面，步骤(a)的培养持续5-10天，诸如6、7、8或9天。在具体方面，步骤(a)的培养持续8天。

在某些方面，将MSC培养至85-90％汇合，诸如85、86、87、88、89或90％汇合。汇合可以通过监视葡萄糖和乳糖水平来测量。例如，乳糖水平可以是约2-6mmol/L,诸如约2、3、4、5或6mmol/L，并且葡萄糖水平可以是约80-140mg/dL,诸如约80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135或140mg/dL。

在一些方面，在基本上不含PLT的培养基中培养24-72小时，诸如24-48、36-50、48-60或50-72小时,诸如约36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或52小时。在具体方面，在基本上不含PLT的培养基中培养约48小时。在具体方面，进一步培养步骤的培养基不含PLT。

在某些方面，在用PLT培养和在基本上不含PLT的培养基中培养之间洗涤MSC。在一些方面，将MSC在无血清的确定成分培养基中培养。在具体方面，整个方法在无血清条件下进行。

在具体方面，将条件培养基级分收集在密封袋中。在特定方面，每24-72小时收集条件培养基级分。在一些方面，每40-50小时收集条件培养基级分。在一个具体方面，每48小时收集条件培养基级分。

在一些方面，条件培养基级分各自体积为200-300mL，诸如200-250或250-300mL。在某些方面，收集条件培养基级分达10-14天,诸如10、11、12、13或14天。在具体方面，收集条件培养基级分达12天。在特定方面，收集至少5个条件培养基级分。在特定方面，方法实施少于3周。

在一些方面，每个条件培养基级分包含9x10¹¹至50x10¹¹个外泌体。在具体方面，在收集的培养基级分中分离至少10x10¹²个外泌体。在特定方面，在收集的培养基级分中分离至少15x10¹²个外泌体。可以分离至少10x10¹¹、15x10¹¹、20x10¹¹、25x10¹¹、30x10¹¹、35x10¹¹、40x10¹¹、45x10¹¹、50x10¹¹、60x10¹¹、70x10¹¹、80x10¹¹、90x10¹¹、10x10¹²、15x10¹²、20x10¹²或25x10¹²个外泌体。

在某些方面，分离包括过滤和超速离心合并的级分以获得含有外泌体的沉淀(pellet)并且将含有外泌体的沉淀重悬于缓冲液中。在一些方面，使用泵和热密封管以功能封闭的方式进行分离。在一些方面，过滤进一步限定为将合并的级分通过滤器，诸如0.2μm滤器。在另外的方面，分离进一步包括在过滤之前的离心步骤，以去除大的细胞碎片。在具体方面，分离在4℃进行。

在特定方面，缓冲液包含约0.01-0.1M,诸如约0.08、0.09或0.1M,特别是约0.09M氯化钠，约0.1-0.5M,诸如约0.1、0.2或0.3M,特别是约0.23M葡萄糖酸钠，约0.1-0.5M,诸如约0.1、0.2或0.3M,特别是约0.27M三水合醋酸钠，1-10mM,诸如约6-7mM,特别是约5mM氯化钾，和约1-5mM,诸如约2-4mM,特别是约3mM氯化镁。在一些方面，缓冲液具有约6-8,诸如约6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或7.6,特别是约7.4的pH。在特定方面，缓冲液是

在另外的方面，所述方法进一步包括用治疗剂装载外泌体。在一些方面，治疗剂包括一种或多种细胞因子、化疗药物、核酸、小分子或蛋白质。在某些方面，核酸包括DNA和/或RNA。在一些方面，RNA是siRNA、miRNA或shRNA。在具体方面，RNA是siRNA。在一些方面，装载包括电穿孔外泌体。在某些方面，电穿孔在

中进行。在具体方面，所述方法不包括在分离外泌体和电穿孔步骤之间洗涤外泌体或交换缓冲液。在具体方面，来自分离外泌体步骤的外泌体的数量至装载的外泌体的数量减少不超过20％。

在另一个实施方案中，提供了药物组合物，其包含通过各实施方案的方法(例如，在功能封闭的生物反应器中在包含人血小板裂解物(PLT)的培养基中培养MSC至80-90％汇合；在基本上不含PLT(例如，不含PLT)的培养基中进一步培养细胞；从生物反应器中收集条件培养基级分；和从条件培养基级分中分离外泌体)产生的外泌体。

在还有的另一个实施方案中，提供了一种治疗癌症的方法，包括施用有效量的根据各实施方案的方法(例如，在功能封闭的生物反应器中在包含人血小板裂解物(PLT)的培养基中培养MSC至80-90％汇合；在基本上不含PLT(例如，不含PLT)的培养基中进一步培养细胞；从生物反应器中收集条件培养基级分；和从条件培养基级分中分离外泌体)产生的外泌体。在一些方面，受试者是人。

在某些方面，将电穿孔的外泌体直接输注到受试者中。在另外的方面，所述方法进一步包括施用至少第二种抗癌疗法。在一些方面，所述至少第二种抗癌疗法包括化疗、放疗、基因疗法、外科手术、激素疗法、抗血管生成疗法或免疫疗法。

在另一个实施方案中，提供了将RNA递送到细胞中的方法，包括施用有效量的装载RNA的外泌体，所述外泌体通过各实施方案的方法(例如，在功能封闭的生物反应器中在包含人血小板裂解物(PLT)的培养基中培养MSC至80-90％汇合；在基本上不含PLT(例如，不含PLT)的培养基中进一步培养细胞；从生物反应器中收集条件培养基级分；从条件培养基级分中分离外泌体；以及用RNA装载所述分离的外泌体，由此产生装载RNA的外泌体)产生。在一些方面，细胞是人细胞。在具体方面，细胞是癌细胞或T细胞。

在另一个实施方案中，提供了在有此需要的受试者中治疗疾病或病症的方法，包括向所述受试者施用有效量的外泌体，所述外泌体通过各实施方案的方法(例如，在功能封闭的生物反应器中在包含人血小板裂解物(PLT)的培养基中培养MSC至80-90％汇合；在基本上不含PLT(例如，不含PLT)的培养基中进一步培养细胞；从生物反应器中收集条件培养基级分；和从条件培养基级分中分离外泌体)产生。在一些方面，外泌体装载有siRNA或miRNA。在特定方面，外泌体装载有KRAS siRNA。在一些方面，受试者是人。

在一些方面，疾病或病症是癌症、炎性病症或免疫相关病症。在具体方面，癌症是肺癌。

在某些方面，将外泌体口服、局部、静脉内、腹膜内、肌内、内镜(endoscopically)、经皮、皮下、区域(regionally)、或通过直接注射施用。在一些方面，将外泌体静脉内施用。

在另外的方面，所述方法进一步包括施用至少第二种治疗剂。在一些方面，所述至少第二种治疗剂是抗癌剂。在某些方面，抗癌剂是化疗、放疗、基因疗法、外科手术、激素疗法、抗血管生成疗法或免疫疗法。

在另一个实施方案中，提供了在患有免疫介导的炎性疾病的受试者中治疗所述疾病的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的来源于MSC的外泌体，所述外泌体根据本发明的方法(例如，在功能封闭的生物反应器中在包含人血小板裂解物(PLT)的培养基中培养MSC至80-90％汇合；在基本上不含PLT(例如，不含PLT)的培养基中进一步培养细胞；从生物反应器中收集条件培养基级分；和从条件培养基级分中分离外泌体)产生。在一些方面，免疫介导的炎性疾病选自由以下组成的组：类风湿性关节炎(RA)，炎性肠病(IBD)，和克罗恩病(Crohn's disease)。在某些方面，MSC是同种异体的(allogeneic)。在一些方面，将外泌体系统或局部施用。在某些方面，将外泌体经由直肠、鼻、口腔(buccal)、阴道、皮下、皮内、静脉内、腹膜内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内或颅内路线，或者经由植入的贮库来施用。在一些方面，将外泌体连同至少一种另外的治疗剂一起施用。

从以下详细描述，本发明的其他目的、特征和优势将变得明显。然而，应当理解，该详细描述和具体实例尽管表明本发明的优选实施方案却是仅通过举例说明的方式提供的，因为从该详细描述在本发明的精神和范围内进行各种改变和改进将对于本领域技术人员而言变得明显。

附图说明

以下附图形成本发明说明书的一部分并且被包括来进一步显示本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个结合本文提供的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。

图1A-1D:(图1A)设计来使用Turumo细胞扩增系统(Bioreactor)从间充质干细胞(MSC)产生EV的示意步骤。(图1B)详细描述关于MSC生物反应器培养物用以收集外泌体的步骤的示意图。(图1C)来自MSC-条件培养基的外泌体的分离和电穿孔步骤的示意图。(图1D)描述了来源于MSC的外泌体的产生的示意图。

图2:用于从在生物反应器上培养的MSC产生含有EV的条件培养基的策略的示意图。

图3:用于从在生物反应器上培养的MSC-条件培养基分离EV的策略的示意图。

图4A-4B:鉴定在生物反应器中产生的来源于MSC的外泌体。(图4A)在每次收获时在生物反应器中产生的来源于MSC的外泌体的流式细胞术，显示外泌体标志物的表达。(图4B)来此每次收集的代表性TEM，显示外泌体的典型形态。

图5A-5E:在每次收获时在生物反应器中产生的外泌体的定量。(图5A)以通过microBCA和Nanosight确定的量(quantum)确定产生的来源于MSC的外泌体的数量。(图5B)使用Nanosight测量的每次收获的粒度分布。(图5C)在外泌体产生期间生物反应器中的葡萄糖和乳糖的水平。(图5D)在不同时间点和通过Nanosight定量的从MSC条件培养基中分离的每个细胞产生的外泌体的数量。(图5E)在24小时和48小时分离的在来源于MSC的外泌体上的外泌体标志物的代表性流式细胞术。

图6A-6B:在补充有人血小板裂解物(hPLT)的培养基中或无血清条件下产生的来源于MSC的外泌体的定量。(图6A)通过Nanosight分析的在存在或不存在hPLT下培养的MSC条件培养基中分离的每个细胞的外泌体的数量。(图6B)使用仅培养基vs补充有人血小板裂解物(hPLT)的培养基产生的来源于MSC的外泌体的流式细胞术，显示了在无血清的培养基上产生的外泌体的纯度。

图7:使用十六种不同nucleofactor程序和三种不同nucleofactor溶液评估来源于MSC的外泌体的电穿孔。通过经由来源于MSC的外泌体的siRNA递送在受体细胞上在48小时后诱导的凋亡来评估电穿孔的效率。

图8A-8C:使用五种不同溶液评估来源于MSC的外泌体的电穿孔。(图8A)通过经由来源于MSC的外泌体的siRNA递送在受体细胞上在48小时后诱导的凋亡来评估电穿孔的效率。(图8B)使用研究缓冲液(RB)或临床缓冲液(CB；即血小板裂解物(PLT))，在电穿孔后MSC外泌体的代表性透射电子显微照片，显示了在电穿孔后外泌体完整性的保持。(图8C)使用来源于MSC的外泌体的siRNA的递送诱导的受体细胞中基因转录的沉默，所述外泌体使用Lonza装置和

溶液电穿孔。

图9:超速离心之前和之后的外泌体的数量。使用研究缓冲液的外泌体的电穿孔包括第二洗涤步骤，其可以导致至少50％样品损失。

图10A-10D:在生物反应器中产生和注入小鼠的预先标记的来源于MSC的外泌体的生物分布。在腹膜内(图10A,10B)或静脉内(图10C,10D)施用8×10⁹个标记的外泌体于野生型(WT)裸鼠中6小时后DIR-标记的MSC外泌体的荧光。(A,C)解剖的器官。(B,D)没有脾和肝的解剖的器官。

具体实施方式

为了配制用于人疗法的外泌体，它们的制备的数个方面需要仔细考虑，包括外泌体的大规模产生符合良好生产规范(GMP)标准。因此，本研究关注创新产生符合GMP的外泌体的方法和相关的系统分析。

因此，在某些实施方案中，本发明提供了使用功能封闭的生物反应器(诸如Terumo细胞扩增系统)从间充质干细胞(MSC)产生EV(诸如外泌体)的有效和临床相关的策略。本文提供的方法可以在短期内(诸如约3周)产生至少10x10¹²个EV。本发明的方法包括在功能封闭的无血清系统中大规模产生和分离临床级别的EV。诸如从骨髓来源的MSC以临床相关的剂量产生EV。

在优选实施方案中，整个方法是无血清的并且因此基本上没有来自血清的外泌体对来源于MSC的EV的污染。具体地，所述方法可以包括在生物反应器中MSC的初始培养中使用人血小板裂解物(PLT)。本发明人已经发现培养MSC至约80-90％,诸如约85％汇合，导致EV的有效产生。因此，然后可以将MSC转换至不含PLT的培养基达约24-72小时,诸如约24小时或48小时，之后收集包含EV的条件培养基。条件培养基级分可以约每48小时收集并冷冻，诸如在约-80℃冷冻，直至分离EV。条件培养基级分可以收集约4-10次，诸如约5、6、7或8次，特别是约6次。因此，从接种MSC到生物反应器中直至最后收集的时间段可以是约15-30天，诸如约20天。每个条件培养基级分可以包含至少9x10¹¹个外泌体,诸如至少1x10¹²个外泌体,特别是约3x10¹²个外泌体。

优选地，在分离EV之前将收集的培养基级分解冻并合并。外泌体的分离可以包括初始离心步骤，诸如以1,000g离心，接着通过诸如约100,000g超速离心。可以存在多轮超速离心，诸如3轮，以产生外泌体沉淀。在一些方面，将外泌体沉淀重悬于符合GMP的缓冲液(诸如

)中。外泌体可以进一步进行过滤，诸如用0.2μm滤器过滤，之后超速离心。该方法可以导致至少9-10x10¹²个，诸如多至15x10¹²个外泌体或更高的外泌体总产量。

另外，外泌体可以装载治疗剂，诸如细胞因子、化疗剂或核酸。因此，提供了一种通过在FDA批准的缓冲液(诸如

)中电穿孔而装载外泌体(诸如通过本发明方法产生的那些)的方法。电穿孔可以在流过式(flow-through)电穿孔系统(诸如4D-Nucleofactor LV大规模转染系统,Lonza)中进行。每个电穿孔运行可以包括至少2x10¹²个外泌体。外泌体可以装载核酸，诸如siRNA。因为缓冲液是FDA批准的、无菌的并且对于在患者中使用是无热原的，所以在施用于患者之前不需要洗涤步骤来交换缓冲液，因为它们可以直接输注到患者中。因此，没有如现有方法那样在额外的洗涤步骤中的外泌体损失，现有方法可导致约50％的外泌体损失。该缓冲液可以保持电穿孔后外泌体的完整性。

本文进一步提供了使用外泌体(诸如装载有siRNA的外泌体)来治疗患者中的疾病(诸如免疫相关疾病和癌症)的方法。

I.定义

如本文所用，关于指定组分“基本上不含”在本文中是用于意指所述指定组分中全都没有被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。由于非故意的组合物污染导致的指定组分的总量因此远远低于0.05％，优选低于0.01％。更优选这样的组合物，其中用标准分析方法不能检测到指定组分的量。

如本说明书中使用，“一个”或“一种”可以是指一个/一种或多个/多种。如本文权利要求中使用，当与措词“包含”一起使用时，措词“一个”或“一种”可以是指一个/一种或多个/多种。

权利要求中的术语“或”的使用是用于是指“和/或”，除非明确指出仅仅是指备选方案或者备选方案是相互排斥的，但是公开内容支持仅仅是指备选方案和“和/或”的定义。如本文使用，“另一个(种)”可以是指至少第二个(种)或更多个(种)。术语“约”、“基本上”和“近似”一般地是指所述值+/-5％。

“胞外囊泡”和“EV”是来源于细胞的和细胞分泌的微囊泡，其作为一个类别包括外泌体、外泌体样囊泡、核外粒体(ectosomes，其由囊泡直接从质膜出芽(budding)导致)、微颗粒、微囊泡、脱落(shedding)微囊泡(SMV)、纳米颗粒和甚至(大的)凋亡泡(apoptoticblebs)或凋亡体(由细胞死亡导致)或膜颗粒。

如本文所用，术语“微囊泡”和“MV”典型地是指被磷脂双层包围的较大的胞外膜囊泡或结构，其直径为约100nm至约1,000nm，或在血浆中约100nm至约400nm。通过质膜的出芽或起泡的调节释放形成微囊泡/MV。

在胞外囊泡类别内，重要的成分是“外泌体”本身，其优选描述为直径为约40-120nm,诸如50-100nm并且是胞吞来源的膜状囊泡，即由磷脂双层包围的囊泡，其由多泡体(MVB)的胞吐融合或者“胞吐作用”导致。外泌体可以分离自任何适当的来自哺乳动物的生物样品，包括但不限于全血，血清，血浆，尿，唾液，母乳，脑脊髓液，羊水，腹水，骨髓和培养的哺乳动物细胞(例如，未成熟树突细胞(野生型或永生化))，诱导或非诱导多能干细胞，成纤维细胞，血小板，免疫细胞，网织红细胞，肿瘤细胞，间充质干细胞，卫星细胞，造血干细胞，胰腺干细胞，白色和米色前脂肪细胞等)。本领域技术人员将理解，培养的细胞样品将在细胞适合的培养基中(使用无外泌体血清)。

外泌体包括在其他囊泡中不存在的特定的表面标志物，包括表面标志物诸如tetraspanins,例如，CD9,CD37,CD44,CD53,CD63,CD81,CD82和CD151；靶向或粘附标志物诸如整联蛋白,ICAM-1,EpCAM,膜融合标志物诸如膜联蛋白,TSG101,ALIX；和其他外泌体跨膜蛋白，诸如Rab5b,HSP70,LAMP2(溶酶体相关膜蛋白)和LIMP(溶酶体整合膜蛋白)。

本文所用的术语“间充质干细胞”或“MSC”是指来源于中胚层的多能成体干细胞，其具有自我再生和分化能力以产生具有广大表型种类的后代细胞，所述表型种类尤其包括结缔组织、骨髓基质、脂肪细胞、真皮和肌肉。MSC通常具有这样的细胞标志物表达谱，其特征在于它们是标志物CD19、CD45、CD14和HLA-DR阴性的，是标志物CD105、CD106、CD90和CD73阳性的。MSC可以分离自任何类型的组织。通常，MSC可以分离自骨髓、脂肪组织、脐带，或外周血。在一个具体实施方案中，MSC是骨髓来源的干细胞。

作为外泌体来源的MSC可以是自体的、同种异体的或异种的。如本文所用，术语“自体的”是指MSC的供体和来源于所述MSC的外泌体(或分离的外泌体群体)的受体是同一受试者。术语“同种异体的”是指MSC的供体和来源于所述MSC的外泌体(或分离的外泌体群体)的受体是不同的受试者。术语“异种的”是指MSC的供体和来源于所述MSC的外泌体(或分离的外泌体群体)的受体是不同物种的受试者。在一个具体实施方案中，外泌体源自的MSC是同种异体的。

本文所用的术语“来源于脂肪组织的干细胞”或“ASC”是指来源于脂肪组织的MSC。ASC可以通过本领域已知的方法分离自脂肪组织，所述方法例如以下在“人脂肪间充质干细胞分离和扩增”中描述的方法。“脂肪组织”是指任何脂肪组织。脂肪组织可以是棕色或白色脂肪组织，其来源于例如皮下、网膜/内脏、乳房、性腺、器官周围或其他脂肪组织部位。优选地，脂肪组织是皮下白色脂肪组织。脂肪组织可以包括原代细胞培养物或永生化细胞系。脂肪组织可以来自具有脂肪组织的任何生物体。在一些实施方案中，脂肪组织是哺乳动物的脂肪组织，并且在另外的实施方案中，脂肪组织是人脂肪组织。脂肪组织的一个方便来源是吸脂手术。然而，应当理解，脂肪组织的来源和分离脂肪组织的方法对于本发明而言都不是关键的。在一个具体实施方案中，ASC分离自受试者的吸脂(lipoaspirate)。

MSC可以来源于任何动物，优选哺乳动物，包括非灵长类(例如，牛，猪，马，猫，狗，大鼠或小鼠)和灵长类(例如，猴，或人)。在一个具体实施方案中，MSC是人的MSC。

术语“功能封闭的”是指被密封以确保流体无菌的系统，所述密封是通过气密密封整个系统或者通过在与收集系统的所有连接处提供无菌阻挡滤器来实现的。

术语“生物反应器”是指大规模细胞培养物系统，其在封闭的无菌系统中为细胞提供营养物和去除代谢物，以及提供有益于细胞生长的物理-化学环境。在具体方面，生物和/或生化过程在监视的和控制的环境和操作条件(例如，pH，温度，压力，营养供应和废物去除)下进展。根据本发明，适合用于本发明的方法的生物反应器的基本类别包括中空纤维生物反应器。

术语“中空纤维”意欲包括(任何形状的)中空结构，其含有限定尺寸、形状和密度的孔以用于将(溶液中的)营养物递送至生物反应器中含有的细胞和从生物反应器中含有的细胞中去除(溶液中的)废物。为了本发明的目的，中空纤维可以由可吸收或不可吸收的材料构成。纤维包括但不限于管状结构。

如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指活的哺乳动物生物体，诸如人，猴，牛，绵羊，山羊，狗，猫，小鼠，大鼠，豚鼠，或它们的转基因物种。在某些实施方案中，患者或受试者是灵长类。人患者的非限制性实例有成人、青少年、婴儿和胎儿。

“治疗(Treatment或treating)”包括：(1)在经历或显示疾病病理学或症状学的受试者或患者中抑制疾病(例如，阻止病理学和/或症状学的进一步发展)，(2)改善正在经历或显示疾病病理学或症状学的受试者或患者中的疾病(例如，逆转病理学和/或症状学)，和/或(3)在正在经历或显示疾病病理学或症状学的受试者或患者中实现疾病的任何可测量的减轻。

术语“有效的”当该术语在说明书和/或权利要求中使用时，是指足以实现所需的、期望的或意欲的结果。“有效量”、“治疗有效量”或“药学有效量”当在用化合物治疗患者或受试者的情况下使用时是指化合物的量，其当施用于受试者或患者用于治疗或预防疾病时，是足以实现该疾病的所述治疗或预防的量。

本文使用的术语“癌症”可以用于描述实体瘤、转移性癌症或非转移性癌症。在某些实施方案中，癌症可源自膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳房、结肠、食道、十二指肠、小肠、大肠、结肠、直肠、肛门、牙龈、头部、肾脏、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、胰腺、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌部或子宫。

在应用于细胞时的术语“接触”和“暴露”在本文中用于描述过程，通过所述过程，治疗剂被递送到靶细胞或置于与靶细胞直接并置。为了实现细胞杀死，例如，一种或多种药剂以杀死细胞或防止其分裂的有效量递送到细胞。

患者的有效反应或患者对治疗的“反应”是指赋予处于疾病或病症风险或患有疾病或病症的患者的临床或治疗益处。这类益处可包括细胞或生物反应、完全反应、部分反应、稳定疾病(不进展或复发)，或具有较晚复发的反应。例如，有效反应可以是减小的肿瘤尺寸或诊断患有癌症的患者的无进展生存期。

本文所用的“治疗剂”是指可以施用于受试者以便获得疾病或健康相关状况的治疗益处的任何试剂。例如，包括治疗剂的纳米颗粒可以被施用于受试者以便减小肿瘤尺寸、减少或抑制肿瘤的局部浸润、或降低转移发展的风险。

本文所用的“诊断剂”是指可以施用于受试者以便诊断受试者中疾病或健康相关状况的任何试剂。诊断可以包括确定疾病是否存在，疾病是否进展，或者疾病状态的任何变化。

治疗剂或诊断剂可以是小分子、肽、蛋白质、多肽、抗体、抗体片段、DNA或RNA。在具体实施方案中，治疗剂或诊断剂是siRNA。

本文所用的“核酸”通常是指DNA、RNA或其衍生物或类似物的分子(即，链)，所述分子包含核碱基。核碱基包括例如在DNA(例如，腺嘌呤“A”，鸟嘌呤“G”，胸腺嘧啶“T”或胞嘧啶“C”)或RNA(例如，A，G，尿嘧啶“U”或C)中发现的天然存在的嘌呤或嘧啶碱基。术语“核酸”包括术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”，分别是术语“核酸”的亚属。术语“寡核苷酸”是指长度为3至约100个核碱基的分子。术语“多核苷酸”是指至少一个长度大于约100个核碱基的分子。

这些定义是指单链或双链核酸分子。双链核酸是通过完全互补结合形成的，但是在一些实施方案中，双链核酸可以通过部分或基本上互补的结合形成。因此，核酸可以包括这样的双链分子，其包括一个或多个互补链或具体序列的“互补序列”，典型地包括分子。如本文所用，单链核酸可以用前缀“ss”表示，而双链核酸可以用前缀“ds”表示。

如本文所用，“核苷酸”是指进一步包含“主链部分”的核苷。主链部分通常共价连接核苷酸至另一个包含核苷酸的分子或另一个核苷酸，以形成核酸。天然存在的核苷酸中的“主链部分”典型地包含磷部分，其与5-碳糖共价连接。主链部分的连接典型地发生在5-碳糖的3'-或5'-位。然而，本领域已知其他类型的连接，特别是当核苷酸包括天然存在的5-碳糖或磷部分的衍生物或类似物时。

核酸可以包含核碱基的衍生物或类似物、核碱基接头部分和/或主链部分(其可以在天然存在的核酸中存在)或者完全由它们组成。如本文所用，“衍生物”是指天然存在的分子的化学修饰的或改变的形式，而术语“模拟物”或“类似物”指在结构上可以类似于或可以不类似于天然存在的分子或部分但是具有类似功能的分子。如本文所用，“部分”通常是指较大化学或分子结构的较小化学或分子组件。核碱基、核苷和核苷酸类似物或衍生物是本领域公知的。

术语“siRNA”(短干扰RNA)是指短双链RNA复合物，典型地长度为19-28个碱基对。换句话说，siRNA是包含两条核苷酸链的双链核酸分子，每条链具有约19至约28个核苷酸(即,约19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个核苷酸)。复合物经常包括3′-突出端(overhang)。siRNA可以使用本领域技术人员已知的技术制备并且各种各样的siRNA可商购自供应商诸如Integrated DNA Technologies,Inc.(Coralville,Iowa)。在一个实施方案中，如本文所述的针对TNF-α的2′-O-甲基-修饰的siRNA双链体可以结合到纳米颗粒中，其中在反义链上的2′-O-甲基修饰消除了脱靶效应，将非特异性免疫应答最小化并且改善了siRNA稳定性。

“微RNA(miRNA)”是短的非编码RNA，其可以通过3’-UTR元件靶向和基本上沉默编码蛋白的基因。miRNA可以长度为约21-22个核苷酸并且产生自较长的前体，其可以由非编码蛋白的基因转录。

“免疫病症”、“免疫相关病症”或“免疫介导的病症”是指其中免疫反应在疾病的发展或进展中起作用的病症。免疫介导的病症包括自身免疫病症、同种异体移植物排斥、移植物抗宿主病以及炎性病症和变态反应病症。

“自身免疫病”是指其中免疫系统产生针对作为正常宿主一部分的抗原(即，自身抗原)的免疫反应(例如，B-细胞或T-细胞反应)由此引起对组织的损伤的疾病。自身抗原可以来源于宿主细胞，或者可以来源于共生生物体，诸如通常定殖于粘膜表面的微生物(已知为共生生物体)。

本文所用的术语“汇合”是指覆盖表面的细胞的百分比，所述表面诸如生物反应器的中空纤维。汇合可以通过其中培养细胞的培养基中葡萄糖和/或乳糖的水平来测量。

II.外泌体的产生

本发明的某些实施方案涉及通过使用功能封闭的系统、诸如生物反应器、特别是中空纤维生物反应来大规模产生临床级别的EV、特别是外泌体的方法。重要的是，整个外泌体产生过程，包括后续的装载治疗剂，可以是无血清的。

A.间充质干细胞

用于产生EV的细胞可以是MSC，诸如来源于脂肪或来源于骨髓的MSC。在具体方面，MSC是人MSC，其可以是自体的或同种异体的。

MSC可以以下列密度接种在生物反应器中：约100-1,000个细胞/cm²,诸如约150个细胞/cm²,约200个细胞/cm²,约250个细胞/cm²,约300个细胞/cm²,诸如约350个细胞/cm²,诸如约400个细胞/cm²,诸如约450个细胞/cm²,诸如约500个细胞/cm²,诸如约550个细胞/cm²,诸如约600个细胞/cm²,诸如约650个细胞/cm²,诸如约700个细胞/cm²,诸如约750个细胞/cm²,诸如约800个细胞/cm²,诸如约850个细胞/cm²,诸如约900个细胞/cm²,诸如约950个细胞/cm²,或约1000个细胞/cm²。特别地，细胞可以以约400-500个细胞/cm²,诸如约450个细胞/cm²的密度接种。

接种在生物反应器中的细胞的总数可以是约1.0x10⁶至约1.0x10⁸个细胞,诸如约1.0x10⁶至5.0.0x10⁶、5.0x10⁶至1.0x10⁷、1.0x10⁷至5.0x10⁷、5.0x10⁷至1.0x10⁸个细胞。在具体方面，接种在生物反应器中的细胞的总数是约1.0x10⁷至约3.0x10⁷,诸如约2.0×10⁷个细胞。

细胞可以接种在任何适当的细胞培养基中，其中许多是可商购的。例举性的培养基包括DMEM、RPMI、MEM、Media 199、HAMS等。在一个实施方案中，培养基是αMEM培养基，特别是补充有L-谷氨酰胺的αMEM。培养基可以补充有以下中的一种或多种：生长因子，细胞因子，激素，或B27，抗生素，维生素和/或小分子药物。具体地，培养基可以是无血清的。

在一些实施方案中，细胞可以在室温温育。培养箱可以是湿润化的和具有约5％CO₂和约1％O₂的气氛。在一些实施方案中，CO₂浓度范围可以是约1-20％、2-10％或3-5％。在一些实施方案中，O₂浓度范围可以是约1-20％、2-10％或3-5％。

在具体实施方案中，将细胞接种在无血清的培养基中并在其中培养。培养基可以补充有血小板裂解物，特别是人血小板裂解物(PLT)。PLT可以在培养基中以约1-10％,诸如约1-4％、2-5％、3-6％、4-7％、5-8％或6-10％,诸如约4％、5％或6％,特别是约5％的浓度存在。

在接种后MSC可以初始在生物反应器中培养约5-10天，诸如约5、6、7、8、9或10天,特别是约7、8或9天。特别地，MSC可以初始在具有PLT的培养基中培养直至约75-95％汇合,诸如约75-80％、80-85％、85-90％或90-95％汇合,特别是约85-90％,诸如85％、86％、87％、88％、89％或90％汇合。一旦细胞达到预期汇合，可以将细胞转移至不含PLT的培养基。在转移至不含PLT的培养基之前，细胞可以用缓冲液诸如PBS洗涤至少一次。

在不含PLT的培养基中培养细胞是用于防止来源于MSC的外泌体被可能存在于PLT中的外泌体污染或稀释。在一些方面，PLT可以进行离心以去除外泌体和获得不含外泌体的PLT。

细胞可以在不含PLT的培养基中培养约8-100小时,诸如12-72小时,诸如约12-15、15-20、20-25、25-30、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、65-70或70-72小时。具体地，细胞可以在不含PLT的培养基中培养约24-48小时,诸如约48小时，之后收获外泌体。

B.生物反应器

生物反应器可以按照一般类别分组，包括：静态生物反应器，搅拌式摇瓶生物反应器，旋转壁式生物反应器，中空纤维生物反应器和直灌式生物反应器。在生物反应器内，细胞可以是游离的，或固定化的，接种在多孔3维支架上(水凝胶)。

中空纤维生物反应器可以用于增强培养期间的物质转移(mass transfer)。中空纤维生物反应器是基于中空纤维的3D细胞培养系统，所述中空纤维是以平行阵列排列的小的半渗透性毛细管膜，典型分子量截止值(MWCO)范围为10-30kDa。这些中空纤维膜经常成束并且容纳在管状聚碳酸酯壳内以产生中空纤维生物反应器筒。在该筒(其也配备有入口和出口端口)内，存在两个区室：在中空纤维内的毛细管内(IC)空间，和在中空纤维周围的毛细管外(EC)空间。

因此，对于本发明，生物反应器可以是中空纤维生物反应器。中空纤维生物反应器可以具有包埋在纤维内腔内的细胞，培养基灌注内腔外空间，或者备选地可以通过中空纤维提供气体和培养基灌注，而细胞在内腔外空间内生长。适合于本发明的中空纤维生物反应器是本领域已知的，并且可以包括但不限于Caridian(Terumo)BCT Quantum细胞扩增系统。

中空纤维应当适合于递送营养和去除生物反应器中的废物。中空纤维可以具有任何形状，例如，它们可以是圆形和管状的或者是同心环的形式。中空纤维可以由可吸收或不可吸收的膜制成。例如，适当的中空纤维的成分包括聚二噁烷酮，聚交酯，polyglactin，聚乙醇酸，聚乳酸，聚乙醇酸/三亚甲基碳酸酯，纤维素，甲基纤维素，纤维素聚合物，纤维素酯，再生纤维素，pluronic，胶原蛋白，弹性蛋白，和它们的混合物。

在接种细胞之前可以将生物反应器进行启动处理(primed)。启动处理可以包括用缓冲液诸如PBS冲洗。启动处理也可以包括用胞外基质蛋白诸如纤连蛋白包被生物反应器。生物反应器然后可以用PLT培养基诸如αMEM洗涤。

C.条件培养基收集

可以每8-100小时,诸如每12-72小时,诸如约12-15、15-20、20-25、25-30、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、65-70或70-72小时收集来自在不含PLT的培养基中培养的细胞的条件培养基。具体地，条件培养基级分可以每约24-48小时收集。

条件培养基级分可以包括约100-500mL,诸如约100-150、150-200、250-300、350-400、400-450或450-500mL,特别是约250mL的体积。级分可以收集在密封袋中并冷冻保存于诸如约-70°至约-90℃,诸如约-80℃，直至分离外泌体。

在具体方面，对于每次运行，收集条件培养基至少4次,诸如4-10次,特别是5、6、7、8或9次,特别是6次。单个的级分可以诸如在4℃解冻过夜，或者在2-6℃解冻约10-20小时。

D.分离外泌体

合并的条件培养基级分然后可以进行外泌体分离，特别是在4℃进行。条件培养基可以在约2℃、4℃、6℃、8℃、10℃、12℃、14℃、16℃、18℃、20℃、22℃、24℃或26℃的温度下离心。在一个实施方案中，条件培养基在约4℃的温度下离心。可以通过本领域已知的用于外泌体分离的方法进行外泌体的分离。优选地，如以上外泌体的产生，外泌体的分离也在封闭系统中进行。这可以通过使用泵和密封管来完成。

分离可以包括离心步骤以去除大的碎片，接着过滤，和一个或多个超速离心步骤。分离方法可以进行多次，以处理所有合并的培养基级分，诸如3次。

离心步骤可以包括以约500-2,000g、诸如约1,000g离心约5-25min,诸如约15min。条件培养基可以在约1,000g、2,000g、4,000g、6,000g、8,000g；10,0000g；12,000g、14,000g、16,000g或18,000g下离心。离心可以达诸如10-30分钟,12-28分钟,14-24分钟,或15-20分钟的时间。如本领域技术人员将理解，适当的可商购的实验室离心机例如THERMO-SCIENTIFIC^TM或COLE-PARMER^TM用于进行该离心步骤。具体地，离心可以在封闭系统(诸如Cobe 2991细胞处理器(Terumo))中进行。可以进行超过一次的低速离心以去除活细胞、死细胞和较大的细胞碎片。

过滤步骤可以包括使用具有亚微米滤器的过滤袋，诸如0.1-0.3微米滤器，诸如0.2微米滤器，以去除碎片，诸如较大的微囊泡。上清液然后可以使用与管直接线连接的注射器转移至管(例如，聚碳酸酯管)。过滤可以重复超过一次。过滤可以通过一次或多次通过相同尺寸的滤器(例如0.2微米滤器)来进行。备选地，可以使用2个或更多个滤器进行过滤，使用相同或减小尺寸的滤器，例如一次或多次通过40-50微米滤器，一次或多次通过20-30微米滤器，一次或多次通过10-20微米滤器，一次或多次通过0.2-10微米滤器等。用于该步骤的适当滤器包括使用0.45和0.22微米滤器。

超速离心可以以75,000至150,000g、诸如100,000至170,000g、诸如约100,000g进行约2-6小时,诸如1-3小时,诸如约4或5小时。任何可商购的超速离心机，例如THERMO-SCIENTIFIC^TM或Beckman^TM，可以用于进行该步骤。具体地，超速离心可以使用任何封闭系统的离心机进行，所述离心机诸如但不限于45Ti型转子(Beckman-Coulter)。该超速离心步骤可以任选地重复例如2次或更多次，以便增强结果。使用确立的技术从上清液中取出含有外泌体的沉淀，并且重悬于适当的生理溶液中。

本领域技术人员将理解，来自任何离心或超速离心步骤的外泌体沉淀可以在离心步骤之间使用适当的生理溶液洗涤，所述生理溶液例如无菌PBS、无菌0.9％盐水或无菌含糖的0.9％盐水缓冲液。

在离心后，去除溶液，并且将外泌体重悬于适当缓冲液如PBS中。缓冲液的pH可以是与样品相容的任何pH，但是典型范围为6至8。缓冲液可以具有4至10、4至6、4至8、6至10、6至8或8至10的pH。具体地，外泌体沉淀可以重悬于诸如在约7.4的生理pH下的临床级别的缓冲液诸如

中。缓冲液的体积可以是沉淀溶液的约0.01个体积至约0.09个体积、约0.02个体积至约0.08个体积；约0.03个体积至约0.07个体积。收获的外泌体可以立即使用，诸如用于电泳或治疗，或冷冻和储存例如在-20℃以备以后使用。

如本文所用，分析包括允许直接或间接可视化外泌体的任何方法并且可以是体内或离体的。例如，分析可包括但不限于离体显微镜或细胞计数检测和可视化与固体基底结合的外泌体，流式细胞术，荧光成像，等等。在例举性方面，来源于癌症细胞的外泌体使用针对磷脂酰肌醇蛋白聚糖1的抗体检测，并随后结合至固体基底和使用显微镜或细胞计数检测可视化。外泌体可以通过如下来分析：外泌体表面标志物:CD63,CD47,CD9和CD81的流式细胞术表达，和/或透射电子显微镜(TEM)。另外，纳米颗粒跟踪分析和微BCA测定可以用于确定外泌体的数量。

因此，从接种MSC到生物反应器中直至最终收集的时期可以是约15-30天,诸如16、17、18、19、20、21、22、23或24天,诸如约19或20天。每个条件培养基级分可以包含至少9x10¹¹个外泌体,诸如至少1x10¹²个外泌体,诸如至少2x10¹²个外泌体,特别是约3x10¹²个外泌体。所述方法可以导致总共产生至少10x10¹²个外泌体,诸如至少11x10¹²个外泌体,诸如至少12x10¹²个外泌体,诸如至少13x10¹²个外泌体,诸如至少14x10¹²个外泌体,诸如至少15x10¹²个外泌体,诸如至少16x10¹²个外泌体,诸如至少17x10¹²个外泌体,诸如至少18x10¹²个外泌体,诸如至少19x10¹²个外泌体,或诸如至少20x10¹²个外泌体。

E.外泌体的装载

通过本发明的方法产生的外泌体可以装载货物(cargo)，诸如治疗剂或诊断剂。可以使用本发明的外泌体递送的货物的实例包括在外泌体中不是天然存在的外源物质(源自外部来源)，诸如但不限于核酸分子诸如DNA(核的和线粒体的)，RNA诸如mRNA，tRNA，miRNA，和siRNA，适体(aptamer)和其他含有核酸的分子，肽，蛋白质，核酶，糖，聚合物，治疗剂，小分子等等。

在一个实施方案中，本发明的分离的外泌体特别用于递送具有二级结构的化合物(例如，miRNA,mRNA,蛋白质/肽)，以及大化合物，例如包含超过20个碱基对、例如超过50个碱基对或超过100个碱基对的核酸分子、肽、蛋白质等等。

可以使用本领域确立的用于将货物引入细胞的方法，将货物引入本发明的外泌体。因此，例如使用电穿孔将货物引入外泌体，所述电穿孔施加约20-1000V/cm范围内的电压。使用基于阳离子脂质的转染试剂的转染也可以用于将货物引入外泌体。适当的转染试剂的实例包括但不限于Lipofectamine MessengerMAXTm转染试剂，LipofectamineRNAiMAX转染试剂,Lipofectamine 3000转染试剂,或Lipofectamine LTX试剂和PLUSTM试剂。对于货物装载，使用适当量的转染试剂，并且其可以根据试剂、样品和货物而变化。例如，使用Lipofectamine MessengerMAXTm转染试剂，可以使用约0.15uL至10uL范围内的量将100ng至2500ng mRNA或蛋白质装载到外泌体中。也可以使用其他方法将货物引入外泌体，例如使用穿透细胞的肽来进行蛋白质引入。

在具体实施方案中，使用电穿孔，诸如通过在FDA-批准的缓冲液(诸如

)中电穿孔，将货物(诸如核酸，诸如siRNA)装载到外泌体中。电穿孔可以在流通式电穿孔系统中进行，所述电穿孔系统诸如4D-Nucleofactor LV大规模转染系统,Lonza。每次电穿孔运行可以包括至少2x10¹²个外泌体。因为缓冲液是FDA批准的、无菌的并且对于在患者中使用是无热原的，所以在施用于患者之前不需要洗涤步骤来交换缓冲液，因为它们可以直接输注到患者中。因此，没有如现有方法那样在额外的洗涤步骤中的外泌体损失，现有方法可导致约50％的外泌体损失。

在具体实施方案中，治疗剂可以是RNA，诸如siRNA,shRNA,质粒,mRNA,miRNA,或ncRNA,特别是siRNA或miRNA治疗剂。miRNA可以是miRNA模拟物，或miRNA前体。装载到外泌体中的RNA的尺寸可以长度小于100个核苷酸，诸如小于75个核苷酸，特别是长度小于50个核苷酸。例如，RNA可以具有约10-100个核苷酸,诸如20-50个核苷酸,特别是10-20、15-25、20-30、25-35、30-40或45-50个核苷酸的长度。

RNA可以是修饰的或未修饰的。RNA可以包含一个或多个核苷酸改变。该改变可以包括添加非核苷酸材料诸如至RNA(一个或多个)末端或内部(在RNA的一个或多个核苷酸处)。在某些方面，RNA分子含有3'-羟基基团。本发明的RNA分子中的核苷酸也可以包含非标准核苷酸，包括非天然存在的核苷酸或脱氧核糖核苷酸。双链寡核苷酸可以含有修饰的主链，例如，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，或本领域已知的其他修饰的主链，或者可以含有非天然核苷间连接。siRNA的另外的修饰(例如，2'-O-甲基核糖核苷酸,2'-脱氧-2'-氟核糖核苷酸,“通用碱基”核苷酸,5-C-甲基核苷酸,一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间连接，和反向脱氧脱碱基残基掺入)可以在美国公开No.20040019001和美国专利No.6,673,611(其各自通过引用完整地结合)中找到。总之，所有上述的改变的核酸或RNA称为修饰的siRNA。

优选地，RNAi能够降低蛋白质表达，降低至少10％、20％、30％或40％,更优选降低至少50％、60％或70％,和甚至更优选降低至少75％、80％、90％、95％或更多。

用于本文所述的方法或组合物的siRNA可以包含这样的部分，其与由所述基因/蛋白质的NCBI参考序列编码的mRNA序列互补。在一个实施方案中，siRNA包括双链部分(双链体)。在一个实施方案中，siRNA长度为20-25个核苷酸。在一个实施方案中，siRNA包含19-21个核心RNA双链体，独立地在一条或两条链上具有一个或2个核苷酸的3′突出端。在一个实施方案中，突出端是UU。siRNA可以是5′磷酸化或者不是，并且可以用本领域已知的任何修饰进行修饰，以改善功效和/或对核酸酶降解的抗性。在一个非限制性实施方案中，可以施用siRNA，使得其转染到一个或多个细胞中。在一个实施方案中，siRNA可以包括双链RNA，其包含第一条和第二条链，其中RNA的一条链与基因的RNA转录物的一部分80、85、90、95或100％互补。

在一个实施方案中，本发明的siRNA的单链组件长度为14至50个核苷酸。在另一个实施方案中，siRNA的单链组件长度为14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个核苷酸。在还有的另一个实施方案中，本发明的siRNA的单链组件长度为21个核苷酸。在还有的另一个实施方案中，本发明的siRNA的单链组件长度为22个核苷酸。在还有的另一个实施方案中，本发明的siRNA的单链组件长度为23个核苷酸。在一个实施方案中，本发明的siRNA的长度为28至56个核苷酸。

靶基因通常是指：包含编码多肽的区域的多核苷酸，或调节复制、转录或翻译或对于所述多肽的表达是重要的其他过程的多核苷酸区域，或包含编码多肽的区域和与其可操作连接的调节表达的区域两者的多核苷酸。靶基因可以是染色体的(基因组的)或染色体外的。它可以是细胞内源的，或者它可以是外源基因(转基因)。外源基因可以整合到宿主基因组中，或者它可以存在于染色体外遗传构建体诸如质粒或粘粒上。靶基因也可以来源于病原体，诸如病毒、细菌、真菌或原生动物，其能感染生物体或细胞。靶基因可以是病毒基因和前病毒基因，其不引发干扰素应答，诸如逆转录病毒基因。靶基因可以是编码蛋白质的基因或者非蛋白质编码基因，诸如编码核糖体RNA、剪接体RNA、tRNA等的基因。

可以靶向在细胞中表达的任何基因。优选地，靶基因是参与细胞活动进展或与其相关的靶基因，所述细胞活动对于疾病是重要的或者作为研究目标具有特别兴趣。因此，作为实例，以下是可以用于本发明方法中调节或削弱靶基因表达的可能的靶基因类别：发育基因(例如，粘附分子,细胞周期蛋白激酶抑制剂,Wnt家族成员,Pax家族成员,Winged螺旋家族成员,Hox家族成员,细胞因子/淋巴因子和它们的受体,生长或分化因子和它们的受体,神经递质和它们的受体),肿瘤抑制基因(例如，APC,CYLD,HIN-1,KRAS2b,p16,p19,p21,p27,p27mt,p53,p57,p73,PTEN,Rb,子宫珠蛋白(Uteroglobin),Skp2,BRCA-1,BRCA-2,CHK2,CDKN2A,DCC,DPC4,MADR2/JV18,MEN1,MEN2,MTS1,NF1,NF2,VHL,WRN,WT1,CFTR,C-CAM,CTS-1,zac1,ras,MMAC1,FCC,MCC,FUS1,基因26(CACNA2D2),PL6,Beta*(BLU),Luca-1(HYAL1),Luca-2(HYAL2),123F2(RASSF1),101F6,基因21(NPRL2),或编码SEM A3多肽的基因),促细胞凋亡基因(例如，CD95,胱天蛋白酶-3,Bax,Bag-1,CRADD,TSSC3,bax,hid,Bak,MKP-7,PARP,bad,bcl-2,MST1,bbc3,Sax,BIK,和BID),细胞因子(例如，GM-CSF,G-CSF,IL-1α,IL-1β,IL-2,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-8,IL-9,IL-10,IL-11,IL-12,IL-13,IL-14,IL-15,IL-16,IL-17,IL-18,IL-19,IL-20,IL-21,IL-22,IL-23,IL-24,IL-25,IL-26,IL-27,IL-28,IL-29,IL-30,IL-31,IL-32，IFN-α,IFN-β,IFN-γ,MIP-1α,MIP-1β,TGF-β,TNF-α,TNF-β,PDGF,和mda7),癌基因(例如，ABLI,BLC1,BCL6,CBFA1,CBL,CSFIR,ERBA,ERBB,EBRB2,ETS1,ETS1,ETV6,FGR,FOX,FYN,HCR,HRAS,JUN,KRAS,LCK,LYN,MDM2,MLL,MYB,MYC,MYCL1,MYCN,NRAS,PIM1,PML,RET,SRC,TAL1,TCL3和YES),和酶(例如，ACP去饱和酶和羟化酶(hycroxylases)、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、ATP酶、醇脱氢酶、淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、过氧化氢酶、纤维素酶、环氧化酶、脱羧酶、糊精酶、酯酶、DNA和RNA聚合酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、GTP酶、解旋酶、半纤维素酶、整合酶、转化酶、异构酶、激酶、乳糖酶、脂肪酶、脂氧合酶、溶菌酶、果胶酯酶、过氧化物酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸化酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶和肽酶(peptidease)、普鲁兰酶(pullanase)、重组酶、逆转录酶、拓扑异构酶、木聚糖酶)。

如本领域技术人员将理解，在装载货物之前或之后，本发明的外泌体可以进一步通过以下改变：包含靶向部分以增强其作为递送货物的媒介物的效用。在这方面，可以改造外泌体以结合特异性靶向特定细胞或组织类型的实体。该靶特异性实体，例如，具有针对靶细胞或组织上的受体或配体的亲和力的肽，可以整合到外泌体膜内，例如通过使用本领域已确立的方法融合至外泌体膜标志物。

III.使用方法

在一些实施方案中，本发明提供了使用本文提供的外泌体来递送治疗剂诸如RNAi至细胞的方法。另外的可以被外泌体靶向以进行递送的免疫细胞包括树突细胞、NK细胞和/或B细胞。在另外的实施方案中，通过本发明的外泌体递送的治疗剂可以是小分子、肽、疫苗或抗原。细胞可以是体内或离体的。在一个实施方案中，提供了递送RNA至细胞中的方法，包括将有效量的包含RNAi的外泌体施用于细胞。所述细胞可以是免疫细胞，诸如T细胞，或癌细胞，诸如KRAS-阳性癌细胞。

在另一个实施方案中，提供了免疫刺激生物体的方法，包括将有效量的包封RNA的外泌体施用于受试者。RNA可以是免疫调节RNA。在另一个实施方案中，提供了治疗患有疾病或病症的受试者的方法，包括施用有效量的本发明的外泌体。在一些实施方案中，提供了本发明的外泌体用于治疗疾病或病症或用于免疫刺激受试者的用途。

体内细胞可以在任何受试者诸如哺乳动物中。例如，受试者可以是人、小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、马、猪、山羊、绵羊、灵长类或鸟类物种。在具体实施方案中，受试者是人。例如，人可以是患有疾病的受试者。疾病可以是折磨受试者的任何疾病，诸如炎性疾病、增生性疾病、传染病或变性疾病。在具体实施方案中，疾病是增生性疾病，诸如癌症。例如，癌症可以是乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌细胞、肝癌、子宫颈癌、结肠癌、肾癌、皮肤癌、头颈癌、骨癌、食管癌、膀胱癌、子宫癌、淋巴癌、胃癌、胰腺癌、睾丸癌、肠癌、淋巴瘤或白血病。在具体实施方案中，癌症是卵巢癌。

在另一个实施方案中，提供了在患有免疫介导的炎性疾病的受试者中治疗所述疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明的外泌体。

癌可以具体地属于以下组织学类型，但是其不限于这些：恶性赘瘤(neoplasm)；癌；未分化的癌；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状腺癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌(pilomatrix carcinoma)；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；混合型肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌(trabecularadenocarcinoma)；腺样囊性癌；腺瘤性息肉内腺癌；家族性结肠息肉病腺癌；实体癌；恶性类癌瘤；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌(oxyphilicadenocarcinoma)；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡腺癌；乳头状和滤泡腺癌；非包裹性硬化性癌；肾上腺皮层癌；子宫内膜样癌；皮肤附件癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；黏液性囊腺癌；黏液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性管癌；髓性癌；小叶癌；炎性癌；乳腺佩吉特氏(paget)病；腺泡细胞癌；腺鳞癌；伴鳞状化生的腺癌；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质瘤；恶性卵泡膜细胞瘤；恶性粒层细胞瘤；恶性睾丸母细胞瘤；塞尔托利细胞癌(sertoli cell carcinoma)；恶性莱迪希细胞肿瘤(leydig cell tumor)；恶性脂质细胞肿瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳腺外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤(glomangiosarcoma)；恶性黑色素瘤；无色素性黑色素瘤；浅表扩散性黑色素瘤；在巨大色素痣中的恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；黏液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎横纹肌肉瘤；腺泡状横纹肌肉瘤；基质肉瘤；恶性混合肿瘤；苗勒管(mullerian)混合瘤；肾胚细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间叶瘤；恶性brenner瘤；恶性叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤(dysgerminoma)；胚胎癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺肿(struma ovarii)；绒膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西氏肉瘤；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤(juxtacortical osteosarcoma)；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞瘤；间叶细胞软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤文氏(ewing)肉瘤；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞性牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性神经胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；神经胶质母细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经细胞胶质瘤；原始神经外胚层瘤(primitive neuroectodermal)；小脑肉瘤；节细胞性神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；成视网膜细胞瘤；嗅神经性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞肿瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金氏病；霍奇金氏；副肉芽肿；恶性小淋巴细胞性淋巴瘤；恶性大细胞、扩散性淋巴瘤；恶性滤泡性淋巴瘤；蕈样真菌病；其它指定非霍奇金氏淋巴瘤；恶性组织细胞增多病；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增殖性小肠疾病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病(erythroleukemia)；淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓性白血病；嗜碱性粒细胞性白血病；嗜酸性粒细胞性白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；巨核母细胞白血病；髓系肉瘤；和毛细胞白血病。

在一些实施方案中，提供了在受试者中治疗疾病或病症的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的装载了治疗剂的外泌体。所述疾病可以是免疫相关疾病，诸如自身免疫病。自身免疫病的非限制性实例包括：斑秃，强直性脊柱炎，抗磷脂综合征，自身免疫性阿狄森氏病(autoimmune Addison's disease)，肾上腺自身免疫病，自身免疫性溶血性贫血，自身免疫性肝炎，自身免疫性卵巢炎和睾丸炎，自身免疫性血小板减少症，贝赫切特病(Behcet's disease)，大疱性类天疱疮，心肌病，乳糜泻阵发性皮炎(celiac spate-dermatitis)，慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)，慢性炎性脱髓鞘性多神经病，Churg-Strauss综合征，瘢痕性类天疱疮，CREST综合征，冷凝集素病，克罗恩病，盘状狼疮，特发性混合型冷球蛋白血症(essential mixed cryoglobulinemia)，纤维肌痛-纤维肌炎，肾小球性肾炎，格雷夫斯病(Graves'disease)，吉兰巴雷病(Guillain-Barre)，桥本甲状腺炎，特发性肺纤维化，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，IgA神经病，幼年型关节炎，扁平苔藓，红斑狼疮，梅尼埃病(Meniere's disease)，混合性结缔组织病，多发性硬化，1型或免疫介导的糖尿病，重症肌无力，肾病综合征(诸如微小病变型肾病，局灶性肾小球硬化症，或膜性肾病)，寻常型天疱疮，恶性贫血，结节性多动脉炎，多软骨炎，多腺性综合征，风湿性多肌痛，多肌炎和皮肌炎，原发性无丙种球蛋白血症，原发性胆汁性肝硬化，银屑病，银屑病性关节炎，雷诺氏现象(Raynaud's phenomenon)，莱特尔综合征(Reiter's syndrome)，类风湿性关节炎，结节病，硬皮病，舍格伦综合征(Sjogren's syndrome)，僵人综合征，系统性红斑狼疮，红斑狼疮，溃疡性结肠炎，葡萄膜炎，血管炎(诸如结节性多动脉炎，大动脉炎(takayasuarteritis)，颞动脉炎/巨细胞性动脉炎，或疱疹性血管炎皮炎(dermatitisherpetiformis vasculitis))，白斑，和韦格纳肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)。因此，可以使用本文公开的方法治疗的自身免疫性疾病的一些实例包括但不限于多发性硬化，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，I型糖尿病，克罗恩病；溃疡性结肠炎，重症肌无力，肾小球性肾炎，强直性脊柱炎，血管炎或银屑病。受试者也可以患有变态反应性病症，诸如哮喘。

可以预测和监视治疗结果，和/或受益于该治疗的患者可以通过本文描述的方法鉴定或选择。

关于瘤性病症治疗，根据瘤性病症的阶段，瘤性病症治疗涉及以下疗法中的一个或组合：去除瘤性组织的外科手术、放疗，和化疗。其它治疗性方案可与给药抗癌剂例如治疗性组合物和化疗剂结合。例如，待用这类抗癌剂治疗的患者还可接受放疗和/或可经受外科手术。

对于疾病的治疗，治疗性组合物的适当剂量将取决于如上定义的待治疗的疾病的类型，疾病的严重程度和病程，患者的临床病史和对药剂的反应，和主治医师的判断。药剂适当地向患者一次或经一系列治疗给药。

治疗性和防治性方法和组合物可以有效实现期望效应的组合量提供。组织、肿瘤或细胞可与一种或多种组合物或一种或多种包含药剂中的一种或多种的药理学制剂接触，或通过使组织、肿瘤和/或细胞与两种或更多种不同组合物或制剂接触。另外，预期这类组合疗法可与化疗、放疗、外科手术疗法或免疫疗法结合使用。

以结合方式的给药可包括在同一剂型中同时给药两种或更多种药剂、以单独的剂型同时给药和分开给药。即，本发明治疗性组合物和另一种治疗剂可以一起配制在同一剂型中并且同时给药。备选地，本发明治疗性组合物和另一种治疗剂可同时给药，其中两个药剂均以单独制剂存在。在另一个替代方案中，治疗剂可紧接着另一种治疗剂给药，反之亦然。在分开给药方案中，本发明治疗性组合物和另一种治疗剂可相隔数分钟或相隔数小时或相隔数天给药。

本文所述的外泌体可以用于治疗、研究和诊断应用中。例如，上面描述的外泌体可以添加到细胞培养物中以增强细胞的一个或多个表型特性。本发明的外泌体可以添加到细胞培养物中以抑制细胞的一个或多个表型特性。本发明的外泌体可以添加到细胞培养物中以为细胞提供新的表型特性。

A.药物组合物

本文所述的某些方法涉及包括施用药学有效量的包含本发明的外泌体的组合物的方法。

如本文所用，“药用载体”包括任何和所有溶剂，分散介质，包衣，表面活性剂，抗氧化剂，防腐剂(例如，抗细菌剂，抗真菌剂)，等渗剂，吸收延迟剂，盐，防腐剂，药物，药物稳定剂，凝胶，粘合剂，赋形剂，崩解剂，润滑剂，甜味剂，调味剂，染料，诸如此类的物质和它们的组合，如本领域普通技术人员已知的(Remington’s,1990)。除非任何常规载体与活性成分不相容，考虑其在治疗性或药物组合物中的应用。本发明中使用的组合物可以包括不同类型的载体，其取决于所述组合物是否以固体、液体或气溶胶形式施用和所述组合物是否需要对于诸如注射的给药途径是无菌的。

用于药物活性物质的该媒介和试剂的使用是本领域公知的。除非任何常规媒介或试剂与活性成分不相容，考虑其在治疗性药物组合物中的应用。补充的活性成分也可以结合到组合物中，并且这些在以下更详细地讨论。对于人给药，制剂优选满足无菌、致热原性、一般安全性和纯度标准，如FDA局的生物制品标准所要求的。

包含外泌体的组合物可以彻底透析以去除不希望有的小分子量分子和/或冻干，以更容易配制到所需媒介物中(当适当时)。在具体方面，包含本发明的外泌体的组合物(例如，在

中)不需要任何处理并且可以直接输注到受试者中。活性化合物然后通常配制用于通过任何已知途径施用(诸如肠胃外施用)。施用方法在以下更详细地描述。

本发明考虑这样的方法，其使用作为无菌溶液的组合物用于血管内注射或用于通过任何其他途径的应用，如以下更详细地讨论。本领域普通技术人员将熟悉用于产生用于注射或通过其他任何途径应用的无菌溶液的技术。无菌注射液溶液如下制备：将活性化合物以所需量与本领域技术人员熟悉的各种其他成分一起掺合到适当溶剂中。

组合物的制剂可以根据给药途径而改变。对于在水溶液中的肠胃外给药，例如，溶液应当被适当地缓冲并且液体稀释液首先用足量的盐水或葡萄糖成为等渗的。在这方面，鉴于本发明，可以使用的无菌水性介质是本领域技术人员已知的。

除了配制用于肠胃外给药(诸如静脉内或肌内注射)的化合物以外，其他药用形式包括用于通过可植入药物递送装置给药的制剂，和任何其他形式。在本发明中还可以使用鼻溶液或喷雾剂、气溶胶或吸入剂。

口服制剂包括这些通常使用的赋形剂，如例如药物级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等。这些组合物采取溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉末剂的形式。本领域普通技术人员将熟悉用于制备口服制剂的公知技术。

在某些实施方案中，药物组合物包括至少约0.1重量％的活性剂。组合物可以包括例如约0.01％的活性剂。在其他实施方案中，药物组合物包括例如，占组合物重量的约2％至约75％或占组合物重量的约25％至约60％，和其中衍生的任何范围的活性剂。

药物组合物可以包括各种抗氧化剂以延缓一种或多种组分的氧化。另外，通过防腐剂诸如各种抗细菌剂和抗真菌剂，包括但不限于对羟基苯甲酸酯类(例如，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或它们的组合，可以导致对微生物作用的预防。组合物可以在制造和储存条件下稳定，并且可以保存抗微生物(诸如细菌和真菌)污染作用。应当理解，外毒素污染应当保持最少在安全水平，例如低于0.5ng/mg蛋白质。

在其中组合物是液体形式的实施方案中，载体可以是溶剂或分散介质，包括但不限于水、乙醇、多元醇(例如，甘油，丙二醇，液体聚乙二醇等)，脂质(例如，甘油三酯，植物油，脂质体)和它们的组合。在许多情况下，它优选包括等渗剂，诸如例如糖、氯化钠或它们的组合。

在其他实施方案中，可以使用本发明中的鼻溶液剂或喷雾剂，气溶胶或吸入剂。鼻溶液剂可以是水溶液，其设计来以滴剂或喷雾剂施用于鼻通道。

通过将所需量的纳米颗粒根据需要与以上例举的各种其他成分一起掺合到适当溶剂中，接着灭菌，制备无菌可注射溶液。

在配制后，外泌体可以以与剂量制剂相容的方式和以治疗有效的量施用。

使用本领域普通技术人员已知的任何方法，可以将纳米颗粒施用于受试者。例如，可以将药学有效量的包含外泌体的组合物静脉内、脑内、颅内、鞘内施用于黑质或黑质区域，皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、气管内、鼻内、局部(topically)、肌内、腹膜内、皮下、口服、局部(topically)、区域(locally)、吸入(例如，气溶胶吸入)、注射、输注、连续输注、直接局部灌注沐浴靶细胞来施用，其经由导管、经由灌洗，以乳膏形式，以液态组合物形式(例如脂质体)，或者通过其他方法或前述的任何组合施用，如本领域普通技术人员已知的(Remington’s,1990)。在具体实施方案中，使用药物递送装置，将组合物施用于受试者。

在其他实施方案中，将外泌体配制用于通过以下途径给药：包括但不限于：口服，鼻内，肠，局部，舌下，动脉内，髓内，鞘内，吸入，眼，透皮，阴道或直肠途径，并且在每种情形中包括适当载体。例如，可以制备用于局部施用的外泌体组合物，其包括适当载体。可以使用适当基质诸如甘油三酯基质来制备用于局部施用的乳膏、洗剂和油膏。这些乳膏、洗剂和油膏也可以包含表面活性剂。也可以制备气溶胶制剂，其中使用适当的推进剂辅剂。也可以向组合物中加入其它辅剂，无论如何施用所述组合物，例如，抗微生物剂、抗氧化剂和其他防腐剂可以加入组合物以防止在长期储存期间微生物的生长和/或降解。

基于预期目标，例如抑制细胞死亡，确定纳米颗粒的药物有效量。施用的量(根据治疗的数量和剂量两者)取决于被治疗的受试者、受试者的状态、所需的保护、和给药途径。治疗剂的精确量还取决于执业者的判断并且对于每个个体是独特的。

例如，治疗剂的剂量可以是每剂量约0.0001毫克至约1.0毫克，或约0.001毫克至约0.1毫克，或约0.1毫克至约1.0毫克，或甚至约10毫克等等。可以施用多个剂量。在一些实施方案中，一个剂量是至少约0.0001毫克。在另外的实施方案中，一个剂量是至少约0.001毫克。在还有的其他实施方案中，一个剂量是至少0.01毫克。在还有的另外的实施方案中，一个剂量是至少约0.1毫克。在更具体的实施方案中，一个剂量可以是至少1.0毫克。在甚至更具体的实施方案中，一个剂量可以是至少10毫克。在另外的实施方案中，一个剂量是至少100毫克或更高。

在其他非限制性实施例中，一个剂量也可以包括每次给药约1微克/kg/体重、约5微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约200微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微克/kg/体重、约1毫克/kg/体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、约200毫克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/体重、至约1000mg/kg/体重或更多，和其中衍生的任何范围。在从本文列出的数字衍生的范围的非限制性实施例中，基于上述数字，可以施用约5mg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5微克/kg/体重至约500毫克/kg/体重的范围等等。

如本领域普通技术人员确定，剂量可以重复。因此，在本文所述方法的一些实施方案中，考虑单个剂量。在其他实施方案中，考虑两个或更多个剂量。当施用超过一个剂量至受试者时，剂量之间的时间间隔可以是本领域普通技术人员确定的任何时间间隔。例如，剂量之间的时间间隔可以是约1小时至约2小时,约2小时至约6小时,约6小时至约10小时,约10小时至约24小时,约1天至约2天,约1周至约2周,或更长,或者在这些所述范围中任一个内衍生的任何时间间隔。

在某些实施方案中，该方法可以提供连续供应的药物组合物至患者。这可以通过导管插入术、接着连续施用治疗剂来实现。施用可以是术中或术后。

B.组合疗法

本发明的某些实施方案提供了给药或施用一种或多种第二形式(secondaryform)的疗法以用于治疗或预防疾病。例如，所述疾病可以是增生性疾病，诸如癌症。

第二形式的疗法可以施用一种或多种第二药剂，所述第二药剂可以用于治疗或预防癌症。

如果第二疗法是药剂，则它可以在纳米颗粒给药之前、同时或之后施用。

给药外泌体和第二疗法之间的间隔可以是本领域普通技术人员确定的任何间隔。例如，间隔可以是数分钟至数周。在其中分开施用药剂的实施方案中，通常确保在每次递送时间之间没有过完长时间，使得每个治疗剂仍然能够对受试者发挥有益的组合效果。例如，治疗剂之间的间隔可以是彼此约12h至约24h，更优选在彼此约6小时至约12h内。在一些情形中，然而，用于治疗的时期可以延长，其中在各个给药之间经过数天(2、3、4、5、6或7天)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。在一些实施方案中，基于受试者对于纳米颗粒的反应，确定第二治疗剂的给药时间安排。

可以利用各种组合。对于以下实例，外泌体组合物是“A”并且抗癌疗法是“B”:

将本发明的任何化合物或疗法施用于患者将遵循用于给药这些化合物的一般方案，考虑药剂的毒性(如果有的话)。因此，在一些实施方案中，存在监视可能由组合疗法引起的毒性的步骤。预期可以重复治疗周期。还考虑各种标准疗法以及外科手术干预可以与所述疗法组合应用。

在特别方面，考虑标准疗法将包括化疗、放疗、免疫疗法、外科手术疗法或基因疗法，并且可以与本文所述的基因表达抑制剂疗法、抗癌疗法或者与基因表达抑制剂疗法和抗癌疗法两者联合使用。

1.化疗

各种各样的化疗剂可以根据本发明的实施方案使用。术语“化疗”是指使用药物来治疗癌症。“化疗剂”用于意指在治疗癌症中施用的化合物或组合物。这些药剂或药物通过其在细胞内的活性模式分类，例如它们是否影响细胞周期及它们在什么阶段影响细胞周期。备选地，药剂可基于其直接交联DNA、嵌入到DNA中或通过影响核酸合成诱导染色体及有丝分裂畸变的能力来表征。

化疗剂的实例包括：烷化剂，如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；番荔枝内酯(acetogenin)(尤其是布拉他辛和布拉他辛酮)；喜树碱(包括合成类似物托泊替康)；苔藓抑素；卡利他汀(callystatin)；CC-1065(包括它的合成类似物阿多来新、卡泽来新和比泽来新)；念珠藻环肽(特别是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；多拉司他汀；杜卡霉素(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；软珊瑚醇(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；sarcodictyin；海绵毒素；氮芥类，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧化氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺和乌拉莫司汀；硝基脲类，如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，如烯二炔抗生素(例如，卡奇霉素，尤其是卡奇霉素γlI和卡奇霉素ωI1)；达内霉素，包括达内霉素A；双膦酸盐类，如氯膦酸盐；埃斯波霉素；以及新制癌菌素生色团和相关色蛋白烯二炔抗生素生色团、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放射菌素、氨茴霉素(authrarnycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉代-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁和佐柔比星；抗代谢药，如甲胺喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、蝶罗呤和三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、噻咪嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷；雄激素类，如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮(dronanolone propionate)、环硫雄醇、美雄烷和睾内酯；抗肾上腺类，如米托坦和曲洛司坦；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；倍思塔布(bestrabucil)；比山群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙碱；地吖醌；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美坦辛类，如美坦辛和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他汀；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙酰肼；丙卡巴肼；PSK多糖复合物；雷佐生；根霉素；西佐喃；螺旋锗(spirogermanium)；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2’,2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星(gacytosine)；阿糖胞苷("Ara-C")；环磷酰胺；紫杉烷类，例如，紫杉醇和多西他赛吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；铂配位络合物，如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺肖林；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基喋呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄素，如视黄酸；卡培他滨；卡铂、丙卡巴肼、普卡霉素、吉西他滨、诺维本、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、反铂和以上任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

2.放疗

导致DNA损伤并且已经被广泛使用的其它因素包括通常被称为γ-射线、X-射线的那些和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。还考虑其它形式的DNA损伤因素，如微波、质子束辐射(美国专利No.5,760,395和4,870,287)和紫外线辐射。可能的是所有这些因素引起对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复以及染色体的装配和维持的大范围损伤。X-射线的剂量范围为从以50至200伦琴的日剂量持续长时间段(3周到4周)到2000至6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围大幅变化，并且取决于同位素的半衰期、发射的辐射的强度和类型，以及瘤性细胞的摄取。

3.免疫疗法

本领域的技术人员将理解，附加免疫疗法可与本发明的方法组合或结合使用。在癌症治疗的情形下，免疫治疗剂可以依赖于使用免疫效应细胞和分子以靶向并破坏癌细胞。利妥昔单抗

为这类实例。免疫效应子可以为例如对肿瘤细胞表面上的某个标记物具有特异性的抗体。单独的抗体可以用作疗法的效应子或其可以募集其它细胞以实际实现细胞杀死。抗体还可以缀合到药物或毒素(化疗剂、放射性核素、蓖麻蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)并且用作靶向剂。备选地，效应子可以是携带表面分子的淋巴细胞，其直接或间接与肿瘤细胞靶标相互作用。多种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。

抗体-药物缀合物(ADC)包含共价连接至杀细胞药物的单克隆抗体(MAb)。该方法将MAb针对它们的抗原靶标的高特异性与高度有效的细胞毒性药物结合起来，导致“武装的”MAb，其将有效负载(药物)递送至具有富集水平的抗原的肿瘤细胞。药物的靶向递送还使其在正常组织中的暴露最小化，导致降低的毒性和改善的治疗指数。FDA对两种ADC药物的批准，即2011年的

(本妥昔单抗(brentuximab)vedotin)和2013年的

(曲妥珠单抗(trastuzumab)emtansine或T-DM1)，确认了该方法。目前有超过30种ADC候选药物处于癌症治疗的临床试验的各个阶段。因为抗体改造和接头-有效负荷优化变得越来越成熟，所以新ADC的发现和开发越来越多地依赖于适合于该方法的新靶标的鉴定和验证以及产生靶向MAb。ADC靶标的两个标准是在肿瘤细胞中上调的/高水平的表达和稳健内化。

在免疫疗法的一个方面中，肿瘤细胞可以带有某一适合于靶向(即，不存在于大部分其它细胞上)的标志物。存在许多肿瘤标志物并且这些中的任一个可以适于在本发明的上下文中的靶向。常见肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸基路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、层粘连蛋白受体、erb B和p155。免疫疗法的一个替代方面为将抗癌效应与免疫刺激效应组合。还存在免疫刺激分子，包括：细胞因子，如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN，趋化因子，如MIP-1、MCP-1、IL-8，和生长因子，如FLT3配体。

当前所研究的或在使用中的免疫疗法的实例为免疫佐剂，例如，牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳香族化合物；细胞因子疗法，例如，干扰素α、β、和γ，IL-1、GM-CSF和TNF；基因疗法，例如，TNF、IL-1、IL-2和p53；以及单克隆抗体，例如，抗CD20、抗神经节苷脂GM2和抗p185。考虑可与本文所述的抗体疗法一起采用的一种或多种抗癌疗法。

在一些实施方案中，免疫疗法可以是免疫检查点抑制剂。免疫检查点是免疫系统中调高信号(例如，共刺激分子)或调低信号的分子。可以通过免疫检查点阻断靶向的抑制性检查点分子包括：腺苷A2A受体(A2AR),B7-H3(也称为CD276),B和T淋巴细胞衰减剂(BTLA),细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4,也称为CD152),吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO),杀伤细胞免疫球蛋白(KIR),淋巴细胞活化基因-3(LAG3),程序化死亡1(PD-1),T-细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)和T细胞活化V-结构域Ig抑制物(VISTA)。具体地，免疫检查点抑制剂靶向PD-1轴和/或CTLA-4。

免疫检查点抑制剂可以是药物，诸如小分子，重组形式的配体或受体，或特别是抗体，诸如人抗体(例如，国际专利公开No.WO2015016718；两者都通过引用结合于此)。可以使用免疫检查点蛋白或其类似物的已知的抑制剂，特别是可以使用嵌合的、人源化的或人形式的抗体。如本领域技术人员将知晓，备选的和/或等价的名称可以用于本发明中提到的某些抗体。该备选的和/或等价的名称在本发明上下文中可交换。例如，已知帕姆单抗(lambrolizumab)也称为备选和等价名称MK-3475和帕博丽珠单抗(pembrolizumab)。

在一些实施方案中，结合PD-1的拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体的结合的分子。在一个具体方面，PD-1配体结合配偶体是PDL1和/或PDL2。在另一个实施方案中，结合PDL1的拮抗剂是抑制PDL1与其结合配偶体的结合的分子。在一个具体方面，PDL1结合配偶体是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，结合PDL2的拮抗剂是抑制PDL2与其结合配偶体的结合的分子。在一个具体方面，PDL2结合配偶体是PD-1。拮抗剂可以是抗体，其抗原结合片段，免疫黏附素，融合蛋白，或寡肽。例举性的抗体描述于美国专利No.8,735,553,8,354,509,和8,008,449，它们全部通过引用结合于此。用于本文提供的方法中的其他PD-1轴拮抗剂是本领域已知的，诸如描述于美国专利申请No.20140294898,2014022021,和20110008369，它们全部通过引用结合于此。

在一些实施方案中，结合PD-1的拮抗剂是抗-PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，抗-PD-1抗体选自纳武单抗(nivolumab)、帕博丽珠单抗和CT-011。在一些实施方案中，结合PD-1的拮抗剂是免疫黏附素(例如，含有与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区域)融合的PDL1或PDL2的胞外或结合PD-1的部分的免疫黏附素)。在一些实施方案中，结合PD-1的拮抗剂是AMP-224。纳武单抗，也称为MDX-1106-04,MDX-1106,ONO-4538,BMS-936558,和

是一种在WO2006/121168中描述的抗-PD-1抗体。帕博丽珠单抗，也称为MK-3475,Merck 3475,帕姆单抗，

和SCH-900475，是一种在WO2009/114335中描述的抗-PD-1抗体。CT-011，也称为hBAT或hBAT-1，是一种在WO2009/101611中描述的抗-PD-1抗体。AMP-224，也称为B7-DCIg，是一种在WO2010/027827和WO2011/066342中描述的PDL2-Fc融合可溶性受体。

在本文提供的方法中可以靶向的另一个免疫检查点是细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，也称为CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列具有Genbank登录号L15006。CTLA-4存在于T细胞表面上并且当结合于抗原呈递细胞表面上的CD80或CD86时用作“关闭”开关。CTLA4是免疫球蛋白超家族的成员，其在辅助性T细胞表面上表达并且向T细胞传递抑制信号。CTLA4类似于T-细胞共刺激蛋白CD28，并且两个分子都结合抗原呈递细胞上的CD80和CD86(其分别也称为B7-1和B7-2)。CTLA4向T细胞传递抑制信号，而CD28传递刺激信号。胞内CTLA4也存在于调节性T细胞中并且可能对于它们的功能是重要的。通过T细胞受体和CD28的T细胞活化会导致增加的CTLA-4(B7分子的抑制性受体)表达。

在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗-CTLA-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)，其抗原结合片段，免疫黏附素，融合蛋白，或寡肽。

适用于本发明方法的抗-人-CTLA-4抗体(或从其衍生的VH和/或VL结构域)可以使用本领域公知的方法产生。备选地，可以使用本领域公知的抗-CTLA-4抗体。例如，在US 8,119,129,WO 01/14424,WO 98/42752；WO 00/37504(CP675,206,也称为曲美木单抗(tremelimumab)；之前为替西木单抗(ticilimumab)),美国专利No.6,207,156中公开的抗-CTLA-4抗体可以用于本文公开的方法中。上述出版物中每个的教导由此通过引用结合。也可以使用与这些本领域公认的抗体的任一种竞争结合CTLA-4的抗体。例如，人源化CTLA-4抗体在国际专利申请No.WO2001014424、WO2000037504和美国专利No.8,017,114(全部通过引用结合于此)中描述。

例举性的抗-CTLA-4抗体是伊匹木单抗(ipilimumab)(也称为10D1,MDX-010,MDX-101,和

)或其抗原结合片段和变体。在其他实施方案中，抗体包含伊匹木单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方案中，抗体包括伊匹木单抗的VH区域的CDR1、CDR2和CDR3结构域，和伊匹木单抗的VL区域的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，所述抗体与上述抗体竞争结合于和/或结合至CTLA-4上的相同表位。在另一个实施方案中，抗体与上述抗体具有至少约90％的可变区氨基酸序列同一性(例如，与伊匹木单抗至少约90％、95％或99％的可变区同一性)。

用于调节CTLA-4的其他分子包括CTLA-4配体和受体(诸如描述于美国专利No.US5844905,US5885796和国际专利申请No.WO1995001994和WO1998042752；全部通过引用结合于此)和免疫黏附素(诸如描述于美国专利No.US8329867，通过引用结合于此)。

4.外科手术

约60％患有癌症的人将经受某种类型的外科手术，包括预防性、诊断性或分期、治愈性和姑息性外科手术。治愈性外科手术包括切除术，其中全部或部分癌组织被物理地去除、切离和/或破坏，并且可与其它疗法结合使用，如本发明实施方案的治疗、化疗、放疗、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法。肿瘤切除术指的是物理去除肿瘤的至少一部分。除了肿瘤切除术之外，通过外科手术的治疗包括激光外科手术、冷冻外科手术、电外科手术和显微镜控制的外科手术(莫氏外科手术(Mohs'surgery))。

在切离部分或全部癌细胞、组织或肿瘤时，可能在体内形成空腔。可以通过向区域灌注、直接注射或局部施用附加抗癌疗法来实现治疗。这类治疗可以重复，例如每1、2、3、4、5、6或7天，或每1、2、3、4和5周，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月重复。这些治疗也可具有变化的剂量。

5.其它药剂

预期其它药剂可与本发明实施方案的某些方面组合使用来改善治疗的疗效。因此可以考虑更多的实例。这些附加药剂包括影响细胞表面受体和GAP连接上调的药剂、细胞生长抑制和剂分化剂、细胞粘附抑制剂、增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂或其它生物药剂。通过增加GAP连接的数量增加胞间信号传递将提高对相邻过度增殖细胞群体的抗过度增殖作用。在其它实施例中，细胞生长抑制剂或分化剂可与本发明实施方案的某些方面组合使用来改善治疗的抗过度增殖功效。考虑细胞粘附抑制剂改善本发明的功效。细胞粘附抑制剂的实例是粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀(Lovastatin)。进一步考虑提高过度增殖细胞对凋亡的敏感性的其它药剂(例如抗体c225)可以与本发明实施方案的某些方面组合使用来改善治疗功效。

IV.试剂盒

在本发明实施方案的各个方面中，考虑试剂盒，其含有治疗剂和/或其他治疗剂和递送剂。在一些实施方案中，本发明实施方案考虑用于制备和/或施用本发明实施方案的外泌体组合物的试剂盒。试剂盒可包含含有本发明实施方案的药物组合物中的任一种的一个或多个密封小瓶。例如，试剂盒可以包括外泌体以及制备、配制和/或施用本发明实施方案的组分或实施本发明方法的一个或多个步骤的试剂。在一些实施方案中，试剂盒还可包含合适的容器，其为不与试剂盒的组分反应的容器，如eppendorf管、测定板、注射器、瓶或试管。容器可由可灭菌材料如塑料或玻璃制得。

试剂盒还可包括说明书页，其概述在本文中阐述的方法的程序步骤，并且将遵循如本文所描述的或所属领域的普通技术人员已知的基本上相同的程序。说明书信息可在含有机器可读指令的计算机可读介质中，所述机器可读指令当使用计算机执行时引起以下真实或虚拟程序的显示：递送药物有效量的治疗剂。

V.实施例

包括以下实施例以展示本发明的优选实施方案。本领域的技术人员应理解，以下实施例中所公开的技术代表本发明人发现的在本发明的实践中良好地起作用的技术，并且因此可以被视为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域的技术人员应理解，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下对所公开的具体实施方案作出许多改变并且仍获得相似或类似结果。

实施例1–产生和表征外泌体

为了从MSC产生大量外泌体，改变骨髓来源的MSC的生物反应器培养物使得能够收获250mL的条件培养基收集物。Terumo Quantum细胞扩增系统是设计用于符合GMP的细胞产生的自动化中空纤维细胞培养平台。

用约2.0×10⁷个MSC将MSC以约450个细胞/cm²的密度接种于生物反应器中。将细胞在5％氧中使用补充有L-谷氨酰胺加上人血小板裂解物(PLT)的αMEM培养基培养8天，以进行MSC扩增和贴壁。

本策略中未被他人报道过的独特步骤包括最初在生物反应器中使用血小板裂解物进行最优MSC汇合，一旦生物反应器中的MSC达到85％或更高的汇合接着进行下一步：将培养基更换为无血清的条件培养基。该步骤避免了最终产品被以下外泌体所污染：所述外泌体在血小板裂解物中大量存在，并且否则将稀释来源于MSC的外泌体。将该条件培养基放置在生物反应器中达48小时，然后收集用于EV纯化(图1)。生物反应器连续产生EV达12天，其包括6次收集(每48小时1次)(图2)。

使用该方法，通过从约6亿个MSC依次收集EV来最优化系统。在21天后，将每48小时收集并储存在-80℃的条件培养基级分解冻，合并并在功能封闭的系统中过滤(图3)。

对于该工艺，在热封袋管后使用泵(Baxter)过滤，其与临床细胞治疗程序所需的GMP合规性一致。使用XE-90超速离心机(BeckmanCoulter)，通过在4℃以100,000g超速离心4小时，从条件培养基中分离EV作为外泌体。使用Baxter泵和热封管从超速离心机中以功能封闭的方式取出外泌体，以获得最高质量的临床产品。

通过过滤和超速离心来富集外泌体，每次收获的外泌体的数量范围为9000亿至45000亿个。每次生物反应器运行产生的外泌体的总数范围为9.8至15.1万亿个。来自生物反应器运行的所有6次收获的外泌体的模式尺寸显示在约170nm的特征峰。外泌体蛋白质含量的测量值接近通过Nanosight分析确定的外泌体计数。特别地，条件培养基的代谢物收获保持恒定，支持MSC是保持活力的。

通过外泌体表面标志物:CD63,CD47,CD9和CD81的流式细胞术表达；和透射电子显微镜(TEM)(图4)来鉴定纯化的外泌体。另外，使用纳米颗粒追踪分析和微量BCA测定来定量外泌体(图5)。来自一次生物反应器运行的收率是最少10×10¹²个外泌体，其等于约来自100个T-225烧瓶的外泌体收率。因此，本方法允许有效的临床级别地产生外泌体。

实施例2–外泌体的电穿孔

用LV部件调整4D Nucleofactor系统以允许封闭的、有效的和可放大的体外转染范围为2.5x10¹⁰至2.5x10¹²个外泌体的大量的外泌体，诸如来源于实施例1的外泌体。4DNucleofactor装置含有三种不同的Nucleofector溶液：SE、SF和SG，其各自与十六个不同的Nucleofector程序组合使用来源于MSC的外泌体和特定的siRNA进行测试。通过由携带siRNA的MSC-外泌体诱导的受体细胞凋亡测定，评估每种情形将siRNA有效掺入来源于MSC的外泌体中的效率(图7)。

先前，使用确定成分的电穿孔缓冲液(研究缓冲液，‘RB’)将siRNA引入外泌体，其在处理细胞或小鼠之前需要外泌体的洗涤步骤，因为该缓冲液未被批准用于人用。洗涤步骤与外泌体的损失相关，这可以通过使用稀释剂来缓解，所述稀释剂使得能够将siRNA成功电穿孔到外泌体中并且可以直接施用于细胞或小鼠。关于电穿孔，测试了临床缓冲液(

‘CB’)，一种FDA批准的人用稀释剂，其用于MSC和许多其他细胞产品输注到患者中。在电穿孔来源于MSC的外泌体之后，电子显微镜分析证实了使用原始配制的研究缓冲液(RB)或

存在完好的外泌体(图8B)。

实施例3–优化外泌体制造条件

为了确定从MSC培养物产生外泌体的最佳时间，在不同时间进行条件培养基的收集(图5D)。将通过nanosight获得的数据(即颗粒数量)与通过流式细胞术获得的数据(即，外泌体标志物的百分比)结合。结果显示，来自MSC的颗粒的数量在24小时达到最高水平并且保持直至48小时。在该时刻后颗粒的数量显著降低。流式数据表明，与在24小时的百分比相比，外泌体标志物的百分比在48小时富集(图5E)。因为在24小时和48小时之间的颗粒数量并没有显著差异，所以选择48小时的时间点作为收集的时间点。

接下来，为了确定从培养物中的MSC产生外泌体的理想条件，在存在和不存在含有PLT的培养基的情况下培养24小时后从条件培养基中分离来源于MSC的外泌体。结果显示，从具有PLT的培养基中分离的颗粒的数量要高于无血清的培养基(图6A)。然而，外泌体标志物的流式细胞术表明外泌体的百分比低，这可能是由于在PLT中高数量的蛋白质和脂质导致(图6B)。

因此，使用无菌溶液(即

)优化了将小序列的核酸或蛋白质电穿孔到外泌体中的方法(图8A)，所述无菌溶液可以直接输注到人中，减少了操作，材料损失，和治疗成本(图9)。测试了五种不同的研究缓冲液，之后证明了

产生了最佳电穿孔结果(图8A)。此外，体内证明了通过该策略产生的来源于MSC的外泌体靶向多种组织的能力(图10)。

因此，本研究证明了有效大规模产生携带KRAS siRNA的MSC-外泌体，所述siRNA可以沉默受体细胞中靶RNA的体外表达(图8C)。与先前的方法相比，该方法产生了多于一个对数(log)的更大量的EV。另外，本方法将允许直接输注操作的外泌体而不需要洗涤或其他操作。

实施例4–材料和方法

细胞:将获自MD安德森癌症中心(MD Anderson Cancer Center)的细胞疗法实验室(Cell Therapy Laboratory)的来源于骨髓的第3代MSC在补充有1％L-谷氨酰胺、5％人血小板裂解物和1％青霉素链霉素的αMEM(完全培养基)中培养。评估来自3个不同供体的MSC，随后基于其高外泌体产生收率，选择单个供体。对于体外转染，在6-孔平板的每个孔中接种250,000个Panc-1细胞过夜。在外泌体处理之前，将单层用1mlPBS洗涤两次，然后用1ml无血清的培养基(补充有1％青霉素-链霉素的RPMI)中的外泌体处理达指定的时间点，如关于每个测定所述的。

临床缓冲液(

pH 7.4或‘CB’)包含0.09M氯化钠，0.23M葡萄糖酸钠；0.27M三水合醋酸钠，5mM氯化钾，3mM氯化镁。它不含抗微生物剂。pH用氢氧化钠调节至7.4。

从位于MD安德森癌症中心的细胞疗法实验室的GMP设施中培养的MSC严格产生临床级别的外泌体。将Quantum生物反应器培养系统(Terumo BCT)用1L的1X PBS进行启动处理(自动化过程)并用在250ml的1X PBS中稀释的5mg人纤连蛋白(BD Biosciences,德国)包被24h。然后，生物反应器用500ml补充有1％L-谷氨酰胺、5％人血小板裂解物和1％青霉素-链霉素的αMEM(完全培养基)培养基洗涤，并装载在25ml完全培养基中稀释的20x10⁶个MSC(第3代)，并使用完全培养基扩增9天。将新鲜完全培养基连续添加到细胞中并且调节入口速率，如通过每日葡萄糖和乳酸盐测量所确定。在9天后，当细胞达到约80％汇合时(如通过葡萄糖和乳糖测量确定)，将细胞用2L的1X PBS洗涤以用不含PLT的培养基(补充有1％L-谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素的αMEM)替换完全培养基。然后每48小时收集生物反应器条件培养基(250ml)于密封袋(封闭系统)中达总共6次收集(收获)。在这12天期间，基于每日测量的恒定的葡萄糖水平，培养物没有扩增。因此在12天内每48h连续收获外泌体。将收获物储存在-80℃以进一步加工。测试每个收获物的无菌状态(证实对于厌氧菌和好氧菌为阴性)、内毒素(<1EU/ml)和支原体(PCR,阴性)。然后将收集物在4℃解冻过夜，合并，并且使用Cobe2991细胞处理器(Terumo BCT)在封闭系统中以1,000g离心15分钟。在通过离心(1,000g，15min，4℃)去除大细胞碎片后，使用0.2-μm滤器的过滤袋(Terumo BCT)将条件培养基在封闭系统中过滤。然后，使用注射器和与聚碳酸酯管(Beckman Coulter)直接连接的线路，将600ml上清液转移至半封闭系统中的六个透明聚碳酸酯管(每个管具有100ml容量)中，密封并且在45Ti型转子(Beckman-Coulter)中以100,000g离心3小时。重复该过程三次直至将所有收集物离心(spun)(总共1500ml)。然后使用与泵连接的16G注射器(BDBiosciences,目录号14-826-18B)吸出上清液。将外泌体沉淀使用18G注射器(BD,目录号408360)手工重悬于4ml(每管)临床缓冲液中，并转移至无菌玻璃容器(APP Pharma,30ml容量)中。将其维持在4℃达72h直至所有离心完成。当所有离心完成时，重悬外泌体的最终合并的体积是72ml。合并的MSC外泌体通过NanoSight^TM(0.5ml)、流式细胞术(1ml)分析并且测试内毒素(使用0.5ml的合并样品)和无菌状态(使用1ml的合并样品，如上详述)。将外泌体(终体积69ml)最终等分于冷冻玻璃小瓶中，每个小瓶含有(2ml)，并储存于-80℃。对于未来的临床产品的制备，直接加工外泌体用于大规模电穿孔(关于详情，参见下文)，然后等分并储存于–80℃。

使用NTA测量粒度和浓度分布：使用NanoSight^TMLM 10仪器(NanoSight Ltd)分析分离的外泌体悬浮液。将分析设置最优化并且在样品之间保持恒定，并且分析每个视频以给出关于每个粒度的平均值、模式、中值和估计的浓度。

通过微量BCA测定定量外泌体：在重悬于CB中的MSC外泌体用1X PBS洗涤并且在SW41Ti型转子(Beckman Coulter)中以100,000g超速离心3h。然后洗涤的MSC外泌体再次通过NanoSight^TM测量并使用微量BCA蛋白质测定试剂的试剂盒(Thermo Scientific)根据制造商的说明书来分析总蛋白质含量。

电穿孔外泌体:将总数为0.5x10¹²的来源于MSC的外泌体和0.5mg的siRNA源2(Avecia)混合在20ml的临床缓冲液中。使用4DNucleofator LV部件(Lonza)在封闭系统中将这些外泌体电穿孔。LVNucleocuvette^TM筒是一种新的池皿系统，其允许高达20ml的电穿孔。将该筒连接于两个贮存袋(入口和出口)，和蠕动泵，所述蠕动泵每次用1ml填充所述筒。在所有程序期间将出口袋保持在冰上并且程序需要约10分钟来完成。电穿孔后，通过NanoSight^TM分析外泌体，测试内毒素和无菌状态(如上详述)，等分于冷冻小瓶中，并且储存于-80℃。这些外泌体然后在冰上解冻，并用于随后的体外和体内实验。对于体外实验，将外泌体稀释用于下游应用，如下文详述。对于体内实验，将10⁹个电穿孔的外泌体稀释在100μL的研究缓冲液或临床缓冲液中。

电子显微镜:将处于最适浓度的固定样本放置于300目碳/formvar包被的格栅并允许吸附至formvar达最少1分钟。将格栅用PBS洗涤并且放置于0.1M磷酸盐缓冲液中的2.5％戊二醛中达15min。在PBS和蒸馏水中漂洗后，使得格栅干燥和使用乙酸双氧铀染色以造影。样品用Tecnai Bio Twin透射电子显微镜(FEI,Hillsboro,OR)观察，并且图像用AMTCCD照相机(Advanced Microscopy Techniques,Danvers,MA)获取。

外泌体的流式细胞术分析:将来自MSC的外泌体如上所述分离并重悬于200μl的PBS中。将醛/硫酸盐珠(10μl,Life Technologies)加入溶液并且允许珠和外泌体混合物使用台式旋转器室温混合15分钟。然后将PBS(600μl)加入溶液并在4℃继续混合过夜。加入1M甘氨酸(400μl)并且在室温继续混合1小时。然后将混合物以8,000g离心1min。然后将沉淀重悬于100μL在PBS中的10％BSA，并且室温混合45min。将混合物以8,000g离心1min，并且吸出上清液。然后将连接有外泌体的珠(沉淀)重悬于20μl在PBS中的2％BSA，并且针对CD47、CD63、CD81、CD9、CD29、CD90或同种型对照进行免疫标记。将与珠结合的外泌体与1μl的抗-CD47抗体(eBiosciences,目录号14-0479)或1μl的抗-CD63(BD biosciences,目录号556019),或1μl的抗CD-81抗体(BDBiosciences,目录号555675),或1μl的抗-CD9抗体(Sigma,目录号SAB4700092),或1μl的抗-CD29抗体(Biolegend,目录号303001),或1μl的抗-CD90抗体(Biolegend,目录号328101),或1μl的小鼠IgG1,κ同种型对照抗体(BDBiosciences,目录号555746)以20μl体积温育，并在室温混合30min。然后将混合物以8,000g离心1min，吸出上清液，并且将沉淀重悬于20μl在PBS中的2％BSA。然后，向样品和同种型对照加入1μl的二抗(Invitrogen,目录号A21202)。然后将所有样品在室温混合1h。然后将样品以8,000g离心1min，吸出上清液，并且将沉淀重悬于200μl在PBS中的2％BSA。将与珠结合的外泌体用在PBS中的2％BSA洗涤三次。使用LSR Fortessa X-20细胞分析仪分析外泌体标志物(CD9,CD63和CD81,CD47)和间充质标志物(CD29和CD90)的表达。使用FlowJoR软件(TreeStar Inc.)分析数据。对于每个实验对于同种型对照和样品两者并排地获得流式细胞术数据。使用相同的外泌体制备物，独立地重复2次流式细胞术实验。

本文中所公开和要求的所有方法均可以在无需过度实验的情况下根据本公开进行和实行。尽管已关于优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域的技术人员将显而易见的是，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可将变化应用于本文所述方法和方法的步骤或步骤的顺序。更具体地说，将显而易见的是，在化学上和生理学上均相关的某些药剂可取代本文所描述的药剂，同时将实现相同或类似结果。对本领域的技术人员显而易见的所有这类类似取代和修改视为在由所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念内。

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Claims (77)

1.一种从间充质干细胞(MSC)制备外泌体的方法，所述方法包括：

(a)在功能封闭的生物反应器中在包含人血小板裂解物(PLT)的培养基中培养MSC至75-95％汇合；

(b)在基本上不含PLT的培养基中进一步培养所述细胞；

(c)从所述生物反应器中收集条件培养基级分；以及

(d)从所述条件培养基级分中分离外泌体。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在收集后将每个条件培养基级分储存于-80℃。

3.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤(d)之前将所述条件培养基级分解冻并合并。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述MSC进一步限定为来源于骨髓的MSC。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述MSC进一步限定为来源于脂肪的MSC。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其进一步包括在步骤(a)之前用至少1x10⁷个MSC接种所述生物反应器。

7.根据权利要求6所述的方法，其中以约400-500个细胞/cm²的密度接种所述MSC。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述封闭的生物反应器是中空纤维生物反应器。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述中空纤维生物反应器是Terumo细胞扩增系统。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中在步骤(a)的培养基中所述PLT的浓度为5％。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中向所述生物反应器中的MSC连续加入新鲜培养基。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述细胞在5％氧下培养。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中步骤(a)的培养持续5-10天。

14.根据权利要求13所述的方法，其中步骤(a)的培养持续8天。

15.根据权利要求1所述的方法，其中将所述MSC培养至80-90％汇合。

16.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中将所述MSC培养至85-90％汇合。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中步骤(b)的培养持续24-72小时。

18.根据权利要求17所述的方法，其中步骤(b)的培养持续48小时。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中步骤(b)的培养基不含PLT。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中在步骤(a)和(b)之间洗涤所述MSC。

21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述MSC在无血清的确定成分培养基中培养。

22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中步骤(a)-(d)在无血清条件下进行。

23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中将所述条件培养基级分收集在密封袋中。

24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中每24-72小时收集所述条件培养基级分。

25.根据权利要求24所述的方法，其中每40-50小时收集条件培养基级分。

26.根据权利要求24所述的方法，其中每48小时收集条件培养基级分。

27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述条件培养基级分各自体积为200-300mL。

28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中收集所述条件培养基级分达10-14天。

29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中收集所述条件培养基级分达12天。

30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中收集至少5个条件培养基级分。

31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中在少于3周内进行步骤(a)-(d)。

32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中每个条件培养基级分包含9x10¹¹至50x10¹¹个外泌体。

33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中分离至少10x10¹²个外泌体。

34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中分离至少15x10¹²个外泌体。

35.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中分离包括将合并的级分过滤和超速离心以获得含有外泌体的沉淀，并且将所述含有外泌体的沉淀重悬于缓冲液中。

36.根据权利要求35所述的方法，其中使用泵和热密封管以功能封闭的方式进行分离。

37.根据权利要求35所述的方法，其中过滤进一步限定为使所述合并的级分通过0.2μm滤器。

38.根据权利要求35所述的方法，其中分离进一步包括在过滤之前的离心步骤以去除大的细胞碎片。

39.根据权利要求35-38中任一项所述的方法，其中分离在4℃进行。

40.根据权利要求35所述的方法，其中所述缓冲液包含0.09M氯化钠、0.23M葡萄糖酸钠、0.27M三水合醋酸钠、5mM氯化钾和3mM氯化镁。

41.根据权利要求35或40所述的方法，其中所述缓冲液具有7.4的pH。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述缓冲液是PLASMALYTE-

43.根据权利要求1-42中任一项所述的方法，其进一步包括用治疗剂装载所述外泌体。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述治疗剂包括一种或多种细胞因子、化疗药物、核酸、小分子或蛋白。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述核酸包括DNA和/或RNA。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述RNA是siRNA、miRNA或shRNA。

47.根据权利要求45所述的方法，其中所述RNA是siRNA。

48.根据权利要求43-47中任一项所述的方法，其中所述装载包括电穿孔所述外泌体。

49.根据权利要求48所述的方法，其中电穿孔在PLASMALYTE-

中进行。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述方法不包括在步骤(d)和电穿孔之间洗涤所述外泌体或交换缓冲液。

51.根据权利要求50所述的方法，其中来自步骤(d)的外泌体的数量至装载的外泌体的数量减少不超过20％。

52.药物组合物，其包含通过权利要求1-51中任一项所述的方法制备的外泌体。

53.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据权利要求1-51中任一项所述的方法制备的外泌体。

54.根据权利要求53所述的方法，其中所述受试者是人。

55.根据权利要求53或54所述的方法，其中将电穿孔的外泌体直接输注至所述受试者。

56.根据权利要求53-55中任一项所述的方法，其进一步包括施用至少第二种抗癌疗法。

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述至少第二种抗癌疗法包括化疗、放疗、基因疗法、外科手术、激素疗法、抗血管生成疗法或免疫疗法。

58.一种将RNA递送至细胞的方法，所述方法包括向所述细胞施用有效量的通过权利要求43-51中任一项所述的方法制备的装载RNA的外泌体。

59.根据权利要求58所述的方法，其中所述细胞是人细胞。

60.根据权利要求59所述的方法，其中所述细胞是癌细胞或T细胞。

61.一种在有此需要的受试者中治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1-51中任一项所述的方法制备的外泌体。

62.根据权利要求61所述的方法，其中所述外泌体装载有siRNA或miRNA。

63.根据权利要求61或62所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症、炎性病症或免疫相关病症。

64.根据权利要求61-63中任一项所述的方法，其中所述癌症是肺癌。

65.根据权利要求61-64中任一项所述的方法，其中所述外泌体装载有KRAS siRNA。

66.根据权利要求61-65中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

67.根据权利要求61-66中任一项所述的方法，其中将所述外泌体口服、局部、静脉内、腹膜内、肌内、通过内镜、经皮、皮下、区域或通过直接注射施用。

68.根据权利要求67所述的方法，其中所述外泌体静脉内施用。

69.根据权利要求61-68中任一项所述的方法，其进一步包括施用至少第二种治疗剂。

70.根据权利要求69所述的方法，其中所述至少第二种治疗剂是抗癌剂。

71.根据权利要求70所述的方法，其中所述抗癌剂是化疗、放疗、基因疗法、外科手术、激素疗法、抗血管生成疗法或免疫疗法。

72.一种在患有免疫介导的炎性疾病的受试者中治疗所述疾病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1制备的来源于MSC的外泌体。

73.根据权利要求72所述的方法，其中所述免疫介导的炎性疾病选自类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病(IBD)和克罗恩病。

74.根据权利要求72或73所述的方法，其中所述MSC是同种异体的。

75.根据权利要求72-74中任一项所述的方法，其中系统或局部施用所述外泌体。

76.根据权利要求72-75中任一项所述的方法，其中将所述外泌体经由直肠、鼻、口腔、阴道、皮下、皮内、静脉内、腹膜内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内或颅内路线或者经由植入的贮库来施用。

77.根据权利要求72-76中任一项所述的方法，其中将所述外泌体连同至少一种另外的治疗剂一起施用。

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