KR102285160B1

KR102285160B1 - 전구세포에서 유래한 다기능성 엑소좀을 포함하는 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102285160B1
Application number: KR1020200182983A
Authority: KR
Inventors: 쵄소왠; ??소왠; 김창영
Original assignee: 주식회사 타임바이오; ??소왠; 김창영
Priority date: 2020-12-24
Filing date: 2020-12-24
Publication date: 2021-08-03
Also published as: WO2022139439A1

Abstract

본 발명은 전구세포에서 유래한 엑소좀을 포함하는 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 육안병변, 조직학적 검사 및 사이토카인 등에서 피부염의 예방 또는 치료에 탁월한 효과가 있다. 특히, 본 발명의 조성물은 혈관주위의 침윤된 면역세포를 억제 및 제거하여 조직의 미세환경과 혈관을 복구하고, 호중과 림프구의 평형을 회복시키며, 세포의 염증을 완화하여 근본적으로 피부염을 억제 및 완화시킬 수 있으며, 피부염과 같은 다양한 면역질환 또는 염증 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

전구세포에서 유래한 다기능성 엑소좀을 포함하는 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for the prevention and treatment of dermatitis using progenitor cell derived multifunctional exosomes}

본 발명은 전구세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 하는 피부염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 상기 조성물은 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료용 약학 조성물, 연고, 스프레이 등 피부외용제 및 화장료 조성물에 관한 것이다.

아토피 피부염을 대표로 하는 많은 피부염은 염증성 피부질환으로 칭해진다. 염증성 피부질환의 명확한 발병기전은 밝혀지지 않았지만 면역세포들의 복합적인 기능장애와 밀접한 연관성이 있다. 또한, 조직학적으로 염증성 피부질환은 대부분 혈관주위 면역세포 침윤현상을 보인다(선행기술문헌 논문 1). 이 외에도 염증성 피부염에서는 면역글로불린 IgE 증가와 사이토카인 iNOS, IL-6, TNFα, TSLP(Thymic stromal lymphopoietin), CCL17(TARC) 등의 증가가 관찰되고 이런 요소들이 피부염의 중증도와 연관되어 있고, 피부염에서 자주 보이는 가려움증, 건조증, 피부 병변의 원인이라고 알려져 있다.

이러한 연구를 바탕으로, 염증성 피부질환 치료제를 개발하고자 하는 노력들이 있다. 현재까지 개발된 피부염 치료제는 스테로이드, 항히스타민제 및 듀플리맙(Dupilumab, 브랜드명 : 듀피젠트) 등이 있다. 스테로이드와 항히스타민제는 다양한 부작용이 보고되어 있을 뿐만 아니라 피부염에 대한 근본적인 치료제가 아니기에 지속적으로 사용하기가 어려운 문제점이 있다. 듀피젠트는 사이토카인인 IL-4와 IL-13을 동시에 타깃하는 단일클론항체 의약품으로 시중에서 출시되었지만 복강경 주사제로 사용 편이성, 연령 및 아토피 피부염의 중증도에 대한 사용제한, 높은 가격에 대한 부담 및 제한적인 효과와 다양한 부작용이 문제가 되고 있다.

이와 같이, 현재까지 발굴된 피부염 치료제는 모두 증상을 완화시키는 것에 초점을 맞추고 있으며, 근본적인 치료를 위한 접근방식의 치료제는 현재로는 없다. 듀피젠트도 사이토카인을 표적으로 삼지만 근본적으로 사이토카인을 분비하는 면역세포를 조절하는 근본적인 치료제는 아니다. 또한, 임상연구 중에 있는 많은 치료제 후보물질들이 듀피젠트와 같이 사이토카인이 표적이므로 향후 동일한 문제에 직면하게 될 것이다.

한편, 전통적인 치료제 연구와 달리 줄기세포로 피부염 치료제를 개발하고자 하는 노력이 진행되고 있다. 하지만, 최근 중간엽 줄기세포 아토피 피부염 치료제가 임상 3상에서 유효성을 입증하는데 실패하면서 줄기세포 관련 피부염 치료제 연구개발에도 적신호가 켜진 상황이다.

이에 중간엽 줄기세포 분비인자인 엑소좀 등을 이용한 피부염 치료제 개발도 시도되고 있다. 엑소좀은 엔도솜(endosome)에서 생성되는 크기가 30-150nm되는 막으로 둘러싸인 소낭체이다. 생리학적 조건에서 모든 생물체의 세포는 엑소좀를 분비한다. 미세소포(microvesicals), 세포자멸사 소체(apoptotic bodies) 등 기타 세포 외 소낭체들의 크기도 엑소좀과 비슷하지만 생물발생 경로가 다르다. 엑소좀의 가장 큰 역할은 카고(cargo) 즉 물질운반체로서 단백질, 지질, mRNA, microRNA, long non-coding RNA 등 핵산정보를 운반하는 것이다. 생리학적 조건에서 엑소좀은 지속적으로 세포와 세포사이를 오가면서 이런 정보를 전달하여 세포들의 교류에 중요한 역할을 한다. 특히 엑소좀이 운반하는 물질 중에서 microRNA들이 가장 중요하다는 것이 밝혀졌고 엑소좀이 생리학적 또는 치료 효능을 나타낼 수 있는 핵심이다 (선행기술문헌 논문 2). 한국공개특허 제2020-0084798호와 제2045188호 등에도 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 진정용 조성물에 관한 기술이 제시되어 있다. 그러나, 엑소좀의 특성은 유래 세포에 따라 결정되기에 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀은 중간엽 줄기세포와 같이 그 효과가 제한적일 것으로 판단되고 있다.

본 발명은 대부분의 염증성 피부질환에 보이는 혈관주위 면역세포 침윤현상에 초점을 맞추어 치료제 개발을 진행하였다. 그 중에서도, 호중구와 림프구의 조절에 대한 연구를 진행하였다. 호중구와 림프구 비율은 아토피 피부염의 발병도를 반영하고, 아토피 피부염 정도를 나타내는 SCORAD (Scoring Atopic Dermatitis) index의 증가에 따라 호중구와 림프구 비율이 증가하는 것으로 보고되어 있다(선행기술문헌 논문 3). 또한, 호중구와 림프구 비율은 건선과 밀접한 연관성이 있고, 건선 환자에서 피부질환의 범위가 넓고 중증도가 심할수록 혈액 속 호중구와 림프구 비율이 증가하는 것으로 보고되어 있다(선행기술문헌 논문 4).

결과적으로 본 발명은 기존의 피부염 치료제와는 전혀 다른 기전으로 직접적으로 혈관주위 면역세포 침윤현상을 억제하고 호중구와 림프구를 조절하는 엑소좀을 전구세포로부터 획득하였고, 해당 엑소좀이 현존하는 약물과 달리 근본적으로 면역시스템을 조절하여 피부염을 치료하는 획기적인 효과를 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

한국공개특허 제2020-0084798호(신경줄기세포 유래 엑소좀(exosomes)을 함유하는 아토피 치료용 약학조성물) 한국등록특허 제2192317호(천연 추출물 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 진정용 조성물) 한국등록특허 제2045188호(지방줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 피부염 개선 용도

(논문 1) Ackerman et al., Histologic diagnosis of inflammatory skin diseases, 3rd edition, 2005. (논문 2) Zhang et al., Exosomes beyond stem cells for restorative therapy in stroke and neurological injury, Nature reviews neurology, 15, 193-203 (2019). (논문 3) Jiang et al., Assessment of neutrophil to lymphocyte ratio and platelet to lymphocyte ration in atopic dermatitis patients, Medical science monitor, 23:1340-1346(2017). (논문 4) B.B.Sen et al., Neutrophil to lymphocyte ratio as a measure of systemic inflammation in psoriasis, Cutaneous and Ocular Toxicology, 33, 223-227(2014)

본 발명의 목적은 전구세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 피부염 예방 또는 치료할 수 있는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 특히 본 발명의 목적은 피부염에서 발견되는 혈관주위의 침윤된 면역세포를 억제 및 제거하여 조직의 미세환경과 혈관을 복구하고, 호중과 림프구의 평형을 회복시키며, 세포의 염증을 완화하여 근본적으로 피부염을 억제 및 완화시킬 수 있으며, 피부염과 같은 다양한 면역질환 또는 염증 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있는 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 엑소좀을 포함하는 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료용 약학 조성물, 피부외용제 및 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 고농도, 고순도, 입자크기 분포가 균일한 멸균된 전구세포 유래 엑소좀을 대량으로 수득할 수 있고, 이와 같이 수득된 안정적이고 안전하며 활성이 뛰어난 전구세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일측면에 따르면, 전구세포 유래 엑소좀을 함유하는 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

여기서, 상기 전구세포는 표면마커 중에서 CD24, CD117, SSEA-1에 대하여 음성이고 CD31, CD45RA, CD105, CD146, TRA-1-60에 대하여 양성인 것이 바람직하다.

또한, 상기 엑소좀은 표면마커 중에서 CD9, CD63, CD81외에도 CD44, CD53, CD98을 함유하는 것이 바람직하다.

그리고, 본 발명의 엑소좀은 전구세포 배양액을 필터에 통과시켜 세포 잔해물, 노폐물, 거대 입자 중 적어도 어느 하나를 여과하는 단계, 상기 여과된 배양액을 멸균 필터로 멸균하는 단계, 상기 멸균된 배양액을 접선흐름여과방법을 이용하여 농축과 정용여과과정을 통해 엑소좀을 분리하는 단계, 상기 분리된 엑소좀에 안정화 버퍼를 추가하여 다시 시작 부피가 되도록 희석하는 단계 및 상기 희석된 엑소좀을 액체 교환 시스템으로 멸균 필터에 통과시켜 멸균한 후 밀봉된 저장용기에 저장하는 단계를 수행하여 수득될 수 있다.

여기서, 접선흐름여과를 위한 분자량 한계치를 얻기 위하여 10,000 Da, 50,000Da 또는 75,000Da의 중공사 필터를 사용할 수 있다.

그리고, 상기 c단계의 농축과 정용여과는 접선흐름여과를 단속 또는 연속적으로 진행하고, 농축은 시작 부피에 대하여 10배 내지 25배 농축하고, 정용여과 과정은 농축된 부피에 대하여 적어도 10배의 부피를 갖는 버퍼로 여과하는 과정을 포함할 수 있다.

또한, 상기 엑소좀 희석은 농축 및 정용여과된 부피에 대하여 10배 내지 25배의 안정화 버퍼를 첨가하여 전체 부피가 시작 부피와 같도록 희석하는 과정을 포함하는 것이 바람직하다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 일측면에 따르면, 전구세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료용 피부외용제가 제공된다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 일측면에 따르면, 전구세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 피부염의 예방, 개선, 완화용 화장료 조성물이 제공된다.

본 발명의 조성물은 대부분의 피부염에서 공통으로 발견되는 혈관주위 면역세포 침윤현상을 억제하고, 혈관을 복구하고 침윤된 면역세포를 제거하며, 염증의 근본적인 원인인 호중구와 림프구를 조절하여 질병의 중증도와 연관성을 보이는 호중구와 림프구 비율을 감소시키며, 동시에 다양한 염증성 사이토카인을 억제하여 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료할 수 있다.

특히, 본 발명의 조성물은 피부염의 치료제 연구개발 접근법에 있어 종래에 시도한 적이 없고 종래의 기술로 해결이 되지 않는 새로운 기전과 치료법을 제시한다. 또한, 혈관주위 면역세포 침윤현상 및 면역세포를 직접 제어하기에 광범위한 피부염에 적용이 가능하고 효과적으로 피부염을 억제 및 완화할 수 있다.

따라서, 본 발명의 조성물은 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료용 약학조성물, 피부외용제 및 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 고농도, 고순도, 입자크기가 균일하고 멸균된 특이성 전구세포 유래 엑소좀을 저가로 대량으로 생산할 수 있고 해당 기술은 스케일업과 GMP적용이 가능하며, 본 발명의 엑소좀의 뛰어난 활성으로 현재까지 보고된 줄기세포 유래 엑소좀보다 상대적으로 낮은 농도에서도 뛰어난 효능을 보이기에 상업적으로 활용가치가 굉장히 높다.

도1은 본 발명의 일 구체예에 따라 전구세포 엑소좀을 제조하는 과정을 설명하는 흐름도이다.
도2는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 입자크기 분포를 나타내는 나노입자 추적 분석결과를 도시한 그래프이다.
도3은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀을 전자현미경으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도4는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀을 사람피부에 적용한 후 피부조직 생검 수행 결과를 정상피부 및 염증성 피부와 비교한 것이다.
도5는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀을 랫드에 적용한 후 혈액학적 검사를 통해 호중구와 림프구 비율이 조절된 결과를 나타낸 것이다.
도6는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀을 형광염색하여 피부세포에 처리하였을 때 피부세포가 엑소좀을 흡수한 결과를 나타낸 것이다.
도7은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀에 의한 염증성 피부세포가 분비하는 엑소좀의 분비변화를 나타낸 것이다.
도8은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀에 의한 iNOS 형성 감소 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도9은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀에 의한 (a) IL-6, (b) TNFα, (c) TSLP, (d) TARC의 변화량을 ELISA 키트로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도10은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀이 인체 피부에 흡수되는 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도11은 본 발명의 일 구체예에 다른 엑소좀을 포함하는 조성물을 사람의 피부에 도포한 후 피부염의 환부가 현저히 개선되는 것을 보여주는 사진을 나타낸 것이다.

본 발명에 기재된 실시예 및 도면에 도시된 구성은 본 발명의 바람직한 실시예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 표현하는 것은 아니므로, 본 발명의 권리범위는 본문에 설명된 실시예 및 도면에 의하여 제한되는 것으로 해석되어서는 아니 된다. 즉, 실시예는 다양한 변경이 가능하고 여러 가지 형태를 가질 수 있으므로 본 발명의 권리범위는 기술적 사상을 실현할 수 있는 균등물들을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 발명에서 제시된 목적 또는 효과는 특정 실시예가 이를 전부 포함하여야 한다거나 그러한 효과만을 포함하여야 한다는 의미는 아니므로, 본 발명의 권리범위는 이에 의하여 제한되는 것으로 이해되어서는 아니 될 것이다.

여기서 사용되는 모든 용어들은 다르게 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 것으로 해석되어야 하며, 본 발명에서 명백하게 정의하지 않는 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미를 지니는 것으로 해석될 수 없다.

본 발명에 있어서, ‘예방’이란 용어는 본 발명의 약학조성물의 투여로 인해 면역질환 또는 염증질환, 예컨대 피부염의 발병을 억제 또는 지연시키거나 완화시키는 모든 과정을 나타내며, 질병의 발생을 차단하는 좁은 의미로 해석되어서는 안된다.

본 발명에 있어서, ‘개선’이란 용어는 본 발명의 약학조성물의 투여로 인해 면역질환 또는 염증질환, 예컨대 피부염의 증세가 어느 정도 개선되는 모든 과정을 나타내며, 해당 질환의 증상이 어느 정도 나아지는 좁은 의미로 해석되어서는 안된다.

본 발명에 있어서, ‘치료’란 용어는 본 발명의 약학조성물의 투여로 인해 면역질환이나 염증질환, 예컨대 피부염의 증세가 호전되거나 나아지는 모든 과정을 나태내며, 해당 질환의 증상이 완전히 사라지는 좁은 의미로 해석되어서는 안된다.

본 발명은 피부염 예방, 개선, 완화 또는 치료에 있어서 임상적 적용이 가능한 고농도, 고순도, 입자크기가 균일한 멸균된 엑소좀을 대량생산하는 기술과 상기 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 엑소좀을 저가로 대량으로 제공할 수 있는 임상 및 상업적으로 뛰어난 획기적인 기술을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어, “엑소좀(exosome)”은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 소낭체를 의미한다.

피부염의 연구에 따르면, 위에서 언급한 바와 같이, 줄기세포 또는 줄기세포 유래 엑소좀 효능에 대한 연구가 보고되어 있으나, 중간엽 줄기세포 같은 경우 임상 3상에서 효능 입증에 실패하여 줄기세포의 효능에 대해 부정적인 상황이며, 엑소좀의 특성은 유래 세포에 따라 결정되기에 줄기세포의 임상결과를 통해 줄기세포가 분비하는 엑소좀 또한 피부염에 대한 효능이 제한적일 것으로 판단되고 있다.

본 발명은 기존에 밝혀진 엑소좀이 아닌 특이성 전구세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 하는 조성물로서 피부외용제 또는 주사제와 같은 약학조성물로 적용될 때, 피부염에서 발견되는 혈관주위의 침윤된 면역세포를 억제 및 제거하여 조직의 미세환경과 혈관을 복구하고, 호중과 림프구의 평형을 회복시키며, 세포의 염증을 완화하여 근본적으로 피부염을 억제 및 완화시킬 수 있으며 피부염의 예방, 개선, 완화, 또는 치료에 뛰어난 효과를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 치료용 엑소좀 조성물은 종래에 알려진 모든 피부염 접근방법과 전혀 다른 새로운 기전으로 피부염을 개선, 완화, 치료하여 이러한 효능은 종래기술로는 전혀 도달할 수 없는 기전과 효과임을 명백히 밝혀둔다.

이하 본 발명을 실시예를 통해 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다.

(1) 세포의 배양

인간 피부세포주인 HaCaT세포를 10% 우태아혈청(Fetal bovine serum, ThermoFisher Scientific에서 구매), 2mM L-글루타민(ThermoFisher Scientific에서 구매) 및 1% 항생제-항진균제(Antibiotics-antimyotics, ThermoFisher Scientific에서 구매)가 함유된 DMEM(ThermoFisher Scientific에서 구매)배지에 5% CO2, 37℃조건에서 계대배양하였다.

본 발명에 속하는 엑소좀을 획득하기 위한 전구세포의 배양방법은 아래와 같다. 전구세포를 20% 우태아혈청(FBS)(Thermo Fisher Scientific에서 구매)을 함유한 Advanced DMEM배지로 재부유시켜 세포배양접시에 접종한 후 5% CO2, 37℃ 조건 하에서 배양하였다. 75% 이상의 세포가 부착된 후, 1배 인산완충생리식염수(1xPBS, 칼슘과 마그네슘이 없음, Corning에서 구매)로 충분히 세척후, 10% 녹아웃 혈청 대체물(Knockout serum replacement), 2mM L-글루타민의 디펩타이드 형태(L-alanyl-L-glutamine dipeptide)를 함유한 DMEM/F-12배지로 교체하여 그 배양액을 회수하였다.

(2) 접선흐름여과를 이용한 엑소좀 분리

상기 배양액에 함유된 엑소좀은 농도가 높고, 입자크기 분포가 균일하기에 접선흐름여과 시스템으로 엑소좀을 분리하기 용이하고 화학물질 또는 소분자 물질 등 첨가물을 추가하지 않았다. 우선 배양액을 20ml/min의 속도로 펌핑하여 필터(Sartopore 2 XLG SartoScale 25(0.8μm, 0.2μm) 사용)로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대입자 등 불순물을 제거하고 멸균까지 진행하였다. 여과멸균된 배양액은 즉시 또는 -20℃ 냉동고에 동결보관하였다가 해동시킨 후, 접선흐름여과장치(TFF: Tangential Flow Filtration)를 이용하여 엑소좀을 분리하였다.

상기 여과멸균된 배양액에서 엑소좀을 분리하기 위하여 접선흐름여과방법으로 농축 및 정용여과(diafiltration)를 진행하였다. 접선흐름여과방법을 위한 필터로는 중공사 필터(Repligen에서 구매)를 사용하였다. 중공사 필터는 엑소좀의 성질과 여과 목적에 따라 다양한 재질과 분자량 한계치(Molecular weight cutoff)을 선택할 수 있다. 선택된 분자량 한계치에 의해 선별적으로 엑소좀을 분리하였고 선택된 분자량 한계치보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 모두 제거하였다. 엑소좀을 분리하기 위한 중공 섬유로는 mPES(Modified Polyethersulfone), PS(Polysulfone), PES(Polyethersulfone) 또는 ME(Mixed Cellulose Ester)재질을 사용하였고, 분자량 한계치는 10,000 Da, 50,000Da 또는 75,000Da를 사용하였다. 접선흐름 여과방법을 이용한 농축 및 정용여과(diafiltration)과정은 단속 또는 연속적으로 수행하였고 농축은 시작 부피에 대하여 10배 내지 25배 농축하고, 정용여과는 농축한 부피에 대하여 적어도 10배, 바람직하게는 12배 내지 15배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 수행하였다. 완충용액은 1배 인산완충생리식염수(1xPBS, 칼슘과 마그네슘이 없음, Corning에서 구매)를 사용하였고 어떠한 화학물질 또는 저분자 물질도 첨가하지 않았다. 접선흐름여과방법으로 농축과 정용여과를 거친 엑소좀은 안정화 버퍼를 10배 내지 25배 추가하여 엑소좀의 부피가 시작 부피와 같게 되도록 희석하였다.

본 발명의 방법으로 분리한 엑소좀을 최종적으로 필터(Sartopore 2 XLG SartoScale 25(0.8μm, 0.2μm)로 여과 멸균하고 바로 이어지는 일회용 조립 밀폐용기의 포트(Thermo Fisher Scientific에서 구매)를 통해 완전한 무균상태가 보장된 밀폐용기에 수송하였다.

(3) 분리된 엑소좀의 특성 분석

본 발명의 엑소좀의 크기분포와 모양을 확인하기 위하여 나노입자 추적 분석기(NanoSight NS300 제품, Malvern Panalytical에서 구매)와 전자현미경으로 분석하였다. 나노입자 추적 분석기로 크기분포를 분석한 결과는 도 2와 같고, 음성염색(negative staining)법으로 염색하여 분석한 전자현미경 사진결과는 도 3과 같다.

본 발명의 엑소좀의 크기분포를 볼 때 평균 약 90-100nm에 집중적으로 분포되어 있기에 상기 엑소좀을 피부염 치료제로 사용할 경우 피부 침투력이 뛰어나고 피부가 상기 엑소좀에 대한 흡수능력이 월등히 높다.

(4) 사람 피부조직 생검을 통한 엑소좀 효과 분석

본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 수득된 엑소좀을 함유하는 조성물을 정상인의 피부에 염증을 유발하여 1시간 도포한 후 정상피부, 염증성 피부 및 염증성 피부에 상기 엑소좀을 처리한 피부조직에 대한 생검을 실시한 결과가 도 4에 나타나 있으며, 도 4의 생검 결과를 통해 염증성 피부에 엑소좀을 1시간 처리한 후의 피부 조직은 염증성 피부 조직에 비해 혈관주위 면역세포 침윤현상이 회복되고 침윤된 면역세포가 제거되며 혈관이 복구되었음을 알 수 있다.

따라서, 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 수득된 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 피부외용제 또는 화장료 조성물은 상기와 같은 임상시험을 통해 확인되는 바와 같이 대부분의 피부염에서 발생하는 혈관주위 면역세포 침윤현상에 대해 예방, 개선, 완화 또는 치료효과를 나타낼 수 있다.

(5) 랫드를 이용한 엑소좀 효과 분석

6주령의 암수 랫드 각각 20마리를 아래와 같이 2군으로 분류하였다.

- 대조군: 정상 대조군

- 실험군: 경배부 피모를 제모기(Max 45, MOSER에서 구매)를 이용하여 약 6cmx6cm로 제모하였고 5cmx5cm 넓이를 경피투여 부위로 결정하였다. 투여부위에 일회용 주사기를 이용하여 엑소좀을 도포하고, 대조군은 대조물질을 도포한 후, 엘리자베스 칼라(넥 칼라)를 경부에 장착하고 엑소좀 도포 6시간 경과 후에 이를 제거하였다. 본 발명의 엑소좀과 대조물질은 300ul씩 1일 1회 13주간 투여하였다.

본 발명의 엑소좀과 대조물질을 처리한 랫드에 대하여 부검 전 약 18시간 이상 절식시킨 후, 부검일에 흡입마취제인 아이소플루레인(isoflurane)으로 마취하여 배대동맥으로부터 혈액을 채취하였다. 혈액학적 검사는 채취한 혈액 약 1ml를 EDTA 함유 튜브에 넣은 후, 혈구분석기(SYSMEX에서 구매)로 백혈구 백분율을 측정하였다. 백혈구 백분율을 측정 결과인 도 5를 살펴보면, 수컷과 암컷 랫드 모두 대조군에 비하여 실험군에서 림프구 대비 호중구의 비율이 상당히 낮음을 알 수 있다.

상기와 같은 결과들로부터 본 발명의 조성물은 피부염의 원인이 되는 호중구를 감소시키고 림프구를 증가시켜 호중와 림프구의 비율을 감소시킨다는 것을 알 수 있다. 본 발명의 엑소좀을 함유하는 약학조성물은 염증 관련 면역세포의 활성 내지는 관여를 저해하기에 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료용 약학조성물, 피부외용제 및 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

(6) 본 발명의 엑소좀의 피부세포 흡수 시험

본 발명의 엑소좀을 추적하기 위하여 DiD cell labeling solution(ThermoFisher Scientific에서 구매)을 처리하여 상기 엑소좀을 형광염색하였다.

HaCaT세포를 10% 우태아혈청, 2mM L-글루타민을 포함한 DMEM배지에 현탁시키고 이를 배양접시에 30~40%의 밀집도를 갖도록 분주하였다. 다음날 DiD형광염색한 엑소좀을 2~4시간처리하여 배양하였다. 배양이 끝난 후 4% PFA로 고정시킨 후 형광염색제인 비스벤지마이드 (Bisbenzimide, Hoechst 33342, ThermoFisher Scientific에서 구매)로 처리하여 형광현미경으로 분석하였다.

도 6은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀을 형광염색하여 피부세포에 처리하였을 때 피부세포가 엑소좀을 흡수한 결과를 나타낸 것으로서, 도 6에서 빨간색 점은 피부세포가 본 발명의 엑소좀을 효과적으로 흡수하였다는 것을 나타내고 파란색은 피부세포의 세포핵을 나타낸다.

(7) 본 발명의 엑소좀의 항염증 효과 시험

HaCaT세포를 10% 우태아혈청, 2mM L-글루타민을 포함한 DMEM배지에 현탁시키고 이를 배양접시에 30~40%의 밀집도를 갖도록 분주하였다. 다음날 LPS가 포함된 새로운 배지로 염증반응을 유발한 후 본 발명의 엑소좀을 24시간동안 처리하여 배양하였다. 배양이 끝난 후 세포파쇄물과 배양상층액을 취하여 그 속에 존재하는 엑소좀의 변화를 나노입자 추적 분석기로 측정하였고, 또한 그 속에 존재하는 iNOS(Abcam에서 구매), IL-6, TNFα, TSLP(ThermoFisher Scientific에서 구매), TARC(Sigma Aldrich에서 구매)의 변화량을 ELISA kit로 측정하였다.

도7은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀에 의한 염증성 피부세포가 분비하는 엑소좀의 분비변화를 나타낸 것, 도8은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀에 의한 iNOS 형성 감소 효과를 확인한 결과를 나타낸 것, 도9a 내지 9d는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀에 의한 (a) IL-6, (b) TNFα, (c) TSLP, (d) TARC의 변화량을 ELISA 키트로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 7 내지 9에서 x축의 control은 정상 피부세포 음성대조군, LPS는 LPS로 피부세포 염증반응을 유발한 양성 대조군, LPS+exosome은 LPS로 피부세포 염증반응을 유발한 후 엑소좀을 처리한 실험군을 나타내고, y축은 각 물질의 농도를 나타낸다.

도 7에 도시된 바와 같이, 본 발명의 엑소좀은 인간 피부세포인 HaCaT세포에서 LPS에 의해 유도되는 엑소좀의 분비증가를 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.

도 8에 도시된 바와 같이, 본 발명의 엑소좀은 인간 피부세포인 HaCaT세포에서 LPS에 의해 유도되는 염증반응인 iNOS생성을 효과적으로 감소시킨다는 것을 확인하였다.

또한, 도 9와 같이 본 발명의 엑소좀은 LPS에 의해 유도되는 IL-6, TNFα, TSLP, TARC 사이토카인의 생성을 감소시키다는 것을 확인하였다.

이러한 결과는 본 발명의 엑소좀이 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료를 위한 효과적인 활성을 가지고 염증반응을 감소시키기에, 본 발명의 엑소좀은 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료를 위한 임상적 약학조성물의 유효성분으로 활용될 수 있는 것임을 보여주고 있다.

(8) 본 발명의 엑소좀의 인체 피부 투과능력 시험

본 발명의 엑소좀을 형광염색하기 위하여 Vybrant DiD cell-labeling solution(ThermoFisher Sicentific에서 구매)를 사용하였다. 1mM DiD 5ul를 1ml의 본 발명의 엑소좀과 혼합하여 빛을 차단한 상태로 37℃에서 20분간 반응시켰다. 9ml의 DMEM((ThermoFisher Sicentific에서 구매)배지와 5ml의 Total exosome isolation reagent(ThermoFisher Sicentific에서 구매)를 혼합하여 충분히 반응시킨 후 침전시킨 후 1ml의 1배 인산완충생리식염수(Corning에서 구매)로 재현탁하여 사용하였다.

경피 흡수를 실험할 수 있는 Franz diffusion cell(비엔씨테크에서 구매)에 상기 DiD-엑소좀을 고정한 인체 피부조직(고마바이오텍에서 구매)의 바깥면에 도포하였고 내부는 1xPBS로 채워주었다. 도포된 DiD-엑소좀의 건조를 막기 위하여 호일로 밀봉하여 24시간동안 반응시켜 DiD-엑소좀이 피부에 흡수되게 하였다. 반응이 종료된 후, 인체 피부조직 바깥면의 액체를 와이퍼(Kimwipes)로 흡수한 후 1배 인산완충생리식염수로 충분히 세척하였고, 인체 피부조직의 수분을 완전히 제거한 후 액체질소탱크에 10분간 급속냉동하였다. 급속냉동된 인체 피부조직을 매스로 각질층을 제거하고 각질층이 제거된 인체 피부조직을 형광현미경으로 관찰하였으며, 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀이 인체 피부에 흡수되는 정도를 확인한 결과가 도 10에 나타나 있다. 도 10의 결과를 통해, 본 발명의 엑소좀은 인체 피부장벽을 효과적으로 통과하여 표피와 진피까지 깊숙이 전달될 수 있다는 것을 보여주고 있다. 따라서, 상기 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 또는 화장료 조성물은 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료 등에 있어서 효과적으로 작용할 것으로 기대된다.

(9) 사람 피부에서 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 효과 시험

본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 수득된 엑소좀을 함유하는 조성물을 중증 아토피 환자 5인의 환부(목, 팔, 다리 등)에 4~8주동안 1일 2회 도포하였으며, 도 11a 및 11b에 본 발명의 조성물 도포 전후의 환부 상태가 나타나 있다.

도 11a 및 11b를 통해, 본 발명의 일 구체예에 다른 엑소좀을 포함하는 조성물을 사람의 피부에 도포한 경우 환자들의 극심한 가려움증이 현저히 완화되었고, 피부염으로 인한 피부병변이 현저히 개선되었음을 알 수 있다.

Claims

전구세포 유래 엑소좀을 함유하며, 상기 엑소좀은 표면마커 중에서 CD9, CD63, CD81 외에도 CD44, CD53 및 CD98을 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 전구세포는 표면마커 중에서 CD24, CD117, SSEA-1에 대하여 음성이고 CD31, CD45RA, CD105, CD146, TRA-1-60에 대하여 양성인 전구세포로부터 유래한 것을 특징으로 하는 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 하기의 단계들을 수행하여 수득되는 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료용 약학적 조성물
a. 전구세포 배양액을 필터에 통과시켜 세포 잔해물, 노폐물, 거대 입자 중 적어도 어느 하나를 여과하는 단계
b. 상기 여과된 배양액을 멸균 필터로 멸균하는 단계
c. 상기 멸균된 배양액을 접선흐름여과방법을 이용하여 농축과 정용여과과정을 통해 엑소좀을 분리하는 단계
d. 상기 분리된 엑소좀에 안정화 버퍼를 추가하여 다시 시작 부피가 되도록 희석하는 단계
e. 상기 희석된 엑소좀을 액체 교환 시스템으로 멸균 필터에 통과시켜 멸균한 후 밀봉된 저장용기에 저장하는 단계
제4항에 있어서,
접선흐름여과를 위한 분자량 한계치를 얻기 위하여 10,000Da, 50,000Da 또는 75,000Da의 중공사 필터를 사용하는 것을 특징으로 하는 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료용 약학적 조성물
제4항에 있어서,
상기 c단계의 농축과 정용여과는 접선흐름여과를 단속 또는 연속적으로 진행하고, 농축은 시작 부피에 대하여 10배 내지 25배 농축하고, 정용여과 과정은 농축된 부피에 대하여 적어도 10배의 부피를 갖는 버퍼로 여과하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료용 약학적 조성물.
제4항에 있어서,
상기 엑소좀 희석은 농축 및 정용여과된 부피에 대하여 10배 내지 25배의 안정화 버퍼를 첨가하여 전체 부피가 시작 부피와 같도록 희석하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료용 약학적 조성물.
전구세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하며, 상기 엑소좀은 표면마커 중에서 CD9, CD63, CD81 외에도 CD44, CD53 및 CD98을 함유하고 있는 것을 특징으로 하는, 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료용 피부외용제.
전구세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하며, 상기 엑소좀은 표면마커 중에서 CD9, CD63, CD81 외에도 CD44, CD53 및 CD98을 함유하고 있는 것을 특징으로 하는, 피부염의 예방, 개선, 완화용 화장료 조성물.