CN113274408A - 一种磁性外泌体在制备创面修复或创面愈合产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种磁性外泌体在制备创面修复或创面愈合产品中的应用，所述磁性外泌体是利用磁性Fe₃O₄纳米颗粒，或磁性Fe₃O₄纳米颗粒联合静磁场，刺激MSCs产生的磁性外泌体。相比未经处理的间充质干细胞的外泌体，本发明的磁性外泌体具有显著增强人皮肤成纤维细胞增殖、迁移和成血管的能力。本发明还提供了所述间充质干细胞外泌体的制备方法。本发明制备的磁性外泌体可用于制备促进创面修复的制剂、治疗糖尿病创面愈合的药物，在组织再生和难治性或巨大创面修复或愈合治疗具有很大的应用潜力。

Description

一种磁性外泌体在制备创面修复或创面愈合产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种磁性外泌体在制备创面修复或创面愈合产品中的应用。

背景技术

在许多病理情况，如糖尿病或严重烧伤，在正常的伤口愈合过程未能完全恢复皮肤功能，从而导致潜在的严重并发症或造成的感染，因此在皮肤组织损伤后完成创面的愈合是至关重要的。正常的皮肤组织分三层表皮层、真皮层和皮下组织层，其损伤修复是一个动态和复杂的过程，主要包括：出血、凝固、急性炎症、细胞迁移増殖和分化、血管生成、细胞外基质的合成和重塑。这些复杂的过程基本可以概括为3个的阶段：①炎症期；②组织细胞的增殖期；③组织结构的重塑。

间充质干细胞(MSC)因其具有来源组织广泛、易于体外扩増和移植后的低排斥反应等优点被认为在治疗皮肤组织再生中具有巨大的临床应用前景。MSC旁分泌在损伤模型中可发挥促増殖、抗调亡和抑制炎症等重要作用，而作为MSC旁分泌的重要成分，外泌体(exosomes)与MSC细胞相比，具有许多优势：①外泌体可直接与靴细胞发生融合发挥生物学效应，作用效率高：②外泌体在-80℃长期稳定保存，内含有效成分受外泌体脂质膜保护，不易被破坏，且便于运输：③使用时间易于掌握，使用浓度、剂量及途径易于控制；④克服了MSC在体内存活率低及长期应用突变致瘤的潜在隐患：⑤避免了直接应用MSC造成的血管栓塞等并发症。因此，MSC来源的外泌体在组织损伤修复中的作用及机制研究就显得特别重要，且具有潜在应用价值。

磁性Fe₃O₄纳米颗粒具有超顺磁性和高饱和磁化强度，是一种磁性强、制备相对简单、生物相容性较好的磁性材料。具备超顺磁性的纳米颗粒，在外加静磁场存在时，则可以展现出更好的磁性效应。

目前虽已证明外泌体治疗创面从安全性和疗效方面都有不错的效果，但其安全性和疗效仍不能完全保证。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种磁性外泌体在制备创面修复或创面愈合产品中的应用。

本发明的第二目的在于提供一种磁性外泌体在制备人皮肤成纤维细胞增殖、迁移和促成血管形成产品中的应用。

本发明的第三目的在于提供一种用于治疗糖尿病创面愈合的药物。

本发明的还一目的在于提供一种磁性外泌体的制备方法。

所述磁性外泌体利用磁性Fe₃O₄纳米颗粒，或/和联合静磁场刺激MSCs产生的磁性外泌体。

本发明通过利用磁性Fe₃O₄纳米颗粒，或磁性Fe₃O₄纳米颗粒联合静磁场，刺激MSCs产生的磁性外泌体，具有更好的血管生成和纤维形成的作用，以此进一步促进创面愈合、创面修复的机制，同时改进外泌体纯化和鉴定的方法，最终能够开发出针对急性或慢性创面的高效外泌体治疗产品。

首先，本发明提供了一种磁性外泌体在制备创面修复或创面愈合产品中的应用，所述磁性外泌体是利用磁性Fe₃O₄纳米颗粒，或磁性Fe₃O₄纳米颗粒联合静磁场，刺激MSCs产生的磁性外泌体。

优选的，所述创面修复或创面愈合包括组织再生、难治性或巨大创面修复或愈合。

进一步地，本发明提供了一种磁性外泌体在制备人皮肤成纤维细胞增殖、迁移和促成血管形成相关产品中应用，所述磁性外泌体是利用磁性Fe₃O₄纳米颗粒，或磁性Fe₃O₄纳米颗粒联合静磁场，刺激MSCs产生的磁性外泌体。

优选的，所述磁性Fe₃O₄纳米颗粒的刺激浓度为25-400μg/ml，优选50μg/ml。

优选的，所述静磁场的刺激强度为50-150mT，优选100mT。

进一步地，本发明提供了一种用于急性或慢性创面修复的高效外泌体治疗产品，如用于治疗糖尿病创面愈合的药物，所述药物包括磁性外泌体，所述磁性外泌体的浓度为10¹⁰-10¹¹颗粒/ml。

在本发明外泌体的上述实施方案中，所述间充质干细胞为人间充质干细胞。

本发明另一个方面还提供上述外泌体的制备方法，所述磁性外泌体是利用磁性Fe₃O₄纳米颗粒，或磁性Fe₃O₄纳米颗粒联合静磁场刺激MSCs产生的磁性外泌体，具体包括如下步骤：

1)培养间充质干细胞；

2)用所述磁性纳米颗粒，或磁性Fe₃O₄纳米颗粒联合静磁场处理上述间充质干细胞；

3)间充质干细胞外泌体的提取、纯化。

在本发明上述方法的一些实施方案中，所述间充质干细胞为人间充质干细胞。

有益效果

本发明提供了一种磁性外泌体在制备创面修复或创面愈合产品中的应用，本发明还提供了磁性外泌体，相比未经处理的间充质干细胞的外泌体，本发明的磁性外泌体具有显著增强人皮肤成纤维细胞增殖、迁移和成血管的能力。本发明还提供了所述间充质干细胞外泌体的制备方法。本发明制备的磁性外泌体可用于制备促进创面修复的制剂、治疗糖尿病创面愈合的药物，在组织再生和难治性或巨大创面修复或愈合治疗具有很大的应用潜力。

附图说明

图1A所示，为与空白(Control)相比，不同浓度(25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml)的超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒处理1-5天对人充质干细胞(MSC)增殖的影响。

图1B所示为经50μg/ml超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒处理的间充质干细胞，进一步用不同强度的静磁场(Control：0mT、50mT、100mT、200mT SMF)处理3天后，对间充质干细胞凋亡的影响。

图2A所示为透射电镜下观察到的三种外泌体MSC-Exo、MSC-Fe₃O₄-Exo和MSC-Fe₃O₄-SMF-Exo的形态。

图2B所示为western blotting检测的三种外泌体BMSC-Exo、BMSC-Fe₃O₄-Exo和BMSC-Fe₃O₄-SMF-Exo的表面特异性蛋白CD9、CD63、CD81、TSG-101以及内质网来源蛋白calnexin。

图3A-B所示transwell显示MSC-Fe₃O₄-Exo组和MSC-Fe₃O₄-SMF-Exo组的迁移率也显著高于对照组，其差异具有统计学意义(P<0.05)，而MSC-Fe₃O₄-SMF-Exo组的迁移率也显高于MSC-Fe₃O₄-Exo组(P<0.05)。

图3C所示BMSC-Exo组、MSC-Fe₃O₄-Exo组和MSC-Fe₃O₄-SMF-Exo组bFGF和PDGFRα均依次升高。

图4A所示为相对于对照组，三组外泌体注射治疗组大鼠的伤口愈合情况。

图4B为伤口闭合率差异情况。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明将人MSC(购自American type culture collection，ATCC)用含10％FBS、1％青链霉素的α-MEM完全培养基按1:3比例传代培养，得到第一代间充质干细胞，继续传代培养至第3代间充质干细胞。本申请实施例选用第3代的间充质干细胞开展实验。本发明文中的MSC和MSCs都指外泌体。

以下实施例中数据采用SPSS17.0软件系统进行处理，所得数据均值±标准差表示，两组间比较采用t检验，当p<0.05，差异有统计学意义。

bFGF和PDGFRα是成纤维相关基因。

国际细胞外囊泡学会发布"证明样品中存在外泌体的最低实验要求"指导性文件中提出，采用蛋白标志物鉴定外泌体时，应同时检测到所分离样品中至少存在1个跨膜蛋白(如四次跨膜蛋白CD9、CD63，黏附分子等)、1个细胞内源性蛋白，如肿瘤易感基因101(tumorsusceptibility gene 101，TSGl01)、膜联蛋白A(annexin A，ANXA)、Rab家族蛋白(Ras-related protein Rab，Rab)，而不存在内质网来源蛋白，如钙联接蛋白(calnexin,CANX)、高尔基体基质蛋白(Golgi matrixprotein，GM130)或核蛋白)。

实施例1：磁性外泌体的制备1

本实施例磁性外泌体利用磁性Fe₃O₄纳米颗粒，和磁性Fe₃O₄纳米颗粒联合静磁场刺激MSCs产生的磁性外泌体。

(1)将10mg灭菌后的Fe₃O₄溶50ml完全培养基α-MEM中，接着等比例稀释，分别配置成浓度为400，200，100，50，25μg/ml含有Fe₃O₄的培养基。细胞传代过程中更换为不同梯度的培养基。根据细胞生长形态和增殖实验确定最佳Fe₃O₄浓度。

(2)将最佳Fe₃O₄浓度培养下的细胞置于不同强度的静磁场(static magneticfield,SMF)刺激(钕铁硼永磁材料，北京鑫昌利功能材料有限责任公司)，磁场强度依次为50，100，150mT。根据细胞形态和凋亡实验确定最佳静磁场强度。

实施例2：细胞增殖和凋亡实验

(1)细胞增殖实验：取P3代的MSCs，消化离心后，重悬细胞、计数，同时按照实施例1制备相应浓度梯度的Fe₃O₄-MSC。按照5×10³/孔的密度，将细胞样品接种96孔板，每孔加入100μL的含10％FBS的α-MEM培养基，置于孵箱中培养。24小时后，弃除培养基，每孔加入90μL新鲜的培养基，10μL的CCK-8，避光37℃孵育1h。连续测量5天，每天3个复孔。450nm波长下测量每孔的OD值，绘制增殖曲线。

(2)细胞凋亡实验：按照实施例1步骤制备相应磁场强度梯度的Fe₃O₄-SMF-MSC，3天后直接收集到10ml的离心管中，每样本细胞数为1-5×10⁶/mL，PBS洗涤数次后离心，用100ul的FITC-Annexin V和PI标记溶液重悬细胞，避光孵育15min后洗涤细胞，加入荧光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动，上机测试。

(3)图1A所示，为与空白(Control)相比，不同浓度(25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml)的超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒处理1-5天对人充质干细胞(MSC)增殖的影响。根据图1A可知，50μg/ml的超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒细胞生长形态和增殖效果最好，25-100ug/ml的超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒细胞生长形态和增殖效果要好于没有超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒处理的空白对照。

图1B所示为经50μg/ml超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒处理的间充质干细胞，进一步用不同强度的静磁场(Control：0mT、50mT、100mT、200mT SMF)处理3天后，对间充质干细胞凋亡的影响。流式细胞凋亡结果显示100mT静磁场强度下，MSC细胞凋亡最少。刺激强度为50-150mT时，对MSC细胞凋亡都有明显作用。

实施例3透射电镜和免疫印迹

(1)电镜观察外泌体的形态用最佳浓度Fe₃O₄(50μg/ml)刺激MSC分泌的外泌体记为MSC-Fe₃O₄-Exo；最佳浓度Fe₃O₄(50μg/ml)联合最佳磁场强度(100mT)刺激MSC分泌的外泌体记为MSC-Fe₃O₄-SMF-Exo。取超速离心法分离纯化外泌体10μl，加入等体积平衡盐PBS溶液稀释后滴加于2mm的载样铜网上，于室温静置3分钟后用滤纸将多余液体轻轻吸去，用3％(w/v)磷钨酸钠溶液(PH6.8)30μl室温负染5分钟，用双蒸水轻轻洗一遍后室温晾干，于透射电镜观察并照相。随机选取20个外泌体测量其直径。

(2)免疫印迹(western blotting)法检测外泌体表面特异性蛋白：BCA蛋白定量法测定外泌体悬液的蛋白浓度；配制5％浓缩胶及12％分离胶，加入待测样本电泳；取出分离胶转膜至PVDF膜；封闭完成后，一抗CD9(1:1000)，CD63(1:1000)，CD81(1:1000)，TSG-101(1:1000)，calnexin(1:1000)以及β-actin(1:1000)孵育过夜，二抗HRP(1:10000)孵育1h后将PVDF膜显影。

(3)实验结果：

图2A所示为透射电镜下观察到的三种外泌体MSC-Exo、MSC-Fe₃O₄-Exo和MSC-Fe₃O₄-SMF-Exo的形态，图中外泌体呈圆形或椭圆形结构，直径约50-150nm，有完整的包膜结构(白箭头所示为外泌体)，内含低密度物质；外泌体直径主要集中在80-120nm，极少数大于150nm。按照外泌体的数量由多到少依次为MSC-Fe₃O₄-SMF-Exo、MSC-Fe₃O₄-Exo、MSC-Exo。

图2B所示为western blotting检测的三种外泌体BMSC-Exo、BMSC-Fe₃O₄-Exo和BMSC-Fe₃O₄-SMF-Exo的表面特异性蛋白CD9、CD63、CD81、TSG-101以及内质网来源蛋白calnexin。结果显示三种外泌体均可表达表面特异性蛋白CD9、CD63、CD81、TSG-101，但是不能表达内质网来源蛋白calnexin，而MSC细胞上清可表达calnexin。由此可鉴定这三种外泌体。

实施例4细胞迁移和免疫印迹

(1)细胞transwell迁移实验：取汇合率达到85％的人皮肤成纤维细胞(HSF)(中国医学科学院国家细胞资源库，北京，中国)，弃去培养基，加入无血清DMEM培养基(GibcoBRL,Grand Island,USA)继续培养12小时后消化、离心，重悬，计数；将总量为100μl 5×10⁵/孔的细胞悬液接种于transwell培养板的上室内。按照分组分别各孔加入20μl PBS、20μl MSC-Exo、20μl MSC-Fe₃O₄-Exo和20μl MSC-Fe₃O₄-SMF-Exo。在培养板的下室各加入600μl的培养液。将培养板置于37℃、5％CO₂条件下培养。24小时后弃除培养基，PBS洗涤3次。多聚甲醛固定30min，将小室适当风干。0.1％结晶紫染色20min，用棉签轻轻擦掉膜上层未迁移细胞，PBS洗3遍。倒置荧光显微镜下拍照，每孔随机5个视野，统计、比较各组细胞数量。

(2)Western blot法检测外泌体对成纤维相关基因的表达水平：以5×10⁵/孔密度接种HSFs于6孔板上；待培养至细胞密度70％时，分别加入100μl PBS、100μl MSC-Exo、100μl MSC-Fe₃O₄-Exo和100μl MSC-Fe₃O₄-SMF-Exo，培养48h后收取细胞；按实施例3所述Western blotting步骤，一抗孵育bFGF(1:1000)、PDGFRα(1:1000)、GAPDH(1:10000)抗体，检测不同组HSFs中bFGF和PDGFRα表达水平。

(3)实验结果

图3A-B所示transwell显示MSC-Fe₃O₄-Exo组和MSC-Fe₃O₄-SMF-Exo组的迁移率也显著高于对照组，其差异具有统计学意义(P<0.05)，而MSC-Fe₃O₄-SMF-Exo组的迁移率也显高于MSC-Fe₃O₄-Exo组(P<0.05)。

图3C所示BMSC-Exo组、MSC-Fe₃O₄-Exo组和MSC-Fe₃O₄-SMF-Exo组bFGF和PDGFRα均依次升高。表明磁性外泌体(MSC-Fe₃O₄-Exo和MSC-Fe₃O₄-SMF-Exo)促进细胞成纤维分化的效果较普通外泌体强。成纤维分化和形成贯穿整个创面修复过程中。炎症期刺激成纤维细胞增殖分化，合成胶原蛋白；增殖期上皮组织纤维化形成，填补缺损组织；塑型期胶原纤维排列，使新生的组织力量增加。

本发明最佳实施例如下：

1.50μg/ml磁性纳米颗粒或联合100mT静磁场刺激MSC产生的外泌体作为一种新型的磁性外泌体。

2.磁性外泌体较MSC分泌的外泌体具有更好的促进创面修复的能力。

3.磁性纳米颗粒联合静磁场刺激MSC产生的磁性外泌体MSC-Fe₃O₄-SMF-Exo较磁性纳米颗粒刺激MSC产生的磁性外泌体MSC-Fe₃O₄-Exo具有更好的纤维形成和创面修复能力。

实施例5动物实验方法

1.大鼠皮肤缺损模型的建立及外泌体的注射

(1)皮肤缺损模型的建立：①腹腔注射适量4％水合氯醛(1mL/100g)麻醉，将大鼠背部毛发使用电推工具剪短后，再涂抹6％硫酸钠溶液用来除掉毛发，毛发溶解后迅速使用清水冲洗；②消毒大鼠背部皮肤，在大鼠背部切除2.0×2.0cm全层皮肤，可见深筋膜存在。采集注射外泌体前(day0)创面照片。

(2)外泌体的注射：每只大鼠的背部全层皮缺损创面随机分为四组，分别局部注射MSC-Exos(2×10¹⁰particles，200μL)、MSC-Fe₃O₄-Exos(1×10¹¹particles，200μL)、MSC-Fe₃O₄-SMF-Exos(1×10¹¹particles，200μL)和等体积的PBS(对照组)，将创面覆盖一层油纱布后加盖无菌纱布，常规手术操作将边缘缝合并包扎。

2.皮肤损伤愈合指标的检测

(1)创面愈合观察：术后将动物分笼饲养，每天观察大鼠的进食、创面变化等情况。创面闭合率测算：将直角尺放在创面旁作对比，采集移植后第7天(day7)和14天(day14)创面照片，用Image-Pro plus图像分析系统计算创面愈合面积百分率。创面闭合率(woundclosure rate，％)＝(A₀-A_t)/A₀×100％.其中A₀为初始面积，A_t为某时间点创面面积。

(2)实验结论

图4A所示为相对于对照组(局部注射等体积PBS)，三组外泌体注射治疗组大鼠的伤口愈合速度加快，且磁性外泌体(MSC-Fe₃O₄-SMF-Exos和MSC-Fe₃O₄-Exos)，其促皮肤伤口愈合的作用明显强于MSC-Exos组，而联合静磁场的MSC-Fe₃O₄-SMF-Exos促进创面愈合的效果也优于仅利用磁性纳米颗粒Fe₃O₄诱导的MSC-Fe₃O₄-Exos组。术后第7和14天，MSC-Fe₃O₄-SMF-Exos组和MSC-Fe₃O₄-Exos组伤口闭合率分别为67.14±9.87％vs.49.23±4.37％和96.87±3.62％vs.90.09±5.97％，且显著高于相同时间点PBS组和MSC-Exos组的闭合程度，差异均具有统计学意义(P<0.05)，如图4B所示。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种磁性外泌体在制备创面修复或创面愈合产品中的应用，所述磁性外泌体是利用磁性Fe₃O₄纳米颗粒，或磁性Fe₃O₄纳米颗粒联合静磁场，刺激MSCs产生的磁性外泌体。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述创面修复或创面愈合包括组织再生、难治性或巨大创面修复或愈合。

3.一种磁性外泌体在制备人皮肤成纤维细胞增殖、迁移和促成血管形成相关产品中的应用，所述磁性外泌体是利用磁性Fe₃O₄纳米颗粒，或磁性Fe₃O₄纳米颗粒联合静磁场，刺激MSCs产生的磁性外泌体。

4.如权利要求1～3任意一项所述的应用，其特征在于，所述磁性Fe₃O₄纳米颗粒的刺激浓度为25-400μg/ml。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述磁性Fe₃O₄纳米颗粒的刺激浓度为50μg/ml。

6.如权利要求1～3任意一项所述的应用，其特征在于，所述静磁场的刺激强度为50-150mT。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述静磁场的刺激强度为100mT。

8.如权利要求1～3任意一项所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞为人间充质干细胞。

9.一种用于治疗糖尿病创面愈合的药物，其特征在于，所述药物包括磁性外泌体，所述磁性外泌体的浓度为10¹⁰-10¹¹颗粒/ml。

10.一种磁性外泌体的制备方法，其特征在于，所述磁性外泌体是利用磁性Fe₃O₄纳米颗粒，或磁性Fe₃O₄纳米颗粒联合静磁场刺激MSCs产生的磁性外泌体，具体包括如下步骤：

1)培养间充质干细胞；

2)用所述磁性纳米颗粒，或磁性Fe₃O₄纳米颗粒联合静磁场处理上述间充质干细胞；

3)间充质干细胞外泌体的提取、纯化。

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