CN114632480A - 一种具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒、外泌体及其制备方法与应用 - Google Patents

一种具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒、外泌体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及干细胞的技术领域，具体公开了一种具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒、外泌体及其制备方法与应用。该具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：将纳米铁类氧化物、纳米氧化镍、纳米石墨烯依次溶于水中；然后调节温度及pH；最后进行冷却、分离；利用上述方法获得的具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒；利用该具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒提取外泌体的制备方法；利用该制备方法获得的外泌体；以及上述具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒与外泌体在促进血管生成方面的应用。本申请能够简单、快速地获得一种高含量的外泌体，进而显著增强血管的生成能力。

Description

一种具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒、外泌体 及其制备方法与应用
技术领域
本申请涉及干细胞的技术领域，具体涉及一种具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒、外泌体及其制备方法与应用。
背景技术
间充质干细胞是一种能够长期存活，并能不断进行自我繁殖与分化，几乎存在于所有组织中的细胞。近年来，间充质干细胞多被用于移植手术中，首先从自体采集间充质干细胞，然后进行分离、培养，最后将增殖后的间充质干细胞重新注入体内，通过细胞自身的自我靶向性功能达到受损器官和组织部位，从而对病变的组织、细胞进行修复，进而重建正常的组织与细胞。然而自体采集的间充质干细胞存在很多缺陷，例如体内存活率低，稳定性差、易突变致瘤，易产生并发症等。
干细胞外泌体是由干细胞经“内吞-融合-外泌”等系列调控行为分泌到干细胞外的膜性小囊泡，兼具干细胞的优异性能，且比细胞的存活率高、稳定性好、潜在隐患小，具有很好的应用价值。
目前，间充质干细胞外泌体的提取最常用的方法有超速离心法和密度梯度离心法，密度梯度离心法由于操作比较复杂、且耗时较长，故难以实现大规模生产；而超速离心法存在产量低、膜完整性损失、离心效率低等缺陷，很难达到要求的使用效果。
发明内容
为了简单、快速地获得一种高含量的外泌体，本申请提供一种具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒、外泌体及其制备方法与应用。
第一方面，本申请提供一种具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒的制备方法，采用如下的技术方案：
一种具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)在无氧条件下，将纳米铁类氧化物与纳米氧化镍均匀分散于水中形成前体溶液；
(2)在搅拌作用下，将步骤(1)获得的前体溶液升温至40-50℃，并缓慢滴加碱液，调节溶液pH为9-10，形成悬浊液；
(3)在无氧条件下，向步骤(2)获得的悬浊液中加入纳米石墨烯，并持续搅拌升温至70-80℃，并在此温度下搅拌1-2h，冷却并分离沉淀，获得所述超顺磁纳米颗粒。
本申请提供一种超顺磁纳米颗粒的制备方法，利用该方法制备的超顺磁纳米颗粒能够促进细胞分泌外泌体，进而定向增强血管的生成功能。
优选的，所述纳米铁类氧化物、所述纳米氧化镍和所述纳米石墨烯的重量比为(2-3)：(1-2)：0.3。
进一步的，所述纳米铁类氧化物、所述纳米氧化镍和所述纳米石墨烯的重量比为2.5：1.5：0.3。
在一个具体的实施方案中，所述纳米铁类氧化物、所述纳米氧化镍和所述纳米石墨烯的重量比可以为1：1.5：0.3、2：1.5：0.3、2.5：1.5：0.3、3：1.5：0.3、4：1.5：0.3、2.5：0.5：0.3、2.5：1：0.3、2.5：2：0.3或2.5：3：0.3。
在一些具体的实施方案中，所述纳米铁类氧化物、所述纳米氧化镍和所述纳米石墨烯的重量比还可以为(1-2)：1.5：0.3、(2-2.5)：1.5：0.3、(2.5-3)：1.5：0.3、(3-4)：1.5：0.3、2.5：(0.5-1)：0.3、2.5：(1-1.5)：0.3、2.5：(1.5-2)：0.3或2.5：(2-3)：0.3。
本申请通过控制超顺磁纳米颗粒中纳米铁类氧化物、纳米氧化镍和纳米石墨烯的添加量，来探究超顺磁纳米颗粒对于干细胞分泌外泌体的刺激作用，从而获得一种高含量的干细胞外泌体。
优选的，所述纳米铁类氧化物为磁性Fe3O4纳米颗粒或磁性γ-Fe2O3纳米粒子。
磁性Fe3O4纳米颗粒和磁性γ-Fe2O3纳米粒子均具有超顺磁性和高饱和磁化强度，是一种磁性强、制备方法简单、生物相容性好的磁性材料。纳米铁类氧化物在降解过程中会产生Fe3+，Fe3+可以促进人脐静脉内皮细胞中血管生成因子的表达，进而促进血管的生成。
第二方面，本申请提供一种由上述具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒的制备方法获得的具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒。
第三方面，本申请提供一种外泌体的制备方法，采用如下的方案：
一种外泌体的制备方法，包括提取外泌体步骤；所述提取外泌体步骤采用了上述具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒。
所述提取外泌体前还需进行细胞培养；所述细胞培养采用的培养基为间充质干细胞无血清培养基。
本申请提供了一种利用上述具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒制备外泌体的方法，该方法首先对干细胞进行培养，然后利用纳米铁类氧化物、纳米氧化镍和纳米石墨烯制备而成超顺磁纳米颗粒刺激干细胞分泌外泌体，最后进行离心从而获得干细胞外泌体。上述利用超顺磁纳米颗粒获取外泌体的制备方法操作简单、耗时短，且获得的外泌体的含量较高。
本申请采用间充质干细胞无血清培养基对干细胞进行培养，有效降低了添加一种血清带来的携带细菌、病毒等安全隐患，降低了干细胞临床应用的风险。
优选的，所述间充质干细胞无血清培养基中还包括以下重量份的组分：烟酰胺1-4份、N-正辛基-D-葡萄糖胺2-6份、医用肝素钠1-3份。
进一步的，所述间充质干细胞无血清培养基中还包括以下重量份的组分：烟酰胺3份、N-正辛基-D-葡萄糖胺4份、医用肝素钠2份。
本申请采用的间充质干细胞无血清培养基中还添加了烟酰胺、N-正辛基-D-葡萄糖胺、医用肝素钠，有效提高了细胞扩增的效率并保持干细胞的生物特性，确保了干细胞的临床使用质量标准。
第四方面，本申请提供一种外泌体。
一种外泌体，利用上述外泌体的制备方法获得。
优选的，所述外泌体为人脐带间充质干细胞外泌体。
本申请通过外泌体的制备方法获得一种人脐带间充质干细胞外泌体，该人脐带间充质干细胞外泌体的含量高、增殖性能好、免疫活性低、稳定性好、易于储存，具有很好的应用前景。
人脐带间充质干细胞相比于相关技术中的骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞具有更好的增殖性与更低的免疫活性，因此，人脐带间充质干细胞分泌的人脐带间充质干细胞外泌体也具有很好的增殖性能和较低的免疫活性，且稳定性好、易于储存。
第五方面，本申请提供的具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒及外泌体在促进血管生成方面的应用。
本申请提供的人脐带间充质干细胞外泌体能够促进血管的生成与分化，具有显著的增强血管内皮细胞增殖、迁移和血管生成的能力。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1.本申请提供一种具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒的制备方法，并将超顺磁纳米颗粒中的纳米铁类氧化物、纳米氧化镍和纳米石墨烯的重量比控制在(2-3)：(1-2)：0.3范围内，可以获得一种含量较高的外泌体，该外泌体能够定向增强血管的生成功能。
2.提供了一种利用超顺磁纳米颗粒获取的具有定向增强血管生成功能的外泌体的制备方法，该方法首先对干细胞进行培养，然后利用超顺磁纳米颗粒刺激干细胞分泌外泌体，最后进行离心从而获得干细胞外泌体，上述方法操作简单、耗时短，获得的干细胞外泌体的含量高。
3.本申请采用含有烟酰胺、N-正辛基-D-葡萄糖胺和医用肝素钠的间充质干细胞无血清培养基对干细胞进行培养，该培养基还能够有效促进干细胞的生长与分化，使得干细胞具有较强的增殖能力；同时，由于该培养基中不包含动物血清，因此培养获得的干细胞的安全性高。
附图说明
图1是本申请提供的利用具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒提取外泌体的制备方法流程图。
具体实施方式
本申请提供了一种具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)在无氧条件下，将纳米铁类氧化物与纳米氧化镍均匀分散于水中形成前体溶液；
(2)在搅拌作用下，将步骤(1)获得的前体溶液升温至40-50℃，并缓慢滴加1％的NaOH水溶液，调节溶液pH为9-10，形成悬浊液；
(3)在无氧条件下，向步骤(2)获得的悬浊液中加入纳米石墨烯，并持续搅拌升温至70-80℃，并在此温度下搅拌1-2h，冷却并分离沉淀，获得所述超顺磁纳米颗粒。
其中，所述纳米铁类氧化物、所述纳米氧化镍和所述纳米石墨烯的重量比为(2-3)：(1-2)：0.3。所述纳米铁类氧化物为磁性Fe3O4纳米颗粒或磁性γ-Fe2O3纳米粒子。
利用上述具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒的制备方法获得的具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒。
本申请还提供了一种外泌体的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)细胞培养：将干细胞用含10％FBS、1％青链霉素的α-MEM完全培养基按1:3比例传代培养，并选取第3代的干细胞；然后将第3代的干细胞接种于含有烟酰胺、N-正辛基-D-葡萄糖胺和医用肝素钠的100mL间充质干细胞无血清培养基中，在5％体积CO2、37℃培养箱中进行培养；所述干细胞为人脐带间充质干细胞或骨髓充质干细胞。
其中，所述间充质干细胞无血清培养基中包括以下重量份的组分：烟酰胺1-4份、N-正辛基-D-葡萄糖胺2-6份、医用肝素钠1-3份。进一步的，所述间充质干细胞无血清培养基中还可以包括以下重量份的组分：烟酰胺3份、N-正辛基-D-葡萄糖胺4份、医用肝素钠2份。
(2)提取外泌体：将步骤(1)中的人脐带间充质干细胞培养2d后，当细胞融合率达到70％-80％时，更换培养基为含有4-6mg超顺磁纳米颗粒的100mL间充质干细胞无血清培养基，饥饿处理36h后，收集上清液；然后将上清液依次在400×g、1000×g、2000×g下低速离心，每次离心5min，分别去除细胞碎片等沉淀物、取上清液；最后将上清液在100000×g下进行1次超速离心，离心时间为30min，离心完毕弃上清液，收获沉淀即为人脐带间充质干细胞外泌体。
利用上述外泌体的制备方法获得外泌体。进一步的，所述外泌体为人脐带间充质干细胞外泌体。
上述具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒及外泌体在促进血管生成方面的应用。
本申请中人脐带间充质干细胞购自American type culture collection，ATCC；间充质干细胞无血清培养基、烟酰胺、N-正辛基-D-葡萄糖胺、医用肝素钠均购自北京伊诺凯科技有限公司；磁性Fe3O4纳米颗粒、纳米氧化镍和纳米石墨烯均购自浙江亚美纳米科技有限公司。其余试剂、溶剂和其它试验材料等均可通过商购获得。
以下结合制备例1-9、实施例1-16、对比例1-3及附图对本申请作进一步详细说明。
制备例
制备例1-9
制备例1-9分别提供一种具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒的制备方法。
上述制备例的不同之处在于：超顺磁纳米颗粒中各组分的重量比，具体如表1所示。
上述制备例提供的具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒的制备方法，具体步骤如下：
(1)在无氧条件下，将磁性Fe3O4纳米颗粒与纳米氧化镍均匀分散于水中形成前体溶液；
(2)在搅拌作用下，将步骤(1)获得的前体溶液升温至45℃，并缓慢滴加1％的NaOH水溶液，调节溶液pH为10，形成悬浊液；
(3)在无氧条件下，向步骤(2)获得的悬浊液中加入纳米石墨烯，并持续搅拌升温至75℃，并在此温度下搅拌1h，冷却并分离沉淀，获得所述超顺磁纳米颗粒。
表1制备例1-9中超顺磁纳米颗粒中各组分的重量比
Figure BDA0003557815450000051
Figure BDA0003557815450000061
实施例
实施例1-9
实施例1-9分别提供一种外泌体的制备方法。
上述实施例的不同之处在于：超顺磁纳米颗粒，制备例1-9提供的超顺磁纳米颗粒分别用于实施例1-9，具体如表2所示。
上述实施例提供的利用具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒提取外泌体的制备方法如图1所示，具体步骤如下：
(1)细胞培养：将人脐带间充质干细胞用含10％FBS、1％青链霉素的α-MEM完全培养基按1：3比例传代培养，选取第3代的人脐带间充质干细胞，然后将第3代的人脐带间充质干细胞接种于含有烟酰胺、N-正辛基-D-葡萄糖胺和医用肝素钠的100mL间充质干细胞无血清培养基中，在5％体积CO2、37℃培养箱中进行培养。其中，烟酰胺300μg、N-正辛基-D-葡萄糖胺400μg、医用肝素钠200μg。
(2)提取外泌体：将步骤(1)中的人脐带间充质干细胞培养2d后，当细胞融合率达到80％时，更换培养基为含有5mg的超顺磁纳米颗粒的间充质干细胞无血清培养基100mL，饥饿处理36h后，收集上清液；然后将上清液先在400×g下低速离心5min，去除细胞碎片等沉淀物，取上清液；然后将上清液在1000×g下低速离心5min，去除沉淀物，取上清液；再继续在2000×g下低速离心5min，去除沉淀物，取上清液；最后将上清液在100000×g下进行1次超速离心，离心时间为30min，离心完毕弃上清液，收获沉淀即为人脐带间充质干细胞外泌体。
表2实施例1-9提供的外泌体的制备方法中的超顺磁纳米颗粒
Figure BDA0003557815450000062
Figure BDA0003557815450000071
实施例10-13
实施例10-13分别提供一种外泌体的制备方法。
上述实施例与实施例3的不同之处在于：培养基中各组分的添加量，具体如表3所示。
表3实施例10-15提供的培养基中各组分的添加量
Figure BDA0003557815450000072
实施例16
实施例16提供一种外泌体的制备方法。
上述实施例与实施例3的不同之处在于：采用的干细胞为骨髓间充质干细胞。
对比例
对比例1
对比例1提供一种外泌体的制备方法。
上述对比例与实施例3的不同之处在于：超顺磁纳米颗粒为磁性Fe3O4纳米。
对比例2
对比例2提供一种外泌体的制备方法。
上述对比例与实施例3的不同之处在于：超顺磁纳米颗粒为纳米氧化镍。
对比例3
对比例3提供一种外泌体的制备方法。
上述对比例与实施例3的不同之处在于：外泌体提取步骤。
对比例3的干细胞外泌体的提取方法中，外泌体提取步骤为：将培养2d后的细胞接种于100mL间充质干细胞无血清培养基中，饥饿处理36h后，收集上清液；然后将上清液依次在400×g、1000×g、2000×g下低速离心，每次离心5min，去除细胞碎片等沉淀物；然后将上清液在100000×g下进行1次超速离心，离心时间为30min，离心完毕弃上清液，收获沉淀即为人脐带间充质干细胞外泌体。
检测试验
对实施例1-16、对比例1-3制得的外泌体的含量进行检测(以蛋白计)，结果如表4所示。
外泌体含量的检测方法参考BCA检测法。BAC工作液中包括试剂A+试剂B。其中，试剂A为1％BCA二钠盐、2％无水碳酸钠0.16％酒石酸钠、0.4％氢氧化钠、0.95％碳酸氢钠的混合溶液，PH值为11.25；试剂B为4％硫酸铜。
表4实施例1-16、对比例1-3制得的人脐带间充质干细胞外泌体的含量检测结果
Figure BDA0003557815450000081
血管生成试验将实施例1-16、对比例1-3制得的人脐带间充质干细胞外泌体，利用PBS溶液分别配置成浓度为0.3mg/mL的悬液，然后对上述悬液进行血管生成实验，实验结果如表5所示。
在血管生成载玻片微孔中加入10μL不含生长因子的基质胶，在37℃成胶后，每孔接种一种上述悬液，培养2.5h，拍照，倒置显微镜，观察血管生成情况。
表5实施例1-16、对比例1-3获得的人脐带间充质干细胞外泌体对血管生成的作用
Figure BDA0003557815450000091
结合表4、表5，并对比实施例1-16、对比例1-3的检测结果可知，本申请提供的利用具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒提取外泌体的制备方法能够将人脐带间充质干细胞的外泌体从人脐带间充质干细胞中提取出来，且提取出的人脐带间充质干细胞外泌体的外泌体含量较高，利用上述高外泌体含量的人脐带间充质干细胞外泌体进行血管生成试验，结果发现，该人脐带间充质干细胞外泌体能够显著促进血管的生成与分化，增强血管的生成能力。
根据实施例1-9、对比例1-3的检测结果可知，实施例1-9获得的人脐带间充质干细胞外泌体中的外泌体含量明显高于对比例1-3获得的人脐带间充质干细胞外泌体中的外泌体含量，说明利用磁性Fe3O4纳米颗粒、纳米氧化镍和纳米石墨烯混合使用提取人脐带间充质干细胞外泌体的作用效果更显著；且血管生成试验结果发现，实施例1-9获得的人脐带间充质干细胞外泌体对于血管的生成与分化作用效果明显优于对比例1-3获得的人脐带间充质干细胞外泌体。
进一步对比发现，实施例2-4、实施例7-8提供的利用具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒提取外泌体的制备方法中，将超顺磁纳米颗粒中磁性Fe3O4纳米颗粒、纳米氧化镍和纳米石墨烯的重量比控制在(2-3)：1.5：0.3时，人脐带间充质干细胞外泌体中的外泌体含量更高，对于血管的生成与分化作用效果更显著。因此，本申请将超顺磁纳米颗粒中磁性Fe3O4纳米颗粒、纳米氧化镍和纳米石墨烯的重量比控制在(2-3)：1.5：0.3范围内，可以获得外泌体含量高的人脐带间充质干细胞外泌体，该脐带间充质干细胞外泌体对于血管的生成与分化具有显著的效果，进而增强血管的生成能力。
对比实施例3、实施例10-15的检测结果可知，实施例10-15提供的利用具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒提取外泌体的制备方法获得的人脐带间充质干细胞外泌体均含有较高的外泌体含量，说明间充质干细胞无血清培养基中加入烟酰胺、N-正辛基-D-葡萄糖胺和医用肝素钠可以有效促进干细胞增殖、分化，进而获得大量的人脐带间充质干细胞外泌体。血管生成试验结果发现，实施例10-15获得的人脐带间充质干细胞外泌体均能够促进血管的生成与分化。因此，说明本申请将间充质干细胞无血清培养基中的组分控制在以下范围内：烟酰胺1-4份、N-正辛基-D-葡萄糖胺2-6份、医用肝素钠1-3份，可以获得高外泌体含量的人脐带间充质干细胞外泌体，该人脐带间充质干细胞外泌体能够显著促进血管的生成与分化，进而提高血管的生成能力。
对比实施例3、实施例16的检测结果可知，实施例3提供的利用具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒提取外泌体的制备方法获得的人脐带间充质干细胞外泌体的外泌体含量高于实施例16提供的利用具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒提取外泌体的制备方法获得的骨髓间充质干细胞外泌体的外泌体含量。因此，利用本申请提供的利用具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒提取外泌体的制备方法获得的人脐带间充质干细胞外泌体的含量更高，该人脐带间充质干细胞外泌体对增强血管的生成与分化能力作用效果更为显著。
综上所述，本申请提供的利用具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒提取外泌体的制备方法中，将超顺磁纳米颗粒中磁性Fe3O4纳米颗粒、纳米氧化镍和纳米石墨烯的重量比控制在(2-3)：1.5：0.3范围内；间充质干细胞无血清培养基中的组分控制在以下范围内：烟酰胺1-4份、N-正辛基-D-葡萄糖胺2-6份、医用肝素钠1-3份可以获得高外泌体含量的人脐带间充质干细胞外泌体，上述人脐带间充质干细胞外泌体能够促进血管的生成与分化，对于血管生成能力的培养具有显著的作用效果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）在无氧条件下，将纳米铁类氧化物与纳米氧化镍均匀分散于水中形成前体溶液；
（2）在搅拌作用下，将步骤（1）获得的前体溶液升温至40-50℃，并缓慢滴加碱液，调节溶液pH为9-10，形成悬浊液；
（3）在无氧条件下，向步骤（2）获得的悬浊液中加入纳米石墨烯，并持续搅拌升温至70-80℃，并在此温度下搅拌1-2h，冷却并分离沉淀，获得所述具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述纳米铁类氧化物、所述纳米氧化镍和所述纳米石墨烯的重量比为（2-3）：（1-2）：0.3。
3.根据权利要求1所述的具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述纳米铁类氧化物为磁性Fe3O4纳米颗粒或磁性γFe2O3纳米粒子。
4.一种利用权利要求1-3中任一项所述的具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒的制备方法获得的具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒。
5.一种外泌体的制备方法，其特征在于，包括提取外泌体步骤；所述提取外泌体步骤采用了权利要求4所述的具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒。
6.根据权利要求5所述的外泌体的制备方法，其特征在于，所述提取外泌体前还需进行细胞培养；所述细胞培养采用的培养基为间充质干细胞无血清培养基。
7.根据权利要求6所述的外泌体的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞无血清培养基中还包括以下重量份的组分：烟酰胺1-4份、N-正辛基-D-葡萄糖胺2-6份、医用肝素钠1-3份。
8.利用权利要求5-7中任一项所述的外泌体的制备方法获得的外泌体。
9.根据权利要求8所述的外泌体，其特征在于，所述外泌体为人脐带间充质干细胞外泌体。
10.如权利要求4所述的具有定向增强血管生成功能的超顺磁纳米颗粒及权利要求8所述的外泌体在促进血管生成方面的应用。
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