CN109745341A - 四氧化三铁超顺磁性纳米颗粒刺激干细胞外泌体成骨 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种干细胞来源的外泌体制剂，所述外泌体制剂是通过Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒刺激干细胞分泌的外泌体。进一步发明人提供了所述的外泌体制剂在制备促进骨髓间充质干细胞成骨分化药物制剂中的应用以及在制备治疗骨科疾病生物制剂或骨修复材料中的应用。鉴于涉及骨坏死、骨缺损复杂的病理生理学进程，本发明采用Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒刺激干细胞分泌的外泌体制成的外泌体制剂，可以采用局部骨缺损部位注射给药，或者与可吸收凝胶混合后局部填充，直达病所，激发骨髓间充质干细胞成骨活性及促进成骨细胞沉积、促进骨坏死或骨损伤修复。

Description

四氧化三铁超顺磁性纳米颗粒刺激干细胞外泌体成骨

技术领域

本发明涉及纳米材料、生物医学技术领域，具体涉及Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒刺激骨髓间充质干细胞外泌体成骨。

背景技术

骨组织缺损是因外伤、感染、肿瘤及骨骼发育异常等因素使机体丧失一些骨质从而形成较大间隙，这一问题在临床较为常见并且较难处理。如何促进骨组织缺损的修复，一直是该领域研究人员研究的重点。虽然，自体骨移植是治疗的最好方法，但自体骨源移植极其有限并增加患者痛苦，而异体骨移植又存在免疫反应和诸多并发症等。

近年来，随着骨组织工程技术的发展，这一问题得到了一定程度的解决。目前骨组织研究主要集中于生物支架材料、种子细胞及因子的研究。在骨组织工程中需要生物支架材料和种子细胞的相互结合才能发挥其应有的作用，而种子细胞的选择尤为重要，早期研究人员选用骨细胞和骨髓基质细胞，但是这些种子细胞取材困难，容易对患者造成二次伤害。因此，研究人员将种子细胞的目标锁定在了间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)。间充质干细胞有着低免疫原性的特性，广泛存在于结缔组织和器官间质，具有多向分化潜能、自我复制能力、造血支持和免疫调控等特点，MSC目前已经被应用于造血系统疾病、抗移植排斥、器官缺血性损伤的修复和自身免疫性疾病的免疫调节治疗等临床试验中，在再生医学领域有着重要的作用。MSC在一定的条件下可分化为成骨细胞、成脂肪细胞和成软骨细胞等成熟的细胞。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是间充质干细胞的一种，具有多向分化的潜能，经过体外成骨诱导，并且植入体内后能进继续产生成骨活动。但由于宿主微环境缺乏血运，种子细胞在缺氧环境中易引起凋亡，导致成骨效果不佳。然而其存在存活率较低、稳定性差、免疫排斥反应、体外刺激培养存在瘤化等问题，严重限制其广泛的临床应用。

因此，寻找一种既具有骨髓间充质干细胞治疗效果又易于保藏、安全可靠的细胞材料是十分必要的，作为细胞间信号传导及细胞旁分泌关键成分的exosome越来越引起人们的关注。BMSCs旁分泌在损伤模型中可以发挥促增殖、抗凋亡和抑制炎症等作用，而作为BMSCs旁分泌的重要成分，exosome与BMSCs细胞相比，具有许多优势：①exosome可直接与靶细胞发生融合发挥生物学效应，作用效率高；②exosome在-70℃长期稳定保存，内含有效成分受exosome脂质膜保护，不易被破坏，且便于运输；③使用时间易于掌握，使用浓度、剂量及途径易于控制；④克服了BMSCs在体内存活率低及长期应用突变致瘤的潜在隐患；⑤避免了直接应用BMSCs造成的血管栓塞等并发症；⑥避免了将Fe₃O₄直接打入体内造成的未知风险。因此，BMSCs来源的exosome在组织损伤修复中的作用及机制研究就显得特别重要，且具有潜在应用价值。

因此，寻找一些新的手段和途径代替干细胞发挥相关的治疗效果是一种可行的策略。

发明内容

本发明的目的在于提供一种干细胞来源的外泌体制剂，所述外泌体制剂是通过Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒刺激干细胞分泌的外泌体。本发明另一目的在于提供所述的外泌体制剂在促进骨髓间充质干细胞成骨分化以及在制备治疗骨科疾病生物制剂或骨修复材料中的用途。

为了实现上述目的，本发明采用以下方案：

首先，本发明提供一种干细胞来源的外泌体制剂，所述外泌体制剂是通过Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒刺激干细胞分泌的外泌体。

优选的，所述Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒为Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒溶液，所述Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒溶液浓度为0.5mg/ml～2mg/ml。

优选的，所述Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒溶液浓度为1mg/ml。

优选的，所述干细胞为骨髓间充质干细胞。

本发明通过实验证明Fe₃O₄刺激骨髓间充质干细胞分泌的外泌体与无Fe₃O₄刺激干细胞分泌的外泌体相比，所外泌体分泌的量更多，并且更能促进骨髓间充质干细胞成骨作用。

进一步地，本发明提供了所述的外泌体制剂在制备促进骨髓间充质干细胞成骨分化药物制剂中的应用。

进一步地，本发明还提供了所述的外泌体制剂在制备治疗骨科疾病生物制剂或骨修复材料中的应用。

优选的，所述生物制剂包含外泌体制剂作为活性成分；优选的，所述生物制剂还包含其他治疗骨科疾病的药物。

优选的，所述骨修复材料包括外泌体制剂；优选的，所述骨修复材料可包括可吸收凝胶，所述凝胶在体内起到一定的固定作用。

优选的，所述凝胶可以选用透明质酸等常见的可吸收降解材料。

优选的，所述骨科疾病包括骨缺损、骨坏死、骨质疏松、骨折、骨创伤。

更进一步地，本发明提供了一种促进骨髓间充质干细胞内成骨分化的方法，步骤如下：

(1)骨髓间充质干细胞的培养；

(2)取第3-5代生长良好的BMSCs用含有Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒的10％胎牛血清的低糖DMEM培养液进行培养；

(3)收集上清液，提取其中的外泌体；

(4)用含有外泌体的培养基孵育诱导BMSCs成骨14天；

(5)对BMSCs成骨分化检测。

优选的，所述步骤(2)中Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒浓度为0.5mg/ml～2mg/ml。

优选的，所述步骤(4)外泌体的浓度为1*10⁹～2*10¹²/ml。

优选的，所述步骤(5)BMSCs成骨分化检测方法包括BMSCs成骨分化标志物ALP活性检测、ALP染色试剂盒检测或茜素红染色检测法。

碱性磷酸酶(ALP)是早期成骨标志，促进细胞成熟、钙化，ALP的定量检测可以反映成骨细胞的分化水平，其活性越高，说明前成骨细胞向成熟的成骨细胞分化的越明显。

有益效果

鉴于涉及骨坏死、骨缺损复杂的病理生理学进程，本发明采用Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒刺激干细胞分泌的外泌体制成的外泌体制剂，可以采用局部骨缺损部位注射给药，或者与可吸收凝胶混合后局部填充，直达病所，激发骨髓间充质干细胞成骨活性及促进成骨细胞沉积、促进骨坏死或骨损伤修复。

基于Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒刺激BMSCs与不含Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒刺激BMSCs分泌的外泌体相比，所外泌体分泌的量更多，更能促进骨髓间充质干细胞成骨作用。Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒刺激BMSCs分泌的外泌体在治疗骨缺损和骨坏死等骨科疾病中具有广泛的应用前景，它不但具备了干细胞移植疗效，而且减低了细胞移植风险，如免疫排斥反应，致畸致瘤等。

本发明提供了Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒刺激BMSCs分泌的外泌体促进成骨作用，为临床上骨缺损、骨坏死、骨质疏松、骨代谢性疾病等提供一种新的治疗方法，为开发制备治疗骨质疏松、骨折、骨缺损、骨创伤等疾病的药物提供物质基础。

附图说明

图1 CCK-8检测Fe₃O₄对骨髓间充质干细胞毒性；

图2电镜下观察Fe₃O₄被BMSCs吞噬现象；

图3电镜下观察外泌体形态50-100nm；

图4Fe₃O₄对BMSCs分泌外泌体的影响，不含Fe₃O₄刺激的BMSCs产生外泌体的量(A)是含Fe₃O₄的BMSCs产生外泌体(B)的1/3；

图5碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒检测外泌体孵育7天和14天BMSCs中ALP成骨标志物的表达情况；

图6A-C的是茜素红染色，颜色越深表明成骨效果越好；D-F的为ALP染色：越黑表明效果越好。图A、D为1mg/ml Fe₃O₄组；B、E为无Fe₃O₄组；C、F为无外泌体组。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

以下实施例中数据采用SPSS17.0软件系统进行处理，所得数据均值±标准差表示，两组间比较采用t检验，当p<0.05，差异有统计学意义。

实施例1骨髓间充质干细胞(BMSCs)的培养

本发明实验所用是人的骨髓间充质干细胞购自上海优予生物科技有限公司。

将BMSCs细胞用含体积浓度为10％胎牛血清的低糖DMEM培养液，按1:3比例传代培养，得到第一代骨髓间充质干细胞，继续传代培养至第三代骨髓间充质干细胞。本实验选用第3-5代的细胞开展后续实验。

实施例2 CCK-8检测Fe₃O₄对骨髓间充质干细胞毒性

取第3-5代BMSCs接种于96孔板中，细胞的种植密度为1×10⁴/孔，培养2d后更换含有Fe₃O₄的培养基，加入浓度分别为0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml Fe₃O₄，处理5d，使用CCK8法对Fe₃O₄处理1d、2d、3d和5d的细胞进行毒性检测。每孔加入10μL的CCK8溶液和90μL的DMEM培养基，使用酶标仪测量各孔吸光度，CCK8溶液吸收波长为450nm。

CCK8细胞毒性实验发现，使用0-1mg/ml浓度梯度的Fe₃O₄对BMSCs未见明显毒性作用，大于1mg/ml浓度的Fe₃O₄对细胞增殖存在一定影响(图1)。

实施例3 Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒刺激骨髓间充质干细胞外泌体

取第3-5代生长良好的BMSCs按1×10⁵/孔密度接种于6孔板，待细胞融合率达到70-80％以上时，将细胞分为2组：对照组和Fe₃O₄处理组。对照组：用10％胎牛血清的低糖DMEM培养液培养；Fe₃O₄处理组：将Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒(南京晓励生物)以1mg/ml溶于含体积浓度为10％胎牛血清的低糖DMEM培养液中，对细胞进行培养。

1.透射电镜观察Fe₃O₄标记BMSCs细胞：

Fe₃O₄处理的BMSCs在37℃、5％CO₂培养箱中培养48h，经0.25％胰蛋白酶37℃消化1min后，120g离心5min，PBS冲洗2次，2.5％戊二醛固定；PBS冲洗，1％锇酸后固定2h，梯度乙醇、丙酮脱水，618环氧树脂包埋液浸透包埋，超薄切片机600～800nm切片，醋酸铀、枸橼酸铅染色，透射电镜下观察。

透射电镜结果如图2显示：黑色颗粒为Fe₃O₄可以被骨髓间充质干细胞BMSCs吞噬。

2.外泌体分离提取

取两组BMSCs细胞培养至达到80％融合时，更换无血清低糖DMEM培养液，饥饿处理24h后收集上清，按照ExoQuick^TM试剂盒(SBI)操作说明书提取外泌体，将提取的外泌体加入100μl PBS重悬，-80℃冻存用于后续实验。

电镜鉴定外泌体形态：取上述分离纯化外泌体悬液10μl，加入等体积平衡盐PBS溶液稀释，滴加于直径2mm载样铜网上，于室温静置1分钟后，用滤纸将多余液体轻轻吸去；用3％磷钨酸钠溶液(PH6.8)室温复染5min，用双蒸水轻轻洗一遍后室温晾干2min；于透射电镜观察并照相。各视野区随机选取20个外泌体测量其直径。

在透射电镜下观察，BMSCs外泌体呈椭圆形，直径约50-100nm，有完整的包膜结构，内含低密度物质，无Fe₃O₄颗粒，见图3。

3.纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)

取各组分离纯化外泌体悬液1μl，加入等体积平衡盐PBS溶液稀释至NTA画面中粒子束不超过100个。根据Nanosight-NS500记录的颗粒数，按仪器测量结束后，收集并分析报告。所述NTA粒径检测是由Particle Metrix公司完成。

NTA检测外泌体的粒径及浓度分布，结果如图4所示，外泌体直径约为50-100nm，Fe₃O₄能刺激BMSCs分泌更多外泌体，Fe₃O₄处理组是正常对照组分泌外泌体浓度的3倍。

实施例4 BMSCs成骨分化检测

BMSCs细胞培养：实验分两组，无Fe₃O₄组：使用10％胎牛血清的低糖DMEM培养液和Fe₃O₄处理组：使用含有1mg/ml Fe₃O₄的10％胎牛血清的低糖DMEM培养液；培养条件：在37℃、5％CO₂培养箱中培养48h；分别提取两组细胞上清中的外泌体。

然后，发明人分别用含有两组分离的外泌体的培养基，分别孵育BMSCs细胞14天后进行后续实验，实验设置空白对照无外泌体组。其中，所述两组外泌体的浓度为1*10¹¹/ml。所述外泌体的浓度也可以为1*10⁹～1*10¹²/ml，均有促进BMSCs干细胞成骨分化效果。

1.发明人利用碱性磷酸酶检测试剂盒(碧云天)检测外泌体孵育7天和14天BMSCs中碱性磷酸酶(ALP)活性。

1)试剂准备：将所有试剂取出，恢复至室温使用。

a.显色底物溶液：取一管显色底物，溶解于2.5ml的检测缓冲液中(可先用1ml检测缓冲液进行溶解，充分溶解和混匀后，转移至15ml离心管，再加入1.5ml检测缓冲液)，充分溶解和混匀，冰上放置。新鲜配制的显色底物溶液需在6小时内使用。

b.标准品工作液：取10μl p-nitrophenol溶液(10mM)，用检测缓冲液稀释至0.2ml，最终浓度为0.5mM。

2)样品准备：

采用适当细胞或组织裂解液裂解细胞或组织，使用碧云天的P0013J Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)裂解相关样品。如果有必要需进行适当匀浆，随后离心取上清，用于碱性磷酸酶的检测。

样品的稀释：如果样品中含有较高活性的碱性磷酸酶，可以使用原有的裂解液或PBS等进行稀释，也可以采用试剂盒中的检测缓冲液进行稀释。

3)参考下表1中使用96孔板设置空白对照孔、标准品孔和样品孔。标准品的用量分别为4、8、16、24、32和40微升，样品通常可以直接加50微升。如果样品中的碱性磷酸酶活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定。

表1加样量

	空白对照	标准品	样品
				检测缓冲液	50μl	(100-x)μl	(50-y)μl
显色底物	50μl	—	50μl
				样品	—	—	yμl
标准品工作液	—	xμl	—

4)用枪头轻轻吹打混匀。

5)37℃孵育5-10分钟。

6)每孔加入100μl反应终止液终止反应。此时，标准品或有碱性磷酸酶活性的孔会呈现不同深浅的黄色。

7)在405nm测定吸光度。如果不能测定405nm，也可以在400-415nm范围内检测吸光度。

8)碱性磷酸酶活性单位的定义：在pH9.8的diethanolamine(DEA)缓冲液中，37℃条件下，每分钟水解para-nitrophenyl phosphate显色底物产生1微摩尔p-nitrophenol所需的碱性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位，也被称作一个DEA酶活力单位。

9)根据酶活性定义，计算出样品中的碱性磷酸酶活性。

结果如图5所示，两组分泌的外泌体分别孵育BMSCs细胞14天后，发现Fe₃O₄处理组分泌的外泌体与无Fe₃O₄组相比，明显增加了BMSCs细胞成骨效果。

2.ALP检测和茜素红钙结节表达的检测

BMSCs按照每孔2x10⁵个细胞接种于6孔板中，分别用含有两组分离的外泌体培养液孵育BMSCs成骨诱导培养14天，设置空白对照无外泌体组。

茜素红染色：PBS冲洗2次，每次3min；加入95％乙醇，固定10min；吸去固定液，PBS冲洗2次，每次3min，加入0.1％的茜素红染色液(Sigma，美国)，染30min；用PBS冲洗2次，去除残留的染色液；加入PBS，完成染色；显微镜下观察细胞染色情况。

ALP染色检测：PBS冲洗2次，每次3min，4％多聚甲醛固定30min后，PBS冲洗2次，每次3min，加入ALP显色试剂盒(碧云天生物工程有限公司)，室温避光孵育40min，双蒸水冲洗2次终止显色反应。

茜素红染色显示，在聚集生长中心可见点状染色阳性的钙化结节，细胞周围钙盐被染成橘红色。颜色越深表明成骨效果越好，镜下观察两组细胞均出现橘红色矿化结节，且1mg/ml Fe₃O₄组矿化结节形成量高于无Fe₃O₄组(图6A-C)。

ALP染色结果显示，1mg/ml Fe₃O₄刺激BMSCs细胞分泌的外泌体对干细胞的成骨作用效果最好(图6D-F)。

上述实验说明，经过Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒刺激BMSCs分泌的外泌体的量更多，更能促进骨髓间充质干细胞成骨作用，可为临床上骨缺损、骨坏死、骨质疏松、骨折、骨创伤以及骨代谢性疾病等提供一种新的治疗方法。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种干细胞来源的外泌体制剂，其特征在于，所述外泌体制剂是通过Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒刺激干细胞分泌的外泌体。

2.如权利要求1所述的外泌体制剂，其特征在于，所述Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒为Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒溶液，所述Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒溶液浓度为0.5mg/ml～2mg/ml。

3.如权利要求2所述的外泌体制剂，其特征在于，所述Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒溶液浓度为1mg/ml。

4.如权利要求1所述的外泌体制剂，其特征在于，所述干细胞为骨髓间充质干细胞。

5.权利要求1至4任一项所述的外泌体制剂在制备促进骨髓间充质干细胞成骨分化药物制剂中的应用。

6.权利要求1至4任一项所述的外泌体制剂在制备治疗骨科疾病生物制剂或骨修复材料中的应用。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述骨科疾病包括骨缺损、骨坏死、骨质疏松、骨折、骨创伤。

8.一种促进骨髓间充质干细胞内成骨分化的方法，其步骤如下：

(1)骨髓间充质干细胞的培养；

(2)取第3-5代生长良好的BMSCs用含有Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒的10％胎牛血清的低糖DMEM培养液进行培养；

(3)收集上清液，提取上清液中的外泌体；

(4)用含有外泌体的培养基孵育诱导BMSCs成骨14天；

(5)对BMSCs成骨分化的检测。

9.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒浓度为0.5mg/ml～2mg/ml。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中外泌体浓度1*10⁹～1*10¹²/ml。