CN110438072A - 脂肪间充质干细胞的制备方法 - Google Patents

脂肪间充质干细胞的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110438072A
CN110438072A CN201910790168.XA CN201910790168A CN110438072A CN 110438072 A CN110438072 A CN 110438072A CN 201910790168 A CN201910790168 A CN 201910790168A CN 110438072 A CN110438072 A CN 110438072A
Authority
CN
China
Prior art keywords
stem cell
mesenchymal stem
adipose tissue
preparation
fat mesenchymal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910790168.XA
Other languages
English (en)
Inventor
刘小翠
孙灿兴
李静静
赵蓝
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Wei Tai Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Guangdong Wei Tai Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Wei Tai Biotechnology Co Ltd filed Critical Guangdong Wei Tai Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201910790168.XA priority Critical patent/CN110438072A/zh
Publication of CN110438072A publication Critical patent/CN110438072A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/90—Polysaccharides
    • C12N2501/905—Hyaluronic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Abstract

本发明提供一种脂肪间充质干细胞的制备方法，涉及干细胞与再生医学领域。该脂肪间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：脂肪组织预处理：用组织清洗液将采集的脂肪组织清洗至无血液残留，将清洗后的脂肪组织剪碎，得到脂肪微粒；消化：向脂肪微粒中加入脂肪组织消化液进行第一次消化，加入胰蛋白酶进行第二次消化，第二次消化后离心，去除上清液收集沉淀；其中，所述脂肪组织消化液包括DNA酶、I型胶原酶和Ⅲ型胶原酶；清洗：将沉淀清洗干净，筛去组织块，离心得到脂肪间充质干细胞。本发明的方法得到的脂肪间充质干细胞的数量多、纯度高、活性好。

Description

脂肪间充质干细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及干细胞与再生医学领域，特别是涉及脂肪间充质干细胞的制备方法。
背景技术
骨髓间充质干细胞(BMSC)，是人们在哺乳动物的骨髓基质中发现的一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群，临床上用于治疗多种疾病。2012年1月，韩国FDA批准的自体脂肪干细胞药物Cytori Therapeutics成功上市，用于治疗复杂性克隆氏病并发肛瘘。同年10月美国FDA批准了Cytori Therapeutics公司脂肪干细胞对心脏衰竭患者有效性的临床试验。2012年有研究显示关节腔内注射骨髓间充质干细胞可以使OA模型动物关节软骨再生。2012年另外一项研究证实骨髓间充质干细胞可以缓解羊骨关节炎病情及改善软骨组织缺损。但是，BMSC取材困难，而且细胞增殖活性随着年龄增长而逐渐降低。
脂肪组织中含有一类具有多向分化潜力的细胞，即脂肪组织血管基质细胞(SVF)，SVF中包括脂肪间充质干细胞(MSC)，其生物学性质与骨髓间充质干细胞类似，可向脂肪、骨、软骨、肌肉内皮、造血、肝、胰岛和神经等多种细胞方向分化。脂肪组织在人体内储存量丰富，获取简便、创伤小。同样质量或体积的脂肪组织和骨髓组织，脂肪组织的数量远高于骨髓组织的数量。SVF细胞的增殖能力受年龄影响较小，其扩增能力比BMSC更强，在细胞连续培养扩增过程中，BMSC比SVF更容易发生早期衰老现象。而且，异体SVF相比于异体BMSC，异体SVF免疫反应更弱。因此，间充质干细胞能够替代一部分骨髓间充质干细胞，其具有更广阔的临床应用前景。
脂肪间充质干细胞一般是通过抽取人体脂肪组织获取，在抽取脂肪组织后需要进行分离处理才能获得可应用的脂肪间充质干细胞，但是现有的处理方法提取率低，得到的细胞纯度和活性也较低。
发明内容
基于此，有必要针对现有获取脂肪间充质干细胞的方法提取率低、纯度低的问题，提供一种脂肪间充质干细胞的制备方法，从脂肪组织中提取脂肪间充质干细胞的提取率高，纯度高。
一种脂肪间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
脂肪组织预处理：用组织清洗液将采集的脂肪组织清洗至无血液残留，将清洗后的脂肪组织剪碎，得到脂肪微粒；
消化：向脂肪微粒中加入脂肪组织消化液进行第一次消化，加入胰蛋白酶进行第二次消化，第二次消化后离心，去除上清液收集沉淀；其中，所述脂肪组织消化液包括DNA酶、I型胶原酶和Ⅲ型胶原酶；
清洗：将沉淀清洗干净，筛去组织块，离心得到脂肪间充质干细胞。
上述制备方法，对脂肪组织采用两步消化，充分的将脂肪组织消化，并获得丰富的有核细胞，从而使脂肪间充质干细胞得率高、纯度高、活性好，有利于应用于临床。
在其中一个实施例中，所述脂肪组织消化液包括以下使用浓度的组分：DNA酶0.02～0.05mg/mL，I型胶原酶0.4～0.6mg/mL，Ⅲ型胶原酶0.4～0.6mg/mL，溶剂为含双抗的DMEM培养基；所述含双抗的DMEM培养基中的双抗为0.5～1.0μg/mL的硫酸庆大霉素和0.5～1.0μg/mL两性霉素B。本发明选用DNA酶、I型胶原酶和Ⅲ型胶原酶作为脂肪组织消化液的组分，其中DNA酶可以分解DNA，排除DNA污染现象，I型胶原酶和Ⅲ型胶原酶搭配，能够更好的将脂肪组织充分的消化。以备获得更多，纯度跟高的脂肪间充质干细胞。
在其中一个实施例中，所述消化步骤具体为：保持消化处理温度为36～38℃，将脂肪组织消化液和胰蛋白酶预热至36～38℃，向脂肪微粒中加入脂肪组织消化液，混合均匀后震荡消化35～45min，转速为200～300r/min；加入胰蛋白酶，继续消化12～18min；消化完成后，离心4～6min，离心转速为1700～1900r/min，去除上清液收集沉淀。
在其中一个实施例中，所述脂肪组织预处理的具体步骤为：用组织清洗液将采集的脂肪组织清洗至无血液残留，将清洗干净的脂肪组织离心4～6min，离心转速为1000～1500r/min，离心后去除上清液；将清洗后的脂肪组织剪碎至体积为0.1～1mm3的脂肪微粒。
在其中一个实施例中，所述组织清洗液通过以下方法制备得到：将生理盐水、硫酸庆大霉素、两性霉素B和红细胞裂解液混合均匀，其中硫酸庆大霉素的浓度为25～35μg/mL，两性霉素B的浓度为8～12μg/mL，红细胞裂解液的用量为总体积的48％～52％。红细胞裂解可以有效清除样品中的血液。
在其中一个实施例中，所述清洗步骤具体为：用PBS溶液清洗沉淀，离心4～6min，离心转速为1500～2000r/min，去除上清液收集沉淀，如此重复用清洗2～4次，用生理盐水重悬沉淀，过100μm筛网去除大块组织，离心4～6min，离心转速为1500～2000r/min，得到脂肪间充质干细胞。
在其中一个实施例中，所述采集的脂肪组织在运输过程中需要添加组织保护液进行密封冷藏，冷藏温度为2～8℃，所述组织保护液通过以下方法制备得到：将生理盐水、硫酸庆大霉素、两性霉素B混合均匀，其中硫酸庆大霉素的浓度为25～35μg/mL，两性霉素B的浓度为8～12μg/mL。组织保护液可以有效预防运输过程中出现污染。
在其中一个实施例中，所述脂肪微粒在未使用时，需要分装至冻存管，加入冻存液进行冻存，所述冻存液的成分为：甘油、甘露醇和含有双抗的DMEM，甘油、甘露聚糖和含有双抗的DMEM的质量比为1:(2～3):(6～7)。冻存液用甘油代替DMSO，防止DMSO残留带来的副作用，甘露醇能够为细胞提供营养成分。
在其中一个实施例中，所述清洗步骤后设有培养步骤，所述培养步骤具体为：向清洗步骤中得到的脂肪间充质干细胞加入细胞培养液，取9～11mL接种至T75细胞培养瓶中，标记为P0代，于培养箱中静置培养，培养温度为37±0.5℃，CO2浓度为5％±0.5％；每隔4～5天更换一次细胞培养液，待细胞融合至60％～70％时进行传代培养，标记为P1代；所述细胞培养液的制备方法为：将含双抗的DMEM培养基、透明质酸钠、甘氨酸和抗坏血酸混合均匀。透明质酸钠、甘氨酸和抗坏血酸对细胞有较好的保护作用，同时还能提供营养，促进细胞的粘附、增殖分化能力。
本发明另一方面还提供上述制备方法得到的脂肪间充质干细胞。该脂肪间充质干细胞，具有纯度高、活性高的优点，有利于应用于临床。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的对脂肪组织采用两步消化，充分的将脂肪组织消化，并获得丰富的有核细胞，从而使得到的脂肪间充质干细胞得率高、纯度高、活性好，有利于应用于临床。
附图说明
图1为采用实施例1的方法得到的P0代脂肪间充质干细胞培养7天的照片；
图2为采用对比例1的方法得到的P0代脂肪间充质干细胞培养7天的照片；
图3为采用对比例2的方法得到的P0代脂肪间充质干细胞培养7天的照片；
图4为采用对比例3的方法得到的P0代脂肪间充质干细胞培养7天的照片；
图5为采用实施例1的方法得到的P3代脂肪间充质干细胞培养3天的照片；
图6为采用对比例1的方法得到的P3代脂肪间充质干细胞培养3天的照片；
图7为采用对比例2的方法得到的P3代脂肪间充质干细胞培养3天的照片；
图8为采用对比例3的方法得到的P3代脂肪间充质干细胞培养3天的照片。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1
一种脂肪间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
1)采集：采集人腹部或者大腿部采取脂肪块约30～40g，或通过抽脂获得脂肪组织悬液，悬液体积为40～50mL。
2)运输：将采集到的脂肪组织和组织保护液放置于运输瓶中密封冷藏运输，冷藏温度为2～8℃；
其中，组织保护液通过以下方法制备得到：将生理盐水、硫酸庆大霉素、两性霉素B混合均匀，其中硫酸庆大霉素的浓度为30μg/mL，两性霉素B的浓度为10μg/mL；
3)预处理：脂肪组织运抵实验室后，用组织清洗液将脂肪组织清洗至无血液残留，将清洗干净的脂肪组织离心5min，离心转速为1300r/min，离心后去除上清液，将清洗后的脂肪组织剪碎至体积为0.1～1mm3的脂肪微粒；
4)冻存：脂肪微粒未使用时，需要分装至冻存管，加入冻存液进行冻存；
其中，冻存液的成分为：甘油、甘露醇和含有双抗的DMEM，甘油、甘露聚糖和含有双抗的DMEM的质量比为2:5:13；
5)消化：保持环境温度为36～38℃，将脂肪组织消化液和胰蛋白酶预热至36～38℃，向脂肪微粒中加入与脂肪微粒体积相当的脂肪组织消化液，混合均匀后震荡消化40min，转速为150r/min；加入与脂肪组织消化液体积相当的胰蛋白酶，继续消化15min；消化完成后，离心5min，离心转速为1800r/min，去除上清液收集沉淀；
其中，脂肪组织消化液包括以下使用浓度的组分：DNA酶0.025mg/mL，I型胶原酶0.5mg/mL，Ⅲ型胶原酶0.5mg/mL，溶剂为含双抗的DMEM培养基，含双抗的DMEM培养基中的双抗为1.0μg/mL的硫酸庆大霉素和1.0μg/mL两性霉素B；
6)清洗：用PBS溶液清洗步骤5)中收集的沉淀，离心5min，离心转速为1800r/min，去除上清液收集沉淀，如此重复用清洗3次，用生理盐水重悬沉淀，过100μm筛网去除大块组织，离心5min，离心转速为1800r/min，得到脂肪间充质干细胞；
其中，组织清洗液通过以下方法制备得到：将生理盐水、硫酸庆大霉素、两性霉素B和红细胞裂解液混合均匀，其中硫酸庆大霉素的浓度为30μg/mL，两性霉素B的浓度为10μg/mL，红细胞裂解液的体积分数为50％；
7)培养：向清洗步骤中得到的脂肪间充质干细胞加入细胞培养液，吸取细胞液接种至T75细胞培养瓶中，每个T75细胞培养瓶中细胞液为10mL，标记为P0代，于培养箱中静置培养，培养温度为37±0.5℃，CO2浓度为5％±0.5％；每隔5天更换一次细胞培养液，待细胞融合至60％～70％时进行传代培养，标记为P1代，根据需要可继续传代；
其中，细胞培养液的制备方法为：将含双抗的DMEM培养基、透明质酸钠、甘氨酸和抗坏血酸混合均匀。
实施例2
一种脂肪间充质干细胞的制备方法，与实施例1的区别在于，脂肪组织消化液中Ⅲ型胶原酶的浓度为0.4mg/mL。
实施例3
一种脂肪间充质干细胞的制备方法，与实施例1的区别在于，脂肪组织消化液中III型胶原酶的浓度为0.6mg/mL。
对比例1
一种脂肪间充质干细胞的制备方法，与实施例1的区别在于，消化步骤中脂肪组织消化液的包括以下使用浓度的组分：DNA酶0.025mg/mL，I型胶原酶0.5mg/mL，溶剂为含双抗的DMEM培养基。
对比例2
一种脂肪间充质干细胞的制备方法，与实施例1的区别在于，消化步骤中脂肪组织消化液的包括以下使用浓度的组分：DNA酶0.025mg/mL，III型胶原酶0.5mg/mL，溶剂为含双抗的DMEM培养基。
对比例3
一种脂肪间充质干细胞的制备方法，与实施例1的区别在于，消化步骤中脂肪组织消化液的包括以下使用浓度的组分：DNA酶0.05mg/mL，I型胶原酶0.5mg/mL，中性蛋白酶0.5mg/mL，溶剂为含双抗的DMEM培养基。
实验例1
采用倒置显微镜对实施例和对比例得到的P0代培养7天后的细胞和P3代培养3天后的细胞进行拍照，照片如图1～6所示；采用Cell count进行细胞计数，计数结果如表1所示：
表1脂肪间充质干细胞计数表
从表1可见，相比于对比例，采用本发明的方法得到的脂肪间充质干细胞的数量更高，表明采用本发明的方法提取率更高，得到的细胞增殖速度快，活性好。尤其是本发明实施例1中的脂肪组织消化液采用I型胶原酶和III型胶原酶配合使用，得到的细胞数量是对比例的2.5～3.3倍，表明其增殖速度最快，活性最好。
从图1～8可以看出，采用本发明的方法得到的脂肪间充质干细胞的纯度较高，其中实施例1的细胞生长状态最好，纯度最高。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
脂肪组织预处理：用组织清洗液将采集的脂肪组织清洗至无血液残留，将清洗后的脂肪组织剪碎，得到脂肪微粒；
消化：向脂肪微粒中加入脂肪组织消化液进行第一次消化，加入胰蛋白酶进行第二次消化，第二次消化后离心，去除上清液收集沉淀；其中，所述脂肪组织消化液包括DNA酶、I型胶原酶和Ⅲ型胶原酶；
清洗：将沉淀清洗干净，筛去组织块，离心得到脂肪间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述脂肪组织消化液包括以下使用浓度的组分：DNA酶0.02～0.05mg/mL，I型胶原酶0.4～0.6mg/mL，Ⅲ型胶原酶0.4～0.6mg/mL，溶剂为含双抗的DMEM培养基；所述含双抗的DMEM培养基中的双抗为0.5～1.0μg/mL的硫酸庆大霉素和0.5～1.0μg/mL的两性霉素B。
3.根据权利要求2所述的脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述消化步骤具体为：保持消化处理温度为36～38℃，将脂肪组织消化液和胰蛋白酶预热至36～38℃，向脂肪微粒中加入脂肪组织消化液，混合均匀后震荡消化35～45min，转速为200～300r/min；加入胰蛋白酶，继续消化12～18min；消化完成后，离心4～6min，离心转速为1700～1900r/min，去除上清液收集沉淀。
4.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述脂肪组织预处理的具体步骤为：用组织清洗液将采集的脂肪组织清洗至无血液残留，将清洗干净的脂肪组织离心4～6min，离心转速为1000～1500r/min，离心后去除上清液；将清洗后的脂肪组织剪碎至体积为0.1～1mm3的脂肪微粒。
5.根据权利要求4所述的脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述组织清洗液通过以下方法制备得到：将生理盐水、硫酸庆大霉素、两性霉素B和红细胞裂解液混合均匀，其中硫酸庆大霉素的浓度为25～35μg/mL，两性霉素B的浓度为8～12μg/mL，占总体积48％～52％的红细胞裂解液。
6.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述清洗步骤具体为：用PBS溶液清洗沉淀，离心4～6min，离心转速为1500～2000r/min，去除上清液收集沉淀，如此重复用清洗2～4次，用生理盐水重悬沉淀，过100μm筛网去除大块组织，离心4～6min，离心转速为1500～2000r/min，得到脂肪间充质干细胞。
7.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述采集的脂肪组织在运输过程中需要添加组织保护液进行密封冷藏，冷藏温度为2～8℃，所述组织保护液通过以下方法制备得到：将生理盐水、硫酸庆大霉素、两性霉素B混合均匀，其中硫酸庆大霉素的浓度为25～35μg/mL，两性霉素B的浓度为8～12μg/mL。
8.根据权利要求7所述的脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述脂肪微粒在未使用时，需要分装至冻存管，加入冻存液进行冻存，所述冻存液的成分为：甘油、甘露醇和含有双抗的DMEM，甘油、甘露聚糖和含有双抗的DMEM的质量比为1:(2～3):(6～7)。
9.根据权利要求1～8任一项所述的脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述清洗步骤后设有培养步骤，所述培养步骤具体为：向清洗步骤中得到的脂肪间充质干细胞加入细胞培养液，取9～11mL接种至T75细胞培养瓶中，标记为P0代，于培养箱中静置培养，培养温度为37±0.5℃，CO2浓度为5％±0.5％；每隔4～5天更换一次细胞培养液，待细胞融合至60％～70％时进行传代培养，标记为P1代；所述细胞培养液的制备方法为：将含双抗的DMEM培养基、透明质酸钠、甘氨酸和抗坏血酸混合均匀。
10.一种采用权利要求1～9任一项所述的制备方法得到的脂肪间充质干细胞。
CN201910790168.XA 2019-08-26 2019-08-26 脂肪间充质干细胞的制备方法 Pending CN110438072A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910790168.XA CN110438072A (zh) 2019-08-26 2019-08-26 脂肪间充质干细胞的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910790168.XA CN110438072A (zh) 2019-08-26 2019-08-26 脂肪间充质干细胞的制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110438072A true CN110438072A (zh) 2019-11-12

Family

ID=68437648

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910790168.XA Pending CN110438072A (zh) 2019-08-26 2019-08-26 脂肪间充质干细胞的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110438072A (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111826347A (zh) * 2020-06-03 2020-10-27 和携科技有限公司 一种从人脂肪组织中高效获取原代间充质干细胞的方法
CN112226406A (zh) * 2020-10-19 2021-01-15 中国医学科学院北京协和医院 一种人体血管周围脂肪组织单细胞悬液制备方法
CN112779213A (zh) * 2021-02-04 2021-05-11 河南科技大学 一种犬米色脂肪干细胞体外分离培养方法
CN113416694A (zh) * 2021-07-21 2021-09-21 江苏瑞思坦生物科技有限公司 一种从微量脂肪中高效获得脂肪间充质干细胞的方法
CN114606183A (zh) * 2022-03-17 2022-06-10 上海坤爱生物科技股份有限公司 一种动物源脂肪干细胞分离提取方法
CN114832016A (zh) * 2022-04-19 2022-08-02 芙普瑞生物细胞科学(苏州)有限公司 脂肪svf细胞制剂及其应用
CN115011480A (zh) * 2022-01-12 2022-09-06 昆明理工大学 一种从动物组织中分离微生物的方法及其用途

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2354220A1 (de) * 2010-01-29 2011-08-10 Karl Georg DDR Heinrich Verfahren zur Herstellung einer mesenchymalen Stammzellenpräparation
CN104673745A (zh) * 2015-02-05 2015-06-03 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种猪脂肪干细胞的分离培养方法
CN105907710A (zh) * 2016-05-05 2016-08-31 何红葖 一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法
CN105969726A (zh) * 2016-07-19 2016-09-28 安徽惠恩生物科技股份有限公司 一种脂肪源干细胞提取制备方法
CN106754685A (zh) * 2017-01-17 2017-05-31 四川华皓生物科技有限公司 一种人脂肪间充质干细胞库的构建方法
CN107858329A (zh) * 2017-12-15 2018-03-30 英科博雅生命科技有限公司 从脂肪中分离脂肪间充质干细胞的方法和使用的试液
CN108004207A (zh) * 2017-12-15 2018-05-08 英科博雅生命科技有限公司 从脂肪中获取大量脂肪间充质干细胞的方法
CN108728411A (zh) * 2018-06-26 2018-11-02 吉林省太阳鸟再生医学工程有限责任公司 一种脂肪干细胞的分离培养方法
CN108823148A (zh) * 2018-07-23 2018-11-16 广东唯泰生物科技有限公司 一种脂肪间充质干细胞诱导分化为肝脏样细胞的方法
CN108865988A (zh) * 2018-07-23 2018-11-23 广东唯泰生物科技有限公司 一种人羊膜间充质干细胞分离、培养及纯化方法
CN109112094A (zh) * 2018-08-10 2019-01-01 广东唯泰生物科技有限公司 一种脂肪间充质干细胞诱导分化为血管内皮细胞的方法
CN109486753A (zh) * 2017-09-12 2019-03-19 深圳华云生物科技发展有限公司 一种脂肪干细胞提取方法

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2354220A1 (de) * 2010-01-29 2011-08-10 Karl Georg DDR Heinrich Verfahren zur Herstellung einer mesenchymalen Stammzellenpräparation
CN104673745A (zh) * 2015-02-05 2015-06-03 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种猪脂肪干细胞的分离培养方法
CN105907710A (zh) * 2016-05-05 2016-08-31 何红葖 一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法
CN105969726A (zh) * 2016-07-19 2016-09-28 安徽惠恩生物科技股份有限公司 一种脂肪源干细胞提取制备方法
CN106754685A (zh) * 2017-01-17 2017-05-31 四川华皓生物科技有限公司 一种人脂肪间充质干细胞库的构建方法
CN109486753A (zh) * 2017-09-12 2019-03-19 深圳华云生物科技发展有限公司 一种脂肪干细胞提取方法
CN107858329A (zh) * 2017-12-15 2018-03-30 英科博雅生命科技有限公司 从脂肪中分离脂肪间充质干细胞的方法和使用的试液
CN108004207A (zh) * 2017-12-15 2018-05-08 英科博雅生命科技有限公司 从脂肪中获取大量脂肪间充质干细胞的方法
CN108728411A (zh) * 2018-06-26 2018-11-02 吉林省太阳鸟再生医学工程有限责任公司 一种脂肪干细胞的分离培养方法
CN108823148A (zh) * 2018-07-23 2018-11-16 广东唯泰生物科技有限公司 一种脂肪间充质干细胞诱导分化为肝脏样细胞的方法
CN108865988A (zh) * 2018-07-23 2018-11-23 广东唯泰生物科技有限公司 一种人羊膜间充质干细胞分离、培养及纯化方法
CN109112094A (zh) * 2018-08-10 2019-01-01 广东唯泰生物科技有限公司 一种脂肪间充质干细胞诱导分化为血管内皮细胞的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JÉRÔME LALOZE ET AL: "A Novel Method of Human Adipose-Derived Stem Cell Isolation with Resultant Increased Cell Yield", 《PLAST RECONSTR SURG》 *
刘鼎新 等: "《细胞生物学研究方法与技术（第二版）》", 31 May 1997, 北京医科大学 中国协和医科大学联合出版社 *
王二云: "大鼠脂肪间充质干细胞的分离培养及向心肌细胞诱导分化的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》 *
齐凯 等: "人脐带来源间充质干细胞分离培养方法的优化", 《中国组织工程研究与临床康复》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111826347A (zh) * 2020-06-03 2020-10-27 和携科技有限公司 一种从人脂肪组织中高效获取原代间充质干细胞的方法
CN112226406A (zh) * 2020-10-19 2021-01-15 中国医学科学院北京协和医院 一种人体血管周围脂肪组织单细胞悬液制备方法
CN112779213A (zh) * 2021-02-04 2021-05-11 河南科技大学 一种犬米色脂肪干细胞体外分离培养方法
CN113416694A (zh) * 2021-07-21 2021-09-21 江苏瑞思坦生物科技有限公司 一种从微量脂肪中高效获得脂肪间充质干细胞的方法
CN115011480A (zh) * 2022-01-12 2022-09-06 昆明理工大学 一种从动物组织中分离微生物的方法及其用途
CN115011480B (zh) * 2022-01-12 2023-07-25 昆明理工大学 一种从动物组织中分离微生物的方法及其用途
CN114606183A (zh) * 2022-03-17 2022-06-10 上海坤爱生物科技股份有限公司 一种动物源脂肪干细胞分离提取方法
CN114832016A (zh) * 2022-04-19 2022-08-02 芙普瑞生物细胞科学(苏州)有限公司 脂肪svf细胞制剂及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110438072A (zh) 脂肪间充质干细胞的制备方法
JP2022167950A (ja) 椎間板の修復および／または再構成
JP6745713B2 (ja) 椎間板の修復および／または再構成
CN104958320A (zh) 一种治疗骨关节炎的细胞制剂及其制备方法
CN108348555B (zh) 细胞扩增方法和治疗组合物
CN105062959A (zh) 一种人羊膜间充质干细胞的分离培养方法
CN106754674A (zh) 从人胎盘羊膜制备羊膜间充质干细胞的方法及其应用
AU2006293780A1 (en) Kit for preparing a composition comprising fat cells
CN105238751A (zh) 一种脐带组织间充质干细胞的分离培养方法
CN106913583A (zh) 人间充质干细胞源外泌体生物活性制剂的制备方法及应用
CN108865986B (zh) 用于修复关节软骨损伤/缺损的间充质干细胞制剂及其制备方法和应用
CN106434557A (zh) 由脐带间充质干细胞制备cd34阳性细胞的方法
Wang et al. Comparison of in vivo adipogenic capabilities of two different extracellular matrix microparticle scaffolds
CN102517251A (zh) 一种间充质干细胞及其制备方法和应用
CN105820998A (zh) 临床回输级细胞治疗用人脂肪干细胞ADSCs分离提取培养方法
CN103223194A (zh) 一种用于软骨损伤修复的软骨移植物及其制备方法
JP2019508455A (ja) クローン病における肛囲複雑瘻孔の治療において使用するための脂肪組織由来間質幹細胞
CN105687239A (zh) 一种脂肪干细胞组合物及其制备方法
CN102965337A (zh) 分离提取人皮下脂肪间充质干细胞的方法和提取专用培养基
Taha et al. Adipose-derived stem/progenitor cells from lipoaspirates: A comparison between the Lipivage200-5 liposuction system and the Body-Jet liposuction system
CN108653329A (zh) 一种用于治疗骨关节炎的药物及其制备方法
Han et al. Comparison between intra-articular injection of infrapatellar fat pad (IPFP) cell concentrates and IPFP-mesenchymal stem cells (MSCs) for cartilage defect repair of the knee joint in rabbits
US9956317B2 (en) Clinical applications of formulations containing adipose-derived stem cells
CN111849887A (zh) 一种自体脂肪三维凝胶及其svf干细胞的制备方法及应用
CN111235091A (zh) 一种人自体脂肪血管基质成分svf的提取试剂及提取方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20191112

RJ01 Rejection of invention patent application after publication