CN108653329A - 一种用于治疗骨关节炎的药物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于治疗骨关节炎的药物,其包括体积比为1:1:1的质量浓度为10%的透明质酸、脂肪组织血管基质细胞和富血小板血浆。
Description
技术领域
本发明属于干细胞与再生医学领域,具体涉及一种用于治疗骨关节炎的药物,以及该药物的制备方法。
背景技术
骨关节炎(OA)是一种严重的退行性关节病变,又称退行性关节炎或骨性关节炎,是中老年人中比较常见的一种慢性疾病。其发病因素很多,包括肥胖、年龄增长伴随的关节软骨磨损、外伤、内分泌紊乱等,随着病情发展,患者关节软骨组织发生改变后会导致患者疼痛、关节僵硬及功能丧失,严重影响生活质量,增加家庭和社会的负担。本病发病之初大多采取保守治疗,包括消炎、镇痛、关节润滑等,病情发展到后期整个关节功能丧失后只能采取人工关节置换手术。骨关节炎现有治疗手段大多采取保守疗法,轻度疼痛患者主要给予理疗、口服非甾类药物消炎镇痛、关节腔内注射透明质酸润滑等方法,对于重度患者采取人工关节置换手术。理疗或者镇痛药物并不能缓解病情,随着病情发展,患者最终需要置换人工关节,关节置换手术费用昂贵,也给患者带来巨大痛苦。
间充质干细胞治疗骨关节炎是近十年兴起的技术,一般选用异体脐带间充质干细胞(UC-MSC)、自体骨髓间充质干细胞(BMSC)或自体脂肪间充质干细胞(ADSC)作为种子细胞进行治疗。2012年有研究显示关节腔内注射骨髓间充质干细胞(BMSC)可以使OA模型动物关节软骨再生。2012年另外一项研究证实骨髓间充质干细胞(BMSC)可以缓解羊骨关节炎病情进展及改善软骨组织缺损。但是异体间充质干细胞在临床上的应用存在伦理问题,在现行政策法规当中无法临床应用,自体骨髓间充质干细胞和自体脂肪间充质干细胞也需要体外培养扩增,面临取材困难、细胞增殖活性随着年龄增长而逐渐降低的问题。因此来源广泛、取材方便、创伤小、无体外培养要求的脂肪组织血管基质细胞是用于关节软骨修复的理想的细胞。
脂肪组织血管基质细胞(SVF)就是将抽脂手术抽取的脂肪组织通过适当的消化酶消化分解,离心后获取的脂肪细胞外的细胞成分,SVF中包含大量的血液衍生细胞和脂肪衍生细胞,包括淋巴细胞、血管内皮细胞、脂肪间充质干细胞、成纤维细胞等。抽取适量的脂肪组织可以获得足够多的脂肪衍生细胞,这些细胞可以不经过体外扩增培养直接应用于临床,通常10ml脂肪组织可以分离出500-1000万有核细胞,而这些有核细胞中至少10%是脂肪间充质干细胞。和体外扩增的脂肪间充质干细胞相比,这些新鲜分离的细胞可以更加安全有效的临床治疗,FDA甚至将过夜培养的细胞定性为超过最低限度处理的细胞(21CFRPARTs 16、1270和1271)。
发明内容
本发明的一个目的是针对以上要解决的技术问题,提供一种能够有效治疗骨关节炎的药物。
本发明的另一个目的是提供所述药物的制备方法。
为此,本发明提供了一种用于治疗骨关节炎的药物,其包括体积比为1:1:1的质量浓度为10%的透明质酸、脂肪组织血管基质细胞和富血小板血浆。
作为一种优选的实施方式,通过先使用组织消化酶组合物消化脂肪组织然后再用浓度为0.05%的胰蛋白酶EDTA溶液消化,得到所述脂肪组织血管基质细胞,所述组织消化酶组合物包括重量比例为20:20:10:1的生理盐水、I型胶原酶、中性分离酶和DNA酶。
优选地,所述组织消化酶组合物、所述脂肪组织与所述胰蛋白酶EDTA溶液的体积比为1:1:1。
优选地,所述脂肪组织为自体脂肪组织。
作为一种优选的实施方式,所述脂肪组织血管基质细胞为自体脂肪组织血管基质细胞。
作为一种优选的实施方式,所述药物为注射针剂。
作为一种优选的实施方式,所述富血小板血浆通过以下步骤制备获得:向外周血加入肝素钠抗凝,离心后吸取上层血浆和白细胞层,然后再次离心,去除上层多余血浆和下层红细胞,取中间层血浆,即得到富血小板血浆。
本发明还提供了所述药物的制备方法,其包括以下步骤:
(1)将脂肪组织清洗干净,离心;
(2)向所述脂肪组织中加入与所述脂肪组织等体积的组织消化酶组合物,震荡消化,其中所述组织消化酶组合物包括重量比例为20:20:10:1的生理盐水、I型胶原酶、中性分离酶和DNA酶;
(3)消化结束后再加入与所述脂肪组织等体积的质量浓度为0.05%的胰蛋白酶EDTA溶液,震荡消化;
(4)消化结束后离心,分离去除上层油脂和消化液,得到下层细胞;
(5)用生理盐水清洗所述下层细胞,离心去除上清液,得到沉淀;
(6)将所述沉淀用生理盐水再次重悬并筛除大块组织,再次离心得到脂肪组织血管基质细胞;
(7)将所述透明质酸、所述脂肪组织血管基质细胞与所述富血小板血浆混合,得到所述用于治疗骨关节炎的药物。
现有脂肪组织血管基质细胞治疗骨关节炎多为脂肪组织血管基质细胞生理盐水悬液或脂肪组织血管基质细胞悬浮于富血小板血浆中注射,本发明的药物配方中,添加10%(质量浓度)的临床级大分子量的透明质酸作为细胞粘附的支架材料,有利于注射的脂肪组织血管基质细胞在关节腔内停留并粘附到受损软骨部位,并在前期为关节活动提供润滑作用,在各种生长因子作用下促进受损软骨组织再生,且脂肪组织血管基质细胞注射针剂营养丰富,为受损软骨修复提供丰富的营养,可达到最佳的修复效果。
另一方面,本发明的药物制备方法中,优化了脂肪组织消化酶的配方和消化步骤。不同的消化酶配方和消化步骤对制备得到的脂肪组织血管基质细胞数量及活性影响巨大,现有脂肪组织血管基质细胞制备技术都是直接采用I型胶原酶消化,本发明是通过多次实验后得到的消化酶组合配方和两步消化方法。通过本发明的方法,能够最大限度的分离脂肪组织中的有核细胞,脂肪组织血管基质细胞得率高、脂肪组织血管基质细胞注射针剂营养丰富、注射到关节腔内的脂肪组织血管基质细胞更容易粘附在受损的关节软骨处,达到最佳的治疗效果。此外,自体脂肪组织血管基质细胞(SVF)和自体富血小板血浆(PRP)处理时间短,细胞活性高,无临床应用的伦理问题,可用广泛适用于临床治疗。富血小板血浆(PRP)来自患者自体外周血,不存在免疫排斥反应,取材方便、制作简单,富血小板血浆关节腔内注射改善关节腔内微环境,可以为脂肪组织血管基质细胞生长分化为软骨细胞修复受损软骨组织提供丰富营养。实验结果表明,脂肪组织血管基质细胞(SVF)联合自体富血小板血浆(PRP)可以有效治疗退行性关节炎,修复受损关节软骨,改善患者生活质量。
附图说明
图1是比格犬的骨骼MRI成像结果。
图2是比格犬的骨骼X光成像结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的详述,但本发明并不限于以下实施例。
如未特别指出,本发明所使用的试剂均为现有试剂,可通过商业渠道获得。
按照以下步骤制备注射针剂:
1、采集30ml受试者脂肪组织后密封于运输瓶中冷藏运输(4-8℃),运输瓶中需要添加50ml组织保护液,组织保护液由生理盐水添加25μg/ml的硫酸庆大霉素和5μg/ml的两性霉素B配制,确保运输过程中无细菌和真菌污染。
2、脂肪组织运抵实验室后组织清洗液清洗干净,组织清洗液由生理盐水添加25μg/ml的硫酸庆大霉素和5μg/ml的两性霉素B配制,直至清洗液无血液残留。
3、清洗干净的脂肪组织于水平离心机中低速离心(800r/min)离心1分钟,去除多余清洗液。
4、脂肪组织加入等体积的组织消化酶组合物于37℃环境中震荡消化45分钟,震荡转速为150r/min。组织消化酶组合物配方是:生理盐水(10ml)+I型胶原酶(10mg)+中性分离酶(5mg)+DNA酶(0.5mg)。
5、消化结束后再加入等体积胰蛋白酶EDTA溶液(浓度为0.05%wt)震荡消化10分钟,脂肪组织:组织消化酶组合物:胰蛋白酶体积比为1:1:1。
6、消化结束后离心分离细胞和油脂,离心参数为1500r/min,离心5min,去除上层油脂和消化液。
7、生理盐水清洗2次,每次离心去除上清液,得到沉淀。
8、沉淀用生理盐水再次重悬并过100μm筛网去除大块组织,再次离心得到脂肪组织血管基质细胞。
9、抽取受试者自体外周血30ml(加入适量肝素钠抗凝),离心(2000r/min)10min,吸取上层血浆和白细胞层;再次离心(4000r/min)8min,去除上层多余血浆和下层红细胞,取中间层3ml血浆得到富血小板血浆。
10、取3ml透明质酸(10%wt)与新鲜制备的3ml富血小板血浆和脂肪组织血管基质细胞混合得到脂肪组织血管基质细胞注射针剂,吸入5ml规格的一次性注射器中。
11、脂肪组织血管基质细胞注射针剂在2小时内注射到受试者关节腔中。
效果验证:
按照以上步骤,以患有骨关节炎的比格犬为实验对象(即受试者),制备得到脂肪组织血管基质细胞(SVF)注射针剂,每个关节腔内注射3ml液体(注射一次),内含3×107SVF细胞,用于比格犬关节软骨修复。分别于注射2周和4周后,对比格犬骨骼进行MRI成像和X光成像,观察关节软骨修复效果。
如图1所示,MRI成像显示治疗组股骨远端及关节周边高信号区域持续减少,髌骨腹侧逐步光滑,髌骨及滑车槽中间逐步软骨新生与关节液新生。提示软骨逐步新生。对照组股骨远端及关节周边高信号区域未见减少,髌骨腹侧未见明显好转,髌骨及滑车槽中间未见明显好转。
此外,如图2所示,X光成像显示治疗组髌骨腹侧缺损逐步恢复,滑车脊缺损也逐步恢复,低密度区域(软骨)也逐步增加,关节内其他结构未受明显影响。对照组X线结果未见明显好转,锯齿状缺损稍平滑,但未见明显平滑,从X线来看,髌骨腹侧缺损恢复缓慢,滑车脊缺损未见明显恢复,低密度区域(软骨)未见明显增长。
Claims (8)
1.一种用于治疗骨关节炎的药物,其特征在于包括体积比为1:1:1的质量浓度为10%的透明质酸、脂肪组织血管基质细胞和富血小板血浆。
2.根据权利要求1所述的药物,其特征在于,通过先使用组织消化酶组合物消化脂肪组织然后再用浓度为0.05%的胰蛋白酶EDTA溶液消化,得到所述脂肪组织血管基质细胞,所述组织消化酶组合物包括重量比例为20:20:10:1的生理盐水、I型胶原酶、中性分离酶和DNA酶。
3.根据权利要求2所述的药物,其特征在于,所述组织消化酶组合物、所述脂肪组织与所述胰蛋白酶EDTA溶液的体积比为1:1:1。
4.根据权利要求2所述的药物,其特征在于,所述脂肪组织为自体脂肪组织。
5.根据权利要求1所述的药物,其特征在于,所述脂肪组织血管基质细胞为自体脂肪组织血管基质细胞。
6.根据权利要求1所述的药物,其特征在于,所述药物为注射针剂。
7.根据权利要求1所述的药物,其特征在于,所述富血小板血浆通过以下步骤制备获得:向外周血加入肝素钠抗凝,离心后吸取上层血浆和白细胞层,然后再次离心,去除上层多余血浆和下层红细胞,取中间层血浆,即得到富血小板血浆。
8.权利要求1至7任一项所述的药物的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)将脂肪组织清洗干净,离心;
(2)向所述脂肪组织中加入与所述脂肪组织等体积的组织消化酶组合物,震荡消化,其中所述组织消化酶组合物包括重量比例为20:20:10:1的生理盐水、I型胶原酶、中性分离酶和DNA酶;
(3)消化结束后再加入与所述脂肪组织等体积的质量浓度为0.05%的胰蛋白酶EDTA溶液,震荡消化;
(4)消化结束后离心,分离去除上层油脂和消化液,得到下层细胞;
(5)用生理盐水清洗所述下层细胞,离心去除上清液,得到沉淀;
(6)将所述沉淀用生理盐水再次重悬并筛除大块组织,再次离心得到所述脂肪组织血管基质细胞;
(7)将所述透明质酸、所述脂肪组织血管基质细胞与所述富血小板血浆混合,得到所述用于治疗骨关节炎的药物。
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