TWI411443B - 富含血小板血漿衍生之生長因子複合物之製備方法以及於活體外促進一組織生長之方法 - Google Patents
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Description
本發明關於一種生長因子複合物、其製備方法及其用途，並且特別地，該生長因子複合物係由富含血小板血漿(Platelet-rich plasma,PRP)所衍生之生長因子複合物。
血小板(platelet)具有凝血、止血等功能，因此在人體中扮演著重要的角色。當血管受創時，血小板特有的胞器α顆粒(α granule)，被活化釋放出內含物，如凝血因子(von Willebrand factor)及纖維蛋白原(fibrinogen)。這些內含物可促使血小板附著在血管壁上並且聚集，達成初步的止血。
近幾年，研究人員還發現，血小板在組織修復和再生過程中，也擔任了非常重要的角色。經實驗證實，α顆粒被活化時，會釋放一些生長因子，例如血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)、轉型生長因子β(transforming growth factors,TGF-β)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、表皮生長因子(epithelial growth factor,EGF)、類胰島素生長因子(insulin-like growth factor,IGF)等。這些生長因子在傷口癒合過程中，可促進細胞的增生、移動、分化以及膠原蛋白合成、血管新生等。因此，已經有醫師在病人手術後，以富含血小板血漿注射至病人體內，以促進骨骼再生。
學者Carmago等人於2000年發表了製備富含血小板血漿的方法。該方法包含下列步驟：首先，抽取病人全血10毫升，加入10%檸檬酸鈉抗凝血劑(trisodium citrate)混合。接著，將全血置於離心管中，以每分鐘5600轉的轉速加以分層離心(gradient density centrifugation)，6分鐘之後可將離心管中的全血分成三部份：最底層為紅血球，最上層為血小板含量很少的血漿，中間層就是血小板含量豐富的血漿。
隨後，先將最上層血小板含量很少的血漿(約2毫升)取出丟棄，再收集中間層血漿，即為富含血小板血漿，並儲存之。此外，使用此富含血小板血漿時，可加入含有10%氯化鈣(calcium chloride)的生理食鹽水及同體積的100單位/毫升牛萃取的凝血脢(bovine thrombin)促進其中的血小板釋出生長因子，再將此富含血小板血漿注射到欲治療的部位。經臨床實驗證實，前述方法可有效地促進傷口癒合，也可有效促進組織(例如，骨組織)的生長速率。
然而，由於富含血小板血漿中含有血漿或血液中的其他物質，因此可能會活化病患體內的巨噬細胞(macrophage)前來吞噬血漿等物質，引發二度發炎。
因此，本發明之一範疇在於提供一種富含血小板血漿衍生之生長因子複合物之製備方法，用以自全血中分離純化出富含血小板血漿衍生之生長因子複合物，以解決先前技術中的問題。
於一具體實施例中，該製備方法包含下列步驟：(a)獲得一全血樣本，並且將該全血樣本離心；(b)收集經步驟(a)離心後之一上層液，並將該上層液離心；(c)收集經步驟(b)離心後之一中層液，將一活化劑與該中層液混合形成一混合液，並將該混合液離心；以及(d)收集經步驟(c)離心後之一上清液，並過濾該上清液，以獲得含有該富含血小板血漿衍生之生長因子複合物之一標的溶液。
本發明之另一範疇在於提供一種富含血小板血漿衍生之生長因子複合物。於一具體實施例中，該富含血小板血漿衍生之生長因子複合物係分離自一全血樣本，並且其係經由如前所述之製備方法所獲得。
本發明之再一範疇在於提供一種醫藥組合物，用以促進一組織的生長。於一具體實施例中，該醫藥組合物包含有效量之前述的富含血小板血漿衍生之生長因子複合物，以及醫藥可接受之載劑。特別地，該組織可以是如椎間盤組織等骨骼組織，或是其他組織。
本發明之又一範疇在於提供一種促進一病患之一組織生長之方法。於一具體實施例中，該方法包含下列步驟：(a)獲得該病患之一全血樣本，並且將該全血樣本離心；(b)收集經步驟(a)離心後之一上層液，並將該上層液離心；(c)收集經步驟(b)離心後之一中層液，將一活化劑與該中層液混合形成一混合液，並將該混合液離心；(d)收集經步驟(c)離心後之一上清液，並過濾該上清液，以獲得含有該富含血小板血漿衍生之生長因子複合物之一標的溶液；(e)將該標的溶液製成一醫藥組合物；以及(f)將該醫藥組合物投藥至該病患。於實際應用中，前述投藥可藉由注射方式進行，或是由其他適當的方式進行。
綜合上述，本發明之方法可自病患本身的全血中分離出富含血小板血漿衍生之生長因子複合物，並且將其製備成醫藥組合物，以投藥給病患，促進病患的組織生長。特別地，根據本發明之富含血小板血漿衍生之生長因子複合物不含血漿、血小板或其他血球之殘骸，物質組成單純，因此可解決先前技術中的問題。
關於本發明之優點與精神可以藉由以下的發明詳述及所附圖式得到進一步的瞭解。
請參見圖一，圖一係繪示根據本發明之一具體實施例的富含血小板血漿衍生之生長因子複合物之製備方法流程圖。如圖一所示，該方法包含下列步驟：
首先，執行步驟S10，獲得一全血樣本，並加入檸檬酸鈉等抗凝血劑，以防止全血樣本過快凝結。隨後，執行步驟S12，將前述全血樣本於室溫下，以每分鐘1,000~3,000轉的轉速離心1~5分鐘。請注意，於實務中，此離心條件可視情況進行適當地調整，並不限於本具體實施例。
經過步驟S12後，前述全血樣本會成為主要包含上下兩層的層狀樣態，其中上層主要為血漿，而下層主要為紅血球、白血球等。
接著，執行步驟S14，收集步驟S12離心後的上層液(即血漿)，並將該上層液於室溫下，以每分鐘2,000~5,000轉的轉速離心5~10分鐘。請注意，於實務中，此離心條件可視情況進行適當地調整，並不限於本具體實施例。
經過步驟S14後，前述上層液會成為層狀樣態，其中間層主要包含富含血小板血漿。根據測量，以前述步驟S10至S14所取得之中間層所包含的血小板濃度可達500k/μl以上。
接著，執行步驟S16，收集此中層液，並且將活化劑(例如，但不受限於，凝血酶(thrombin))與該中層液混合形成混合液。此活化劑可造成中層液裡的血小板破裂，並釋出α顆粒。如前所述，這些α顆粒內含多樣的生長因子，例如，但不限於PDGF、TGF-β、VEGF、EGF、IGF-I、II等，以及多樣的細胞貼附性因子，例如，但不限於纖維蛋白(fibrin)、纖維結合素(fibronectin)、玻連蛋白(vitronectin)等。
於實務中，將活化劑與中層液混合後可藉由每分鐘100~500轉的速度持續振盪1~5小時，以使前述之生長因子以及細胞貼附性因子充分釋放至混合液中。於實務中，此振盪條件可視情況進行適當地調整，並不限於本具體實施例。
接著，執行步驟S18，將該混合液以每分鐘300~1,000轉的轉速離心1~5分鐘。同樣地，於實務中，此離心條件可視情況進行適當地調整，並不限於本具體實施例。
最後，執行步驟S20，收集經步驟S18離心後之上清液，並過濾此上清液，以獲得含有富含血小板血漿衍生之生長因子複合物之標的溶液。於實際應用中，此處的過濾可藉由孔徑為0.1~0.5μm之過濾單元來進行。當然，於實務中，可是情況使用不同孔徑的過濾單元，或者使用其他過濾方式來進行過濾。
於本具體實施例中，本發明之方法還包含步驟S22，將步驟S20所獲得的含有富含血小板血漿衍生之生長因子複合物之標的溶液冷凍乾燥成標的粉體；以及步驟S24，冷凍保存標的粉體(例如，於-20℃、-80℃等低溫冷凍保存)。
於實際應用中，本發明之方法也可直接冷凍保存該標的溶液。請參見下表一，表一列示不同保存溫度以及保存時間對富含血小板血漿衍生之生長因子複合物中的TGF-β之含量(單位為pg/ml)的影響。如表所示，-20℃以下的冷凍保存可使富含血小板血漿衍生之生長因子複合物的活性保存一個月以上。此外，經實驗證實，以粉體形式保存可更有效地維持富含血小板血漿衍生之生長因子複合物的活性。
於實際應用中，吾人可藉由TGF-β或其他生長因子的含量來判斷所製備的富含血小板血漿衍生之生長因子複合物的品質。於實際應用中，以前述方法所製備的富含血小板血漿衍生之生長因子複合物可被應用於體外細胞培養，觀察細胞之活性反應，以證實該富含血小板血漿衍生之生長因子複合物的活性。經實驗證實，當該富含血小板血漿衍生之生長因子複合物存在時，無論是纖維母細胞、椎間盤軟骨細胞、中胚層間葉幹細胞等的細胞增生速率皆有顯著增加。此外，吾人也已證實，本發明之富含血小板血漿衍生之生長因子複合物可有效誘導豬的椎間盤髓核細胞的增生。此外，在培養若干時間後，抽取椎間盤髓核細胞的RNA進行軟骨及硬骨的基因檢測，可發現軟骨分化基因Col II及AGN的表現量會隨著培養天數而增加，而骨分化基因OPN及OCN則無任何表現。藉此可證明本發明的富含血小板血漿衍生之生長因子複合物可可誘導髓核細胞的再分化，同時可避免骨細胞分化的可能性。
於實際應用中，以前述方法所製備的富含血小板血漿衍生之生長因子複合物可被應用於活體動物試驗，以證實該富含血小板血漿衍生之生長因子複合物的活性。舉例而言，吾人可藉由雷射或其他方式於活體動物的體表造成皮膚創傷，再以本發明的富含血小板血漿衍生之生長因子複合物塗敷於創傷處，並持續觀察傷口復原情形。經實驗證實，由顯微鏡觀察H＆E染色的皮膚傷口病理切片發現經過本發明的富含血小板血漿衍生之生長因子複合物治療一周後，纖維母細胞已顯著地進入傷口處，並且傷口周圍有明顯的膠原蛋白層沉積，證實了本發明的富含血小板血漿衍生之生長因子複合物具有促進傷口癒合的能力。
此外，吾人也可經由體外組織培養以及活體動物實驗來驗證以前述方法製備的富含血小板血漿衍生之生長因子複合物的活性，並可與富含血小板血漿進行活性比較。
於一具體實施例中，本發明還提供了包含以前述方法所製備的富含血小板血漿衍生之生長因子複合物的醫藥組合物。於實際應用中，此醫藥組合物還包含醫藥可接受之載劑，例如，但不受限於，無菌的生理食鹽水。該醫藥組合物中的富含血小板血漿衍生之生長因子複合物的含量可視情況進行調整，並不受限於任何特定的劑量。於實際應用中，該醫藥組合物還可包含輔劑，用以增加該富含血小板血漿衍生之生長因子複合物的活性。
於一具體實施例中，前述醫藥組合物可被用來促進病患之組織生長。特別地，此醫藥組合物可被直接注射至病患的患部，例如，但不受限於，退化的椎間盤處、骨折處、拔牙傷口處等。在實際應用中，吾人可藉由X光機定位病患欲治療的位置(例如，椎間盤位置)，以輔助直接注射的準確度。此外，於投藥治療椎間盤退化病患後，吾人可藉由X光以及核磁共振儀器等器材來協助追蹤病患的椎間盤組織增生程度。
經過實驗證明，此醫藥組合物可促進骨骼細胞及組織，如椎間盤髓核細胞及組織，的增生與分化。請注意，於實際應用中，若要治療病患時，製備富含血小板血漿衍生之生長因子複合物所需的全血樣本可直接取自病患本身。此外，於實際應用中，前述純化分離以及投藥之步驟可視情況在無菌環境中施行，並且使用無菌器具，以避免富含血小板血漿衍生之生長因子複合物受到汙染，或病患在治療過程中受到感染。
於實際應用中，本發明之醫藥組合物可被製成口服液、注射液、藥丸、藥粉、藥膏或其它適當的形式。並且，此等醫藥組合物的投藥方式可相對應地選擇口服、塗敷、注射或其它適當的方式。並且，於實際治療時，該醫藥組合物可搭配其它藥物，例如，但不限於，止痛藥、胃藥等一起投藥給患者。另外，本發明之醫藥組合物可用於治療如豬、狗、貓、兔子或其它哺乳類動物，甚至非哺乳類動物。
綜合上述，本發明之方法可自病患本身的全血中分離出富含血小板血漿衍生之生長因子複合物，並且將其製備成醫藥組合物，以投藥給病患，促進病患的組織生長。特別地，根據本發明之富含血小板血漿衍生之生長因子複合物不含血漿、血小板或其他血球之殘骸，物質組成單純，因此可有效避免病患體內的巨噬細胞被活化，而引發二度發炎的狀況。
藉由以上較佳具體實施例之詳述，係希望能更加清楚描述本發明之特徵與精神，而並非以上述所揭露的較佳具體實施例來對本發明之範疇加以限制。相反地，其目的是希望能涵蓋各種改變及具相等性的安排於本發明所欲申請之專利範圍的範疇內。
S10~S24．．．流程步驟
圖一係繪示根據本發明之一具體實施例的富含血小板血漿衍生之生長因子複合物之製備方法流程圖。
S10~S24．．．流程步驟
Claims (7)
- 一種富含血小板血漿衍生之生長因子複合物之製備方法，包含下列步驟：(a)取一全血樣本，並且將該全血樣本離心；(b)收集經步驟(a)離心後之一上層液，並將該上層液離心；(c)收集經步驟(b)離心後之一中層液，將一活化劑與該中層液混合形成一混合液，並將該混合液離心，該活化劑係包含有凝血酶；以及(d)收集經步驟(c)離心後之一上清液，並過濾該上清液，以獲得含有該富含血小板血漿衍生之生長因子複合物之一標的溶液。
- 如申請專利範圍第1項所述之製備方法，其中，步驟(a)的離心條件係於室溫下，以每分鐘1,000~3,000轉的轉速離心1~5分鐘。
- 如申請專利範圍第1項所述之製備方法，其中，步驟(b)的離心條件係於室溫下，以每分鐘2,000~5,000轉的轉速離心5~10分鐘。
- 如申請專利範圍第1項所述之製備方法，其中，步驟(c)進一步包含下列步驟：(c1)將該活化劑與該中層液混合，以每分鐘100~500轉的速度持續振盪1~5小時，以形成該混合液。
- 如申請專利範圍第1項所述之製備方法，其中，步驟(c)的離心條件係以每分鐘300~1,000轉的轉速離心1~5分鐘。
- 如申請專利範圍第1項所述之製備方法，其中，步驟(d)的過濾係將該上清液通過孔徑為0.1~0.5μm之一過濾單元。
- 一種於活體外促進一組織生長之方法，包含下列步驟：(a)取一全血樣本，並且將該全血樣本離心；(b)收集經步驟(a)離心後之一上層液，並將該上層液離心；(c)收集經步驟(b)離心後之一中層液，將一活化劑與該中層液混合形成一混合液，並將該混合液離心，該活化劑係包含有凝血酶；(d)收集經步驟(c)離心後之一上清液，並過濾該上清液，以獲得含有該富含血小板血漿衍生之生長因子複合物之一標的溶液；(e)將該標的溶液製成一處理劑；以及(f)以該處理劑處理該組織。
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