CN115025120B - 一种间充质干细胞注射液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种间充质干细胞注射液及其应用，涉及医用生物材料技术领域。本发明的间充质干细胞注射液，包括骨髓间充质干细胞和骨髓有核细胞。本发明的间充质干细胞注射液通过骨髓间充质干细胞联合骨髓有核细胞，可促进骨、软骨组织的再生修复，有效提高了缺血性股骨头坏死的治疗疗效；采用自体骨髓间充质干细胞联合自体骨髓有核细胞，所用的细胞获取便捷，具有良好的生物相容性和安全性；采用富血小板血浆作为悬浮液，改善缺血性股骨头坏死部位的周围环境，为间充质干细胞注射液通过骨髓间充质干细胞提供一个良好的再生修复环境，同时促进和提高内源生物因子的生成和作用，提高缺血性股骨头坏死的治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及医用生物材料技术领域，具体涉及一种间充质干细胞注射液及其应用。
背景技术
股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)全称股骨头无菌性坏死，或股骨头缺血性坏死，是由于多种原因导致的股骨头局部血运不良，从而引起骨细胞进一步缺血、坏死、骨小梁断裂、股骨头塌陷的一种病变，是骨科的常见病、多发病。股骨头坏死给身体带来很大的危害，股骨头坏死通常发生的部位是髋关节，但髋关节又连接着人体的躯干和下肢，因此随着病情的不断加重，坏死的部位可能会损害整个患肢的健康，从而使患者的活动出现障碍，严重的时候会使患者生活不能自理。如果股骨头坏死在早期的时候，不能够采取及时有效的治疗，那么股骨头坏死的面积则会因为血液循环不流畅而变得越来越大，进而导致髋关节软骨磨损或脱落，严重的时候会导致整个髋关节融合。股骨头坏死病情发展得特别慢，治疗起来很漫长，患者长时间被疾病所折磨，最终导致患者的心理健康受到影响。
股骨头坏死的临床治疗方法不尽相同，目前主要是：保守治疗，包括避免负重、中西医药物治疗、脉冲电刺激、高压氧等；保髋治疗，包括髓芯减压术、各类骨移植术截骨术等；人工关节置换手术。在股骨头坏死的早期(Ⅰ期)，口服相关药物配合物理治疗、避免负重等往往能起到比较满意的效果，必要时可行髓芯减压术；但因其早期临床症状相对较轻，X线表现相对滞后，仅通过骨扫描、磁共振成像等比较特异的检查才能发现部分病变，其严重性往往得不到应有的重视，而错过最佳治疗时机。对于Ⅱ、Ⅲ期患者，可实施各种保髋治疗。而人工关节置换手术对于Ⅲ、Ⅳ期的患者可取得较好的疗效，但其远期效果尚不能肯定。随着对股骨头坏死病理变化及发病机制研究的不断深入，生物与基因技术的不断发展，利用自体组织修复治疗股骨头坏死将成为未来有效治疗选择之一。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种间充质干细胞注射液及其应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种间充质干细胞注射液，所述间充质干细胞注射液包括骨髓间充质干细胞和骨髓有核细胞。
研究表明，间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，它们可以不断地自我更新，并在特定条件下转变成为一种或多种构成人体组织或器官的细胞。骨髓是人体的造血组织，血细胞都由骨髓造血干细胞发育演化形成，在外周血中拥有种类丰富的各种有核细胞。本申请发明人经过大量的实验研究发现，采用骨髓间充质干细胞联合骨髓有核细胞制备得到一种间充质干细胞注射液，该注射液配方简单，安全性高且无毒副作用，通过骨髓间充质干细胞和骨髓有核细胞联合作用，能够提高生长因子的生成，促进骨髓间充质干细胞的分化为骨细胞，促进缺血性股骨头坏死部位的血管生成，使缺血性股骨头坏死部位的骨头得以重生和更新，与单独使用骨髓间充质干细胞进行治疗相比，本发明的间充质干细胞注射液通过骨髓间充质干细胞和骨髓有核细胞联合作用，治疗效果更显著，治疗周期更短。
作为本发明所述间充质干细胞注射液的优选实施方式，所述骨髓间充质干细胞为自体骨髓间充质干细胞，所述外周血有核细胞为自体骨髓有核细胞。本发明采用的是自体骨髓间充质干细胞，更容易获取，同时进一步提高了安全性。采用自体骨髓间充质干细胞修复受损组织具有很好的组织相容性和生理学特性，能够使原组织恢复到损伤前的生理功能指标。与异种材料相比，术后患者也不会有明显的异物感存在，极大程度提高了患者的生活质量。本发明的间充质干细胞注射液中的自体骨髓有核细胞为注射当天采集分离得到的，获取方便且安全性高。
作为本发明所述间充质干细胞注射液的优选实施方式，所述间充质干细胞注射液中，骨髓间充质干细胞的含量为1.0～8.0×107个/mL，骨髓有核细胞的含量为1.0～5.0×106个/mL。
作为本发明所述间充质干细胞注射液的优选实施方式，所述骨髓间充质干细胞和骨髓有核细胞的个数比为5～20:1。
作为本发明所述间充质干细胞注射液的优选实施方式，所述骨髓间充质干细胞和骨髓有核细胞的个数比为7～15:1。
本申请发明人经过大量的研究发现，间充质干细胞注射液中骨髓间充质干细胞和骨髓有核细胞的个数比对间充质干细胞注射液的治疗效果有影响，当骨髓间充质干细胞和骨髓有核细胞的个数比为5～20:1，其能够有效提高股骨头的骨密度，对股骨头坏死的修复效果比较好。更优选地，当骨髓间充质干细胞和骨髓有核细胞的个数比为7～15:1时，其股骨头的再生修复效果更好。
作为本发明所述间充质干细胞注射液的优选实施方式，所述自体骨髓间充质干细胞为传代培养3～4代的细胞。
作为本发明所述间充质干细胞注射液的优选实施方式，所述间充质干细胞注射液还包括悬浮液。本发明的一种间充质干细胞注射液，需要给间充质干细胞和骨髓有核细胞提供作为载体的悬浮液，该悬浮液需要为间充质干细胞和骨髓有核细胞提供所需营养，保持其细胞活性的同时，还要避免产生免疫排斥反应等安全性问题。
作为本发明所述间充质干细胞注射液的优选实施方式，所述悬浮液为富血小板血浆；所述富血小板血浆中血小板的浓度为1.0～6.0×109个/mL。本申请发明人经研究发现，采用富含血小板血浆作为悬浮液，不仅可以改善缺血性股骨头坏死部位的周围环境，为骨髓间充质干细胞和骨髓有核细胞提供一个良好的再生修复内环境，也可以促进和提高内源生物因子的生成和作用，提高缺血性股骨头坏死治疗的效果。
作为本发明所述间充质干细胞注射液的优选实施方式，所述富含血小板血浆采用氯化钙和T细胞因子激活得到。本申请发明人研究发现，采用氯化钙和T细胞因子对富血小板血浆进行刺激培养，使得到的富血小板血浆裂解液中含有高浓度的生长因子，扩大生物效应。
本发明还提供所述的间充质干细胞注射液在制备治疗缺血性股骨头坏死的药物中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供一种间充质干细胞注射液，该间充质干细胞注射液通过骨髓间充质干细胞联合骨髓有核细胞，可促进骨组织的再生修复，有效提高了缺血性股骨头坏死的治疗疗效；本发明的间充质干细胞注射液采用自体骨髓间充质干细胞联合自体骨髓有核细胞，所用的细胞获取便捷，具有良好的生物相容性和安全性；本发明的间充质干细胞注射液采用富血小板血浆作为悬浮液，改善缺血性股骨头坏死部位的周围环境，为间充质干细胞注射液通过骨髓间充质干细胞提供一个良好的再生修复环境，同时促进和提高内源生物因子的生成和作用，提高缺血性股骨头坏死的治疗效果。
附图说明
图1为案例一治疗前和治疗后的MRI检测图。
图2为案例二治疗前和治疗后的MRI检测图。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
本实施例的一种间充质干细胞注射液，包括自体骨髓间充质干细胞、自体骨髓有核细胞和富血小板血浆。所述间充质干细胞注射液中自体骨髓间充质干细胞的含量为2.0×107个/mL，所述间充质干细胞注射液中自体骨髓有核细胞的含量为2×106个/mL；所述间充质干细胞注射液中骨髓间充质干细胞和外周血有核细胞的个数比为10：1；所述富血小板血浆中血小板的浓度为2.0×109个/mL。
本实施例的间充质干细胞注射液的制备方法，包括以下步骤：
(1)富含血小板血清的制备：采集自身外周血250ml，将外周血转移到50ml离心管中，于200g离心20min，离心管上半部分为血清，下半部分为红细胞，若血清部分不足50％，要再次离心。将上清液转移至新的无菌离心管中，取少量用PBS进行稀释对血小板进行计数后，将PRP转移到无菌容器中，加入CaCl2和T细胞因子并混合，于37℃，5％CO2培养6天，培养后于1000g离心6min，收集上清，得所述富血小板血浆(aPRP)；
(2)骨髓有核细胞的提取及制备方法：在患者局部麻醉情况下，从髂后上嵴采集骨髓20-30ml，单侧分三点采集，每点采集10ml骨髓。利用重力离心法将骨髓离心后呈3层，上半部为透明层，下半部含有红细胞呈现红色，中间区域是有核细胞薄层，利用移液管轻轻将有核细胞层移除。重复以上步骤以得到更多有核细胞。进行细胞计数，然后根据细胞计数进行所需自体干细胞制剂的配制；
(3)骨髓间充质干细胞的提取及培养方法：在患者局部麻醉情况下，从髂后上嵴采集骨髓30-50ml，分两侧采集，每侧采集三点，每点采集10ml骨髓。利用重力离心法将骨髓离心后呈3层，上半部为透明层，下半部含有红细胞呈现红色，中间区域是有核细胞薄层，利用移液管轻轻吸取有核细胞，将重悬后的有核细胞接种到无菌培养瓶中，加入细胞培养液置于37℃、饱和湿度、5％的CO2浓度的培养箱内开始原代培养，24-48小时换液。加入新细胞培养液之前利用PBS进行清洗培养瓶1-2次，当培养瓶出现清晰细胞集落(一般7天以上)进行细胞收集并传代(P0)；细胞达到75～85％融合度时，移除瓶内培养液，用PBS清洗两次，用胰蛋白酶消化细胞后转移到无菌离心管内。离心沉淀细胞，重悬后计数，重复上述步骤开始传代(P1)培养。培养至第3代(P3)，收集细胞备用；
(4)将上述步骤(2)制备得到的骨髓有核细胞和步骤(3)的制备得到的骨髓间充质干细胞加入到步骤(1)的富血小板血浆中，混合得所述间充质干细胞注射液。
实施例2
本实施例的一种间充质干细胞注射液，包括自体骨髓间充质干细胞、自体骨髓有核细胞和富血小板血浆。所述间充质干细胞注射液中自体骨髓间充质干细胞的含量为8.0×107个/mL，所述间充质干细胞注射液中自体骨髓有核细胞的含量为4.0×106个/mL；所述间充质干细胞注射液中骨髓间充质干细胞和骨髓有核细胞的个数比为20：1；所述富血小板血浆中血小板的浓度为4.0×109个/mL
本实施例的间充质干细胞注射液的制备方法与实施例1相同。
实施例3
本实施例的一种间充质干细胞注射液，包括自体骨髓间充质干细胞、自体骨髓有核细胞和富血小板血浆。所述间充质干细胞注射液中自体骨髓间充质干细胞的含量为1.0×107个/mL，所述间充质干细胞注射液中自体骨髓有核细胞的含量为2×106个/mL；所述间充质干细胞注射液中骨髓间充质干细胞和骨髓有核细胞的个数比为5：1；所述富血小板血浆中血小板的浓度为3.0×109个/mL。
本实施例的间充质干细胞注射液的制备方法与实施例1相同。
实施例4
本实施例的一种间充质干细胞注射液，包括自体骨髓间充质干细胞、自体骨髓有核细胞和富血小板血浆。所述间充质干细胞注射液中自体骨髓间充质干细胞的含量为1.5×107个/mL，所述间充质干细胞注射液中自体骨髓有核细胞的含量为1.0×106个/mL；所述间充质干细胞注射液中骨髓间充质干细胞和骨髓有核细胞的个数比为15：1；所述富血小板血浆中血小板的浓度为5.0×109个/mL。
本实施例的间充质干细胞注射液的制备方法与实施例1相同。
实施例5
本实施例的一种间充质干细胞注射液，包括自体骨髓间充质干细胞、自体骨髓有核细胞和富血小板血浆。所述间充质干细胞注射液中自体骨髓间充质干细胞的含量为3.5×107个/mL，所述间充质干细胞注射液中自体骨髓有核细胞的含量为5.0×106个/mL；所述间充质干细胞注射液中骨髓间充质干细胞和骨髓有核细胞的个数比为7：1；所述富血小板血浆中血小板的浓度为6.0×109个/mL。
本实施例的间充质干细胞注射液的制备方法与实施例1相同。
对比例1
本对比例的一种间充质干细胞注射液，包括自体骨髓间充质干细胞、自体骨髓有核细胞和富血小板血浆。所述间充质干细胞注射液中自体骨髓间充质干细胞的含量为6.0×107个/mL，所述间充质干细胞注射液中自体骨髓有核细胞的含量为2.0×106个/mL；所述间充质干细胞注射液中骨髓间充质干细胞和骨髓有核细胞的个数比为30：1；所述富血小板血浆中血小板的浓度为2.0×109个/mL。
对比例2
本对比例的一种间充质干细胞注射液，包括自体骨髓间充质干细胞、自体骨髓有核细胞和富血小板血浆。所述间充质干细胞注射液中自体骨髓间充质干细胞的含量为1.0×107个/mL，所述间充质干细胞注射液中自体骨髓有核细胞的含量为5.0×106个/mL；所述间充质干细胞注射液中骨髓间充质干细胞和骨髓有核细胞的个数比为2：1；所述富血小板血浆中血小板的浓度为2.0×109个/mL。
对比例3
本对比例的间充质干细胞注射液与实施例1的区别仅在于本实施例的间充质干细胞注射制剂不含有骨髓有核细胞。
对比例4
本对比例的间充质干细胞注射液与实施例1的区别仅在于本实施例的间充质干细胞注射制剂不含有骨髓间充质干细胞。
效果例
1、动物实验
实验方法：实验动物为普通级1月龄大鼠，体重约280g，雌雄不限，共100只，在大鼠左腿经过骨缘注射地塞米松造模2周。缺血性股骨头坏死大鼠造模完成后，进行手术治疗。先麻醉大鼠，麻醉成功后将大白鼠俯卧位固定于手术台，分别采用实施例1～5、对比例1～4的间充质干细胞注射液缓慢注射至髋臼盂唇之下，对照组大鼠不做治疗处理。治疗3周后。剥离大鼠左右股骨测定股骨重量，并进行骨密度测定。
实验结果如表1所示。
表1
| 组别 | 股骨头重量(g) | 骨密度(g/cm2) |
| 实施例1 | 0.824 | 0.1125 |
| 实施例2 | 0.784 | 0.1088 |
| 实施例3 | 0.653 | 0.1064 |
| 实施例4 | 0.754 | 0.1092 |
| 实施例5 | 0.795 | 0.1081 |
| 对比例1 | 0.725 | 0.1077 |
| 对比例2 | 0.602 | 0.1053 |
| 对比例3 | 0.512 | 0.1001 |
| 对比例4 | 0.535 | 0.9877 |
| 对照组 | 0.450 | 0.0911 |
研究表明，股骨头坏死会使股骨重量和骨密度下降。由表1可知，经实施例1～5、对比例1～4的间充质干细胞注射液治疗后的大鼠的股骨重量和骨密度均高于不进行治疗的对照组。且由实施例1～5、对比例1～2可知，间充质干细胞注射液中骨髓间充质干细胞和骨髓有核细胞的个数比对间充质干细胞注射液的治疗效果有影响，当间充质干细胞注射液中骨髓间充质干细胞和骨髓有核细胞的个数比为5～20:1时，大鼠股骨重量和骨密度增加较明显；由实施例1、对比例3～4可知，间充质干细胞注射液通过骨髓间充质干细胞联合骨髓有核细胞，有效促进骨组织的再生修复，有效提高了缺血性股骨头坏死的治疗疗效，单独使用骨髓间充质干细胞或骨髓有核细胞进行股骨头坏死治疗的效果不佳。
2、临床实践运用典型案例
案例一：患者，60岁，右髋部疼痛3个月，加重并伴右髋关节活动受限1个月，右侧股骨头缺血性坏死。如图1A和图1B所示，治疗前MRI检测可见股骨头坏死灶明显。采用实施例1的间充质干细胞注射制剂进行治疗。治疗3个月后右髋部疼痛显著减轻，髋关节活动范围增加，Harris髋关节功能评分为61分。如图1C和图1D所示，治疗6个月后MRI检测发现低信号区所占股骨头体积为15％，股骨头坏死区显著缩小，代之以正常小梁结构的骨组织。
案例二：患者，23岁，双侧髋部疼痛，活动受限一年。如图2所示，治疗前MRI检测显示双侧股骨头缺血性坏死，为(ARCOⅡ期)。采用实施例1的间充质干细胞注射制剂进行治疗。治疗2个月后，双侧髋部疼痛明显减轻，髋关节活动受限缓解，MRI检测显示已有新生骨形成。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (8)
1.一种间充质干细胞注射液，其特征在于，所述间充质干细胞注射液包括骨髓间充质干细胞和骨髓有核细胞；所述间充质干细胞注射液中，骨髓间充质干细胞的含量为1.0～8.0×107个/mL，骨髓有核细胞的含量为1.0～5.0×106个/mL；所述骨髓间充质干细胞和骨髓有核细胞的个数比为5～20:1。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞注射液，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞为自体骨髓间充质干细胞，所述骨髓有核细胞为自体骨髓有核细胞。
3.根据权利要求1所述的间充质干细胞注射液，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞和骨髓有核细胞的个数比为7～15:1。
4.根据权利要求2所述的间充质干细胞注射液，其特征在于，所述自体骨髓间充质干细胞为传代培养3～4代的细胞。
5.根据权利要求1所述的间充质干细胞注射液，其特征在于，所述间充质干细胞注射液还包括悬浮液。
6.根据权利要求5所述的间充质干细胞注射液，其特征在于，所述悬浮液为富血小板血浆；所述富血小板血浆中血小板的浓度为1.0～6.0×109个/mL。
7.根据权利要求6所述的间充质干细胞注射液，其特征在于，所述富血小板血浆采用氯化钙和T细胞因子激活得到。
8.根据权利要求1～7任一项所述的间充质干细胞注射液在制备治疗缺血性股骨头坏死的药物中的应用。
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| CN101878297A (zh) * | 2007-07-05 | 2010-11-03 | 再生科学有限责任公司 | 用于间质干细胞优化扩增和移植的方法与组合物 |
| CN111281888A (zh) * | 2020-04-01 | 2020-06-16 | 威海市中心医院 | 一种用于治疗股骨头坏死的人脐带间充质干细胞注射液 |
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2022
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| 李磊 ; 杨宇 ; 蔡立雄 ; 杨海韵 ; .髓芯减压联合自体浓缩骨髓有核细胞移植治疗早期股骨头坏死.重庆医学.2015,(03),摘要. * |
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