WO2016125960A1

WO2016125960A1 - 연골손상 치료용 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: WO2016125960A1
Application number: PCT/KR2015/005994
Authority: WO
Inventors: 박재우
Original assignee: 박재우
Priority date: 2015-02-05
Filing date: 2015-06-15
Publication date: 2016-08-11
Also published as: KR101521411B1

Abstract

본 발명은 퇴행성 관절염을 포함하는 연골손상 치료용 조성물에 관한 것으로, 기질혈관분획 (SVF, stromal vascular fraction), 세포외기질 (ECM, extra cellular matrix)을 포함하며， 부작용없이 뼈의 재생이 가능하여 절개 등의 외과적 수술을 최소화할 수 있어 흉터가 없고 회복이 빠른 장점이 있는 뼈 질환용 약학 조성물에 관한 것이다. 또한 상기 조성물에 혈소판 풍부 혈장 (PRP, platelet rich plasma)과 염화칼슘수용액 (CaCl₂) 및 히알루론산 (hyaluroni c acid)을 추가함으로써， 퇴행성 관절염을 포함하는 연골손상에 대한 치료를 효과적으로 수행할 수 있다.

Description

【명세서】

【발명의 명칭】

연골손상 치료용 조성물 및 이의 제조방법

【기술분야】

본 발명은 기질혈관분획 (SVF, stromal vascular fract ion) , 세포외기질 (ECM, extra cel lular matr ix)을 유효성분으로 포함하는 연골손상 치료용 조성물 및 상기 조성물에 선택적으로 혈소판 풍부 혈장 (PRP, platelet rich plasma) , 염화칼슴수용액 (CaCl₂) 및 히알루론산 (hyaluronic acid)을 추가로 포함할 수 있는 퇴행성 관절염올 포함하는 연골손상 치료용 조성물에 관한 것이다.

【배경기술】

관절염은 인류가 앓고 있는 질환 중 유병률 1위의 다발성 질환이다. 이 중 특히 퇴행성 관절염은 65 세 이상 인구 중 70 ~ 80 %가 75 세 이상인 경우에는 거의 100 %가 가지고 있는 대표적인 노인성 질환이다. 현재 우리나라는 전체 인구의 10 ¾> 이상이 퇴행성 관절염을 앓고 있으며， 이러한 유병률은 한국 사회의 급속한 고령화 추세로 인해 매우 빠르게 증가하고 있다. 또한 최근에는 젊은층에서도 많이 발병하고 있으며, 전 세계적으로는 약 5 억 명 이상의 퇴행성 관절염 환자가 있는 것으로 추정된다. 또한 인간 평균수명의 연장과 함께 인간의 사회활동 기간이 늘어남에 따라， 인류 생활의 질적 측면에서 시급히 극복해야 할 중요한 위치를 차지하고 있다.

퇴행성 관절염은 나이가 들면서 무릎 관절이 닳아 통증을 일으키는 질환으로， 무릎의 안쪽과 앞쪽 관절 모두를 과도하게 사용할 때 발생한다. 무릎의 연골조직은 유리성 연골 (hyal ine cart i l age)과 섬유성 연골 ( f ibrous cart i lage)로 구성되는데， 이러한 연골조직은 뼈의 끝부분에 막처럼 둘러져 있으면서 구조적인 완충역할을 하는 것으로, 뼈끼리 직접 맞닿을 때 생길 수 있는 통증 유발이나 뼈의 마모 등을 예방해주고 있다.

연골세포는 연골조직 내의 유일한 세포 성분으로서 연골조직이 정상적인 기능을 유지하기 위해 필수적인 콜라겐 및 프로테오글리칸 등의 매트릭스를 합성， 분비하고 또한 적정속도로 분해하는 역할을 담당함으로써 관절 연골조직의 기능적 항상성을 유지시켜 주는 데에 필수적인 역할을 담당하고 있다.

연골조직 내 연골세포의 기능이 정상적으로 수행되기 위해서는 연골세포의 생성 및 분화가 적절히 이루어져야 하고， 생성된 연골세포의 생존이 잘 보호되어야 하며, 또한 존재하고^' 있는 연골세포의 석회화가 지속적으로 억제되어 연골조직의 경화현상이 방지되어야 한다. 퇴행성 관절염의 가장 원천적인 발병 요인은 이러한 관절 연골세포의 본질적인 기능성이 노화에 따라 상실되는 것이다.

퇴행성 관절염 유발의 핵심 요소 중의 하나는 관절 내 유리성 연골 및 섬유성 연골조직의 양적 손실이며， 이는 연골조직 내 연골세포의 분화 및 생존 유지와 밀접히 연관되어 있다. 퇴행성 관절염 유발의 또 다른 핵심 요소 중의 하나는 관절 내 연골조직의 경화현상이며， 이는 연골세포의 석회화 현상과 직접적으로 연관되어 있다. 퇴행성 관절염이 진행되면， 연골조직의 프로테오글리칸 매트릭스가 기계적으로 마모되면서 연골조직이 소실되고 그 결과로 연골 밑 뼈가 드러나게 된다. 또한 이 단계에서 연골세포의 석회화로 인해 신생되는 작은 돌기성 뼛조각들은 그 주변에 침착되어 연골조직의 경화 현상올 일으킴으로써 마모에 의한 연골조직의 소실을 더욱 가속화시키게 된다. 이와 같은 복합적인 관절조직 구조변형이 염증 및 통증을 유발하게 되고, 증상이 심해지면 관절변형과 운동제한을 초래하게 된다.

이러한 퇴행성 관절 질환을 치료하기 위해 손상된 조직을 제거하거나 손상된 관절 전체를 제거하는 시술법이 활용되고 있으며, 공개특허 게 2011- 0106855호 (2011년 9월 29일, 공개)에서는 동종의 사체로부터 분리된 줄기세포와 골 기판을 서로 결합시켜 이를 외과적 수술을 통하여 손상된 관절부위에 이식하는 방법을 제시하고 있다. 그러나 이러한 시술법들은 심한 절개나 상처가 생길 수 있고 회복이 느리다는 한계가 있다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】 본 발명의 목적은 이러한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 기질혈관분획 및 세포외기질을 유효성분으로 포함하고 혈소판 풍부 혈장， 염화칼슴수용액， 히알루론산을 추가로 더 포함하여， 부작용 없이 뼈 및 연골의 재생을 가능하게 하고， 외과적 수술을 최소화할 수 있는 퇴행성 관절염 등과 같은 연골손상 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

【기술적 해결방법】

상기의 목적올 달성하기 위한 본 발명은， 기질혈관분획 (SVF , stromal vascular fract ion) 및 세포외기질 (ECM, extra cel lular matrix)을 포함하는 연골손상 치료용 조성물로서, 상기 연골 손상 치료용 조성물에는 기질혈관분획 5 ~ 10 중량부와 세포외기질 0.1 ~ 5 중량부가 포함된다. 상기 기질혈관분획은 지방조직을 콜라게네이즈로 처리한 후 원심분리를 통해 얻어질 수 있으며, 상기 기질혈관분획 및 세포외기질은 인간으로부터 유래될 수 있수 있다.

본 발명의 퇴행성 관절염을 포함하는 연골손상 치료용 조성물은 혈소판 풍부 혈장 (PRP, platelet rich plasma) 1 ~ 10 중량부를 더 포함할 수 있으며， 상가 혈소판 풍부 혈장은 자가 혈액에서 유래된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 퇴행성 관절염을 포함하는 연골손상 치료용 조성물은 1 ~ 5 wt% 염화칼슘수용액 (CaCl₂) 0.1 ~ 0.4 중량부 및 히알루론산 (hyaluronic acid) 0.5 ~ 2 중량부를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 퇴행성 관절염을 포함하는 연골손상 치료용 조성물을 제조하는 방법은 (a)지방흡인으로 얻어진 지방조직을 콜라게네이즈 (col lagenase)와 1 ： 1 내지 1 ： 2의 비율로 흔합 및 교반하여 효소반웅을 진행한 후 줄기세포를 포함하는 기질혈관분획을 추출하는 단계; (b)상기 줄기세포를 포함하는 기질혈관분획을 추출 및 .분리하고 남은 지방추출물을 분쇄한 후， 상기 추출한 기질혈관분획을 다시 흔합한 후 기름 (oi l )과 튬네센트 (tumescent ) 용액을 제거하는 단계; (c)상기 기름과 튬네센트 용액이 제거된 지방추출물을 와싱 (washing)하여 효소를 제거하는 단계; (d)상기 와싱 절차 후에 지방추출물을 원심분리하여 기질혈관분획 및 세포외기질을 획득하는 단계; 및 (e)상기 기질혈관분획 및 세포외기질이 각각 5 ~ 10 중량부 및 0.1 ~ 5의 중량부로 흔합하는 단계;를 포함한다. 이때 상기 (e)단계에서 혈소판 풍부 혈장 1 ~ 10 중량부가 추가로 더 포함될 수 있으며， 1 ~ 5 %의 염화칼슘수용액 0.1 ~ 0.4 중량부 및 히알루론산 0.5 ~ 2 중량부가 추가로 더 포함될 수 있다.

【발명의 효과】

본 발명의 뼈 및 연골을 포함한 관절질환 치료용 조성물， 좀 더 구체적으로 퇴행성 관절염을 포함하는 연골손상 치료용 조성물은 기질혈관분획 및 세포외기질을 유효성분으로 포함하는 것으로， 부작용 없이 뼈 및 연골의 재생이 가능하여 절개 등의 외과적 수술을 최소화할 수 있어 흉터가 없고 회복이 빠른 장점이 있다. 또한 상기 조성물에 혈소판 풍부 혈장， 그리고 염화칼슘수용액 및 히알루론산을 추가로 포함하여 상기 뼈 재생 효과를 효율적으로 상승시킬 수 있다.

【도면의 간단한 설명】

도 1은 지방흡인으로 얻은 지방조직을 원심분리하여 농축시킨 지방추출물 이미지이다 . 도 2는 상기 도 1의 지방추출물을 원심분리하여 기질혈관분획을 따로 분리해낸 이미지이다. 도 3은 기질혈관분획 분리 후 남은 지방추출물을 분쇄하는 이미지이다.

도 4는 상기 도 3에서 분쇄된 지방추출물에 기질혈관분획을 다시 흔합한 이미지이다 . 도 5는 지방조직으로부터 획득한 기질혈관분획 및 세포외기질을 나타내는 이미지이다ᅳ 도 6은 기질혈관분획 및 세포외기질을 포함하는 조성물을 무릎에 시술하기 전과 후의 무릎 MRI 이미지이다. 도 7은 기질혈관분획, 세포외기질 및 혈소판 풍부 혈장을 포함하는 조성물을 무릎에 시술하기 전과 후의 무릎 MRI 이미지이다.

도 8은 기질혈관분획， 세포외기질 및 혈소판 풍부 혈장을 포함하는 조성물을 대퇴골두에 시술하기 전과 후의 대퇴골두 MRI 이미지이다.

도 9는 기질혈관분획, 세포외기질， 혈소판 풍부 혈장， 염화칼슘수용액 및 히알루론산을 포함하는 조성물을 무릎에 시술하기 전과 후의 무릎 MRI 이미지이다. 도 10은 기질혈관분획, 세포외기질, 혈소판 풍부 혈장， 염화칼슘수용액 및 히알루론산을 포함하는 조성물을 대퇴골두에 시술하기 전과 후의 대퇴골두 MRI 이미지이다 .

【발명의 실시를 위한 형태】

이하 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정하여 해석되어서는 아니 되며, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 한다.

본 명세서 전체에서， 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함''한다고 할 때， 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 각 단계들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않는 이상 명기된 순서와 다르게 실시될 수 있다. 즉， 각 단계들은 명기된 순서와 동일하게 실시될 수도 있고 실질적으로 동시에 실시될 수도 있으며 반대의 순서대로 실시될 수도 있다.

이하에서는 본 발명의 뼈 및 연골을 포함한 관절질환 치료용 조성물， 즉 퇴행성 관절염을 포함하는 연골손상 치료용 조성물과 그 제조방법에 관하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다 .

본 발명은 기질혈관분획 (SVF , stromal vascular fract ion) 및 세포외기질 (ECM, extra cel lular matrix)을 포함하는 연골손상 치료용 조성물에 관한 것으로서， 부작용 없이 뼈 및 연골의 재생이 가능하여 절개 등의 외과적 수술올 최소화할 수 있어 흉터가 없고 회복이 빠른 장점이 있는 퇴행성 관절염을 포함하는 연골손상 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서 기질혈관분획은 지방조직을 콜라게네이즈로 처리한 후 원심분리하여 얻어진 세포로, 면역세포， 지방줄기세포 등이 포함된 세포들을 의미한다. 이때， 콜라게네이즈는 콜라겐의 가수분해를 촉진하는 효소로서, 지방조직의 콜라겐을 분해하여 지방줄기세포를 분리시키는 역할을 하는 것으로, 당업자의 요구에 따라 동일 내지 유사한 역할을 하는 기타 효소를 처리하거나 기계적 처리를 하는 것으로 대체할 수 있다.

세포외기질은 조직내 또는 세포외의 공간을 채우고 있는 생체고분자의 복잡한 집합체로， 주성분은 콜라겐， 엘라스틴 등의 섬유성 단백질과 세포접착성 단백질로 구성되어 있다. 상기 기질혈관분획 및 세포외기질은 인간으로부터 유래된 것일 수 있으나， 특별히 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 연골손상 치료용 조성물에는 기질혈관분획 및 세포외기질이 각각 5 ~ 10 중량부， 0.1 ~ 5 중량부로 포함되는 것이 바람직하고, 기질혈관분획 8 중량부에 대하여 세포외기질이 0.1 - 5 중량부인 것이 더욱 바람직하며， 상기 함량범위 내에서 이식이 필요한 환자의 상태， 목적， 성별， 나이 등에 따라 적절히 변경될 수 있다.

다만， 기질혈관분획 및 세포외기질의 함량이 상기 범위보다 적을 경우 치료 효율이 낮으며， 상기 범뷔보다 높을 경우 치료 효을 증가가 미비하여 경제적으로 바람직하지 아니하다.

본 발명은 상기 연골손상 치료용 조성물에 혈소판 풍부 혈장 (PRP, platelet rich plasma)을 더 포함하는 퇴행성 관절염을 포함하는 연골손상 치료용 조성물에 관한 것이다. 상기 혈소판 풍부 혈장은 자가 혈액에서 유래된 것일 수 있으나， 특별히 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 약학 조성물 중에 혈소판 풍부 혈장은 1 ~ 10 중량부가 포함되는 것이 바람직하다. 혈소판 풍부 혈장의 함량이 상기 범위를 벗어나는 경우 기질혈관분획과의 함량비가 적절치 않아 상승적 재생 효과가 저하될 수 있다.

히알루론산 (hyaluronic acid)은 식품의약품안전청으로부터 체내 주입이 허가된 생분해성 중합체로서， 생체에서 유래되는 물질이다. 본 발명의 조성물에 함유되는 히알루론산은 인간을 포함한 포유동물의 체액 또는 조직으로부터 정제된 것， 재조합 미생물 또는 세포를 배양하여 얻은 것， 화학적 합성방법에 의해 얻어진 것 모두를 사용할 수 있다. 히알루론산의 중량평균분자량은 약 200 , 000 〜 400， 000의 범위일 수 있다. 히알루론산은 기질혈관분획 등이 적절한 분산될 수 있는 범위에서 포함될 수 있는데， 예컨대 본 발명의 연골손상 치료용 조성물 중에는 0.5 ~ 2 중량부가 포함되는 것이 바람직하다.

염화칼슘수용액 (CaCl₂)은 혈소판풍부혈장을 활성화하여 혈소판 내에 있는 여러 성장인자들을 방출시켜 조직재생을 유도하는 물질이다. 본 발명의 치료용 조성물에 함유되는 염화칼슘수용액의 농도는 1 ~ 5 %가 바람직하며， 3 %의 농도가 더욱 바람직하다. 또한 염화칼슘수용액은 본 발명의 연골손상 치료용 조성물에 0. 1 ~ 0.4 중량부 포함되는 것이 바람직하며， 0. 1 중량부 미만으로 포함되면 염화칼슘수용액의 효과가 나타나지 않고, 0.4 중량부를 초과하면 혈소판 풍부 혈장이 관절 내에서 _CL1rd-l ike substance로의 변화를 막아 지지체 역할을 저해할 수 있다. ^'

본 발명자의 연구에 의하면, 상기와 같은 비율의 치료용 조성물이 퇴행성 관절염 및 대퇴골두 무혈성 괴사증의 치료에 가장 뛰어난 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다.

본 발명의 치료용 조성물은 (a)지방흡인으로 얻어진 지방조직을 콜라게네이즈 (col lagenase)와 1 ： 1 내지 1 ： 2의 비율로 흔합 및 교반하여 효소반응을 진행한 후, 줄기세포를 포함하는 기질혈관분획을 추출하는 단계; (b)상기 즐기세포를 포함하는 기질혈관분획을 추출 및 분리하고 남은 지방추출물을 분쇄한 후， 상기 추출한 기질혈관분획을 다시 흔합한 후 기름 (oi l )과 튬네센트 (tumescent ) 용액을 제거하는 단계; (c)기름과 튬네센트 용액이 제거된 지방추출물을 와싱 (washing)하여 효소를 제거하는 단계 ; (d)상기 와싱 절차 후에 지방추출물을 원심분리하여 기질혈관분획 및 세포외기질을 획득하는 단계; 및 (e)상기 기질혈관분획 및 세포외기질이 각각 5 ~ 10 중량부 및 0. 1 ~ 10 중량부로 흔합되는 단계;를 포함하는 방법으로 제조된다.

이때， (e)단계에서 혈소판 풍부 혈장 1 ~ 10 중량부가 추가로 더 포함될 수 있으며， 또한 (e)단계에서 1 5 %의 염화칼슘수용액 0. 1 ~ 0.4 중량부 및 히알루론산 0.5 - 2 중량부가 추가로 더 포함될 수 있다.

본 발명의 치료용 조성물은 임상 투여 시에 주사 등과 같은 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 치료용 조성물은 실제 임상 투여 시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데， 제제화할 경우에는 보통 사용하는 층전제, 증량제， 결합제， 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 회석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

제제에는 멸균된 수용액， 비수용성용제, 현탁제， 유제， 동결건조제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜， 폴리에틸렌 글리콜, 을리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (wi tepsol ) , 마크로골， 트뷘 (tween) 61， 카카오지， 라우린지， 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 치료용 조성물의 사용법에 있어서， 투여될 양에 영향을 미치는 인자들로는 이에 한정되는 것은 아니지만 투여 방식， 투여 빈도， 치료가 진행 중인 특정 질병， 질병의 심각성, 질병의 병력， 개체가 다른 치료제와 함께 협력 치료법이 진행중인지의 여부， 및 치료가 진행 중인 개체의 연령， 키， 체중, 건강, 및 신체 조건을 포함한다. 일반적으로 치료가 진행 중인 환자의 체중이 증가할수록 상기와 같은 비율의 치료용 조성물 제제를 더 많은 양으로 투약하는 것이 바람직하다 .

본 발명의 치료용 조성물은 연골 재생을 자극하기에 효과적인 양으로 투여할 수 있다. 반월상 연골판의 손상 또는 퇴행성 관절염의 치료를 위해서는 상기의 각 성분을 반으로 나누어 예컨대， 무릎의 앞부분 외부 (anter ior lateral )에 한번， 내부 (anterior medial )에 한번으로 나누어 투입한다.

본 발명의 치료용 조성물의 함량비는 본 발명자의 클리닉에 내원하는 환자들을 대상으로 한 치료결과에 의한다.

[실험예 1]

기질혈관분획 및 세포외기질 획득

기질혈관분획 및 세포외기질 획득을 위해 지방흡인을 실시하였다.

먼저， 환자를 수술실로 옮기고 반듯이 눕힌 후， 베타디엔 (provodineᅳ iodine)으로 하복부에 지방흡인 할 부분을 소독하고 살균된 천을 덮은 후 배꼽 아래 5 cm , 양 옆으로 약 0.5 cm를 절개하였다. 그리고 튬네센트 용액 (500 cc NS + 2 % Lidocaine 40 cc + 0.5 % Marcaine 20 cc + Epinephr ine 1 ： 1000 0.5 cc)을 사용하여 아래 복부 부분을 국소마취 시켰다. 그 다음 3.0 하트만 관을 사용하여 약 120 cc의 지방조직을 얻었다. 이 지방조직을 1000 g-force로 5 분간 원심 분리하였다. 이 과정올 통해 도 1과 같이 최종 약 60 cc의 농축된 지방추출물을 얻었다.

상기 농축된 지방추출물과 소화 효소인 콜라게네이스를 1 ： 1 비율로 흔합하고 37 °C에서 교반하면서 30 분간 효소반웅올 진행한 후 즐기세포를 포함한 기질혈관분획을 300 gᅳ force로 4 분간 원심분리하여 도 2와 같이 따로 분리하였다.

기질혈관분획 분리 후 남은 지방추출물을 도 3과 같이 homogenizer (manual or mechanical )를 사용하여 갈아준 후 (grind or mince) 도 4와 같이 상기 기질혈관분획과 다시 흔합하고， 기름 (oi l )과 튬네센트 용액을 제거하였다.

이 후 500 cc의 D5SR(Dextro3e 5% Lactated Ringer)를 사용하여 세 번 와싱 (washing)하여 효소를 제거하였다. 각각의 와싱 절차 후에 지방추출물을 300 g-force에서 원심 분리하였다. 마지막 원심분리 후에 도 5와 같이 대략 0.1 ~ 5 g의 세포외기질 및 8 g의 줄기세포를 포함하는 기질혈관분획을 획득하였다

[실험예 2]

무릎 관절 시술

본 발명의 뻐 및 연골을 포함한 관절질환 치료용 조성물을 무릎관절에 주입하기 위하여 환자를 둥을 바닥에 대고 반드시 눕히고 오론쪽 무릎을 90 도 각도로 세우도록 하였다. 무릎 주입부위를 베타디엔으로 소독하고 소독천으로 청결하게 덮은 후 2 ¾ 리도케인 ( l idocaine)으로 슬개골을 마취하였다. 18-게이지 1½ 인치 니들을 사용하여 뼈 및 연골을 포함한 관절질환 치료용 조성물을 무릎의 앞쪽 내측 (anterior-medial )에 주입하였다. 주입 후 환자는 세포 부착을 위해 1 시간 동안 부동자세를 유지하도록 지시하였다.

[실험예 3]

대퇴골부 시술

본 발명의 뼈 및 연골을 포함한 관절질환 치료용 조성물을 대퇴골부에 주입하기 위하여 환자를 위로 향하게 눕게 하였다. 베타디엔으로 소독하고 살균 천을 사용하여 청결하게 한 후， 2 % 리도케인을 사용하여 허벅지 대퇴골부를 마취하였다. 16—게이지 3½니들을 사용하여 이 조성물을 초음파의 가이드하에서 대퇴골부에 주입하였다. 그 다음， 환자의 세포의 부착을 위해 다리를 높게 하고 1 시간 동안 유지하게 하였다.

[실시예 1]

SVF+ECM조성물 무릎관절염 연골재생 치료

상기 실험예 1에서 획득된 기질혈관분획 및 세포외기질을 아래의 표 1과 같은 용량으로 5가지 종류의 조성물 (A, B, C, D, E)을 만들어 각각의 조성물올 실험예 2와 같은 방법으로 무릎관절에 시술하였다. 시술 전후, 피험자들의 치료효과를 알아보기 위하여 기능등급지수 (FRI , funct ional rat ing index)와 시각적 상사 척도 (VAS, visual analogue scale)를 사용하였다.

기능등급지수는 일상적인 활동 중 감지되는 신체의 문제점을 측정하여 그 정도를 각 항목별로 분류한 수치이다. 또한， 시각적 상사 척도는 통증 강도 측정에 가장 흔히 쓰이는 방법의 하나로， 본 연구에서 시각적 상사 척도의 측정은 0 ~ 10 까지의 통증수치를 표시하여, 숫자가 낮을수록 피험자가 느끼는 통증의 정도가 약한 것으로 나타내었으며， 그 결과는 아래의 표 1과 같다.

【표 1]

상기 표 1에 따르면, 조성물 A의 경우 시술 2 주 후 및 4 주 후 모두에서 환자의 통증이 완화되는 효과가 나타나지 않기에 바람직하지 못한 것을 알 수 있다. 조성물 B의 경우 4주 후에 환자의 통증이 10 % 이상 경감되었고, 조성물 C의 경우 시술 2주 후부터 환자의 통증이 10 % 이상 경감됨을 알 수 있다. 조성물 A, B 및 C와 비교하여 볼 때， 조성물 D의 경우에는 시술 2주 후에 50 %， 4주 후에 80 % 이상 환자의 통증이 경감되므로 상기 조성물 중에서 효과가 가장 좋은 것으로 나타났다. 특히 조성물 E의 경우 조성물 D와 비교하여 포함된 세포외기질의 양은 증가하였지만, 통증의 경감 정도는 2주 후 43 , 4주 후 57 %로 경감효과가 조성물 D에 비해 떨어지는 것으로 나타났다. 따라서 가장 바람직한 치료용 조성물은 조성물 D인 것을 알 수 있었다.

조성물 D의 시술 전 및 시술 12주 후의 MRI 사진인 도 4를 살펴보면, 오른쪽 무릎 안쪽의 유리성 연골 및 섬유성 연골의 두께가 주사 전에 비하여 12주 후에 상당히 증가하였음을 알 수 있다.

[비교예 1]

SVF+ECM조성물 무릎관절염 연골재생 치료

상기 실시예 1과 비교하기 위하여, 실험예 1과 같은 방법으로 획득한 기질혈관분획 16 g 및 세포외기질 10 g을 포함하는 조성물을 실험예 2와 같은 방법으로 무릎관절에 시술한 후 피험자들의 통증 정도를 파악하기 위해 기능등급지수와 시각적 상사 척도를 평가한 결과 아래의 표 2 및 표 3과 같이 나타났다.

【표 2)

【표 3】

상기 표 2 및 표 3에 따르면， 시술 2 주 후에 환자의 통증은 30 % 이상 경감되었고 무릎의 구부림도 마찬가지로 향상되었다. 시술 4 주 후에는 환자의 통증은 60 % 이상 경감되었으며, 활동범위 또한 더욱 향상되었다.

상기 결과를 실시예 1과 비교하면, 기질혈관분획 16 g 및 세포외기질 10 g이 포함된 비교예 1의 조성물은 기질혈관분획 8 g 및 세포외기질 5 g이 포함된 조성물 D와 치료효과 측면에서 큰 차이가 없으며， 많은 양의 조성물이 시술될수록 환자가 불편함을 느낀다는 문제점이 있기에, 효율적인 측면에서 실시예 1의 조성물 D가 가장 바람직한 것을 알 수 있다.

[실시예 2]

SVF+ECM+PRP조성물 무릎관절염 연골재생 치료

혈소판 분리 혈장 준비 2.5 cc의 항웅고제인 ACD( ant icoagulant acid ci trate dextrose) 포뮬라를 가지고 30 cc의 자가 혈액을 뽑아서 200 X g-force로 15분간 원심분리 하였다. 첫번째 원심분리 후， 상등액올 1000 X g-force으로^■ 5분간 두번째 원심분리를 실시하였다.

상기 두번째 원심분리 후 상등액은 버리고 이 연막 (방치한 혈액 표면에 생기는 백혈구, 혈소판의 얇은 막)을 수득하여 혈소판 풍부 혈장을 얻으며， 아래 표 4와 같이 실험예 1의 결과에 따라 가장 바람직한 조성물인 조성물 D(기질혈관분획 8 g 및 세포외기질 5 g)과 흔합하였다. 이렇게 제조한 치료용 조성물을 실험예 2와 같은 방법으로 무릎관절에 시술한 후 피험자들의 통증 정도를 파악하기 위해 기능등급지수와 시각적 상사 척도를 평가하였다.

【표 4】

No . PEP 결과측 ¾수단 시술전 2주후 4주후 12주후

F 0.5s FRI 35 35 35 33

VAS 7 7 7 6

G lg FRI 37 31 30 26

VAS 8 7 7 6

H 2s FRI 37 20 16 13

VAS 8 5 4 1

I 10§ FRI 36 29 24 21

VAS 7 5 4 2

J l lg FRI 37 35 30 30

VAS 7 7 6 6

(조성물 F ~ J에는 공통적으로 SVF 8g 및 ECM 5g이 포함되어 있음. )

상기 표 4에 따르면， 조성물 F의 경우 시술 2 주 및 4 주에서는 환자의 통증이 완화되는 효과가 없으며, 12 주에서 14 %의 통증 완화 효과를 나타내었다. 조성물 F는 다른 조성물 G ~ J에 비하여 통증 완화 효과가 작고， 느리게 나타나므로 바람직하지 못하다. 조성물 G의 경우 시술 2주 및 4주 후에 환자의 통중이 10 % 이상 경감되었으며， 12주 후에는 20 % 이상의 통증 완화 효과를 나타내었다. 조성물 H의 경우 시술 2주 후에는 30 % 이상， 4주 후에는 50 % 이상， 12주 후에는 80 % 이상의 통증 완화 효과가 나타났다. 조성물 I의 경우 시술 2주 후에는 20 % 이상， 4주 후에는 40 % 이상， 12 주 후에는 70 % 이상의 통증 완화 효과가 나타났다. 조성물 J의 경우 시술 2주 후에는 통증 완화 효과가 없었으며, 4주 및 12주에서 10 % 이상의 통증 완화 효과를 나타내었다. 상기와 같은 결과에 따르면, 조성물 J의 경우 조성물 I에 비하여 혈소판 풍부 혈장이 더 많은 양이 포함되었음에도. 통증 완화 효과가 느리며， 작게 나타나므로 바람직하지 못하다. 또한， 통증 완화 효과 및 효율적인 측면에서 가장 바람직한 조성물은 H로 나타났으며, 조성물 H를 시술받은 환자의 기능등급지수를 더욱 세부적으로 살펴보면 표 5와 같다.

【표 5】

상기 표 5에 따르면, 시술 2 주 후에 환자의 무릎의 구부림은 향상되었고， 12 주 후에는 활동범위가 더욱 향상되었으며， 무릎을 구부리는 데에 따른 통증도 70 % 이상 경감되었다.

또한 시술 전 및 시술 12 주 후의 MRI 사진인 도 7을 살펴보면， 무릎 안쪽 반월상 연골 및 유리성 연골의 두께가 시술 전에 비하여 상당히 증대되었음을 알 수 있으며， 이는 실시예 1의 조성물을 시술한 도 6에서 나타난 차이보다 더 큰 것을 알 수 있다. [실시예 3]

SVF+ECM+PRP조성물 대퇴골두 무혈성괴사 뼈재생 치료

상기 실시예 2의 조성물 H (기질혈관분획 8 g, 세포외기질 5 g 및 혈소판 풍부혈장 2 g)를 대퇴골두 무혈성괴사 치료를 위하여 실험예 3과 같은 방법으로 시술한 후 피험자들의 통증 정도를 파악하기 위해 기능등급지수와 시각적 상사 척도를 평가한 결과 아래의 표 6 및 표 7과 같이 나타났다.

【표 6]

【표 7】

상기 표 6 및 표 7에 따르면, 시술 2주 후에 환자의 통증은 50 % 이상 경감되었고 시술 12 주 후에는 환자의 통증이 70 % 이상 향상되었으며 , 활동범위 또한 더욱 향상되었다.

또한 시술 전 및 시술 12주 후의 MRI 사진인 도 8을 살펴보면， 시술 전에 비하여 시술 12주 후에 상부 관골구 뼈의 결함이 상당히 줄어든 것을 알 수 있다. 따라서 상부 관골구에서의 뼈 재생 및 대퇴골구의 피질하부 부위에서의 뼈 매트릭스 강화가 상당히 증대었음을 알 수 있다.

[실시예 4]

SVF+ECM+PRP+CaCl2+Hyaluroni c acid조성물 무릎관절염 연골재생 치료

상기 실험예 1 및 실시예 2에 따라 획득한 조성물 H (기질혈관분획 8 g, 세포외기질 5 g, 혈소판 풍부 혈장 2 g)에 히알루론산 1 g 및 3 wt% 염화칼슘수용액을 아래 표 8과 같이 흔합하여 치료용 조성물을 제조한 후， 실험예 2와 같은 방법으로 무릎관절에 시술하였다.

【표 8]

No . CaC 결과측 ¾수단 시술전 2주 후 4주후 12주후

K 0. 05g FEI 37 32 31 31

VAS 8 8 7 7

L O . l g FRI 37 28 25 23

VAS 7 5 5 3

M 0.2B FEI 37 20 16 13

VAS 8 4 3 1

N 0.4g FRI 36 21 17 15

VAS 8 4 4 2

0 0.5g FRI 37 30 29 26

VAS 7 5 5 4

(조성물 K ~ 0에는 공통적으로 SVF 8g , ECM 5g , PRP 2g 및 HA lg이 포함되어 이으

상기 표 8에 따르면， 조성물 K의 경우 시술 4 주 및 12 주에서 13 %의 통증 완화 효과를 나타내었다.

조성물 L의 경우 시술 2주 및 4주 후에는 환자의 통증이 20 % 이상 경감되었으며， 12주 후에는 50 % 이상의 통증 완화 효과를 나타내었다.

조성물 M의 경우 시술 2주 후에는 50 % 이상， 4주 후에는 60 % 이상 및 12주 후에는 80 % 이상의 통증 완화 효과가 나타났다.

조성물 N의 경우 시술 2주 및 4주 후에는 50 % 이상, 12 주 후에는 70 % 이상의 통증 완화 효과가 나타났다.

조성물 0의 경우 시술 2주 및 4주 후에는 20 % 이상, 12주 후에서 40 % 이상의 통증 완화 효과를 나타내었다.

상기와 같은 결과에 따르면 조성물 K는 통증 완화 효과가 적기에 바람직하지 못하며， 조성물 0의 경우 조성물 N에 비하여 염화칼슴수용액이 더 많은 양이 포함 되었음에도 통증 완화 효과가 현저히 떨어지는 것으로 나타나 바람직하지 못하다. 또한, 통증 완화 효과 및 효율적인 측면에서 가장 바람직한 조성물은 M으로 나타났으며, 조성물 M을 시술받은 환자의 기능등급지수를 더욱 세부적으로 살펴보면 표 9와 같다.

【표 9】

상기 표 9에 따르면， 시술 2주 후에 환자의 무릎 구부림에 따른 통증은 40 % 이상 경감되었으며， 시술 12주 후에는 80 % 이상 경감되었고， 활동범위 또한 더욱 향상되었다.

또한 시술 전 및 시술 12주 후의 MRI 사진인 도 9를 살펴보면， 시술 전에 비하여 시술 12주 후에 오른쪽 무릎의 안쪽에 반월상 연골 및 유리성 연골의 두께가 증대되었음을 보여주며， 이로 인하여 연골이 재생되었음을 알 수 있다. [비교예 2]

SVF+ECM+PRP+CaC 1 g+Hya 1 ur on i c acid조성물 무릎관절염 연골재생 치료

상기 실시예 4(조성물 M)와 비교하기 위하여， 실험예 1 및 실시예 2에 따라 획득한 기질혈관분획 4 g, 세포외기질 2 g, 혈소판 풍부 혈장 1 g에 3 wt% 염화칼슘수용액 0. 1 g 및 히알루론산 2 g을 더 흔합하여 치료용 조성물을 제조한 후， 실험예 2와 같은 방법으로 무릎관절에 시술한 결과를 표 10 및 표 11로 정리하였다.

【표 10]

【표 11]

물리치료 구부리기 (deg) 구부리기 VAS 뻗기 (deg) 뻗기 VAS

- 활동범위

시술 전 104 7 +4 1/10 시술 2주 후 105 7 +4 1/10 시술 4주 후 104 7 +4 0/10

시술 12주 후 120 4 +4 0/10 상기 표 10 및 표 11에 따르면, 시술 12주 후에 환자의 고통은 40 % 이상 향상되었으며， 무릎의 구부림은 시술 4주 후에 다소 향상되었다.

상기 결과를 실시예 4(조성물 M)와 비교하면， 본 발명의 치료용 조성물인 실시예 4(조성물 M)보다 적은 양의 기질혈관분획， 세포외기질， 혈소판 풍부 혈장 및 염화칼슴수용액이 포함되는 경우에는 치료효과가 떨어지는 것으로 나타났다

[실시예 5]

SVF+ECM+PRP+CaC 1 g+Hya 1 ur on i c acid조성물 대퇴골두 무혈성괴사 뼈재생치료 상기 실시예 4의 조성물 M (기질혈관분획 8 g, 세포외기질 5 g, 혈소판 풍부 혈장 2 g, 3 wt% 염화칼슴수용액 0.2 g 및 히알루론산 1 g)을 대퇴골두 무혈성괴사 치료를 위하여 실험예 3과 같은 방법으로 시술한 후 피험자들의 통증 정도를 파악하기 위해 기능등급지수와 시각적 상사 척도를 평가한 결과 아래의 표 12 및 표 13과 같이 나타났다.

【표 12]

【표 13]

상기 표 12 및 표 13에 따르면， 시술 2주 후에 환자의 고통은 30 % 이상 경감되었고 시술 12주 후에 환자의 고통은 80 % 이상 향상되었으며， 활동범위 또한 더욱 향상되었다.

또한 시술 전 및 시술 12주 후의 MRI 사진인 도 10을 살펴보면， 시술 전에 비하여 시술 12주 후에 상부 관골구에 뼈의 결함이 상당히 줄어든 것을 알 수 있으며， 이는 실시예 3의 조성물을 시술한 도 5에서 나타난 차이보다 더 큰 것을 알수 있다. 이상과 같은 실시예 1 내지 5의 실험결과를 통해， 본 발명의 기질혈관분획, 세포외기질， 혈소판 풍부 혈장， 염화칼슘수용액 및 히알루론산을 포함하는 조성물은 퇴행성 관절염 및 대퇴골두 무혈성 괴사증 등과 같은 뼈 및 연골을 포함한 관절질환의 치료에 매우 효과적이라는 것을 알 수 있다. 환자의 MRI 결과를 통해 본 발명의 조성물을 사용한 경우 무릎 연골 및 대퇴골구 피질하부에서의 뼈 매트릭스 크기에 큰 변화를 확인하였으며， 측정된 물리 치료 결과들과 통증지수， 기능 등급 지수가 모두 향상되었음을 알 수 있었다. 또한 비교예 工 내지 2의 실험결과를 통해, 본 발명의 조성물의 함량보다 적은 양이 투여될 경우 치료효과가 현저히 떨어지며， 많은 양이 투여될 경우에는 치료효과가 비슷하게 나타났다. 하지만 투여량이 많아질수록 환자가 불편함을 느끼는 경향이 있으며， 경제적으로도 바람직하지 못하다.

따라서 본 발명에서 제시하는 기질혈관분획， 세포외기질， 혈소판 풍부 혈장， 염화칼슘수용액 및 히알루론산이 포함된 연골손상 치료용 조성물을 사용할 경우에， 외과수술에 의한 절개나 상처 없이도 효율적으로 퇴행성 관절염을 포함하는 연골손상의 치료가 가능함을 알 수 있다.

【산업상 이용가능성】

본 발명에서 제시된 퇴행성 관절염을 포함하는 연골손상 치료용 조성물은 부작용 없이 뼈 및 연골의 재생이 가능하여 절개 등의 외과적 수술을 최소화할 수 있어 흉터가 없고 회복이 빠른 장점이 있으며， 상기 조성물에 혈소판 풍부 혈장， 그리고 염화칼슘수용액 및 히알루론산을 추가로 포함하여 상기 뼈 재생 효과를 효율적으로 상승시킬 수 있어， 산업상 이용가능성이 있다.

Claims

【청구의 범위】

【청구항 1】

연골손상 치료용 조성물에 있어서，

상기 연골손상 치료용 조성물은 기질혈관분획 (SVF, stromal vascular fraction) 및 세포외기질 (ECM, extra cellular matrix)이 각각 5 ~ 10 중량부 및 0.1 ~ 5 중량부로 포함되고,

상기 기질혈관분획은 지방조직을 콜라게네이즈로 처리한 후 원심분리를 통해 얻어지는 것을 특징으로 하는, 퇴행성 관절염을 포함하는 연골손상 치료용 조성물. 【청구항 2】

제 1항에 있어서,

상기 연골손상 치료용 조성물은 혈소판 풍부 혈장 (PRP, platelet rich plasma) 1 ~ 10 중량부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 퇴행성 관절염을 포함하는 연골손상 치료용 조성물.

【청구항 3]

제 2항에 있어서，

상기 혈소판 풍부 혈장은 자가 혈액에서 유래된 것을 특징으로 하는ᅳ 퇴행성 관절염을 포함하는 연골손상 치료용 조성물.

【청구항 4]

제 1항에 있어서，

상기 연골손상 치료용 조성물은 1 ~ 5 %의 염화칼슘수용액 (CaCl₂) 0.1 ~ 0.4 중량부 및 히알루론산 (hyaluronic acid) 0.5 ~ 2 중량부를 더 포함하는， 퇴행성 관절염을 포함하는 연골손상 치료용 조성물.

【청구항 5】

제 1항에 있어서，

상기 기질혈관분획 및 세포외기질은 인간으로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 퇴행성 관절염을 포함하는 연골손상 치료용 조성물.

【청구항 6】

(a) 지방흡인으로 얻어진 지방조직을 콜라게네이즈 (col l agenase)와 1 ： 1 내지 1 ： 2의 비율로 흔합 및 교반하여 효소반웅을 진행한 후， 줄기세포를 포함하는 기질혈관분획을 추출하는 단계;

(b) 상기 줄기세포를 포함하는 기질혈관분획을 추출 및 분리하고 남은 지방추출물을 분쇄한 후， 상기 추출한 기질혈관분획을 다시 흔합한 후 기름 (oi l )과 튬네센트 (tumescent ) 용액을 제거하는 단계;

(c) 상기 기름과 륨네센트 용액이 제거된 지방추출물을 와싱 (washing)하여 효소를 제거하는 단계 ;

(d) 상기 와싱 절차 후에 지방추출물을 원심분리하여 기질혈관분획 및 세포외기질을 획득하는 단계; 및

(e) 상기 기질혈관분획 및 세포외기질이 각각 5 ~ 10 중량부 및 0. 1 ~ 5 중량부로 흔합되는 단계;를 포함하는 퇴행성 관절염을 포함하는 연골손상 치료용 조성물의 제조 방법 . 【청구항 71

제 6항에 있어서,

상기 (e)단계에서 혈소판 풍부 혈장 1 ~ 10 중량부가 추가로 더 흔합되는 것을 특징으로 하는， 퇴행성 관절염을 포함하는 연골손상 치료용 조성물의 제조 방법 . 【청구항 8]

제 7항에 있어서,

상기 혈소판 풍부 혈장은 자가 혈액에서 유래된 것을 특징으로 하는, 퇴행성 관절염을 포함하는 연골손상 치료용 조성물의 제조 방법.

【청구항 9]

제 6항에 있어서，

상기 (e)단계에서 1 ~ 5 \ %의 염화칼슘수용액 0. 1 ~ 0.4 중량부 및 히알루론산 0.5 - 2 중량부가 추가로 더 흔합되는 것을 특징으로 하는， 퇴행성 관절염을 포함하는 연골손상 치료용 조성물의 제조 방법 .

【청구항 10]

제 6항에 있어서，

상기 기질혈관분획 및 세포외기질은 인간으로부터 유래된 것을 특징으로 하는， 퇴행성 관절염을 포함하는 연골손상 치료용 조성물의 제조 방법 .