KR20140147805A - 지방조직으로부터 비지방 세포의 단리를 위한 방법 및 장치 - Google Patents

Abstract

본 개시내용의 양태에 따라, 지방조직 샘플로부터 비지방 세포의 단리를 위한 장치가 제공된다. 장치는 재료의 제1 시트, 재료의 제1 시트에 결합된 재료의 제2 시트 및 재료의 제1 시트와 재료의 제2 시트 사이에 정해진 다수의 챔버를 포함하되, 다수의 챔버는 주입구 및 배출구를 포함하는 샘플 해리 챔버; 샘플 해리 챔버의 배출구와 유체 연결된 주입구를 포함하는 폐기물 수집 챔버, 및 샘플 해리 챔버와 유체 연결된 주입구 및 배출구를 포함하는 세포 정제 챔버를 포함한다.

Description

지방조직으로부터 비지방 세포의 단리를 위한 방법 및 장치{METHOD AND DEVICE FOR ISOLATION OF NON-FAT CELLS FROM AN ADIPOSE TISSUE}

세포분리, 유세포분석기, 세포분석, 및 세포치료와 같은 생물학 및 의학에서 다수의 기법은 개개의 세포를 단리시키기 위해 조직의 해리에 의존한다. 조직 샘플 처리는 종종 다수의 작용, 예컨대 민싱(mincing), 세척, 효소적 분해, 해리, 인큐베이션, 믹싱, 클럼프 및 파편 제거 및 농축을 수반한다. 연구 실험실에서, 이들은 작용은 종종 개방 환경에서 관을 시험하기 위해 시험관으로부터 전달된 샘플에 의해 수동으로 행해진다. 이러한 수동 처리는 고도로 훈련받은 인원이 필요하며, 생물학적 샘플의 조작은 오염 및 감염의 잠재적인 위험을 제기한다.

최근에, 지방조직으로부터 세포를 단리시키는 것에 연구 및 의학계의 관심이 있다. 몇몇 기법은 환자 또는 동물로부터 지방조직의 일부를 안전하게 제거하도록 개발되었다. 예를 들어, 튜메슨트(tumescent) 지방흡입술 및 워터제트(water jet) 지방흡입술 기법은 환자로부터 지방조직을 제거하기 위해 널리 사용되었다. 지방조직은 지방을 저장하는 지방세포 및 조직을 유지하는 다른 비지방 세포를 함유한다. 지방조직의 구성세포, 그것의 역할 및 그것의 상호작용은 완전하게 이해되지 않으며, 적극적인 학문적 및 임상적 연구의 대상이다.

지방조직을 연구하기 위해, 조직을 해리시키고, 구성성분 세포를 단리시키는 것이 바람직할 수 있다. 공정은 구성성분 세포를 방출하는 단계, 파편 및 원치 않는 세포를 제거하는 단계, 관심 대상의 세포를 농축시키고 풍부화시키는 단계 및 세포를 세척하는 단계를 수반할 수 있다. 이러한 공정은 힘이 들며, 고도로 훈련된 작업자, 값비싼 장비 설치 및 적절한 생물안전 측정에 의한 연구를 필요로 할 수 있다. 다수의 조작 작용은 또한 관심 세포의 유의한 손실을 야기할 수 있는데, 이는 희귀하고 출현이 낮은 세포의 단리를 어렵고 믿을 수 없게 만든다. 더 나아가, 인간 샘플이 사용될 때, 교차 오염 및 감염의 위험이 상당할 수 있다.

따라서, 지방조직으로부터 관심 대상의 세포, 특히 지방세포 이외의 세포의 효과적인 단리 방법을 가지며, 지방조직으로부터 용이하고 안전하게 비지방 세포를 단리시키는 장치를 가지는 것이 바람직하다.

가요성 플라스틱 시트를 포함하는 백(bag)은 말초혈액, 제대혈, 혈액 성분, 혈장, 골수, 지질 흡인물 등과 같은 생물학적 조직 샘플을 수집하고, 처리하고, 저장하는데 널리 사용된다. 백은 가요성이며 확장가능하다는 이점을 가지고, 상이한 용적의 샘플을 수용하도록 그것의 내부 용적을 변화시킬 수 있다. 샘플 처리를 용이하게 하기 위해, 다수의 개개 백은 외부 튜빙을 사용하여 유동적으로 연결되어 시스템을 형성한다. 이러한 백 및 튜빙 시스템은 샘플 처리, 예를 들어 혈액 분획화, 세포 단리 등에서 널리 사용되었다. 그러나, 더 많은 처리 작용이 통합됨에 따라, 백 및 튜빙 시스템은 빠르게 사용하기 힘들고 어렵게 되며, 제작이 어렵게 된다. 시스템은 스파게티처럼 되며 얽히기 쉽게 되고, 다수의 성분은 서로 떨어진다. 이러한 장치를 사용하여, 작업자는 복잡한 장치를 셋업하기 위해 높은 수준의 훈련 및 장기간의 실습 시간을 필요로 한다. 작업자는 또한 정확한 위치에 정확한 순서로 다양한 부분을 장착하는 특별한 주의를 할 필요가 있다. 더 나아가, 다수의 백, 성분 및 튜빙 신장은 종종 개별적으로 만들어진 다음 조립되어야 하기 때문에 이들 장치 및 시스템은 제작이 어렵고 비용이 든다. 이러한 장치의 조립은 노동 집약적이며, 누출 및 오염, 즉 시스템 고장의 위험이 존재할 수 있다. 임상적 적용을 위해, 장치는 종종 일회용이며, 그것의 신뢰성은 중요하다. 집약적 노동 및 장치 고장 위험은 이들 통상적인 스파게티 유사 시스템에 대한 주된 장애물이다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 지방조직 샘플로부터 비지방 세포의 단리를 위한 장치가 제공된다. 장치는 재료의 제1 시트, 재료의 제1 시트에 결합된 재료의 제2 시트, 및 재료의 제1 시트와 재료의 제2 시트 사이에 정해진 다수의 챔버를 포함하되, 다수의 챔버는 주입구 및 배출구를 포함하는 샘플 해리 챔버, 샘플 해리 챔버의 배출구와 유체 연결된 주입구를 포함하는 폐기물 수집 챔버, 및 샘플 해리 챔버와 유체 연결된 주입구 및 배출구를 포함하는 세포 정제 챔버를 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 샘플 해리 챔버는 70㎛ 내지 300㎛의 기공 크기를 갖는 기공을 포함하는 메쉬 필터를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 장치는 20㎛ 내지 50㎛의 기공 크기를 갖는 기공을 포함하는 세포 정제 챔버에 포함된 메쉬 필터를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 샘플 해리 챔버는 제1 기공 크기를 갖는 기공을 포함하는 제1 메쉬 필터를 추가로 포함하며, 세포 정제 챔버는 제2 기공 크기를 갖는 기공을 포함하는 제2 메쉬 필터를 추가로 포함하고, 제2 기공 크기는 제1 기공 크기보다 작다.

일부 실시형태에 따르면, 장치는 샘플 해리 챔버, 폐기물 수집 챔버와 세포 정제 챔버 사이의 유체 연결을 제어하기 위한 수단을 추가로 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 유체 연결을 제어하기 위한 수단은 스탑콕을 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 장치는 린스 용액 및 해리 용액 중 적어도 하나를 샘플 해리 챔버 내로 도입하도록 구성되며, 샘플 해리 챔버와 유체 연결된 배출구를 갖는 유동 제어 장치를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 장치는 샘플 해리 챔버 및 세포 정제 챔버 중 하나에 압력을 적용하기 위한 수단을 추가로 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 장치는 세포 정제 챔버의 배출구와 유체 연결되며 세포 정제 챔버로부터 배출된 유체를 관심 대상의 하나 이상의 세포의 제1 농도를 갖는 제1 용액 및 제1 용액의 농도 미만의 관심 대상의 하나 이상의 세포의 농도를 갖는 제2 용액으로 분리시키도록 구성된 적어도 하나의 미소유체 장치를 포함하는, 하류의 처리 장치를 추가로 포함하되, 관심 대상의 세포는 지방조직 샘플로부터 단리된 비지방 세포를 포함한다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 멸균되어 있고 실질적으로 격리된 지방조직 처리 시스템이 제공된다. 시스템은 주입구, 배출구, 및 조직 처리 챔버의 주입구와 조직 처리 챔버의 배출구 사이에 배치된 적어도 하나의 메쉬 필터를 포함하는 조직 처리 챔버, 조직 처리 챔버와 동일한 인클로저 내에 포함된 폐기물 수집 챔버, 및 파편 제거 기구를 포함하는 파편 제거 챔버 및 조직 처리 챔버와 동일한 인클로저 내에 포함되고 조직 처리 챔버와 유체 연결된 샘플 수집 챔버 중 하나를 포함하되, 폐기물 수집 챔버는 조직 처리 챔버의 배출구와 유체 연결된 주입구를 포함한다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 조직 처리 시스템 내 지방조직 샘플을 처리하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 처리될 지방조직 샘플을 제1 챔버의 주입구 포트를 통해 제1 챔버 내로 도입하는 단계, 제1 챔버 내 지방조직 샘플을 처리하는 단계 및 제1 챔버의 배출구를 통한 제1 챔버로부터의 샘플을 제2 챔버의 주입구를 통해 제1 챔버와 동일한 인클로저 내에 포함된 제2 챔버 내로 옮기는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 지방조직 샘플을 처리하는 단계는 지방조직 샘플을 해리시키는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 지방조직 샘플을 처리하는 단계는 제1 챔버 내 지방조직 샘플로부터 과량의 유체를 제거하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 지방조직 샘플을 처리하는 단계는 린스 용액을 사용하여 제1 챔버 내 지방조직 샘플을 세척하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 지방조직 샘플을 처리하는 단계는 린스 용액을 사용하여 제1 챔버 내 지방조직 샘플을 세척하는 단계 및 적어도 하나의 효소를 포함하는 해리 용액을 사용하여 제1 챔버 내 지방조직 샘플을 해리시키는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 해리 용액은 콜라게나제를 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 해리 용액은 콜라게나제, 데옥시리보뉴클레아제 및 하이알루로니다제를 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 해리 용액을 사용하여 지방조직 샘플을 해리시키는 단계는 약 37℃에서 일어난다.

일부 실시형태에 따르면, 상기 방법은 제2 챔버에 포함된 메쉬 필터를 사용하여 파변을 제거하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 메쉬 필터는 15 마이크로미터 내지 100 마이크로미터의 기공 크기를 가진다.

일부 실시형태에 따르면, 상기 방법은 제1 챔버 내에 샘플을 보유하는 단계 및 제1 챔버 내에 포함된 메쉬 필터 및 제1 챔버의 제1 배출구를 통한 폐기물 유체를 제3 챔버의 주입구를 통해 제1 챔버와 동일한 인클로저 내에 포함된 제3 챔버 내로 옮기는 단계를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 상기 방법은 미소유체 장치를 사용하여 비지방 세포 집단을 풍부화시키는 단계를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 비지방 세포는 줄기세포를 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 상기 방법은 조직 처리 시스템으로부터 세포를 채취하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 상기 방법은 제2 챔버의 배출구와 유체 연결되면서 세포 정제 챔버로부터 배출된 유체를 비지방 세포의 제1 농도를 갖는 제1 용액 및 제1 용액의 농도 미만의 비지방 세포의 농도를 갖는 제2 용액으로 분리시키도록 구성된 적어도 하나의 미소유체 장치를 포함하는, 하류의 처리 장치에서 세포를 처리하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 채취한 세포는 기질 혈관 분획 세포이다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 지방조직으로부터 세포를 단리시키기 위한 장치가 제공된다. 장치는 재료의 제1 시트, 재료의 제1 시트에 결합된 재료의 제2 시트 및 재료의 제1 시트와 재료의 제2 시트 사이에 정해진 다수의 챔버를 포함하되, 다수의 챔버는 주입구 및 배출구를 포함하는 샘플 해리 챔버; 조직 해리 챔버의 배출구와 유체연결된 주입구를 포함하는 폐기물 수집 챔버, 및 샘플 해리 챔버와 유체연결된 주입구 및 배출구를 포함하는 세포 정제 챔버를 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 샘플 해리 챔버는 여과 메쉬를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 장치는 세포 정제 챔버에 포함된 여과 메쉬를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 샘플 해리 챔버는 제1 여과 기공 크기를 갖는 기공을 포함하는 제1 여과 메쉬를 추가로 포함하며, 세포 정제 챔버는 제2 기공 크기를 갖는 기공을 포함하는 제2 여과 메쉬를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 제2 기공 크기는 제1 기공 크기보다 작다.

일부 실시형태에 따르면, 장치는 샘플 해리 챔버, 폐기물 수집 챔버와 세포 정제 챔버 간의 유체 연결을 제어하기 위한 수단을 추가로 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 유체 연결을 제어하기 위한 수단은 스탑콕을 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 장치는 샘플 해리 챔버 내로 린스 용액 및 해리 용액 중 적어도 하나를 도입하도록 구성되고, 조직 해리 챔버와 유체연결된 배출구를 가지는 유동 제어 장치를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 장치는 샘플 해리 챔버 및 세포 정제 챔버 중 하나에 압력을 적용하기 위한 수단을 추가로 포함한다. 수단은 재료의 제1 시트와 재료의 제2 시트 사이에 배치된다. 수단은 재료의 제1 시트 및/또는 재료의 제2 시트 주위에 배치될 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 장치는 세포 정제 챔버의 배출구와 유체 연결되며 세포 정제 챔버로부터 배출된 유체를 관심 대상의 하나 이상의 세포의 제1 농도를 갖는 제1 용액 및 제1 용액의 농도 미만의 관심 대상의 하나 이상의 세포의 농도를 갖는 제2 용액으로 분리시키도록 구성된 적어도 하나의 미소유체 장치를 포함하는, 하류의 처리 장치를 추가로 포함한다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 실질적으로 단리된 지방조직 처리 시스템이 제공된다. 시스템은 주입구, 제1 배출구, 제2 배출구, 및 조직 처리 챔버의 주입구와 조직 처리 챔버의 제1 배출구 사이에 배치된 적어도 하나의 여과 메쉬를 포함하는 지방조직 처리 챔버, 조직 처리 챔버와 동일한 인클로저(enclosure) 내에 포함된 폐기물 수집 챔버, 및 파편 제거 기구를 포함하는 파편 제거 챔버 및 조직 처리 챔버와 동일한 인클로저 내에 포함되면서 조직 처리 챔버의 제2 배출구에 유체 연결된 샘플 수집 챔버 중 하나를 포함하되, 폐기물 수집 챔버는 조직 처리 챔버의 제1 배출구에 유체 연결된 주입구를 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 시스템은 지방조직 처리 챔버와 동일한 인클로저 내이면서 지방조직 처리 챔버의 주입구와 유체 연결된 주입구 및 배출구를 포함하는 유체 용적 측정 챔버를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 유체 용적 측정 챔버의 주입구 및 유체 용적 측정 챔버의 배출구는 각각 체크 밸브를 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 제1 배출구 및 제2 배출구는 지방조직 처리 챔버와 유체 연결된 스탑콕의 배출구를 포함한다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 지방조직으로부터 세포를 단리시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 처리될 샘플을 조직 처리 챔버의 주입구 포트를 통해 조직 처리 챔버 내로 도입하는 단계, 조직 처리 챔버 내 샘플을 처리하는 단계, 및 조직 처리 챔버의 배출구를 통한 조직 처리 챔버로부터의 세포를 샘플 저장 챔버의 주입구를 통해 조직 처리 챔버와 동일한 인클로저 내에 포함된 샘플 저장 챔버 내로 방출시키는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 상기 방법은 조직 처리 챔버 내에서 세포 샘플을 보유하는 단계 및 조직 처리 챔버에 포함된 메쉬 필터 및 조직 처리 챔버의 제1 배출구를 통한 폐기물 유체를 폐기물 수집 챔버의 주입구를 통해 조직 처리 챔버와 동일한 인클로저 내에 포함된 폐기물 수집 챔버 내로 옮기는 단계를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 상기 방법은 조직 처리 시스템으로부터 세포를 추출하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 상기 방법은 샘플 저장 챔버의 배출구와 유체 연결되며 세포를 관심 대상의 하나 이상의 세포의 제1 농도를 갖는 제1 용액 및 제1 용액의 농도 미만의 관심 대상의 하나 이상의 세포의 농도를 갖는 제2 용액으로 분리시키도록 구성된 적어도 하나의 미소유체 장치를 포함하는, 하류의 처리 장치에서 세포의 추출된 샘플을 처리하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 조직 처리 챔버 내 조직 샘플을 처리하는 단계는 조직 세정 용액을 조직 처리 챔버 내로 도입하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 조직 처리 챔버 내 조직 샘플을 처리하는 단계는 조직 처리 챔버 내로 조직 해리 용액을 도입하는 단계를 추가로 포함한다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 지방조직으로부터 세포를 단리시키기 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은 처리될 지질 흡인물 샘플을 메쉬를 포함하는 챔버 내로 도입하는 단계, 샘플로부터 과량의 유체를 제거하는 단계, 적어도 하나의 메쉬를 통해 해리된 샘플을 통과시켜 지방세포 및 파편을 제거하는 단계, 및 샘플로부터 적혈구 세포를 실질적으로 제거하는 단계 및 미소유체 장치를 사용하여 샘플을 적어도 3배만큼 농축시키는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 상기 방법은 세척 용액을 사용하여 샘플을 세척하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 상기 방법은 샘플을 적어도 하나의 효소를 포함하는 해리 용액과 혼합하고 인큐베이션시키는 단계를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 미소유체 장치는 실질적으로 일정한 깊이 및 적어도 하나의 750 마이크로미터 미만의 치수를 갖는 다수의 미소유체 채널을 포함하되, 적어도 2개의 미소유체 채널은 기판의 표면 상에 배열된다.

일부 실시형태에 따르면, 해리 용액은 콜라게나제를 포함하며, 샘플 및 해리 용액은 약 20℃ 내지 약 40℃에서 인큐베이션된다.

일부 실시형태에 따르면, 해리 용액은 콜라게나제 및 데옥시리보뉴클레아제를 포함하며, 샘플 및 해리 용액은 약 37℃에서 인큐베이션된다.

일부 실시형태에 따르면, 미소유체 장치는 샘플을 비지방 유핵 세포 분획으로 분리시키도록 구성된 기둥을 추가로 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 미소유체 장치는 비지방 세포를 세척하고 세척 용액을 사용하여 해리 용액 중의 효소를 실질적으로 제거하도록 구성된다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 실질적으로 단리된 지방조직 처리 시스템이 제공된다. 시스템은 3개의 주입구 포트, 제1 배출구 포트 및 제2 배출구, 및 3개의 주입구 포트와 제1 및 제2 배출구 포트 사이에 배치된 메쉬를 포함하는 샘플 세척 및 해리 챔버, 샘플 세척 및 해리 챔버의 제1 배출구와 유체 연결되는 주입구 커넥터, 배출구 및 주입구 커넥터와 배출구 사이에 배치된 메쉬를 포함하는 클럼프 감소 챔버, 클럼프 감소 챔버의 배출구와 유체 연결된 주입구를 갖는 단리된 세포 및 추가로 파편 제거에 대한 저장소, 및 샘플 세척 및 해리 챔버의 제2 배출구 포트와 유체 연결된 주입구를 갖는 폐기물 용액 수집 챔버, 및 미소유체 장치를 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 미소유체 장치는 실질적으로 일정한 깊이 및 적어도 하나의 750 마이크로미터 미만의 치수를 갖는 다수의 마이크로유체 채널을 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 다수의 미소유체 채널 중 적어도 2개는 기판의 하나의 표면 상에 배열된다.

일부 실시형태에 따르면, 샘플 세척 및 해리 챔버, 클럼프 감소 챔버, 저장소 및 폐기물 용액 수집 챔버의 각각은 동일한 밀봉 포장에 포함된다.

수반되는 도면은 일정한 비례로 축소된 것으로 의도되지 않는다. 도면에서, 다양한 도면에 도시된 각각의 동일하거나 또는 거의 동일한 부품은 동일한 숫자에 의해 표시된다. 명료성의 목적을 위해, 모든 도면에 모든 부품이 표지되지 않을 수도 있다. 모든 도면은 달리 표시되지 않는다면 개략적인 것으로 고려되어야 한다. 도면에서:
도 1a는 본 개시내용의 실시형태에 따른 방법의 흐름도를 도시한 도면;
도 1b는 본 개시내용의 실시형태에 따른 방법의 흐름도를 도시한 도면;
도 2a는 본 개시내용의 실시형태에 따른 샘플 처리 장치의 개략적 다이어그램을 도시한 도면;
도 2b는 본 개시내용의 실시형태에 따른 유동 제어 장치의 개략적 다이어그램을 도시한 도면;
도 2c는 본 개시내용의 실시형태에 따른 유동 제어 장치의 개략적 다이어그램을 도시한 도면;
도 2d는 본 개시내용의 실시형태에 따른 샘플 처리 장치의 개략적 다이어그램을 도시한 도면;
도 2e는 본 개시내용의 실시형태에 따른 샘플 처리 장치의 개략적 다이어그램을 도시한 도면;
도 2f는 본 개시내용의 실시형태에 따른 샘플 처리 장치의 개략적 다이어그램을 도시한 도면;
도 2g는 본 개시내용의 실시형태에 따른 샘플 처리 장치의 개략적 다이어그램을 도시한 도면;
도 3a는 본 개시내용의 실시형태에 따른 샘플 처리 장치의 정면도를 도시한 도면;
도 3b는 도 3a의 샘플 처리 장치의 등각도를 도시한 도면;
도 3c는 도 3a의 장치 챔버 일부의 분해조립도를 도시한 도면;
도 3d는 도 3a의 장치 챔버 일부의 분해조립도를 도시한 도면;
도 3e는 도 3a의 장치 챔버 일부의 측면으로부터의 횡단면도를 도시한 도면;
도 3f는 선택적 클램프를 포함하는 도 3a의 샘플 처리 장치의 정면도를 도시한 도면;
도 4는 본 개시내용의 실시형태에 따른 샘플 처리 장치의 정면도를 도시한 도면;
도 5A는 본 개시내용의 실시형태에 따른 샘플 처리 장치 챔버의 정면도를 도시한 도면;
도 5B는 도 5A의 챔버 일부의 측면으로부터의 횡단면도를 도시한 도면;
도 6A는 본 개시내용의 실시형태에 따른 샘플 처리 장치 챔버의 정면도를 도시한 도면;
도 6B는 도 6A의 챔버 측면으로부터의 횡단면도를 도시한 도면;
도 7은 본 개시내용의 실시형태에 따른 샘플 처리 장치 챔버의 측면으로부터의 횡단면도를 도시한 도면;
도 8a는 본 개시내용의 실시형태에 따른 샘플 처리 장치 챔버의 정면도를 도시한 도면;
도 8b는 도 8a의 챔버의 분해조립도를 도시한 도면;
도 9A는 본 개시내용의 실시형태에 따른 샘플 처리 장치 챔버의 정면도를 도시한 도면;
도 9B는 도 9A의 챔버의 분해조립도를 도시한 도면;
도 10a는 본 개시내용의 실시형태에 따른 샘플 처리 장치 일부의 정면도를 도시한 도면;
도 10b는 도 10a의 샘플 처리 장치의 일부의 분해조립도를 도시한 도면;
도 11은 본 개시내용의 실시형태에 따른 샘플 처리 장치의 정면도를 도시한 도면;
도 12는 본 개시내용의 실시형태에 따른 샘플 처리 장치의 정면도를 도시한 도면;
도 13a는 본 개시내용의 실시형태에 따른 샘플 처리 장치의 정면도를 도시한 도면;
도 13b는 도 13a의 챔버 일부의 횡단면도를 도시한 도면;
도 13c는 도 13a의 장치 챔버의 일부의 횡단면도를 도시한 도면;
도 14는 본 개시내용의 실시형태에 따른 샘플 처리 장치의 정면도를 도시한 도면;
도 15a는 본 개시내용의 일부 실시형태에 포함된 미소유체 장치의 일부를 도시한 도면;
도 15b는 본 개시내용의 일부 실시형태에 포함된 미소유체 장치의 일부를 도시한 도면;
도 15c는 본 개시내용의 일부 실시형태에 포함된 미소유체 장치의 일부를 도시한 도면;
도 15d는 본 개시내용의 일부 실시형태에 포함된 미소유체 장치의 일부를 도시한 도면;
도 15e는 본 개시내용의 일부 실시형태에 포함된 미소유체 장치의 일부를 도시한 도면;
도 16는 본 개시내용의 실시형태에 따른 샘플 처리 장치의 정면도를 도시한 도면;
도 17은 본 개시내용의 일부 실시형태에 포함된 미소유체 장치를 도시한 도면;
도 18A는 본 개시내용의 실시형태에서 처리된 유체의 사진을 도시한 도면; 및
도 18B는 본 개시내용의 실시형태에서 처리된 유체의 사진을 도시한 도면.

본 개시내용은 다음의 설명에 제시되거나 또는 도면에 도시된 부품의 구성 및 배열의 상세한 설명에 대한 그것의 적용으로 제한되지 않는다. 개시내용은 다른 실시형태가 가능하고 다양한 방법으로 실행되거나 또는 수행될 수 있다. 또한, 본 명세서에 사용되는 어구 및 용어는 설명의 목적을 위한 것이며, 제한하는 것으로 간주되지 않는다. 본 명세서에서 "포함하는", "포함하는", "갖는", "함유하는", "수반하는" 및 이들의 변형의 사용은 이후에 열거되는 항목 및 그것의 동등물뿐만 아니라 추가적인 항물을 포함하는 것을 의미한다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 “샘플”, “조직 샘플”, “지방 샘플” 및 “지방조직”은 지방조직 샘플, 예를 들어 지질 흡인물을 포함할 수 있으며, 상기 용어는 상호 호환적으로 사용된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "미소유체 장치"는 실질적으로 평면 또는 곡선일 수 있는 실질적으로 하나의 표면 상에 형성된 적어도 하나의 유동성 채널, 및 약 1㎜ 미만의 적어도 하나의 측면 채널 치수를 가지는 장치를 지칭할 수 있다. 측면 채널 치수는, 예를 들어 채널의 폭 또는 깊이일 수 있다.

이는 지방조직으로부터 관심 대상 세포의 효과적인 단리를 위한 방법을 가지고, 지방조직으로부터 용이하고 안전하게 세포를 단리시키는 장치를 가지는데 바람직한 것으로 발견되었다. 연구 및 임상적 적용을 위해, 인간 오류가 최소화될 수 있도록 지방조직 샘플을 처리하는 다양한 작용은 간소화되는 것이 바람직한 것으로 발견되었다. 추가로, 지방조직 샘플은 오염 및 감염 위험을 최소화하기 위해 외부 환경 및/또는 작업 인원과 직접 신체 접촉 또는 유체 접촉으로부터, 예를 들어 여과되지 않은 공기 흐름을 통해 지방 샘플을 단리시키도록 장벽이 제공되는 실질적으로 "격리된" 환경(isolated environment)에서 처리되는 것이 중요한 것으로 발견되었다. 이는 또한 샘플에 대해 실질적으로 격리된 환경을 제공하기 위해 하나의 조각으로서 다수의 부품 및 구획이 통합된 지방조직 처리를 위한 시스템 및 장치를 가지는 것이 바람직하다는 것을 발견하였다. 지방조직 처리를 위한 시스템 및 장치는 사용이 용이하고, 제조가 용이하며, 낮은 실패 위험을 가지는 것이 바람직하다. 또한 다수의 임상적 및 연구적 적용을 위해, 지방조직 샘플과 직접 접촉되는 장치 및 시스템의 임의의 부분은 멸균되어 있고 일회용인 것이 바람직할 수 있다.

본 개시내용의 양태 및 실시형태는 지방조직 샘플로부터 특정 구성요소 세포 집단을 단리시키기 위한 방법을 제공한다. 본 개시내용의 다른 양태 및 실시형태는 통합되고, 간소화되며, 안전하고 사용이 용이한 방식으로 지방조직 샘플로부터 특정 구성요소 세포 집단을 단리시키기 위한 방법을 가능하게 하기 위한 장치를 제공한다.

본 개시내용의 양태 및 실시형태는 샘플 수집, 세척, 층상, 혼합, 가열, 냉각, 여과, 분해, 저장, 유체 전달 및 조작, 세포 표지, 샘플 처리, 해리, 폐기물 유체 수집, 클럼프 제거, 파편 제거, 세포 농도, 세포 풍부화, 세포 단리, 세포 인큐베이션, 성장, 배양, 분화, 확장 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 지방조직 샘플 처리를 위한 다수의 구획을 포함하는 통합된 장치를 제공한다. 본 개시내용의 실시형태에 따른 통합된 장치는 또한, 예를 들어 구획 사이의 유체 유동을 제어하는 목적을 위한 밸브를 포함할 수 있다. 이러한 장치는 지방조직 샘플 처리의 다양한 작용, 예를 들어 지방조직으로부터 세포의 단리를 통합하고 간소화하는데 유용할 수 있으며, 효소적 분해, 지방조직 해리, 세척, 폐기물 액체 수집, 파편 제거, 세포 농도, 항체를 사용하는 표지, 마그네틱 비드를 사용하는 표지, 세포 확장 등과 같은 다양한 기능을 가능하게 할 수 있다. 이러한 장치는 안전성, 사용의 용이함 및 제조의 용이함이 중요한 적용에 대해 특히 유용할 수 있다. 본 개시내용의 일부 양태 및 실시형태는 이러한 장치를 사용하기 위한 방법을 포함한다.

지방조직으로부터 세포를 단리시키기 위한 현재 개시된 방법의 일 실시형태는 지방조직을 해리시키는 단계, 구성요소 세포를 방출시키는 단계, 방출된 세포를 수집하는 단계 및 조직 파편을 제거하는 단계를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 상기 방법은 지방조직 해리 전 세정 작용 단계를 추가로 포함할 수 있다. 지방조직 세정 작용은 지방조직 샘플로부터 원치 않는 또는 과량의 유체를 제거하거나 또는 배수시키는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 원치 않는 유체는 혈액, 체액 및 튜메슨트 용액을 포함할 수 있다. 지방조직 세정 작용은 린스 용액을 사용하여 지방조직을 린스하거나 또는 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 방출된 세포를 풍부화시키거나 또는 정제하기 위한 하나 이상의 작용을 추가로 포함할 수 있다. 추가로, 상기 방법은 공정으로부터 폐기물 유체의 수집을 추가로 포함할 수 있다. 지방조직으로부터 세포를 단리시키기 위한 현재 개시된 방법의 다른 실시형태는 지방조직으로부터 과량의 유체를 제거하는 단계, 지방조직을 해리시키는 단계 및 구성요소 세포를 방출시키는 단계 및 원치 않는 세포 및 파편을 제거하는 단계를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 상기 방법은 지방조직 샘플을 세척하는 단계, 관심 대상의 세포를 농축하는 단계, 관심 대상의 세포를 세척하는 단계, 및 예를 들어 항체를 사용하여 면역분리를 수행하는 단계 중 하나 이상의 추가로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 관심 대상의 세포를 농축하는 단계 및/또는 세척하는 단계는 적어도 하나의 미소유체 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 작용은 원심분리를 사용할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 작용은 중공섬유를 이용하여 수행될 수 있다.

본 개시내용의 일 실시형태에서, 지방조직으로부터 비지방 세포 집단을 단리시키기 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은 지방조직으로부터 과량의 유체를 제거하는 단계, 지방조직을 완충 용액으로 세척하는 단계, 예를 들어 초음파 또는 효소를 함유하는 해리 용액을 사용하여 지방조직을 해리시키는 단계, 지방세포, 유리 오일, 매트릭스 섬유 및 조직 파편을 제거하는 단계, 적혈구 세포를 감소시키는 단계, 및 관심대상의 세포를 풍부화시키는 단계를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 세포 풍부화 작용은 원심분리, 필터, 또는 미소유체 장치를 사용하여 달성될 수 있다. 상기 방법은 림프구 감소, 세포 세척 및 면역분리 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 지방조직으로부터 과량의 유체를 제거하는 단계, 지방조직을 완충 용액으로 세척하는 단계, 지방조직을 해리시키는 단계, 지방세포, 유리 오일, 매트릭스 섬유 및 섬유 파편을 제거하는 단계, 및 세포 세척 단계의 작용은, 예를 들어, 중력하에 침강시키는 것, 원심분리 및/또는 메쉬필터를 포함하는 스트레이너(strainer)를 사용하여 수행될 수 있다.

지방조직으로부터 비지방 세포 집단을 단리시키기 위한 방법의 일 실시형태의 흐름도는 (100)에서 일반적으로 표시하는 도 1a에서 나타낸다. 지방흡입술 절차 동안, 튜메슨트 유체는 종종 환자에게 도입되어 혈액 손실을 최소화하고, 조직을 단단하게 만들며, 국소 마취를 제공한다. 튜메슨트 용액은 0.05%에서 리도카인 및 1:1,000,000 농도에서 에피네프린을 함유할 수 있다. 상기 방법은 지질 흡인물 지방조직으로부터 과량의 유체를 제거하는 작용(작용(110))을 포함한다. 과량의 유체는 혈액 및 종종 튜메슨트 유체를 포함할 수 있는데, 이는 하류 처리 작용 및 관심 대상의 세포 단리를 방해할 수 있다. 일 실시형태에서, 제거된 과량의 유체 샘플은 중력 침강 또는 원심분리를 사용하여 지방조직층 및 과량의 유체층으로 계층화될 수 있는데, 지방조직은 과량의 유체보다 더 낮은 밀도를 가지기 때문이다. 지방조직층 및 과량의 유체는 그 다음에 과량의 유체로부터 지방조직을 분리시키기 위한 상이한 용기로 분리될 수 있다. 예를 들어, 염 용액, 젖산 링거 용액, 행크스 균형 염 용액 또는 인산염 완충 식염수 용액을 포함하는 세척 용액이 지방조직에 적용되어 조직을 세척할 수 있고, 층상 공정은 지방조직을 세척하기 위해 반복되며 과량의 유체를 더 철저하게 제거할 수 있다. 다른 실시형태에서, 과량의 유체는 메쉬를 포함하는 스트레이너를 사용하여 배수될 수 있다. 세척 용액은 지방조직에 첨가될 수 있고, 스트레이너를 사용하여 배수되어 조직을 세척할 수 있다. 이 세척 공정은 반복될 수 있다. 일 실시형태에서, 스트레이너는 약 30 마이크로미터(㎛) 내지 약 1 밀리리터(㎜), 예를 들어, 약 30㎛, 약 50㎛, 약 70㎛, 약 85㎛, 약 100㎛, 약 120㎛, 약 140㎛, 약 200㎛, 약 300㎛, 약 500㎛, 약 700㎛ 또는 약 1㎜의 기공 크기를 지니는 기공을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 스트레이너는 약 70㎛ 내지 약 500㎛, 예를 들어, 약 70㎛, 약 100㎛, 약 140㎛, 약 200㎛, 약 300㎛ 또는 500㎛의 기공 크기를 갖는 기공을 포함할 수 있다. 더 구체적으로는, 스트레이너는 약 70㎛ 내지 약 200㎛, 예를 들어, 약 80㎛, 약 90㎛, 약 100㎛, 약 120㎛, 약 140㎛, 약 170㎛ 또는 약 200㎛의 기공 크기를 갖는 메쉬 필터를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 다른 실시형태에서, 스트레이너는 조직이 스트레이너에 의해 보유되도록 지방조직보다 더 작은 기공 크기를 가진다. 과량의 유체의 효율적인 제거를 위해, 세척 용액을 첨가하는 단계 및 세척 용액을 제거하는 단계를 포함하는 세척 작용은 약 1 내지 약 10배, 예를 들어 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 8배 또는 10배로 적용될 수 있다. 지방샘플의 용적과 각 세척을 위해 첨가된 세척 용액의 용적 사이의 비는 약 1:0.2 내지 약 1:10, 예를 들어, 약 1:0.2, 약 1:0.3, 약 1: 0.5, 약 1:0.7, 약 1:1, 약 1:2, 약 1:3, 약 1:5 또는 약 1:10일 수 있다. 예를 들어, 튜메슨트 지방흡입술을 사용하여 수집한 100㎖의 지질 흡인물 지방조직은 100㎖의 젖산 링거 용액과 혼합될 수 있고, 기공 크기가 약 140㎛인 기공을 갖는 나일론 메쉬를 사용하여 배수된다. 이 공정은 과량의 유체 제거를 완료하기 위해 3회 수행될 수 있다. 다른 실시형태에서, 각 세척 작용은 샘플 용적의 0.6배 내지 4배의 용적, 예를 들어 샘플 용적의 0.6, 0.8, 1, 1.2, 1.5, 1.8, 2, 2.5, 3 또는 4배를 갖는 세척 용액을 샘플로에 첨가하는 단계 및 제거하는 단계를 각각 포함하고, 세척 작용은 1회, 2회, 3회 또는 4회 수행된다. 다른 실시형태에서, 과량의 유체 제거 작용은 중력 다음에 스트레이너를 사용하는 배수를 사용하여 층상 작용과 조합될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 세척 용액은 미처리 지방조직에 첨가되거나 혼합되어 과량의 유체를 희석시킨 다음 메쉬 스트레이너를 사용하여 유체를 층상화 또는 배수시킬 수 있다. 세척 용액의 첨가 단계는 층상화 또는 배수를 더 효과적으로 만들 수 있다.

본 개시내용의 다른 실시형태에서, 과량의 유체 제거 작용은 배출구를 갖는 용기에 샘플을 넣은 다음, 스트레이너를 사용하지 않고 과량의 유체를 배수시킴으로써 수행될 수 있다. 일 실시형태에서, 용기는 유체 제어를 위한 수단, 예를 핀치 밸브를 추가로 포함할 수 있다. 과량의 유체의 제어를 수행하기 위해, 과량의 유체는 배출구를 통해 배수될 수 있고, 샘플이 배출구에 접근할 때, 배출구는 유체 제어 수단을 사용하여 폐쇄될 수 있다. 배출구는 지방조직 샘플보다 더 작은 크기 또는 조직샘플을 통과시키는 큰 크기를 가질 수 있다. 작용은 수동으로 또는 센서, 예를 들어 배출구에 대해 샘플을 검출할 수 있는 광센서 또는 적외선의 도움에 의해 수행될 수 있다. 세척 용액은 지방조직 샘플에 첨가되어 샘플을 세척 또는 린스할 수 있고, 과량의 유체 제거 작용이 반복되어 지방조직 샘플을 세정할 수 있다. 도 1a에 나타낸 방법의 제2 작용(작용(120))은 지방조직을 해리시키기 위한 것이다. 지방조직은 초음파를 사용하여 해리될 수 있다. 지방조직은 해리 용액을 사용하여 해리될 수 있다. 해리 용액은 지방조직의 세포밖 매트릭스를 파괴하는 효소를 포함할 수 있다. 해리 용액은 콜라게나제, 프로테아제, 프로테이나제, 중성 프로테아제, 엘라스타제, 하이알루로니다제, 리파제, 트립신, 리베라제, DNase, 데옥시리보뉴클레아제, 펩신, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 해리 용액은 0.1 ㎎/㎖ 및 10 ㎎/㎖, 예를 들어, 약 0.1 ㎎/㎖, 약 0.2 ㎎/㎖, 약 0.3 ㎎/㎖, 약 0.5 ㎎/㎖, 약 0.75 ㎎/㎖, 약 1 ㎎/㎖, 약 1.2 ㎎/㎖, 약 1.5 ㎎/㎖, 약 2 ㎎/㎖, 약 3 ㎎/㎖, 약 4 ㎎/㎖, 약 5 ㎎/㎖, 약 7 ㎎/㎖ 또는 약 10 ㎎/㎖의 농도에서 콜라게나제를 포함할 수 있다. 해리 용액은 트립신을 포함할 수 있다. 해리 용액은 콜라게나제 및 데옥시리보뉴클레아제를 포함할 수 있다. 해리 용액은 콜라게나제, 하이알루로니다제 및 데옥시리보뉴클레아제를 포함할 수 있다. 해리 용액은 0.2 ㎎/㎖ 내지 5 ㎎/㎖의 콜라게나제, 0.1 ㎎/㎖ 내지 4 ㎎/㎖의 하가알루로니다제 및 1단위 내지 400단위의 데옥시리보뉴클레아제를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 단위는 4.2 mM의 Mg++ 농도에서 기질로서 DNA를 사용하여 pH 5.0, 25℃에서 0.001/분/㎖의 A260에 대한 변화를 만드는 효소적 활성으로서 정의된다. 해리 용액은 칼슘 이온 및/또는 마그네슘 이온을 추가로 포함할 수 있다. 해리 용액은 0.1 mM 내지 10mM, 예를 들어, 약 0.1mM, 약 0.2mM, 약 0.3mM, 약 0.5mM, 약 0.7mM, 약 1mM, 약 1.5mM, 약 2mM, 약 3mM, 약 4mM, 약 5mM, 약 6mM, 약 7mM, 약 8 mM 또는 약 10mM의 농도에서 마그네슘 또는 칼슘 이온을 포함할 수 있다.

해리 용액을 첨가한 후, 지방조직은 특정 온도, 예를 들어 약 37℃에서 특정 시간 기간, 예를 들어 약 5분 내지 약 30시간 동안 인큐베이션될 수 있다. 인큐베이션 동안, 지방조직 및 해리 용액은 간헐적으로 및/또는 지속적으로 혼합되어 효율적인 반응을 가능하게 할 수 있다. 지방조직 해리 작용 또는 인큐베이션 작용은 37℃에서 약 10분 내지 약 120분, 예를 들어, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 30분, 약 45분, 약 60분, 약 75분, 약 90분 또는 약 120분 동안, 해리 용액 중의 지방조직 샘플을 부드럽게 연속적 또는 간헐적으로 교반시키면서 수행될 수 있으며, 여기서 교반은 3분마다, 예를 들어, 1초마다, 2초마다, 3초마다, 5초마다, 10초마다, 20초마다, 30초마다, 45초마다, 60초마다, 90초마다, 120초마다 또는 180초마다 보다 더 빈번하게 일어난다.

해리 작용의 마지막에, 금속 이온 킬레이터, 예컨대 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA)이 시퀘스터 금속 이온에 첨가될 수 있고, 해리 용액 중의 효소 활성을 중단시키며, 온도는 약 4℃ 내지 30℃, 예를 들어, 실온, 약 25℃, 약 22℃, 약 18℃, 약 15℃, 약 12℃, 약 8℃ 또는 약 4℃로 저하될 수 있다. 온도는 인큐베이션 후 실온 주위, 예를 들어, 25℃ 주위, 또는 18℃ 내지 28℃에서 유지될 수 있다. 다른 실시형태에서, 해리 작용 후 해리 용액 중의 효소를 저해하기 위해 혈장, 혈소판 풍부 혈장, 또는 혈청이 첨가될 수 있다.

도 1a(작용(130))의 방법의 제3 작용은 유리 오일, 매트릭스 섬유, 조직 파편 및 원치 않는 세포, 예를 들어 지방세포를 제거하는 것이다. 지방세포, 매트릭스 섬유 및 조직 파편은 약 10㎛ 내지 약 70㎛, 예를 들어, 약 10㎛, 약 15㎛, 약 20㎛, 약 25㎛, 약 30㎛, 약 35㎛, 약 40㎛, 약 50㎛, 약 60㎛ 또는 약 70㎛의 기공 크기를 갖는 기공을 포함하는 메쉬 스트레이너를 사용하여 실질적으로 제거될 수 있다. 다른 실시형태에서, 해리된 지방조직 샘플은 약 20㎛ 내지 약 50㎛, 예를 들어, 약 20㎛, 약 22㎛, 약 25㎛, 약 30㎛, 약 35㎛, 약 40㎛, 약 45㎛, 및 약 50㎛의 기공 크기를 지니는 메쉬를 통과한다. 메쉬 스트레이너를 통과한 여과액이 수집될 수 있다. 대안적으로, 지방세포, 매트릭스 섬유 및 조직 파편은 원심분리를 사용하여 실질적으로 제거될 수 있다.

도 1a(작용(140, 150 및 160))의 방법의 제4, 제5 및 제6 작용은 적혈구 세포를 감소시키는 단계(RBC), 관심 대상의 세포를 농축시키는 단계, 및 세포를 세척하는 단계를 각각 포함한다. 이들 3개 작용의 순서는 서로 바뀔 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 세포는 우선 농축되고, 세척된 다음, RBC 감소될 수 있다. 다른 실시형태에서, 세포는 그것들이 농축되기 전 우선 세척될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 세포는 동시에 세척되고 농축될 수 있다. 농축 작용은 더 적은 용적이 요망되는 적용에서 유리하게 수행될 수 있다. 예를 들어, 지방조직으로부터 단리된 세포를 배양시키는 단계가 종종 연구에서 수행된다. 세포 배양 플라스크에서 더 높은 종자 세포 밀도를 얻고, 배양 효율을 증가시키기 위해, 세포는 농축될 수 있다. 단리된 세포는 또한 인간 또는 동물 내로 이식 또는 주사를 위해 사용될 수 있는데, 더 양호한 결과를 수득하기 위해 종종 높은 세포 농도가 요망된다. 세포 농축은 또한 동물 또는 인간 환자 내로 이식될 때 세포 성장을 저해하거나 또는 유해한 효과를 야기할 수 있는 이전의 작용에서 사용된 시약, 예를 들어 해리 용액 중의 효소를 실질적으로 제거하는 이점을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 미소유체 장치는 관심 대상의 세포를 농축하고/하거나 적혈구 세포를 제거하기 위해 사용될 수 있다. 미소유체 장치는 제4, 제5 및/또는 제6 작용을 동시에 달성하도록 구성될 수 있다. 추가로, 미소유체 장치는 림프구를 제거하도록 구성되어 면역 반응을 위한 가능성을 감소시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 농도 작용은 원심분리를 사용하여 달성될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 농도 작용은 막 필터를 사용하여 달성될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 농도 작용은 중공섬유, 예를 들어, 중공섬유 막 필터를 사용하여 달성될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 적혈구 세포 감소는 적혈구 세포가 선택적으로 용해되는 적혈구 세포 용해 용액, 예를 들어 염화 암모늄을 사용하여 달성될 수 있다.

도 1a에 나타낸 실시형태의 제6 작용(작용(160))은 관심 대상의 세포를 세척하는 것 및/또는 원하는 완충제 내로 관심 대상 세포를 옮기는 것이다. 원심분리, 완충제 교환 및/또는 투석 방법이 사용될 수 있다. 대안적으로, 미소유체 장치는 또한 이 작용을 수행하도록 구성될 수 있다. 이 작용은 이전의 작용에서 사용된 잔여 시약을 추가로 감소시키며, 관심 대상의 세포가 임상적 이식을 위해 사용될 때 요망될 수 있다. 그러나 일 실시형태에서, 작용(140 내지 160)은 생략할 수 있다.

본 개시내용의 일 실시형태에서, 방법은 지방조직의 사전 조건화, 지방조직의 해리 및 방출된 세포의 정제를 포함한다. 이 방법의 이 실시형태의 흐름도는 도 1b에 나타내며, (200)에서 일반적으로 표시된다. 일 실시형태에서, 지방조직 사전 조건화 작용(작용(210))은 폐기물 유체를 배수시키는 단계, 폐기물 유체를 제거하는 단계, 과량의 유체를 제거하는 단계, 지방조직 샘플을 린스하는 단계, 지방조직 샘플을 세척하는 단계 및/또는 지방조직 샘플을 민싱하는 단계를 포함한다. 민싱은, 지방조직 샘플이 효소에 의해 분해되거나 또는 해리되기 어려운 거대한 덩어리를 포함할 때 유리할 수 있다. 지방조직 사전조건화 작용은 본 개시내용에 개시된 지방조직으로부터 비지방 세포 집단을 단리시키기 위한 양태 및 실시형태를 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 지방조직 사전조건화 작용은 제1 용기 내 지방조직 샘플을 보유하는 한편, 혈액, 튜메슨트 용액 또는 다른 체액과 같은 과량의 유체를 제2 용기로 통과시키는 단계를 포함할 수 있다. 조직 샘플의 보유는 제1 용기 내 메쉬를 사용하여 달성될 수 있다. 일 실시형태에서, 메쉬는 약 70㎛ 내지 약 300㎛, 예를 들어, 약 80㎛, 약 90㎛, 약 100㎛, 약 120㎛, 약 140㎛, 약 170㎛, 약 200㎛ 또는 약 300㎛의 기공 크기를 가진다. 대안적으로, 지방조직 샘플의 보유는 제1 용기 내 메쉬를 사용하지 않고 제1 용기에 대해 지방조직 샘플의 위치를 검출하는 검출기 또는 센서를 사용하여 달성될 수 있다. 지방조직 사전 조건화는 1회 또는 반복적으로 지방조직 샘플을 세척하는 린스 용액을 첨가하는 단계 및 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 조직 사전 조건화는 또한 지방조직 샘플이 과량의 유체 및/또는 폐기물 유체로부터 원심력 하에 분리되는 원심분리를 사용하여 달성될 수 있다. 대안적으로, 지방조직 사건조건화 작용은 지방조직이 해리 및 정제에 대해 허용가능한 조건에 있다면 생략될 수도 있다.

일 실시형태에서, 지방조직 해리 작용(작용(220))은 적어도 하나의 효소, 예를 들어, 콜라게나제, 프로테아제, 프로테이나제, 중성 프로테아제, 엘라스타제, 하이알루로니다제, 리파제, 트립신, 파파인, 리베라제, DNase, 데옥시리보뉴클레아제, 펩신, 또는 이들의 조합물을 포함하는 해리 용액 중의 지방조직 샘플을, 효소 분해에 적합한 온도, 예를 들어 약 32℃ 내지 약 38℃에서 약 3분 내지 20시간의 지속 기간 동안 인큐베이션시키는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 지방조직 해리 작용은 지방조직 샘플을 통해 초음파를 통과시키는 단계를 포함한다. 세포는 지방조직 해리 작용 동안 지방조직 샘플로부터 방출된다.

방출된 세포의 정제(작용(230))는 필터, 메쉬, 중공섬유, 항체, 미소유체 장치 또는 원심분리를 사용하는 세포 농축, 세포 세척, 세포분리, 세포 단리, 파편 제거, 비표적 세포 제거, 적혈구 감소 또는 이들 작용의 조합을 포함할 수 있다. 관리 적용 및 필드 적용의 관점과 같은 다수의 적용을 위해, 단시간 기간, 예를 들어, 15분, 20분, 30분, 45분, 60분, 90분 또는 120분 내에 본 개시내용의 전체 방법을 수행하는 것이 바람직할 수 있다.

지방조직으로부터 비지방 세포 집단을 단리시키기 위해 본 명세서에 개시된 다수의 작용 및 실시형태는 또한 조사 연구 및 약학적 시험 시스템에서 사용될 수 있다. 비지방 세포의 단리는 생리적, 대사적 및 기능적 연구를 위해 또는 약학적 시험 시스템에서 약물 시험을 위해 수행될 수 있다. 본 명세서에 개시된 다수의 작용 및 실시형태는 또한 이식을 위해 조작된 조직에서 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법 및/또는 장치를 사용하여 얻은 세포는 시험관내에서 배양되어 이식을 위해 시험관내 배양된 조직을 형성한다. 지방세포 유래 줄기세포는 기능적 세포 및 조직을 만들도록 단리될 수 있다.

본 개시내용의 일 실시형태는 도 2a에서 개략적으로 나타내고, (300)에서 일반적으로 표시하는 샘플 처리 장치이다. 샘플 처리 장치(300)는 샘플 조건화 챔버(310) 및 폐기물 챔버(320)를 포함한다. 샘플 조건화 챔버(310)는 샘플(340), 예를 들어, 지질 흡인물 또는 지방흡입술로부터의 지방조직 샘플을 수용하기 위한 제1 주입구(305), 린스 용액(350)의 공급원으로부터 린스 용액, 예를 들어, 완충제 용액, 식염수 용액 등을 수용하기 위한 제2 주입구(315), 조건화된 후 샘플(360)을 수집하기 위한 제1 배출구(325), 및 폐기물 용기(320)에 연결되는 제2 배출구(335)를 포함한다. 제2 배출구(335)는 조건화된 챔버(310)와 폐기물 용기(320) 사이의 유체 연결을 개방 및 폐쇄하기 위한 수단(345), 예를 들어 밸브, 핀치 밸브, 스탑콕 등을 포함할 수 있다. 샘플 조건화 챔버(310)는 샘플이 그것의 과량의 유체를 폐기물 용기 내로 배수되고, 린스 용액을 사용하여 세척되도록 한다. 조건화 챔버는 과량의 유체 또는 린스 용액이 폐기물 용기 내로 배수될 때 샘플이 배출구에 가깝게 얻어지는지 여부를 검출하도록 바람직하게는 제2 배출구(335)에 가까운 센서를 추가로 포함할 수 있다. 조건화 챔버는 샘플 세척, 샘플 린스 및 과량의 유체의 제거 동안 지방조직을 보유하도록 구성된 제1 주입구(305)와 제2 배출구(335) 사이에 위치된 스트레이너를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 스트레이너는 약 30㎛ 내지 약 1㎜, 예를 들어, 약 30㎛, 약 50㎛, 약 70㎛, 약 85㎛, 약 100㎛, 약 120㎛, 약 140㎛, 약 200㎛, 약 300㎛, 약 500㎛, 약 700㎛ 또는 약 1㎜의 기공 크기를 지니는 기공을 포함하는 필터를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 스트레이너는 약 70㎛ 내지 약 500㎛, 예를 들어, 약 70㎛, 약 100㎛, 약 140㎛, 약 200㎛, 약 300㎛ 또는 500㎛의 기공 크기를 갖는 기공을 포함할 수 있다. 스트레이너는 약 70㎛ 내지 약 200㎛, 예를 들어, 약 80㎛, 약 90㎛, 약 100㎛, 약 120㎛, 약 140㎛, 약 170㎛ 또는 약 200㎛의 기공 크기를 갖는 메쉬 필터를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 스트레이너는 조직 조각이 스트레이너에 의해 보유되도록 지방조직 조각보다 더 작은 기공 크기를 가진다.

린스 용액은 조건화 챔버에 첨가되는 린스 용액의 용적을 제어하는 유동 제어 장치(330), 예를 들어 연동 펌프를 통해 조건화 챔버에 들어갈 수 있다. 유동 제어 장치는 적어도 하나의 밸브 및 다른 용적의 용기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 유동 제어 장치는 도 2b에 개략적으로 도시한 바와 같은 스탑콕(370) 및 주사기(380)를 포함할 수 있다. 측정 용적을 제공하기 위해, 스탑콕은 주입구가 주사기에 유동적으로 연결된 위치로 우선 전환된다. 주사기의 플런저는 주입구로부터 주사기 내로 유체를 인출하도록 당겨진다. 그 다음에 스탑콕은 배출구가 주사기에 유동적으로 연결된 위치로 전환된다. 다음에, 주사기의 플런저는 배출구를 통해 주사기 밖으로 유체를 제공하도록 밀어 넣어진다. 최종적으로, 스탑콕은 다시 주입구에 주사기를 유동적으로 연결하도록 전환되어 펌핑 주기를 완료한다. 린스 용액의 원하는 용적이 조건화 챔버에 첨가될 때까지 펌핑 주기는 반복될 수 있다. 유동 제어 장치는 또한 도 2c에서 개략적으로 도시하는 바와 같이 2개의 체크 밸브 CV1, CV2, 즉, 유체가 한 방향으로 유동되게 하는 밸브, 및 주사기를 포함할 수 있다. 측정된 용적을 제공하기 위해, 주사기의 플런저는 우선 잡아당겨진 다음, 밀어 넣어져서 펌핑 주기를 완료한다. 제1 체크 밸브(CV1)는 유체가 주입구로부터 주사기까지 유동되게 하도록 구성되며, 제2 체크 밸브(CV2)는 유체가 주사기로부터 배출구까지 유동되게 하도록 구성된다. 유체를 주사기 내로 인출하고 주사기 밖으로 밀어 내기 위해 각각 플런저를 잡아당기고, 밀어넣는 것을 포함하는 펌핑 주기는 린스 용액의 원하는 용적이 조건화 챔버에 첨가될 때까지 반복될 수 있다. 대안적으로, 도 2b 또는 도 2c에 도시된 유동 제어 장치의 주사기는 공기가 들어가고 빠질 수 있는 백 또는 제어된 방식으로 용적이 변할 수 있는 용기로 대체될 수 있다.

본 개시내용의 다른 실시형태는 도 2D에 개략적으로 나타내고 (400)에서 일반적으로 표시한 샘플 처리 장치이다. 샘플 처리 장치(400)는 샘플 해리 챔버(410) 및 세포 정제 장치(420)를 포함한다. 해리 챔버는 샘플을 수용하기 위한 제1 주입구(405), 해리 용액(430)의 공급원으로부터 해리 용액을 수용하기 위한 제2 주입구(415) 및 세포 정제 장치에 유동적으로 연결된 적어도 하나의 배출구(425)를 포함한다. 해리 챔버는 더 작은 구성요소, 예를 들어 단일 세포 및 소세포 클럼프로 샘플을 해리시키도록 구성된다. 해리 용액은 샘플을 분해하는 효소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 해리 용액은 콜라게나제, 프로테아제, 프로테이나제, 중성 프로테아제, 엘라스타제, 하이알루로니다제, 리파제, 트립신, 리베라제, DNase, 데옥시리보뉴클레아제, 펩신, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 온도는, 예를 들어 약 37℃에서 제어될 수 있으며, 해리 챔버 내 샘플 및 유체는 효율적인 효소 반응 및 균일한 해리를 가능하게 하도록 혼합될 수 있다. 해리 챔버의 일 실시형태는 가요성 백이다. 백은 문지름, 짜내기, 굴림, 흔들기, 진탕, 부분적으로 짜내기 및 앞뒤로 방출 또는 혼합을 가능하게 하기 위한 다른 교반일 수 있다. 또한 해리 용액은 세정제, 예컨대 Tween 20 또는 도데실 황산나트륨을 포함할 수 있다. 샘플을 해리시키기 위해 초음파가 사용될 때, 해리 용액은 초음파를 효율적으로 수행하는 매질을 포함할 수 있다. 해리 챔버는 스트레이너, 예를 들어 메쉬 또는 필터를 포함할 수 있다. 스트레이너는 효율적인 해리릴 위한 위치에서 샘플을 보유하고/하거나 해리된 샘플로부터 거대 파편을 제거하는 역할을 할 수 있다. 일 실시형태에서, 스트레이너는 약 30㎛ 내지 약 1㎜, 예를 들어, 약 30㎛, 약 50㎛, 약 70㎛, 약 85㎛, 약 100㎛, 약 120㎛, 약 140㎛, 약 200㎛, 약 300㎛, 약 500㎛, 약 700㎛ 또는 약 1㎜의 기공 크기를 지니는 기공을 포함하는 필터를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 스트레이너는 약 70㎛ 내지 약 500㎛, 예를 들어, 약 70㎛, 약 100㎛, 약 140㎛, 약 200㎛, 약 300㎛ 또는 500㎛의 기공 크기를 갖는 기공을 포함할 수 있다. 스트레이너는 약 70㎛ 내지 약 200㎛, 예를 들어, 약 80㎛, 약 90㎛, 약 100㎛, 약 120㎛, 약 140㎛, 약 170㎛ 또는 약 200㎛의 기공 크기를 갖는 메쉬 필터를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 스트레이너는 조직이 스트레이너에 의해 보유되도록 지방조직 조각보다 더 작은 기공 크기를 가진다.

세포 정제 장치는 해리 챔버에 연결된다. 일 실시형태에서, 샘플 처리 장치는 해리 챔버와 세포 정제 장치 사이의 밸브(435)를 추가로 포함한다. 밸브는 해리 용액과 함께 샘플을 인큐베이션시키도록 폐쇄되고, 방출된 세포가 세포 정제 장치 내로 들어가도록 개방될 수 있다.

세포 정제 장치는 해리 챔버로부터 방출된 세포를 수용하고 방출된 세포를 정제하도록 구성된다. 일 실시형태에서, 세포 정제 장치는 주입구(445)를 통해 해리 챔버에 유동적으로 연결된 챔버, 정제된 세포(440)를 채취하기 위한 배출구(455) 및 해리된 샘플 내 거대 파편을 제거하도록 구성된 스트레이너를 포함한다. 스트레이너는 약 10㎛ 내지 약 100㎛, 예를 들어, 약 10㎛, 약 15㎛, 약 20㎛, 약 25㎛, 약 30㎛, 약 35㎛, 약 40㎛, 약 50㎛, 약 70㎛ 또는 약 100㎛의 기공 크기를 갖는 필터를 포함할 수 있다. 스트레이너는 또한 약 20㎛ 내지 약 60㎛, 예를 들어, 약 20㎛, 약 22㎛, 약 25㎛, 약 30㎛, 약 35㎛, 약 40㎛, 약 50㎛, 내지 약 60㎛의 기공 크기를 지니는 메쉬를 포함할 수 있다

본 개시내용의 다른 실시형태는 도 2e에서 개략적으로 나타내며 (500)에서 일반적으로 표시하는 샘플 처리 장치이다. 샘플 처리 장치(500)는 제1 챔버(510), 폐기물 용기(520) 및 세포 정제 장치(530)를 포함한다. 세포 정제 장치는 상기 개시한 바와 같은 메쉬를 포함할 수 있다. 제1 챔버는 샘플이 해리 전 세척될 수 있는 사전 조건화 챔버, 및 샘플이 더 작은 구성요소, 예를 들어 단일 세포 또는 세포의 소응집물로 해리될 수 있는 해리 챔버로서 작용할 수 있다. 제1 챔버는 샘플을 수용하기 위한 제1 주입구(505) 및 린스 용액(350)의 공급원으로부터 린스 용액을 수용하기 위한 제2 주입구(515)를 포함한다. 일 실시형태에서, 린스 용액 및 해리 용액은 동일 주입구를 통해 제1 챔버로 들어갈 수 있다. 다른 실시형태에서, 제1 챔버는 해리 용액(430)으로부터 해리 용액을 수용하기 위한 제3 주입구(525)를 포함한다. 제1 챔버는 해리 챔버 및 조건화 챔버에 관한 상기 단락에서 기재한 바와 같이, 스트레이너, 예를 들어 메쉬 또는 필터를 추가로 포함할 수 있다. 제1 챔버는 폐기물 챔버 및 세포 정제 장치에 유동적으로 연결된다. 예를 들어 필치 밸브 또는 클램프 밸브를 포함할 수 있는 밸브 V1 및 V2는 유체 흐름을 제어하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 샘플 조건화 동안, 제1 챔버로부터 폐기물 용기 내로 과량의 유체 및 린스 용액이 유동될 수 있도록 밸브 V1은 개방될 수 있다. V1과 V2는 둘 다 샘플 해리 동안 해리 용액과 함께 샘플을 인큐베이션시키기 위해 폐쇄될 수 있다. 해리 후, V2는 해리된 샘플이 세포 정제 장치에 전달되도록 개방될 수 있다.

본 개시내용의 일 실시형태에서, 지방조직 샘플은 제1 챔버(510)에 부하되기 전 특정 온도, 예를 들어 37℃로 사전 가온될 수 있다. 지방조직 샘플의 처리로서 사전가온화는 조직 샘플을 처리를 위해 필요한 시간을 단축시킬 수 있다. 본 개시내용의 다른 실시형태에서, 지방조직 샘플은 제1 챔버(510)에 부하되기 전, 300㎚ 내지 700㎚의 평균 파장을 갖는 빛을 사용하여 광 활성화된다. 광활성화는 조직 샘플 내 세포의 효능을 증가시킬 수 있다. 본 개시내용의 또 다른 실시형태에서, 지방조직 샘플은 음파, 즉, 제1 챔버(510) 내로 부하되기 조직 샘플이 더 용이하게 해리되도록 조직을 느슨하게 하는 초음파를 사용하여 처리된다.

샘플 처리 장치는 제1 챔버 내로 린스 용액의 유동을 제어하기 위해 상기 기재한 바와 같이 유동 제어 장치(330)를 추가로 포함할 수 있다. 유동 제어 장치(330)와 유사할 수 있는 유동 제어 장치(330B)는 또한 제1 챔버 내로 주사된 해리 용액의 유동을 제어하기 위해 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 해리 용액은 제1 챔버 내로 주사되기 전 주사기에 부하된다.

본 명세서에 개시된 샘플 처리 장치는 상이한 변형 및 조합을 가질 수 있다는 것이 인식된다. 예를 들어, 도 2f에서 나타내는 바와 같이, (500A)에서 일반적으로 표시하는 샘플 처리 장치의 실시형태는 제1 챔버인 폐기물 용기와 세포 정제 장치 사이의 유체 유동을 제어하기 위한 2개의 밸브(V1, V2)를 사용할 수 있다. 유동 제어 장치는 2개의 체크 밸브(CV1, CV2) 및 용적 측정 장치(540), 예를 들어, 주사기를 포함할 수 있다. 해리 용액은 체크 밸브 CV3를 통해 제1 챔버에 연결될 수 있다.

본 개시내용의 샘플 처리 장치의 다른 실시형태는 도 2g에서 개략적으로 나타내고 (500B)에서 일반적으로 표시되는데, 여기서 적어도 3개의 스탑콕(SC1, SC2, SC3)이 유체 유동을 제어하기 위해 사용된다. 예를 들어, 샘플 사전조건화 동안, 과량의 유체 및 린스 용액은 제1 챔버로부터 폐기물 용기 내로 옮겨질 수 있다. 스탑콕(SC3)은 샘플 해리 동안 해리 용액과 함께 샘플을 인큐베이션시키는 제1 챔버를 나가는 유동을 중단시킬 수 있다. 해리 후, 스탑콕(SC3)은 해리된 샘플을 세포 정제 장치에 옮기도록 제1 챔버를 세포 정제 장치에 연결시킬 수 있다.

도 3a는 도 2e에서 개략적으로 나타낸 장치의 실시형태를 나타낸다. 장치는 다수의 챔버를 형성하기 위해 함께 결합되는 2개의 플라스틱 시트를 포함한다. 장치는 간결하고, 사용이 용이하며, 안전하고, 비용 효과적인 방식으로 본 명세서에 개시된 지방조직 처리를 위한 방법을 가능하게 할 수 있다. 챔버(1)는 특정 용적까지 공기가 들어갈 수 있는 측정 챔버이다. 챔버는 주입구(포트 1) 및 배출구(포트 2)를 포함한다. 챔버(1)는 유체를 취하고, 특정 사전결정된 용적의 유체를 제공하며, 이에 의해 지방조직 처리를 위해 주입구(포트(3))를 통해 챔버(2) 내로 제공될 유체의 용적을 제어하도록 설계될 수 있다. 포트(2) 및 포트(3)은 튜빙 조각을 통해 유동적으로 연결될 수 있는데, 이 튜빙 조각은 핀치 밸브, 클램프 밸브, 스탑콕, 체크 밸브 또는 다른 밸빙 기구(들)를 사용하여 포트(3)로부터 포트(2)를 유동적으로 연결을 끊도록 핀치 오프될 수 있다. 챔버(1)를 작동시키기 위해, 포트(2)와 포트(3) 사이의 연결은 처음에 끊어진다. 유체는 포트(1)를 통해 챔버(1) 내로 도입되어 챔버를 완전히 또는 부분적으로 공기가 들어가게 한다. 그 다음에 포트(1)는, 예를 들어 핀치 클램프, 핀치 밸브, 스탑콕, 체크 밸브, 또는 다른 밸빙 기구(들)를 사용하여 중단된다. 다음에, 포트(2)와 포트(3) 사이의 밸브는 챔버(1)의 공기가 빠질 때 챔버(1) 내 유체가 챔버(2) 내로 유동되도록 개방된다. 챔버(1)의 공기빠짐은 중력을 사용함으로써, 사이포닝(siphoning)에 의해 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 챔버를 외부에서 짜내고/짜내거나 압축시킴으로써 수행될 수 있다. 챔버(1)는 챔버(2)보다 더 높이 위치되어 중력을 사용하여 유체가 챔버(2)에 제공되는 것을 가능하게 할 수 있다. 이 공정은 챔버(2)에 사전 결정된 양의 유체를 옮기며, 양은 챔버(1)의 공기가 들어간 용적과 공기가 빠진 용적 사이의 차이에 의해 결정된다. 더 적은 용적의 유체가 요망된다면, 챔버(1)는 부분적으로 압축되고, 짜내지며/지거나 핀치 오프되어 챔버(1)로 유입되고/되거나 배출되는 유체의 용적을 제어한다. 대안적으로, 챔버(1)는 그 안에 유체의 일부를 제공하도록 단지 부분적으로 공기가 빠질 수 있다. 더 큰 용적이 요망된다면, 팽창-수축 공정은 원하는 용적의 유체가 챔버(2)에 옮겨질 때까지 수회 반복될 수 있다.

챔버(1), 포트(1) 및 포트(2)는 도 2b 또는 2c에서 개략적으로 나타내는 유동 제어 장치의 실시형태일 수 있다.

포트(1) 및 포트(2)는 유체가 각각 챔버(1)에 단지 들어가고 나가게 하는 일방향 밸브로서 알려진 체크 밸브를 포함할 수 있다. 유체의 설정 용적을 측정하고 제공하는 작용은 매우 단순하다: 유체가 포트(1)를 통해 유입되게 하는 챔버(1)의 압력을 줄이는 단계 및 포트(2)를 통해 유체를 밀어내도록 챔버(1)를 압축하는 단계.

대안적으로, 챔버(1)는 샘플 처리에 필요한 사전 패키징된 용액을 제공하는 저장 챔버일 수 있다. 예를 들어, 젖산 링거 용액, 균형 염 용액, 식염수 용액, 해리 용액, 세척 용액, 린스 용액, 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA)을 함유하는 용액 및/또는 효소 용액은 장치의 부분으로서 챔버(1)에서 패키징될 수 있다.

다른 실시형태에서, 측정 챔버는 플런저를 잡아당기고 밀어냄으로써 사전에 정해진 용적의 유체를 인출하고/하거나 제공할 수 있는 플런저를 포함하는 주사기를 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 측정 챔버는 유체 유동이 연동 펌프를 사용하여 제어되는 연동 펌프 상에 장착된 가요성 튜빙을 포함할 수 있다.

챔버(2)는 도 2e에서 개략적으로 나타낸 제1 챔버(510)의 실시형태일 수 있다. 챔버(2)는 하나 이상의 주입구 및 배출구를 포함하는 지방조직 세척 챔버일 수 있다. 챔버(2)는 또한 해리 챔버로서 작용할 수 있으며, 추가로 적어도 하나의 메쉬, 예를 들어, 스크린, 반투과성막 및/또는 다공성 또는 미소공성막을 포함하는 필터 기구를 포함할 수 있다. 지방조직 샘플, 예를 들어 지질 흡인물 또는 지방 지질 흡인물 조직 조각은 주입구(포트(4))를 통해 챔버(2) 내로 도입되거나 또는 부하될 수 있다. 샘플로부터 과량의 유체는 커넥터(1)를 통한 메쉬를 통해 폐기물 수집 챔버(챔버(3)) 내로 배수될 수 있다. 세척 용액은 챔버(2)에 첨가되어 샘플을 세척하고/하거나 린스할 수 있다. 세척 용액은 측정될 수 있고, 챔버(1)를 통해 챔버(2) 내로 제공될 수 있다. 샘플을 처리하기 위한 용액이 첨가되어 샘플을 변경시킬 수 있다. 혼합 수단이 챔버(2)에 적용되어 린스 및 세척을 더 효과적으로 만들 수 있다. 예를 들어, 챔버(2)는 문질러 지고, 부드럽게 짜내지며, 흔들어지고, 진탕되며, 부분적으로 짜내지며, 앞뒤로 방출되거나 또는 달리 교반되어 혼합을 가능하게 할 수 있다. 그 다음에 폐기물 유체는 폐기물 수집 챔버(챔버(3))에 배수될 수 있다. 챔버(2)(커넥터(1 및 2))의 배출구는 폐기물 유체가 배수되기 전, 세척 용액과 샘플 간에 철저하게 혼합되도록 혼합동안 밸브 수단을 사용하여 폐쇄될 수 있다. 클램프, 예를 들어 도 3f에 도시되는 바와 같은 클램프(1), 클램프(2) 및/또는 클램프(3)은 챔버의 핀치에 적용될 수 있으며, 챔버 간의 유체 연결을 폐쇄시킬 수 있다. 세척 공정은 수회, 예를 들어, 2, 3, 4 또는 5회 반복될 수 있다. 세척 작용 동안, 지방조직 샘플은 챔버(2)에 보유될 수 있다. 작은 덩어리를 포함하는 지방조직 샘플에 대해, 챔버(2)는 샘플을 효율적으로 보유하기 위한 메쉬 또는 막 필터를 포함할 수 있다. 다수의 메쉬 및/또는 필터층(메쉬(1) 및 메쉬(2))은 원하는 지방조직 보유를 제공하기 위해 혼입될 수 있다.

세척 후, 해리 용액은 지방조직 샘플을 해리시키고, 세포를 방출시키도록 챔버(2)에 첨가될 수 있다. 챔버의 온도는 가열, 냉각 및/또는 온도 제어 시스템을 사용하여 특정의 최적화된 온도에서 설정되어 샘플 해리를 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 장치는 인큐베이터, 수욕 내에 위치되어 및/또는 일정한 온도의 플레이트와 접촉되어 최적의 효소 분해를 위해 약 37℃에서 온도를 유지할 수 있다. 해리 용액은 연결 매트릭스, 세포밖 매트릭스 등을 분해하도록 하나 이상의 효소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 콜라게나제는 콜라겐 섬유를 분해하기 위해 37℃에서 사용될 수 있다. 프로테이나제, 프로테아제, 트립신, 프로테이나제 K, 리아제, 효소, 라이시스 용액, 하이알루로니다제, 리파제, 트립신, 리베라제, DNase, 데옥시리보뉴클레아제, 펩신, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 다른 시약이 또한 지방조직 분해를 위해 사용될 수 있다. 해리 챔버(챔버(2))에서 배출구(커넥터(1) 및/또는 커넥터(2))는 분해동안 폐쇄될 수 있다. 챔버(2)는 문질러 지고, 부드럽게 짜내지며, 흔들어지고, 진탕되며, 부분적으로 짜내지며, 앞뒤로 방출되거나 또는 달리 교반되어 혼합을 가능하게 하고, 효율적인 지방조직 해리를 촉진할 수 있다. 분해 작용이 완료될 때, 커넥터(2)는 방출된 세포가 해리 챔버를 나가도록 개방될 수 있다. 챔버(2) 내 적어도 하나의 메쉬는 거대한 파편 조각을 제거하거나 또는 보유하는 역할을 할 수 있다. 분해 후 챔버(2)에서 잠재적으로 붙잡힌 세포를 린스하기 위해, 세척 용액을 첨가하는 단계를 포함하는 1회 이상의 추적 세척 작용이 적용될 수 있다.

도 3a에 나타내는 샘플 처리 장치는 메쉬, 막 필터 및/또는 다른 파편 제거 기구(예를 들어, 메쉬(3))를 포함할 수 있는 파편 제거 챔버(챔버(4))를 추가로 포함할 수 있다. 해리된 샘플은 파편 제거 챔버로 옮겨질 수 있으며, 여기서 거대 클럼프, 지방세포와 같은 원치 않는 세포 및/또는 파편이 샘플로부터 제거될 수 있다. 챔버(4)는 또한 샘플 저장 챔버로서 역할을 할 수 있으며, 여기서 방출된 세포는 추가 사용까지 수용된다. 방출된 세포는 포트(5)를 통해 수집될 수 있다. 챔버(4)는 도 2e에서 개략적으로 나타내는 세포 정제 장치(530)의 실시형태일 수 있다.

도 3b 및 도 3c는 메쉬가 챔버(4)에 혼입된 실시형태를 나타낸다. 메쉬는 폴딩되거나, 2개의 가요성 시트 사이에 샌드위치되거나, 용접되거나, 접착되거나 또 다르게는 함께 융합되어 챔버(4)를 형성할 수 있다. 유사하게는, 메쉬 또는 막 필터는 챔버(2)에 혼입될 수 있다. 도 3d 및 도 3e는 각각 하나 이상의 메쉬가 챔버(2)에서 사용될 수 있다는 것을 나타내는 챔버(2)의 분해조립도 및 횡단면도를 포함한다. 챔버(2) 및/또는 챔버(4)에 포함된 메쉬는 챔버(2) 및/또는 (4)를 통해 유체를 유동 통로를 따라서 계속해서 더 작아지는 기공을 포함할 수 있다. 예를 들어, 메쉬(1)의 공칭 기공 크기(도 3d)는 약 100㎛ 내지 약 900㎛일 수 있으며, 메쉬(2)의 공칭 기공 크기는 약 50㎛ 내지 약 200㎛일 수 있고, 메쉬(3)의 공칭 기공 크기는(도 3c)는 약 10㎛ 내지 약 60㎛일 수 있다.

본 개시내용은 도 3a 내지 도 3f에 나타낸 실시형태의 구체적 구성으로 제한되지 않는다는 것이 인식된다. 본 개시내용의 실시형태는 도 3a 내지 도 3f에 나타낸 것보다 더 많거나 또는 더 적은 챔버를 포함할 수 있다. 구체적 작용 순서를 포함하는 구체적 작업을 달성하기 위해 다양한 기능을 갖는 챔버가 사용되고 구성될 수 있다. 예를 들어, 챔버는 샘플 수집, 세척, 린스, 층상화, 혼합, 가열, 냉각, 필터링, 분해, 저장, 밸빙, 용적 측정, 펌핑, 유체 전달 및 조작, 세포 표지, 샘플 처리, 해리, 폐기물 유체 수집, 클럼프 제거, 파편 제거, 용해, 농축, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 인큐베이션, 혼성화, 세포 배양, 세포 확장 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 기능을 가질 수 있다.

도 4의 (600)에서 일반적으로 도시된 본 개시내용의 샘플 처리 장치의 다른 실시형태는 2개의 플라스틱 시트를 사용하여 형성된다. 챔버(1)는 3개의 주입구 포트(포트(1), 포트(2) 및 포트(3)), 메쉬(메쉬(1)), 및 2개의 배출구 커넥터(커넥터(1) 및 커넥터(2))를 포함하는 샘플 세척 및 해리 챔버이다. 챔버(2)는 주입구 커넥터(커넥터(2)), 배출구/주입구 커넥터(커넥터 3) 및 메쉬(메쉬(2))를 포함하는 클럼프 감소 챔버이다. 메쉬(메쉬(3))를 선택적으로 포함하는 챔버(3)는 단리된 세포를 위한 저장소 및 추가로 파편 제거 또는 세포 정제 챔버일 수 있다. 챔버(4)는 샘플 세척 및 해리 챔버(챔버(1))의 배출구 커넥터와 유체 연결된 주입구 튜빙(커넥터(1))을 포함하는 폐기물 용액 수집 챔버이다.

도 5A 및 도 5B는 2개의 메쉬를 포함하는 본 개시내용의 챔버(610)의 다른 실시형태를 나타낸다. 2개의 메쉬는 실질적으로 중복되지 않도록 구성된다. 각각의 메쉬는 폴딩되고, 2개의 가요성 외부 시트 사이에 샌드위치 된다. 본 실시형태는 단지 2개의 메쉬 층이 시트 사이에 융합되기 때문에 더 용이하게 되는 이점을 가질 수 있다.

도 6A 및 도 6B는 2개의 가요성 외부 시트 사이에 샌드위치된 적어도 하나의 비폴딩 메쉬를 포함하는, 본 개시내용의 챔버(620)의 또 다른 실시형태를 나타낸다. 메쉬는 주입구 포트와 배출구 포트 사이에 위치되며, 주입구 포트로부터 유입되는 유체가 메쉬를 통과하여 배출구 포트를 얻도록 구성된다. 주입구 포트 및 배출구 포트는 메쉬의 반대측 상에 있다. 이 구성은 단지 하나의 메쉬층이 2개의 시트 사이에 밀봉되어야 하기 때문에, 제조가 용이하다는 이점을 가질 수 있다.

도 7은 2개의 가요성 외부 시트 사이에 샌드위치된 주름 잡힌 메쉬를 포함하는, 본 개시내용의 챔버(630)의 또 다른 실시형태를 나타낸다. 이 구성은 증가된 메쉬 면적의 이점을 가질 수 있다.

도 8a 및 도 8b는 본 개시내용의 챔버(640)의 또 다른 실시형태를 나타내는데, 여기서 메쉬는 폴딩되고 밀봉 림(sealing rim)을 따라 밀봉되어 챔버 내로 혼입되기 전 파우치를 형성한다. 플라스틱 메쉬 조각, 예를 들어, 폴리아마이드 메쉬는 접선을 따라 접힐 수 있으며, 2개의 밀봉선을 따라 밀봉되어, 예를 들어 가열 밀봉 또는 고주파수 용접을 사용하여 메쉬 파우치를 형성할 수 있다. 그 다음에 메쉬 파우치는 2개의 가요성 플라스틱 시트, 예를 들어 폴리비닐 클로라이드(PVC) 시트에 위치될 수 있고, 예를 들어 가열 밀봉 또는 무선주파수 용접을 사용하여 밀봉 림을 따라 밀봉될 수 있다.

도 9A 및 9b는 본 개시내용의 챔버(650)의 또 다른 실시형태를 나타내며, 여기서 메쉬는 폴딩되고, 2개의 가요성 플라스틱 시트 사이에 샌드위치 되며, 챔버 내로 밀봉된다. 여기서 챔버 및 메쉬는 주입구 포트를 통해 챔버로 유입되는 샘플이 메쉬를 통과하지 않고 배출구 포트(1)를 통해 배출될 수 있는 반면, 배출구 포트(2)를 통해 배출되는 샘플의 부분은 메쉬를 통과하도록 구성된다. 메쉬의 접선은 거의 수직이다. 다른 실시형태에서, 접선은 수직에 대한 각도일 수 있다.

도 5A 내지 도 9B에 도시된 메쉬 구성 중 어떤 하나 이상은 본 명세서에 개시된 샘플 처리 장치 중 어떤 것의 어떤 챔버에서, 샘플 처리 장치(500)의 챔버(2) 또는 챔버(4)의 하나 이상에서 및/또는 샘플 처리 장치(600)의 챔버(1), 챔버(2) 및/또는 챔버(3)의 하나 이상에서 이용될 수 있다.

도 10a 및 도 10b는 본 명세서에 개시된 샘플 처리 장치의 실시형태 중 어떤 것에 포함될 수 있는 적어도 하나의 튜빙 세그먼트를 포함하는 2개의 챔버 사이의 커넥터를 나타낸다. 플라스틱 시트는 컷아웃되며, 튜빙은 하나의 챔버로부터 다른 챔버로 컷아웃을 가로질러 브릿지된다. 예를 들어, 핀치 클램프 또는 슬라이드 클램프는 튜빙을 통해 유체 연결 및 연결 끊어짐을 전환하는데 사용될 수 있다. 튜빙 부문은 추가로 연부 스트레치 및 가요성 스트레치를 포함하여(도 10a 및 도 10b 내 튜빙(2)) 신뢰가능한 핀칭을 가능하게 할 수 있다. 이는 핀치 밸브가 사용될 때 유리할 수 있다. 핀치 밸브는 수동으로, 공기로 또는 솔레노이드에 의해 작동될 수 있다. 가요성 튜빙은 또한 필요할 때 연동 펌핑을 가능하게 할 수 있다.

본 명세서에 개시된 샘플 처리 장치의 실시형태는 도 11에 도시된 것과 같은 다른 부분(예를 들어, 세척 용액 백 내로 삽입될 수 있는 스파이크, 하나 이상의 핀치 클램프, Y 삽입 부위, 스파이크 포트, 및/또는 주사기에 연결을 위한 루어 커넥터)을 추가로 포함할 수 있으며/있거나 더 큰 시스템의 통합 부분으로서 다른 모듈에 연결될 수 있다. 격막, 주사 포트, 스파이크 포트, 밸브, 체크 밸브, 튜브, 어댑터, 루어, 암 루어락, 숫 루어락, 주사기, 스탑콕, 및/또는 다른 연결 기구가 다른 부분과 함께 본 개시내용의 실시형태의 내부 연결 부분에 사용될 수 있다.

본 개시내용의 다른 실시형태는 샘플 해리 챔버(챔버(1)), 폐기물 용기(챔버(2)) 및 세포 정제 챔버(챔버(3))를 포함하는 샘플 제조 장치이며, 도 12에서 (700)에서 일반적으로 도시된다. 챔버(1)는 선택적으로 제1 필터 메쉬를 포함하여 샘플 세척, 린스 및 사전조건화를 가능하게 할 수 있다. 메쉬는 약 20㎛ 내지 약 600㎛의 기공 크기를 갖는 기공을 포함한다. 지질 흡인물 샘플을 처리하기 위해, 메쉬는 바람직하게는 약 40㎛ 내지 약 200㎛, 예를 들어, 약 40㎛, 약 50㎛, 약 60㎛, 약 70㎛, 약 80㎛, 약 90㎛, 약 100㎛, 약 120㎛, 약 140㎛, 약 170㎛ 또는 약 200㎛의 기공 크기를 가질 수 있다. 스탑콕은 포트(5)에서 유체 연결을 제어하는데, 이는 샘플 해리 및 인큐베이션 동안 폐쇄될 수 있고, 샘플 세척 동안 포트(7)를 통해 챔버(2)에 연결될 수 있으며, 방출된 세포를 수집하기 위해 포트(6)를 통해 챔버(3)에 연결될 수 있다. 챔버(3)는 약 15㎛ 내지 약 150㎛의 기공 크기를 갖는 제2 필터 메쉬를 포함할 수 있다. 제2 메쉬는 해리된 샘플로부터 파편을 제거하며, 포트(8)에서 수집될 수 있는 방출된 세포를 정제한다. 장치는 추가로 샘플을 수용하기 위한 개구부, 예를 들어 스파이크 포트를 포함할 수 있는 포트(4), 린스 용액을 수용하기 위한 주입구, 예를 들어 스파이크를 포함할 수 있는 포트(1), 및 해리 용액을 수용하기 위한 적어도 하나의 주입구, 예를 들어 포트(2)를 포함할 수 있다.

본 개시내용의 또 다른 실시형태는 샘플 해리 챔버(챔버(1)), 폐기물 용기(챔버(2)) 및 세포 정제 챔버(챔버(3))를 형성하기 위한 2개의 가요성 시트 재료, 예를 들어 사전에 정해진 형태로 함께 결합된 플라스틱을 포함하는 샘플 제조 장치이며, 도 13에서 (800)에서 일반적으로 도시한다. 챔버(1)는 샘플 세척, 린스 및 사전 조건화를 가능하게 하기 위한 제1 메쉬(메쉬(1))를 포함할 수 있다. 챔버(3)는 제1 메쉬의 기공 크기보다 더 작은 기공 크기를 갖는 제2 메쉬(메쉬(2))를 포함할 수 있다. 스탑콕(1)은 챔버(1), 챔버(2)와 챔버(3) 간의 유체 연결을 제어한다. 챔버(1)은 주사기, 예를 들어 카테터 팁을 갖는 주사기로부터 샘플의 수용을 가능하게 할 수 있는 커넥터를 포함하는 주입구 포트(포트(1))를 포함한다. 챔버(1)은 스탑콕(2) 및 스탑콕(3)을 포함하는 스탑콕 매니폴드에 연결된 다른 포트(포트(2))를 추가로 포함한다. 린스 용액, 예를 들어, 젖산 링거 주사 용액은 스파이크를 통해 샘플 제조 장치에 연결될 수 있다. 주사기(1) 및 스탑콕(2)은 함께 정해진 양의 린스 용액이 챔버(1)에 첨가되게 하는 유동 제어 장치로서 작용할 수 있다. 해리 용액은 주사기(2)에 부하될 수 있고, 스탑콕(3)을 통해 샘플 제조 장치에 첨가될 수 있다. 해리 용액은 농축 형태로 주사기(2) 내로 부하될 수 있으며, 린스 용액을 사용하여 정상 작업 농도로 재구성될 수 있다. 챔버(3)은 배출구 포트를 포함하는데, 여기서 방출된 세포가 수집될 수 있다. 일 실시형태에서, 배출구 포트에서 압력을 증가시키는 것이 바람직할 수 있다. 챔버(3)는 기밀 방식에서 가압 챔버(챔버(4)) 내에 동봉될 수 있다. 챔버(4)는 가압 유체, 예를 들어 압축 공기가 챔버(3)의 가요성 시트를 통해 챔버(3) 내 유체를 간접적으로 압축하도록 적용될 수 있는 압력 포트를 포함한다. 챔버(3)의 실시형태는 도 13b에 도시되며, 챔버(4)를 포함하는 압력 챔버의 실시형태는 도 13c에 나타낸다. 챔버(3)는 사전에 정해진 위치에서 2개의 가요성 시트를 함께 결합함으로써 형성된다(도 13b). 절단(절단(1))은 다른 시트가 챔버(3)를 동봉하고 챔버(4)를 형성하도록 시트 내에서 만들어진다.

본 개시내용의 다른 실시형태는 하류의 처리 유닛(도 14에 도시된 DPU 1000)을 포함하는데, 이는 처리된 지방조직 및/또는 단리된 세포를 추가로 처리하고, 정제하며, 배양시키고, 확대하고/하거나 분석할 수 있다. 하류의 처리 유닛은, 예를 들어 다음의 기능 중 하나 이상의 가능하게 하도록 구성될 수 있다: 샘플 세척, 샘플 농도, 샘플 분리, 샘플 풍부화, 샘플 단리, 완충제 교환, 샘플 표지, 샘플 변경, 여과, 자기 표지, 자기 분리, 중합효소 연쇄반응(PCR), 항체 상호작용, 항체를 사용하는 친화도 포획, 세포의 영상화, 효소결합 면역흡수 분석법(ELISA), 단백질 제조, 단백질 정제, 단백질 풍부화, 질량 분석법, 고성능 액체 크로마토그래피, 유세포분석기, 세포 분류, 기능성 분석, 세포 배양, 세포 확장, 세포 분화, 면역형검사, 측방유동순도분석, 형광 인시추 혼성화, 데옥시리보핵산(DNA) 혼성화, 리보핵산(RNA) 혼성화, 데옥시리보핵산(DNA) 반응, 리보핵산(RNA) 반응 등.

하류의 처리 유닛은 적어도 하나의 미소유체 장치를 포함하는 미세유동 유닛을 포함할 수 있다. 미소유체 장치는 약 1㎜, 예를 들어, 약 0.95㎜, 약 800㎛, 약 600㎛, 약 500㎛, 약 400㎛, 약 300㎛, 약 200㎛, 약 150㎛, 약 100㎛, 약 80㎛, 약 60㎛, 약 50㎛, 약 40㎛, 약 30㎛, 약 20㎛, 및/또는 약 15㎛ 미만의 적어도 하나의 채널 치수를 포함할 수 있다. 미소유체 장치는 또한 적어도 하나의 실질적으로 일정한 깊이의 채널을 포함할 수 있다. 예를 들어, 미소유체 장치는 약 1㎜, 약 800㎛, 약 600㎛, 약 500㎛, 약 400㎛, 약 300㎛, 약 200㎛, 약 150㎛, 약 100㎛, 약 80㎛, 약 60㎛, 약 50㎛, 약 40㎛, 약 30㎛, 약 20㎛ 또는 약 15㎛의 깊이를 갖는 채널을 포함할 수 있다. 미소유체 장치의 채널 깊이는 공칭 채널 깊이의 20% 이내일 수 있다. 미소유체 장치는 실질적으로 하나의 표면 상에서 채널을 추가로 포함할 수 있는데, 이 평면은 실질적으로 평면이거나 또는 곡선일 수 있다. 미소유체 장치는 또한 하나 이상의 실질적으로 평면인 표면 상에 형성된 채널을 포함할 수 있다.

미소유체 장치는 미세가공, 나노가공 및/또는 반응성 이온 식각, 심도 반응성 이온 식각, 습식 식각, 임프린팅, 사출성형, 엠보싱, 소프트 엠보싱, 스테레오 리소그래피, 몰딩, 소프트 리소그래피, 양극 접합, 초음파 접합, 자기 조립 및/또는 당업계에 공지된 다른 제작 기법을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 미세기계가공 기법을 사용하여 형성될 수 있다.

본 개시내용의 미소유체 유닛의 실시형태는 모든 목적을 위해 본 명세서에 참조로서 포함되는 국제 특허 출원 PCT/US10/061866호, 국제 특허 공개 WO 2011/079217 A1호, 미국 특허 제7,150,812 B2호, 미국 특허 제7,735,652호, 미국 특허 제8,021,614호, 미국 특허 제8,186,913 B2호, 미국 특허 출원 공개 제2012/0063664 A1호, 미국 특허 출원 공개 제2011/0294187 A1호에 개시된 장치, 딘(Dean) 유동을 사용하는 장치, 관성력, 원심력, 결정적 횡방향 변위, 기둥의 배열, 포스트의 배열, 핀치 유동, 자기 구조, 항체 성분, 세포 포획 모이어티, 단백질 포획 모이어티, 데옥시핵산(DNA) 모이어티, 리보핵산(RNA) 모이어티, 여과, 접선 유동 여과, 초음파 집속, 핀치 유동 등을 사용하는 장치를 포함할 수 있다.

본 개시내용의 일부 실시형태, 특히 국제 특허 공개 WO 2011/079217 A1에 개시된 미소유체 장치를 포함하는 것은 현재 설계된 지방조직의 접선 유동 여과를 위한 미소유체 장치의 사용을 금지하는 심각한 문제가 있을 때까지 심각한 클로깅 및 파울링에 저항성인 장치를 제공한다.

본 개시내용의 다른 실시형태는 단리된 세포를 농축하고/하거나 세척하는 중공섬유 유닛을 포함한다.

미소유체 장치를 포함하는 하류의 처리 유닛의 다른 실시형태에서, 미소유체 장치는 세포를 세척하고 원치 않는 시약을 제거한다. 하류의 처리 유닛은 세포를 세척하기 위한 완충제 용액을 도입하는 완충제 용액 주입구를 포함할 수 있다. 세포 세척은 또한 투석을 수행하도록 설계된 미소유체 장치를 사용하여 달성될 수 있다.

또 본 개시내용의 다른 실시형태에서, 하류의 처리 유닛은 약 10배만큼 하류의 처리 유닛의 생산물 내 효소 농도를 감소시키는 미소유체 장치를 포함하며, 예를 들어, 효소 농도는 약 10, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 약 70, 약 100, 약 150, 약 200, 약 400, 약 500, 약 750, 약 1,000, 약 2,000, 약 5,000, 약 10,000, 약 20,000, 약 50,000, 약 100,000, 약 200,000, 약 500,000 또는 약 1,000,000배만큼 감소된다. 이러한 제거를 달성할 수 있는 미소유체 장치의 일 실시형태는 국제 특허 공개 WO 2011/079217 A1에 개시되어 있으며, 여기서 미소유체 장치는 기둥을 포함하고, 적어도 하나의 완충제 스트림, 예를 들어 세포를 세척하기 위한 린스 용액의 스트림을 사용한다.

또 본 개시내용의 다른 실시형태에서, 하류의 처리 유닛은 샘플 해리 동안 도입된 효소의 89% 초과를 제거하는, 예를 들어, 샘플 해리 동안 도입된 효소의 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.5%, 약 99.8%, 약 99.9%, 약 99.95%, 약 99.98%, 약 99.99%, 약 99.995%, 약 99.998%, 약 99.999%, 약 99.9995% 또는 약 99.9999%가 제거되는 미소유체 장치를 포함한다.

또 본 개시내용의 다른 실시형태에서, 하류의 처리 유닛은 샘플 해리 동안 도입된 효소의 약 100%를 제거하는 미소유체 장치를 포함한다.

또 본 개시내용의 다른 실시형태에서, 하류의 처리 유닛은 약 0.1 ㎎/㎖, 예를 들어, 약 0.09 ㎎/㎖, 약 0.05 ㎎/㎖, 약 0.03 ㎎/㎖, 약 0.02 ㎎/㎖, 약 0.01 ㎎/㎖, 약 0.007 ㎎/㎖, 약 0.005 ㎎/㎖, 약 0.003 ㎎/㎖, 약 0.002 ㎎/㎖, 약 0.001 ㎎/㎖, 약 0.0005 ㎎/㎖, 약 0.0002 ㎎/㎖, 약 0.0001 ㎎/㎖, 약 0.00005 ㎎/㎖, 약 0.00002 ㎎/㎖, 약 0.00001 ㎎/㎖, 약 0.000001 ㎎/㎖ 또는 약 0.0000001 ㎎/㎖ 미만의 콜라게나제 농도를 갖는 생산물을 제공하는 미소유체 장치를 포함한다.

또 본 개시내용의 다른 실시형태에서, 하류의 처리 유닛은 샘플 해리 동안 도입된 효소가 실질적으로 없는 산출량을 제공하는 미소유체 장치를 포함한다. 또 본 개시내용의 다른 실시형태에서, 하류의 처리 유닛이 샘플 해리 동안 도입된 효소가 없는 산출량을 제공하는 미소유체 장치를 포함한다.

또 본 개시내용의 다른 실시형태에서, 하류의 처리 유닛은 샘플 해리 동안 도입된 콜라게나제가 실질적으로 없는 산출량을 제공하는 미소유체 장치를 포함한다. 또 본 개시내용의 다른 실시형태에서, 하류의 처리 유닛은 샘플 해리 동안 도입된 콜라게나제가 없는 산출량을 제공하는 미소유체 장치를 포함한다.

본 명세서에 개시된 샘플 처리 장치 중 어떤 하나 이상에서 사용될 수 있는 미소유체 장치의 예는 도 15a, 15b, 15c, 15d 및 15e에서 개략적으로 도시되고 각각 (910), (920), (930), (940) 및 (950)에서 일반적으로 표시된다.

도 15a는 세포 주입구, 완충제 주입구, 세포 배출구 및 완충제 배출구를 지니는 미소유체 채널(910)을 나타낸다. 세포 샘플 및 완충제가 실질적인 대류 혼합 없이 서로 나란히 유동되는 2개의 층류 유동 스트림을 형성하도록 미소유체 채널은 너무 작은 폭 및/또는 깊이, 예를 들어 약 100㎛를 가진다. 유동 속도는 세포 유동 스트림으로부터 완충제 유동 스트림을 확산시키기에 충분한 시간에 원치 않는 입자, 예를 들어 효소를 제공하도록 구성된다. 세포는 원치 않는 입자보다 훨씬 더 크기 때문에, 그것의 확산은 너무 적고, 그것들은 세포 유동 스트림 내에 남아있는다. 세포 스트림 및 완충제 스트림은 상이한 배출구를 통해 미소유체 채널을 나감으로써, 원치 않는 입자를 실질적으로 제거한다.

도 15b는 세포 주입구, 2개의 완충제 주입구, 세포 배출구 및 2개의 완충제 배출구를 지니는 다른 미소유체 채널(920)을 나타낸다. 채널 및 유동 속도는 원치 않는 입자가 세포 스트림으로부터 완충제 스트림까지 확산됨으로써, 원치 않는 입자를 실질적으로 제거하도록 구성된다. 이 구성은 높은 제거 효율을 가질 수 있는데, 원치 않는 입자가 2개의 완충제 스트림에 의해 제거될 수 있기 때문이다.

포스트 또는 기둥은, 예를 들어 도 15c에서 예시한 미소유체 채널(930)에 도시한 바와 같이 미소유체 채널 내에 위치되어 세포 및 완충제 스트림을 안정화시키고, 분자 확산을 촉진하며/하거나 미소유체 채널을 지지한다.

투석을 위해 이용되는 미소유체 장치는 일련의 캐스케이드를 형성하도록 구성될 수 있다. 예는 도 15d에 나타내며, 여기서 원치 않는 입자를 운반하는 완충제 용액은 완충제 배출구(1)로부터 제거되고, 신선한 완충제 용액은 완충제 주입구(2)를 통해 도입되어 잔여 원치 않는 입자를 실질적으로 제거하도록 도입될 수 있다.

도 15e는 채널 및 채널 내 포스트의 어레이를 포함하는 미소유체 장치(950)의 다른 실시형태를 나타낸다. 채널에 도입된 유체의 유동 속도 및 채널 크기는 유체 스트림이 층류가 되도록 설계된다. 전형적으로 미소유체 장치 내 유체의 레이놀드 수가 약 1 미만일 때 층류 유동 및 층류 스트림이 일어난다. 포스트의 어레이는 완충제 스트림 내 입자의 효과적인 확산 계수를 증가시키고, 원치 않는 입자, 예를 들어 세포 스트림으로부터의 효소 제거의 효율성을 개선시킨다.

일 실시형태에서, 미소유체 장치 내 완충제 스트림을 형성하기 위해 사용된 완충제는 린스 용액이다.

또 다른 실시형태에서, 하류의 처리 유닛은 투석막을 포함한다.

도 16에서 개략적으로 나타낸 하류의 처리 유닛(1000)의 또 다른 실시형태는 단리된 세포를 농축시키는 적어도 하나의 미소유체 장치 및 미소유체 장치의 배출구로서 단리된 세포를 수용하도록 구성된 적어도 하나의 수집 저장소, 예를 들어 수집 백을 포함하는 미소유체 장치 유닛을 포함한다. 하류의 처리 유닛은 상기 수집 저장소에 연결된 주사기를 추가로 포함할 수 있다. 생산물은 샘플이 미소유체 장치를 사용하여 처리된 후 수집 저장소로부터 주사기 내로 인출될 수 있다. 하류의 처리 유닛은 폐기물 저장소, 예를 들어 폐기물 백을 추가로 포함할 수 있다.

본 개시내용의 다른 실시형태에서, 하류의 처리 유닛은 큰 용적의 생산물 샘플을 처리하기 위해 원하는 용량, 처리량 및 기능을 달성하는 다수의 미소유체 장치를 포함한다.

유체 전달은 중력, 외부 압력, 진공, 정압, 부압, 헤드 높이, 펌프, 예를 들어, 연동 펌프, 백을 짜내도록 구성된 기구, 백을 짜내는 롤러, 백을 짜내는 플레이트 및/또는 당업계에 공지된 다른 유체 전달 기구를 사용하여 달성될 수 있다. 일 실시형태에서, 유체는 주사기를 사용하여 전달될 수 있다. 다른 실시형태에서, 유체는 도 13에 나타낸 바와 같이 챔버, 예를 들어 세포를 함유하는 백(챔버(3))을 동봉하는 챔버(4)에 적용된 외부 공기압을 사용하여 전달될 수 있다.

본 개시내용의 다른 실시형태에서, 하류의 처리 유닛은 세포를 배양하기 위한 세포 배양 챔버를 포함한다. 세포 배양 챔버는 세포 배양 챔버가 탈착되게 하는 커넥터를 사용하여 연결될 수 있다. 세포 배양 챔버는 세포 성장을 위한 온도 및 조건이 최적화될 수 있는, 예를 들어 약 37℃의 온도 및 약 5% 이산화탄소 농도에서 인큐베이터에 위치될 수 있다. 세포 배양 챔버는 공기에 대해 투과성인 재료, 예를 들어 세포 배양 동안 기체를 교환시키는 필터막 또는 실리콘 고무막을 추가로 포함할 수 있다.

본 명세서에 개시된 바와 같은 샘플 처리 장치의 하나 이상의 챔버는 메쉬, 다층의 메쉬, 및 또는 메쉬의 캐스케이드를 포함할 수 있다(도 5B). 일 실시형태에서, 지방조직 처리를 위해 사용된 메쉬의 기공 크기(예를 들어, 기공 개구부의 중앙값 또는 평균 크기)는 약 1㎛ 내지 약 10㎜, 예를 들어, 약 1㎛, 약 3㎛, 약 6㎛, 약 10㎛, 약 15㎛, 약 25㎛, 약 40㎛, 약 70㎛, 약 100㎛, 약 140㎛, 약 300㎛, 약 700㎛, 약 1㎜, 약 2㎜ 또는 약 3㎜일 수 있다. 지질 흡인물 조직으로부터 비지방 세포를 단리시키기 위해, 메쉬 기공 크기는 약 10㎛ 내지 약 2㎜일 수 있다. 일 실시형태에서, 약 40㎛, 약 70㎛, 약 100㎛, 약 140㎛, 약 250㎛, 및/또는 약 700㎛ 기공 크기 메취, 예를 들어, 폴리아마이드(나일론) 메쉬가 사용될 수 있다.

본 개시내용의 샘플 처리 장치의 다른 실시형태는 2개의 메쉬, 제1 메쉬의 하류에 유체 연결된 제2 메쉬를 포함하는 하나 이상의 챔버를 포함하며, 제2 메쉬의 기공은 제1 메쉬의 기공보다 실질적으로 더 작다.

본 개시내용의 샘플 처리 장치의 또 다른 실시형태는 2개의 막 필터를 포함하는 하나 이상의 챔버를 포함한다. 제2 막 필터는 제1 막 필터의 하류에 유체 연결될 수 있다. 제2 막 필터의 기공은 제1 막 필터의 기공보다 실질적으로 더 작을 수 있다.

본 발명의 개시내용의 샘플 처리 장치의 또 다른 실시형태는 트랙 식각된 막 필터를 포함하는 하나 이상의 챔버를 포함한다.

본 명세서에 개시된 바와 같은 샘플 처리 장치 또는 이의 하위부품의 실시형태는 열가소성 플라스틱, 아크릴로나이트릴 뷰타다이엔 스타이렌(ABS), 아크릴(PMMA), 셀룰로이드, 셀룰로스 아세테이트, 사이클릭 올레핀 공중합체(COC), 사이클릭 올레핀 공중합체(COP), 에틸렌-비닐 아세테이트(EVA), 에틸렌 비닐 알코올(EVOH), 플루오로플라스틱(PTFE와 함께 FEP, PFA, CTFE, ECTFE, ETFE), 이노머, 액정 중합체(LCP), 폴리옥시메틸렌(POM 또는 아세탈), 폴리아크릴레이트(아크릴), 폴리아크릴로나이트릴(PAN 또는 아크릴로나이트릴), 폴리아마이드(PA 또는 나일론), 폴리아마이드-이미드(PAI), 폴리아릴에터케톤(PAEK 또는 케톤), 폴리뷰타다이엔(PBD), 폴리뷰티렌(PB), 폴리뷰틸렌 테레프탈레이트(PBT), 폴리카프롤락톤(PCL), 폴리클로로트라이플루오로에틸렌(PCTFE), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리사이클로헥실렌 다이메틸렌 테레프탈레이트(PCT), 폴리카보네이트(PC), 폴리하이드록시알카노에이트(PHAs), 폴리케톤, 폴리에스터, 폴리에틸렌(PE), 폴리에터에터케톤(PEEK), 폴리에터케톤케톤(PEKK), 폴리에터이미드(PEI), 폴리에터설폰(PES), 염소화된 폴리에틸렌(CPE), 폴리이미드(PI), 폴리락트산(PLA), 폴리메틸펜텐(PMP), 폴리페닐렌 옥사이드(PPO), 폴리페닐렌 설파이드(PPS), 폴리프탈아마이드(PPA), 폴리프로필렌(PP), 폴리스타이렌(PS), 폴리설폰(PSU), 폴리트라이메틸렌 테레프탈레이트(PTT), 폴리우레탄(PU), 폴리비닐 아세테이트(PVA), 폴리비닐 클로라이드(PVC), 폴리비닐리덴 클로라이드(PVDC), 스타이렌-아크릴로나이트릴(SAN), 및/또는 아크릴로나이트릴 뷰타다이엔 스타이렌(ABS)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 재료를 사용하여 구성될 수 있다. 의학적 적용을 위해, 가요성 플라스틱 시트, 예컨대 폴리비닐 클로라이드(PVC), 폴리우레탄(PU), 에틸렌 비닐 아세테이트(EVA), 폴리아마이드(PA 또는 나일론)는 시트 재료로서 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 일 실시형태에서 샘플 처리 장치는 그 사이의 하나 이상의 챔버와 함께 결합되고 정해지는 2개의 가요성 시트를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 샘플 처리 장치는 강성 또는 반강성 재료(예를 들어, 플라스틱 및/또는 상기 개시된 재료 중 어떤 하나 이상의 두꺼운 시트)에 결합되고, 가요성 시트와 강성 또는 반강성 재료 사이의 하나 이상의 챔버를 정하는 가요성 시트를 포함할 수 있다.

시트 재료의 두께는, 일부 실시형태에서 약 0.1㎜ 내지 약 0.8㎜, 예를 들어, 약 0.1㎜, 약 0.15㎜, 약 0.2㎜, 약 0.25㎜, 약 0.3㎜, 약 0.35㎜, 약 0.4㎜, 약 0.5㎜, 약 0.6㎜, 약 0.7㎜ 또는 약 0.8㎜일 수 있다. 시트 재료의 두께는, 일부 실시형태에서 약 0.2㎜ 내지 약 0.4㎜, 예를 들어, 약 0.2㎜, 약 0.25㎜, 약 0.3㎜, 약 0.35㎜ 또는 약 0.4㎜일 수 있다.

막 필터 및/또는 메쉬에 대한 재료는 셀룰로스 아세테이트(CA), 유리 마이크로섬유(GMF), 폴리에터설폰(PES), 폴리프로필렌(PP), 재생된 셀룰로스(RC), 폴리아마이드(PA 또는 나일론), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 및/또는 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

메쉬 재료의 두께는, 일부 실시형태에서 약 10㎛ 내지 약 1,000㎛, 예를 들어, 약 10㎛, 약 15㎛, 약 20㎛, 약 25㎛, 약 30㎛, 약 40㎛, 약 50㎛, 약 60㎛, 약 70㎛, 약 80㎛, 약 90㎛, 약 100㎛, 약 120㎛, 약 150㎛, 약 175㎛, 약 200㎛, 약 250㎛, 약 300㎛, 약 400㎛, 약 500㎛, 약 600㎛, 약 700㎛, 약 800㎛, 약 900㎛ 또는 약 1㎜일 수 있다. 메쉬 재료의 두께는, 다른 실시형태에서 약 50㎛ 내지 약 300㎛, 예를 들어, 약 50㎛, 약 60㎛, 약 70㎛, 약 80㎛, 약 90㎛, 약 100㎛, 약 110㎛, 약 125㎛, 약 140㎛, 약 160㎛, 약 180㎛, 약 200㎛, 약 220㎛, 약 250㎛, 약 275㎛ 또는 약 300㎛일 수 있다.

본 개시내용의 실시형태는 플라스틱 용접, 가열 밀봉, 사출성형, 엠보싱, 접착 결합, 자외광(UV) 경화 접착 결합, 용매 결합, 열풍 용접, 프리핸드 용접, 끝속도(speed tip) 용접, 압출 용접, 접촉 용접, 열 플레이트 용접, 고주파수 용접, 무선주파수 용접, 사출 용접, 초음파 용접, 마찰 용접, 스핀 용접, 레이저 용접 및/또는 용매 용접을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 표준 플라스틱 제작 기법을 사용하여 구성될 수 있다.

본 개시내용의 실시형태는, 예를 들어, 도 2a 내지 도 2g 중 어떤 것에 개략적으로 나타낸 샘플 처리 장치는 열가소성 시트의 고주파수 용접을 사용하여 구성될 수 있다. 용접 다이는 금속, 예를 들어 알루미늄, 놋쇠 또는 스테인레스 스틸로 만들어질 수 있다. 접힐 수 있는 메쉬 조각 및 튜빙 조각은 용접 다이 상에서 2개의 열 가소성 시트 사이에 놓인다. 그 다음에 열가소성 시트는 다른 용접 다이를 사용하여 샌드위치된다. 챔버는 압력, 온도 및 무선주파수 전력이 용접 다이에 적용될 때 형성된다. 폴리아마이드 메쉬를 지니는 폴리비닐 클로라이드(PVC) 시트를 밀봉하기 위해, 약 25℃ 내지 약 120℃, 예를 들어, 약 25℃, 약 50℃, 약 60℃, 약 70℃, 약 80℃, 약 90℃, 약 100℃, 약 110℃ 또는 약 120℃의 온도, 약 10 psi 내지 약 600 psi, 예를 들어, 약 10 psi, 약 20 psi, 약 30 psi, 약 40 psi, 약 50 psi, 약 60 psi, 약 80 psi, 약 100 psi, 약 150 psi, 약 200 psi, 약 300 psi, 약 400 psi, 약 500 psi 또는 약 600 psi의 압력, 및 약 300 W 내지 10 kW, 예를 들어, 약 300 W, 약 500 W, 약 600 W, 약 700 W, 약 800 W, 약 900 W, 약 1 kW, 약 1.2 kW, 약 1.5 kW, 약 2 kW, 약 2.5 kW, 약 3 kW, 약 4 kW, 약 5 kW, 약 6 kW, 약 7 kW, 약 8 kW, 약 9 kW 또는 약 10 kW의 무선 주파수 전력이 적용될 수 있다. 무선주파수 전력은 약 0.5 초 내지 약 1분, 예를 들어, 약 0.5 초, 약 1 초, 약 2 초, 약 3 초, 약 4 초, 약 5 초, 약 6 초, 약 7 초, 약 8 초, 약 10 초, 약 12 초, 약 15 초, 약 20 초, 약 30 초, 약 40 초, 약 50 초 내지 약 60 초의 지속기간 동안 적용될 수 있다. 무선주파수 전력은 동일 또는 상이한 강도에서 수회 적용되어 신뢰할 수 있는 밀봉을 형성할 수 있다. 의학적 적용을 위해, 장치는 제어된 깨끗한 환경에서 제조될 수 있고, 감마선 조사, 에틸렌 옥사이드(EO) 멸균화 및 자외광(UV) 조사를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 표준 멸균화를 사용하여 멸균될 수 있다.

본 개시내용의 일 실시형태에서, 샘플 제조 장치는 멸균된다. 본 개시내용의 일 실시형태에서, 샘플 제조 장치는 일회용이다. 추가로 본 개시내용의 일부 실시형태에서, 샘플 제조 장치는 격리된 환경을 제공하는 실질적인 보호 장벽이며, 여기서 샘플은 외부 환경 및/또는 작업 인원과 직접 물리적 접촉 또는, 예를 들어 여과되지 않은 공기 유동을 통한 유체 접촉으로부터 보호되어 오염 및 감염 위험을 최소화하거나 또는 회피한다.

본 개시내용의 실시형태는 지방조직 샘플과 주위 환경 간의 임의의 직접 물리적 접촉, 유체 연결 및/또는 공기 유동 연결을 실질적으로 감소시키거나 또는 제거하는 보호 장벽으로서 작용할 수 있다. 샘플과 직접 물리적 접촉, 유체 연결 및/또는 여과되지 않은 공기 유동일 수 있는 본 명세서에 개시된 장치의 실시형태의 임의의 부분은 멸균 및/또는 일회용일 수 있다. 본 개시내용의 장치의 실시형태는 오염 위험으로부터 샘플을 그리고 감염 위험으로부터 작업자를 실질적으로 보호할 수 있다.

본 개시내용은 사용이 매우 용이한 지방조직 처리 장치의 설계를 가능하게 하는 것으로 인식된다. 또한 본 개시내용은 제작 공정을 극적으로 단순화시킬 수 있고 이러한 지방조직 처리 장치의 제작 비용을 감소시킬 수 있는 것으로 인식된다. 본 개시내용의 실시형태는 주위 연구실 또는 병원 환경으로부터 샘플을 실질적으로 격리시키는 장치를 사용하여 지방조직 샘플이 실질적으로 오염 및 감염 위험 없이 안전하게 처리될 수 있게 하는 것으로 추가로 인식된다.

실시예

실시예 1. 인간 지질 흡인물 조직으로부터 비지방 세포의 단리.

인간 지질 흡인물을 도 1에 도시한 작용 및 도 3a 및 11에 도시한 장치를 포함하는 방법을 사용하여 처리하였다. 장치는 약 25㎝ 폭 및 약 40㎝ 길이이다. 가요성 플라스틱 시트는 폴리비닐 클로라이드(PVC)로 만들어지며, 메쉬는 폴리아마이드(나일론)으로 만들어진다. 메쉬(1, 2 및 3)는 각각 약 140㎛, 약 70㎛, 내지 약 35㎛의 공칭 기공 크기를 가진다. 동의한 공여자로부터 튜메슨트 지방흡입술을 사용하여 약 40㎖의 인간 지질 흡인물을 수집하였고, 수집으로부터 24시간 이내에 처리하였다. 샘플을 싣고 처리 전 4℃에서 저장하였다.

처음에, 클램프(1 및 2)를 커넥터(1 및 2)를 폐쇄하는데 적용하였다(도 3f). 약 100㎖의 지질 흡인물을 스파이크 포트를 통해 장치에 첨가하였다(도 11). 중력 하에서 혈액 및 튜메슨트 용액을 포함하는 과량의 유체를 챔버(3)에 배수시키기 위해 클램프(2)를 개방하였다. 과량의 유체가 실질적으로 제거된 후, 클램프(2)를 폐쇄하였고, 약 50㎖의 젖산 링거 용액이 측정 챔버(챔버(1))에 유입되도록 핀치 클램프(1)를 개방하였다. 핀치 클램프(1)를 폐쇄하였고, 핀치 클램프(2)를 개방하였다. 챔버(1)를 2개의 편평한 플레이트를 사용하여 짜내어 젖산 링거 용액을 챔버(2)에 옮겼다. 이 측정 및 전달 공정은 약 100㎖의 젖산 링거 용액이 챔버(2)에 첨가될 때까지 반복하였다. 젖산 링거 용액 및 지질 흡인물 샘플을 챔버(2)를 부드럽게 문지르는 것을 사용하여 혼합하여 샘플을 세척하였다. 폐기물 유체가 배수되도록 클램프(2)를 개방하였다. 여기서 이 세척 작용을 3회 수행하였다.

클램프(1 및 2)를 폐쇄하고, 해리 용액을 Y 삽입 부위로부터 챔버(1) 내로 첨가하여 조직 해리 작용을 시작하였다(도 11). 해리 용액은 200㎎의 콜라게나제 및 50㎎의 DNase I을 포함하였고, 20㎖의 젖산 링거 용액 중에서 용해시켰다. 더 많은 젖산 링거 용액을 챔버(1)에 도입하여 해리 용액을 희석시켰다. 그 다음에 해리 용액을 챔버(2)에 옮겼다. 젖산 링거 용액을 다시 챔버(1)에 도입하여 챔버(1)를 세척하였고, 잔여 해리 용액을 챔버(2)에 옮겼다. 약 100㎖의 젖산 링거 용액을 조직 해리 작용 동안 챔버(2)에 첨가하였다. 장치를 37℃ 인큐베이터에 놓았고, 자주 문질러서 조직 샘플과 해리 용액을 효과적으로 혼합시켰다. 조직 해리 작용은 약 45분 내지 60분이 걸렸다.

해리 후, 방출된 세포가 파편 제거 챔버에 유입되도록 클램프(1)를 개방하였다(도 3a의 챔버(4)). 샘플이 메쉬(3)를 통과하도록 클램프(2)를 후속적으로 개방하였다. 조직 파편 및 지방세포를 이 작용 동안 실질적으로 제거하였다.

그 다음에 챔버(4)로부터 나온 용액을 미소유체 장치(1100)에 중력 하에 공급하였고, 이는 도 17에서 도시하며, 본 명세서에서 모든 목적을 위하여 참조로서 포함되는 국제특허출원 PCT/US10/061866에 개시된다. 미소유체 장치는 기판의 편평한 표면 상에 배열된 약 110개의 모듈을 포함하였다. 각 모듈은 4개의 행으로 구성된 약 900개의 기둥을 포함하였다. 미소유체 채널의 깊이는 약 30㎛였다.

미소유체 장치의 생산물을 도 18A 및 도 18B에 나타낸다. 농축한 비지방 세포를 유핵세포 산물 분획에서 실질적으로 수집하였다(도 18A). 유핵 세포 산물 분획의 용적은 유입에 비애 약 8배만큼 감소되었다. 그 다음에 세포를 아크리딘 오렌지(2㎎/ℓ)로 염색하였고, 형광 현미경을 사용하여 영상화하였다. 영상은 지방세포가 미소유체 장치의 생성 생산물에서 실질적으로 없다는 것과, 비지방 유핵 세포가 유핵 세포 분획에서 실질적으로 수집되었다는 것을 나타낸다. 영상은 또한 세포가 양호한 형태이며, 생성 생산물은 파괴된 세포가 실질적으로 없다는 것을 나타낸다.

개시된 방법 및 장치를 사용하여 단리된 세포는 추가로 전체 유핵 세포수 및 ADAM MC 자동화 포유류 세포 계측기를 사용하여 부착된 생존가능한 유핵 세포수를 특성규명하였다. 챔버(4)의 생산물은 처리된 지질 흡인물의 ㎖ 당 약 6.0 x 10⁵개의 전체 유핵 세포를 가진다. 10% 소태아 혈청(FBS)으로 보충한 알파-MEM을 부착된 생존가능한 유핵 세포수에 대한 배양 배지로서 사용하였다. 챔버(4)의 생산물을 샘플링하였고, 세포 배양 챔버, 예를 들어 세포 배양 접시 또는 세포 배양 플라스크 내 배양 배지에서 37℃에서 3일 동안 배양시켰다. 3일 후, 배양 배지를 버렸고, 세포 배양 챔버를 둘베코 인산염 완충 식염수 용액을 사용하여 세척하였다. 그 다음에 양 챔버에 부착된 세포를 3분 동안 트립신을 사용하여 챔버 표면으로부터 방출시켰다. 부착된 생존가능한 유핵 세포수는 처리된 지질 흡인물의 ㎖ 당 약 1.5 x 10⁵개였다.

실시예 2. 샘플 처리 백 장치를 사용하는 인간 지질 흡인물 조직으로부터 비지방 세포의 단리 방법.

도 13에 도시된 바와 같은 샘플 처리 백 장치를 사용하여 인간 지질 흡인물을 처리하였다. 장치는 샘플 해리 챔버(챔버(1)), 폐기물 챔버(챔버(2)) 및 세포 정제 챔버(챔버(3))를 포함한다. 장치는 약 24㎝ 폭, 약 36㎝ 길이이며, 각각 0.3㎜ 두께의 2개의 폴리비닐 클로라이드(PVC) 시트로 만들어진다. 샘플 해리 챔버 및 세포 정제 챔버는 제1 나일론 메쉬(메쉬(1)) 및 제2 나일론 메쉬(메쉬(2))를 포함한다. 제1 메쉬의 기공 크기는 약 125㎛이며, 제2 메쉬의 기공 크기는 약 25㎛이다. 제1 메쉬의 기공 크기는 대안적으로 약 70㎛ 내지 약 160㎛, 예를 들어, 약 70㎛, 약 80㎛, 약 90㎛, 약 100㎛, 약 110㎛, 약 120㎛, 약 130㎛, 약 140㎛, 약 150㎛ 또는 약 160㎛일 수 있다. 제2 메쉬의 기공 크기는 대안적으로 약 20㎛ 내지 약 50㎛, 예를 들어, 약 20㎛, 약 22㎛, 약 25㎛, 약 30㎛, 약 35㎛, 약 40㎛ 또는 약 50㎛일 수 있다.

인간 지질 흡인물은 동의한 공여자로부터 튜메슨트 지방흡입술을 사용하여 수집하였고, 수집으로부터 6시간 내에 처리하였다. 샘플을 싣고 처리 전 4℃에서 저장하였다.

처음에, 스탑콕(1)을 챔버(1)과 챔버(2)를 연결하는 위치에 설치하였다. 100㎎의 콜라게나제, 100㎎의 하이알루로니다제, 및 20,000U의 데옥시리보뉴클레아제를 포함하는 해리 용액을 주사기(2)에 부하하였다. 샘플 처리 백 장치를 스파이크를 사용하여 젖산 링거 주사 용액을 포함하는 린스 용액의 백에 연결하였다.

약 75㎖의 지질 흡인물 샘플을 카테터 팁을 지니는 주사기를 사용하여 포트(1)로부터 챔버(1)에 주사하였다.

지질 흡인물 샘플을 세정하기 위해 세척 작용을 적용하였다. 세척 주기를 시직하기 위해, 스탑콕(1)을 챔버(2 및 3)로부터 유동적으로 연결이 끊긴 챔버(1)에 가까운 위치에 설치하였다. 약 100㎖의 링거 주사 용액을 주사기(1) 및 유동 제어 장치로서 스탑콕(2)을 사용하여 챔버(1)에 주사하였으며, 다음의 작용 순서를 사용하여 작동시켰다: (a) 린스 용액을 주사기(1)에 연결하기 위한 스탑콕(2)을 전환; (b) 주사기(1) 내로 린스 용액을 인출; (c) 챔버(1)에 주사기(1)를 연결하기 위한 스탑콕(2)을 전환; (d) 주사기(1)로부터 챔버(1) 내로 린스 용액을 주입. 원하는 용적의 용액을 해리 챔버에 첨가할 때까지 상기 순서를 반복할 수 있다.

그 다음에 샘플과 린스 용액을 혼합하기 위해 챔버(1)를 문질렀고, 과량의 유체, 즉, 폐기물 용액을 챔버(2) 내로 배수시키기 위해 스탑콕(1)을 전환시켰다. 배수 후, 제1 세척 주기를 완료시켰다. 세척 주기를 2회 반복하였다.

세척 작용은 하나 또는 다수의 세척 주기, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5 주기를 포함할 수 있다.

세척 후, 해리 용액을 챔버(1)에 첨가하였다. 약 100㎖의 린스 용액을 챔버(1)에 첨가하였다. 그 다음에 샘플 처리 백 장치를 약 60분의 인큐베이션 시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 해리 용액과 샘플을 혼합하기 위해 챔버(1)를 이 시간 동안 문질렀다. 일 실시형태에서, 다른 인큐베이션 시간, 예를 들어, 약 15분, 약 20분, 약 30분, 약 40분, 약 50분, 약 75분, 약 90분 또는 약 120분을 사용할 수 있다.

인큐베이션 후, 샘플로부터 방출된 개개의 세포를 챔버(3) 내로 스탑콕(1)을 통과시킨 한편, 거대 조직 파편을 메쉬(1)에 의해 포획하였고, 챔버(1)에 남겨두었다. 챔버(3) 내 메쉬(2)는 추가로 해리된 샘플로부터 거대 지방세포 및 파편을 제거하였다. 그 다음에 주피세포, 지방질 유래 줄기 세포 및 전구세포를 포함하는 비지방 세포를 챔버(3)의 배출구 포트에서 수집하였다.

방출된 세포 및 제거된 잔여 적혈구 및 파편을 농축하기 위해, 그 다음에 샘플 처리 백 장치의 챔버(3)의 배출구 포트에서 수집한 방출된 세포를 국제 특허 공개 WO 2011/079217 A1호에 개시된 바와 같은 제1 미소유체 장치에 통과시켰다. 미소유체 장치는 기판의 표면 상에 배열된 73개의 모듈을 포함하였다. 각각의 모듈은 4개의 행으로 구성된 약 1,300개의 기둥을 포함하였다. 미소유체 장치는 실질적으로 동일한 깊이, 약 35㎛ 내지 약 50㎛의 채널을 포함하였다. 다른 실시형태에서, 미소유체 장치는 약 30㎛ 내지 약 80㎛, 예를 들어, 약 30㎛, 약 35㎛, 약 40㎛, 약 45㎛, 약 50㎛, 약 60㎛, 약 70㎛ 또는 약 80㎛의 깊이를 갖는 채널을 포함할 수 있다. 미소유체 장치의 생산물에서 세포를 약 3배만큼 농축시켰다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 미소유체 장치는 약 2.5배 초과만큼, 예를 들어 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 8, 약 10, 약 12, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 80, 약 100 또는 약 125배만큼 세포를 농축하기 위해 사용될 수 있다.

효소를 제거하기 위해, 세포는 국제 특허 공개 WO 2011/079217 A1에 개시된 제2 미소유체 장치를 통과시켰다. 제2 미소유체 장치는 기판 표면 상에 배열된 83개의 모듈을 포함하였다. 각각의 모듈은 4개의 행으로 구성된 약 900개의 기둥을 포함하였다. 린스 용액의 스트림을 각 모듈에 도입하였고, 세포를 린스 용액 스트림 내로 옮겼으며, 효소로부터 분리시켰다.

제2 미소유체 장치 후 콜라게나제의 잔여 양을 측정하기 위해 효소결합 면역흡수 분석법(ELISA)을 적용하였다. 결과는 콜라게나제 농도가 1000배만큼 감소되었으며, 정제된 세포가 0.001 ㎎/㎖ 미만의 콜라게나제를 함유한다는 것을 나타낸다.

따라서 적어도 하나의 실시형태의 몇몇 양태를 기재하면, 다양한 변경, 변형, 조합 및 개선이 당업자에게 용이하게 일어난다는 것이 인식된다. 이러한 변경, 변화, 조합 및 개선은 본 개시내용의 부분인 것으로 의도되며, 본 개시내용의 정신과 범주 내인 것으로 의도된다. 따라서, 앞서 언급한 기재 및 도면은 단지 예에 의한다.

Claims (26)

1. 지방조직으로부터 비지방 세포의 단리를 위한 장치로서, 상기 장치는,
   재료의 제1 시트;
   상기 재료의 제1 시트에 결합된 재료의 제2 시트; 및
   상기 재료의 제1 시트와 상기 재료의 제2 시트 사이에 정해진 다수의 챔버를 포함하되, 상기 다수의 챔버는,
   주입구 및 배출구를 포함하는 샘플 해리 챔버;
   상기 샘플 해리 챔버의 상기 배출구와 유체 연결된 주입구를 포함하는 폐기물 수집 챔버; 및
   상기 샘플 해리 챔버와 유체 연결된 주입구 및 배출구를 포함하는 세포 정제 챔버를 포함하는, 지방조직으로부터 비지방 세포의 단리를 위한 장치.
2. 제1항에 있어서, 상기 샘플 해리 챔버는 70㎛ 내지 300㎛의 기공 크기를 갖는 기공을 포함하는 메쉬 필터(mesh filter)를 더 포함하는 것인 지방조직으로부터 비지방 세포의 단리를 위한 장치.
3. 제1항에 있어서, 20㎛ 내지 50㎛의 기공 크기를 갖는 기공을 포함하는 세포 정제 챔버 내에 포함된 메쉬 필터를 더 포함하는 것인, 지방조직으로부터 비지방 세포의 단리를 위한 장치.
4. 제1항에 있어서, 상기 샘플 해리 챔버는 제1 기공 크기를 갖는 기공을 포함하는 제1 메쉬 필터를 더 포함하고, 상기 세포 정제 챔버는 제2 기공 크기를 갖는 기공을 포함하는 제2 메쉬 필터를 더 포함하되, 상기 제2 기공 크기는 상기 제1 기공 크기보다 더 작은 것인, 지방조직으로부터 비지방 세포의 단리를 위한 장치.
5. 제1항에 있어서, 상기 샘플 해리 챔버, 상기 폐기물 수집 챔버와 상기 세포 정제 챔버 사이의 유체 연결을 제어하기 위한 수단을 더 포함하는, 지방조직으로부터 비지방 세포의 단리를 위한 장치.
6. 제5항에 있어서, 상기 유체 연결을 제어하기 위한 수단은 스탑콕을 포함하는 것인, 지방조직으로부터 비지방 세포의 단리를 위한 장치.
7. 제1항에 있어서, 상기 샘플 해리 챔버 내로 린스 용액 및 해리 용액 중 적어도 하나를 도입하도록 구성된 유동 제어 장치를 더 포함하되, 상기 샘플 해리 챔버와 유체 연결된 배출구를 갖는 것인, 지방조직으로부터 비지방 세포의 단리를 위한 장치.
8. 제1항에 있어서, 상기 샘플 해리 챔버 및 상기 세포 정제 챔버 중 하나에 압력을 적용하기 위한 수단을 더 포함하는, 지방조직으로부터 비지방 세포의 단리를 위한 장치.
9. 제1항에 있어서, 상기 세포 정제 챔버의 상기 배출구와 유체 연결된 하류 처리 장치를 더 포함하며, 유체 생산물을 관심 대상의 하나 이상의 세포의 제1 농도를 가지는 제1 용액 및 상기 제1 용액 농도 미만의 상기 관심 대상의 하나 이상의 세포의 농도를 갖는 제2 용액으로 분리시키도록 구성된 적어도 하나의 미소유체 장치를 포함하되, 상기 관심대상의 세포는 지방조직 샘플로부터 단리된 비지방 세포를 포함하는 것인, 지방조직으로부터 비지방 세포의 단리를 위한 장치.
10. 멸균되어 있고 실질적으로 격리된 지방조직 처리 시스템(sterile and substantially isolated adipose tissue processing system)으로서,
    주입구, 배출구, 및 상기 조직 처리 챔버의 주입구와 상기 조직 처리 챔버의 배출구 사이에 배치된 적어도 하나의 메쉬 필터를 포함하는 조직 처리 챔버;
    상기 조직 처리 챔버와 동일한 인클로저 내에 포함된 폐기물 수집 챔버; 및
    파편 제거 기구를 포함하는 파편 제거 챔버 및 상기 조직 처리 챔버와 동일한 인클로저 내에 포함되고 상기 조직 처리 챔버에 유체 연결된 샘플 수집 챔버 중 하나를 포함하되,
    상기 폐기물 수집 챔버는 상기 조직 처리 챔버의 상기 배출구와 유체 연결된 주입구를 포함하는, 지방조직 처리 시스템.
11. 조직 처리 시스템 내 지방조직 샘플을 처리하는 방법으로서, 상기 방법은,
    처리될 지방조직 샘플을 제1 챔버의 주입구 포트를 통해 제1 챔버 내로 도입하는 단계;
    상기 제1 챔버 내 상기 지방조직 샘플을 처리하는 단계; 및
    상기 제1 챔버의 배출구를 통한 상기 제1 챔버로부터의 샘플을 상기 제2 챔버의 주입구를 통해 제1 챔버와 동일한 인클로저 내에 포함된 제2 챔버 내로 옮기는 단계를 포함하는, 조직 처리 시스템 내 샘플의 처리 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 지방조직 샘플을 처리하는 단계는 상기 지방조직 샘플을 해리시키는 단계를 포함하는 것인, 조직 처리 시스템 내 샘플의 처리 방법.
13. 제11항에 있어서, 상기 지방조직 샘플을 처리하는 단계는 상기 제1 챔버 내 상기 지방조직 샘플로부터 과량의 유체를 제거하는 단계를 포함하는 것인, 조직 처리 시스템 내 샘플의 처리 방법.
14. 제11항에 있어서, 상기 지방조직 샘플을 처리하는 단계는 린스 용액을 사용하여 상기 제1 챔버 내 상기 지방조직 샘플을 세척하는 단계를 포함하는 것인, 조직 처리 시스템 내 샘플의 처리 방법.
15. 제11항에 있어서, 상기 지방조직 샘플을 처리하는 단계는 린스 용액을 사용하여 상기 제1 챔버 내 상기 지방조직 샘플을 세척하는 단계 및 적어도 하나의 효소를 포함하는 해리 용액을 사용하여 상기 제1 챔버 내 상기 지방조직 샘플을 해리시키는 단계를 포함하는 것인, 조직 처리 시스템 내 샘플의 처리 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 해리 용액은 콜라게나제를 포함하는 것인, 조직 처리 시스템 내 샘플의 처리 방법.
17. 제15항에 있어서, 상기 해리 용액은 콜라게나제, 데옥시리보뉴클레아제 및 하이알루로니다제를 포함하는 것인, 조직 처리 시스템 내 샘플의 처리 방법.
18. 제15항에 있어서, 해리 용액을 사용하는 상기 지방조직 샘플을 해리시키는 단계는 약 37℃에서 일어나는 것인, 조직 처리 시스템 내 샘플의 처리 방법.
19. 제11항에 있어서, 상기 제2 챔버 내 포함된 메쉬 필터를 사용하여 파편을 제거하는 단계를 더 포함하는, 조직 처리 시스템 내 샘플의 처리 방법.
20. 제19항에 있어서, 상기 메쉬 필터는 15 마이크로미터 내지 100 마이크로미터의 기공 크기를 갖는 것인, 조직 처리 시스템 내 샘플의 처리 방법.
21. 제11항에 있어서, 상기 제1 챔버 내에서 상기 샘플을 보유하는 단계 및 상기 제1 챔버 내에 포함된 메쉬 필터 및 상기 제1 챔버의 제1 배출구를 통해 폐기물 유체를 제3 챔버의 주입구를 통해 상기 제1 챔버와 동일한 인클로저 내에 포함된 제3 챔버 내로 옮기는 단계를 더 포함하는, 조직 처리 시스템 내 샘플의 처리 방법.
22. 제11항에 있어서, 미소유체 장치를 사용하여 비지방 세포를 풍부화시키는 단계를 더 포함하는 것인, 조직 처리 시스템 내 샘플의 처리 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 비지방 세포는 줄기 세포를 포함하는 것인, 조직 처리 시스템 내 샘플의 처리 방법.
24. 제11항에 있어서, 상기 조직 처리 시스템으로부터 세포를 채취하는 단계를 더 포함하는 것인, 조직 처리 시스템 내 샘플의 처리 방법.
25. 제11항에 있어서, 상기 제2 챔버의 배출구와 유체 연결되며 상기 세포를 비지방 세포의 제1 농도를 갖는 제1 용액 및 상기 제1 용액 농도 미만의 비지방 세포의 농도를 갖는 제2 용액으로 분리시키도록 구성된 적어도 하나의 미소유체 장치를 포함하는 하류의 처리 장치 내 상기 세포를 처리하는 단계를 더 포함하는 것인, 조직 처리 시스템 내 샘플의 처리 방법.
26. 제24항에 있어서, 상기 채취한 세포는 기질 혈관 분획 세포인 것인, 조직 처리 시스템 내 샘플의 처리 방법.

Images