JP2013126413A - 白血球精製 - Google Patents

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Abstract

【課題】白血球を精製する方法を提供する。
【解決手段】白血球を含む体液又は白血球を含む凍結保護液を上流表面及び下流表面を有する多孔性白血球除去媒体に通過させるステップ。白血球除去媒体から白血球を溶出するステップと、精製した白血球を回収するステップ、及び精製した白血球を溶解するステップ、溶解した白血球の全ＲＮＡを測定するステップを含む。マルチウェル装置を使用して行われ、前記装置が複数のウェルを有し、各ウェルが多孔性白血球除去媒体を有する方法。
【選択図】なし

Description

発明の背景
[0001]白血球（白血球細胞とも呼ぶ）は、細胞治療及び診断を含む種々の用途に有用である。白血球は、例えば、ドナーから得られる臍帯血又は血液から得ることができる。
[0002]従来、白血球を含む臍帯血濃縮液及び幹細胞濃縮液は、液体窒素条件下で保管され、ここで濃縮液は、保管中に白血球を損傷から保護するための凍結保護剤ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。ＤＭＳＯを含む濃縮液は、患者に投与することができるが、ＤＭＳＯは不純物とみなされ得るので、いくつかのプロトコールは、患者への投与前に濃縮液を遠心分離及び洗浄して濃縮液中のＤＭＳＯの存在を減らすステップを含む。このようなプロトコールは、大きな労働力を要し、時間がかかる。
[0003]白血球を得るいくつかの方法は、血液若しくは血液製剤を多孔性白血球除去媒体に通過させるステップと、媒体の下流表面から上流表面まで溶出液を通過させることによって媒体から白血球を溶出するステップ、又は生理食塩水を上流表面から下流表面まで媒体に通した後若しくは空気を上流表面から下流表面まで媒体に通した後に、媒体上で白血球を溶解するステップのいずれかとを含む。しかしながら、これらの方法は、赤血球（赤血球細胞としても知られている）の存在など望ましくないレベルの不純物及び／又は所望の収率よりも低い白血球をもたらした。
[0004]本発明は、従来技術の欠点の少なくともいくつかを改善する。本発明のこれらの及び他の利点は、以下に示す記載から明らかになるだろう。
[0005]本発明の一実施形態は、（ａ）白血球を含む体液を上流表面及び下流表面を有する多孔性白血球除去媒体に通過させるステップであって、上記液が上流表面から下流表面まで通過し、白血球が白血球除去媒体によって保持される、ステップと、（ｂ）洗浄液を下流表面から上流表面まで白血球除去媒体に通過させるステップと、（ｃ）上記洗浄液を重力によって上流表面から下流表面まで白血球除去媒体に通過させるステップとを含む、白血球を精製する方法を提供する。
[0006]別の実施形態は、（ａ）白血球を含む凍結保護液を上流表面及び下流表面を有する多孔性白血球除去媒体に通過させるステップであって、上記液が上流表面から下流表面まで通過し、白血球が白血球除去媒体によって保持される、ステップと、（ｂ）洗浄液を下流表面から上流表面まで白血球除去媒体に通過させるステップと、（ｃ）上記洗浄液を重力によって上流表面から下流表面まで白血球除去媒体に通過させるステップとを含む、白血球を精製する方法を提供する。
[0007]本方法のいくつかの実施形態では、追加の洗浄液を使用して、（ｂ）及び（ｃ）を少なくとも１回繰り返す。
[0008]本方法のいくつかの実施形態は、溶出液を下流表面から上流表面まで白血球除去媒体に通過させることによって、白血球除去媒体から白血球を溶出するステップと、溶出した白血球を回収するステップ、又は、白血球除去媒体によって保持されている間に白血球を溶解するステップとをさらに含む。
[0009]必要に応じて、本方法の実施形態は、マルチウェル装置又は個別フィルター装置を使用して行うことができる。
[0010] 本発明による方法の実施形態を説明し、略図で示す図である。 [0011] 本発明による方法の実施形態を実施するのに適した例示的系を示す図である。 [0012] 閉鎖系を維持しながら実施される本発明による方法の実施形態を実施するのに適した別の例示的系を示す図である。
発明の詳細な説明
[0013]本発明の実施形態によると、（ａ）白血球を含む体液を上流表面及び下流表面を有する多孔性白血球除去媒体に通過させるステップであって、上記液が上流表面から下流表面まで通過し、白血球が白血球除去媒体によって保持される、ステップと、（ｂ）洗浄液を下流表面から上流表面まで白血球除去媒体に通過させるステップと、（ｃ）上記洗浄液を重力によって上流表面から下流表面まで白血球除去媒体に通過させるステップとを含む、白血球を精製する方法が提供される。
[0014]白血球を精製する方法の別の実施形態は、白血球及び凍結保護剤（ＤＭＳＯなど）を含む液を上流表面及び下流表面を有する多孔性白血球除去媒体に通過させるステップであって、上記液が上流表面から下流表面まで通過し、白血球が白血球除去媒体によって保持される、ステップと、（ｂ）洗浄液を下流表面から上流表面まで白血球除去媒体に通過させるステップと、（ｃ）上記洗浄液を重力によって上流表面から下流表面まで白血球除去媒体に通過させるステップとを含む。
[0015]本方法のいくつかの実施形態では、追加の洗浄液を使用して、（ｂ）及び（ｃ）を少なくとも１回繰り返す。
[0016]いくつかの実施形態では、体液又は凍結保護液を重力又は減圧によって多孔性白血球除去媒体に通過させる。洗浄液を下流表面から上流表面まで白血球除去媒体に通過させるステップは、上流表面の上流に陰圧（減圧）を作り出すステップを含む、又は下流表面の下流に陽圧を作り出すステップを含む。
[0017]有利には、白血球は、赤血球及び／又は血小板の存在を減らしながら得ることができる。赤血球及び血小板の存在を最小化することは、細胞治療用途にとって特に有利である。或いは、又はさらに、ＤＭＳＯの存在を最小化することは、細胞治療用途、特に、新生児、乳児及び小児に関するものにとって特に有利である。
[0018]本方法のいくつかの実施形態は、溶出液を下流表面から上流表面まで白血球除去媒体に通過させることによって、白血球除去媒体から白血球を溶出するステップと、溶出した白血球を回収するステップと、又は、白血球除去媒体によって保持されている間に白血球を溶解するステップとをさらに含む。白血球を溶解するステップを含む一実施形態では、本方法は、溶解した白血球の内容物を分析するステップをさらに含む、例えば、溶解した白血球の核酸を分析するステップを含む。
[0019]本方法の好ましい一実施形態では、溶出した白血球を患者などの対象に投与する。
[0020]必要に応じて、本方法の実施形態は、マルチウェル装置又は個別フィルター装置を使用して行うことができる。例えば、白血球除去媒体を有する複数のウェルを有するマルチウェル装置を使用して、別個の部分の体液及び洗浄液は、別個のウェル中の白血球除去媒体を通過する。
[0021]本発明は、種々の供給源の体液、特に哺乳動物の体液を使用して行うことができる（凍結保護液中の細胞もまた種々の供給源のものとすることができる）。哺乳動物が、ネコ科（ネコ）及びイヌ科（イヌ）を含む食肉目、ウシ科（ウシ）及びイノシシ科（ブタ）を含む偶蹄目、又はウマ科（ウマ）を含む奇蹄目のものであることが好ましい。典型的には、哺乳動物は、霊長目、セボイド目（Ｃｅｂｏｉｄｓ）若しくはシモイド目（Ｓｉｍｏｉｄｓ）（サル）、又は真猿目（ヒト及び類人猿）のものである。特に好ましい哺乳動物は、ヒトである。
[0022]本発明の実施形態によると、任意の適当な容量の体液又は凍結保護液を処理することができ、種々の白血球除去媒体及び白血球除去フィルター構成、例えば、約０．３インチ（約７ｍｍ）以下〜約５インチ（約１２ｃｍ）以上の範囲の直径を有する媒体又はフィルターが適当である。
[0023]本発明により使用する臍帯血濃縮液及び幹細胞濃縮液は、本発明の実施形態により白血球を精製する（好ましくは溶出する）前に、当技術分野で知られている種々の技術によって、（例えば、凍結及び解凍した凍結保護剤と組み合わせた濃縮白血球画分を得るために）製造することができる。
[0024]ここで、本発明の構成要素の各々を以下により詳細に記載するが、同じ構成要素は同じ参照番号を有するものとする。
[0025]種々の多孔性白血球除去媒体が本発明への使用に適している。適当な白血球除去媒体には、市販されている媒体、例えば、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）から市販されている媒体が含まれる。
[0026]種々の洗浄液が本発明への使用に適している。典型的には、洗浄液は、所望の細胞と生理学的に適合性があり、細胞に実質的に影響を与えない。例示的な液には、例えば、生理食塩水、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。
[0027]洗浄は、任意の適当な流体流速で達成することができる。典型的には、洗浄液を下流表面から上流表面まで白血球除去媒体に通過させるステップは、例えば、フィルター装置の入口に接続されている注射筒中のプランジャを引くことによって、上流表面の上流に陰圧を作り出すステップ、又はマルチウェル装置のウェル中に真空を作り出すステップを含む。好ましくは、洗浄液を上流表面から下流表面まで白血球除去媒体に通過させるステップは、重力によって達成される。
[0028]溶出を含むこれらの実施形態では、所望の保持細胞、すなわち、フィルターによって保持されている（例えば、捕捉及び／又は吸着されている）白血球（及びいくつかの実施形態では、幹細胞）は、多孔性白血球除去媒体から逆流させることによって、すなわち、溶出液を下流側から上流側に向かう方向に多孔性媒体に、及び入口ポートに通過させて、細胞を含む溶出液が入口ポートから入口ポートに通じる細胞回収容器中に流れるようにすることによって、放出される。
[0029]逆流は、任意の適当な流体流速、例えば、約０．１〜１５Ｌ／分／ｍ２で達成することができるが、この範囲より大幅に高い又は低い流速を使用することができる。例えば、逆流は、約０．５〜１０Ｌ／分／ｍ２、例えば、約１〜８Ｌ／分／ｍ２の流体流速で達成することができ、より好ましくは、流速は、約１．５〜７Ｌ／分／ｍ２、例えば、約２〜６Ｌ／分／ｍ２又はさらには約２．５〜５Ｌ／分／ｍ２（例えば、約３〜４Ｌ／分／ｍ２）である。最も好ましい流速は、溶出液の粘度及び／又は温度、並びにフィルター媒体の性質に依存し得る。したがって、より穏やかな処理が望まれるようないくつかの用途では、逆流は、約１〜１００ｍｌ／分／ｍ２（例えば、約１５〜８５ｍｌ／分／ｍ２）の流速で達成することができ、より好ましくは、流速は、約３０〜７０ｍｌ／分／ｍ２又はさらには約４０〜６０ｍｌ／分／ｍ２（例えば、約５０ｍｌ／分／ｍ２）である。
[0030]種々の溶出液が本発明への使用に適している。典型的には、上記液は、所望の細胞と生理学的に適合性であり、細胞に実質的に影響を与えない。例示的な液には、例えば、生理食塩水、並びに米国特許第６５４４７５１号及び第７２９１４５０号に開示されているより粘性の液が含まれる。
[0031]白血球が本発明により精製され、その後（媒体から溶出されるのではなく）白血球除去媒体中又は上で溶解される実施形態では、種々の試薬及びプロトコールが、白血球を処理及び溶解し、白血球から放出される核酸（好ましくは、ＲＮＡであるが、本発明の実施形態は、ＤＮＡの精製及び／又は単離を含む）を精製及び／又は単離するのに適しており、当技術分野で知られている。必要に応じて、白血球を溶解する前に処理して細胞を安定化することができる。安定化した細胞を、溶解前の適当な期間、白血球除去媒体中若しくは上に維持することができる、又は細胞を安定化の少し後若しくは直後に溶解することができる。好ましくは、溶液を使用して白血球を破壊して、ヌクレアーゼを不活性化させながらＲＮＡを迅速に放出させるようにする。ＲＮＡの精製、全ＲＮＡの単離及び精製したＲＮＡのグロビンＲＮＡの除去を含む、例示的な試薬及びプロトコールは、例えば、「ロイコロック（ＬｅｕｋｏＬＯＣＫ）（商標）Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｇｌｏｂｉｎ ｍＲＮＡ−Ｄｅｐｌｅｔｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒｏｍ Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ Ｓａｍｐｌｅｓ」、Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ、Ｃａｔａｌｏｇ＃ＡＭ１９２３、ＡＭ１９３３、ＡＭ１９３４、（Ｍａｎｕａｌ １９２３Ｍ Ｒｅｖｉｓｉｏｎ Ｂ）Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ（２００７）に開示されている。
[0032]種々の容器及び容器を含む装置が本発明への使用に適しており、ここで、容器を白血球除去媒体の上流及び／又は下流に配置することができる。適当な容器は当技術分野で知られている。典型的には、容器の１個又は複数は、体液、所望の細胞、洗浄液及び／又は溶出液と生理学的に適合性であり、細胞に実質的に影響を与えない。複数の容器を本発明の実施形態に使用することができるので、単一の容器が体液、所望の細胞、洗浄液及び溶出液と生理学的に適合性であることが必要条件ではない。例えば、ある容器を体液又は凍結保護液を白血球除去媒体に通過させるために使用することができ（したがって、洗浄液及び／又は溶出液と生理学的に適合性である必要はない）、別の容器を、白血球除去媒体を通して洗浄液を受け取り、洗浄液を白血球除去媒体に通過させるために使用することができ、別の容器を溶出細胞及び溶出液を受け取るために使用することができる。
[0033]いくつかの実施形態では、体液又は凍結保護液を白血球除去媒体に通過させる、及び白血球除去媒体を通して洗浄液を受け取る、及び洗浄液を白血球除去媒体に通過させるために使用する（１個又は複数の）容器は、実質的に非軟性、例えば、注射筒などの非軟性容器である。しかしながら、本発明の実施形態はそのように限定されない。例えば、体液又は凍結保護液を白血球除去媒体に通過させる、及び白血球除去媒体を通して洗浄液を受け取る、及び洗浄液を白血球除去媒体に通過させるために使用する（１個又は複数の）容器は、軟性容器、例えば、軟性側壁を有する血液バッグ（例えば、プラスチックの血液バッグ）を含むことができ、典型的には、ここで（１個又は複数の）容器は少なくとも２個のポート、例えば、入口ポート及び出口ポートを有する。可撓性側壁を圧縮することができる、或いは減圧を作り出して、空気及び／又は液体が容器から出る、並びに／或いは空気及び／又は液体がバッグに入ると軟性側壁が膨張し、バッグが加圧され、出口ポートを開くと柔軟な容器が空気及び／又は液体を外に誘導するようにすることができる。
[0034]本発明の実施形態は、開放系への使用に適しているが、閉鎖系を維持しながら本発明の実施形態を実施することができる。
[0035]本発明にしたがって以下の定義を使用する。
[0036]体液。体液には、生体と関連した任意の処理又は未処理液が含まれ、特に血液（全血、温血又は冷血、臍帯血及び保存血又は新鮮血を含む）；生理食塩水、栄養物及び／又は抗凝固溶液を含むがこれらに限定されない少なくとも１種の生理的溶液で希釈された血液などの処理された血液；血小板濃縮液（ＰＣ）、多血小板血漿（ＰＲＰ）、乏血小板血漿（ＰＰＰ）、無血小板血漿、血漿、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）、血漿から得られた成分、濃縮赤血球（ＰＲＣ）、移行域（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ）物質又はバフィーコート（ＢＣ）などの血液成分；血液若しくは血液成分由来又は骨髄由来の血液製剤；幹細胞；臍帯血；血漿から分離され、生理的溶液又は凍結保護液に再懸濁された赤血球；並びに血漿から分離され、生理的溶液又は凍結保護液に再懸濁された血小板が含まれる。体液にはまた、骨髄穿刺液を含む生理的溶液が含まれる。体液は、本発明により処理される前に、白血球のいくらかを除去するために処理されていてよい。本明細書で使用する場合、血液製剤又は体液とは、上記成分、並びに他の手段によって得られた及び類似の特性を有する類似の血液製剤又は体液を指す。
[0037]「凍結保護液」は、例えば、それだけに限らないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、アルブミン、デキストラン、スクロース、エチレングリコール、Ｉ−エリスリトール、Ｄ−リビトール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、Ｉ−イノシトール、Ｄ−ラクトース、塩化コリン、アミノ酸、メタノール、アセトアミド、グリセリンモノアセテート及び無機塩などの凍結保護剤及びその混合物を含むことができる。代表的な処理溶液には、国際公開第９６／１７５１４号に開示されているものが含まれる。典型的には、実施形態では、低濃度では細胞に無毒性のＤＭＳＯが使用される。低分子であるので、ＤＭＳＯは、細胞に自由に浸透し、水と結合してその凍結能を修飾することによって、細胞内小器官を保護し、氷形成による損傷を防ぐと考えられている。血漿の添加（例えば、約２０〜２５％の濃度まで）によって、ＤＭＳＯの保護効果を増大させることができる。
[0038]「単位」は、１人のドナーの又は全血の１単位から得られる体液の量である。これはまた、１回の献血中に取られる量を指すこともある。典型的には、単位の容量は変化し、量は患者間で及び献血間で異なる。複数単位のある血液成分、特に血小板及びバフィーコートは、典型的には４つ以上の単位を合わせることによって、貯蔵又は合わせることができる。
[0039]本明細書で使用する場合、用語「閉鎖」とは、系の無菌完全性を損なう必要なく、凍結保護液又は体液、例えば、ドナー血液、血液試料及び／又は血液成分の収集及び処理（及び、必要に応じて、操作、例えば、一部分への分離、成分への分離、濾過、保管及び保存）を可能にする系を指す。閉鎖系は、もともと作られているもの又は「無菌接合（ｓｔｅｒｉｌｅ ｄｏｃｋｉｎｇ）」装置として知られているものを使用して系成分の結合から得られるものであってもよい。例示的な無菌接合装置は、例えば、米国特許第４５０７１１９号、第４７３７２１４号及び第４９１３７５６号に開示されている。
[0040]本発明によるフィルターエレメントの多孔性白血球除去媒体（好ましくは、繊維状多孔性白血球除去媒体）を製造するために、合成高分子材料を含む種々の材料を使用することができる。適当な合成高分子材料には、例えば、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、ポリフッ化ビニリデン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ナイロン６、ナイロン６６、ナイロン６Ｔ、ナイロン６１２、ナイロン１１及びナイロン６共重合体が含まれ、ここで、ポリエステル、例えば、ＰＢＴ及びＰＥＴがより好ましい。典型的には、繊維状多孔性媒体は、メルトブローン（ｍｅｌｔ−ｂｌｏｗｎ）繊維から調製される。例えば、米国特許第４８８０５４８号、第４９２５５７２号、第５１５２９０５号及び第６０７４８６９号は、メルトブローン繊維から調製される多孔性白血球除去フィルター及びフィルターエレメントを開示している。
[0041]白血球除去フィルターエレメントは、液がエレメントを通過する際に目的の１種若しくは複数の材料の通過を減少させる若しくは可能にする、任意の適当な孔構造、例えば、孔サイズ（例えば、米国特許第４３４０４７９号に記載されているように泡立ち点若しくはＫＬによって証明される、又は毛管凝縮フローポロメトリー（ｆｌｏｗ ｐｏｒｏｍｅｔｒｙ）より証明される）、孔定格、孔直径（例えば、米国特許第４９２５５７２号に記載されている修正ＯＳＵ Ｆ２試験を使用して特徴づける場合）又は除去定格を有することができる。白血球は、主に吸着によって除去されると考えられているが、白血球を濾過によって除去することもできる。他の成分、例えば、血漿、血小板及び赤血球の通過を可能にしながら、少なくともいくらかのレベルの白血球を除去するよう孔構造を選択することができる。使用する孔構造は、処理する液の組成及び処理する液の所望の溶出物濃度に依存する。
[0042]フィルターエレメントは、任意の所望の臨界ぬれ表面張力（ＣＷＳＴ、例えば、米国特許第４９２５５７２号に定義されているような）を有することができる。ＣＷＳＴは、例えば、米国特許第５１５２９０５号、第５４４３７４３号、第５４７２６２１号及び第６０７４８６９号にさらに開示されているように当技術分野で知られているように選択することができる。典型的には、フィルターエレメントは、約５３ダイン／ｃｍ（約５３×１０−５Ｎ／ｃｍ）を超える、より典型的には約５８ダイン／ｃｍ（約５８×１０−５Ｎ／ｃｍ）を超えるＣＷＳＴを有し、約６６ダイン／ｃｍ（約６６×１０−５Ｎ／ｃｍ）以上のＣＷＳＴを有することができる。いくつかの実施形態では、エレメントは、７５ダイン／ｃｍ（約７５×１０−５Ｎ／ｃｍ）以上、例えば、約８０〜約１００ダイン／ｃｍ（約８０〜約１００×１０−５Ｎ／ｃｍ）の範囲のＣＷＳＴを有する。
[0043]湿式若しくは乾式酸化によって、表面上にポリマーをコーティング若しくは沈着させることによって、又はグラフト反応によって、（例えば、ＣＷＳＴに影響を及ぼすため、表面電荷、例えば、正若しくは負電荷を組み込むため、及び／又は表面の極性若しくは親水性を変えるために）エレメントの表面特性を修飾することができる。修飾には、例えば、照射、極性又は荷電モノマー、荷電ポリマーによる表面のコーティング及び／又は硬化、並びに表面上に官能基を付着させるための化学修飾の実施が含まれる。グラフト反応は、ガスプラズマ、蒸気プラズマ、コロナ放電、熱、ヴァンデグラフ起電機、紫外線、電子ビームなどのエネルギー源若しくは種々の他の形態の照射への暴露によって、又はプラズマ処理を使用した表面エッチング又は沈着によって活性化することができる。
[0044]フィルター及び／又はフィルター装置は、異なる構造及び／又は機能、例えば、前濾過、支持材、ドレネージ、間隔及び緩衝材の少なくとも１つを有することができる追加のエレメント、層又は成分を含むことができる。
[0045]フィルターエレメント、いくつかの実施形態では、複数のフィルターエレメントを備えるフィルターは、少なくとも１個の入口及び少なくとも１個の出口を備え、入口と出口との間に少なくとも１個の流体流路を規定するハウジング中に配置することができ、ここでフィルターエレメントは流体流路全体にわたっていて、フィルター装置を提供する。典型的には、フィルター装置は、滅菌可能である。適当な形状で少なくとも１個の入口及び少なくとも１個の出口を提供する任意のハウジングを使用することができる。
[0046]或いは、フィルターエレメント又は１個若しくは複数のフィルターエレメントを備えるフィルターは、マルチウェル装置又はフィルタープレート中に配置することができ、ここで、フィルターエレメント又は複数のフィルター装置を備えるフィルターはウェルの中に配置される。適当な装置及びフィルタープレートは、当技術分野で知られており、例えば、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）から、商品名アクロウェル（ＡＣＲＯＷＥＬＬ）（商標）及びアクロプレプ（ＡＣＲＯＰＲＥＰ）（商標）で市販されている、及び／又は例えば、国際公開第２００２／０９６５６３号に記載されている。
[0047]ハウジングは、処理する体液と適合性の任意の不浸透性熱可塑性材料を含む、任意の適当な強固な不浸透性材料から製作することができる。典型的には、ハウジングは、ポリマーから製作する。いくつかの実施形態では、ポリマーは、透明又は半透明のポリマー、例えば、アクリル、ポリプロピレン、ポリスチレン又はポリカーボネート樹脂である。このようなハウジングは、容易に及び経済的に製作され、液の流れをハウジング越しに観察することを可能にする。
[0048]必要に応じて、ハウジングを、例えば、接着剤、溶剤、レーザー溶接、高周波シール、超音波シール及び／又はヒートシールを利用して、当技術分野で知られているように密閉することができる。さらに、又は或いは、ハウジングを射出成形によって密閉することができる。
[0049]以下の実施例は、本発明をさらに説明するが、当然、本発明の範囲を多少なりとも限定するように解釈すべきではない。
実施例１
[0050]この実施例は、本発明の実施形態により、赤血球混入を最小化しながら、高収率で白血球を精製及び回収することができることを示している。
[0051]フィルター装置は、Ｌｅｕｋｏｓｏｒｂ白血球除去媒体を備える２５ｍｍアクロディスク（ＡＣＲＯＤＩＳＣ）（登録商標）シリンジフィルター（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）とする。装置の入口ポートを、空の５ｍＬ注射筒に接続し、出口ポートを廃棄物容器につながる管に接続し、新たに収集したドナーの血液の９ｍＬ試料を、ＥＤＴＡ又はＣＰ２Ｄ抗凝固剤で処理し、フィルターを通して、重力によって排出する。濾過した血液は捨てる。
[0052]新たな５ｍＬ注射筒（プランジャを含む）を、装置の入口ポートに接続し、装置の出口ポートに接続した管を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）約８μＬを含む容器（「廃棄物容器」）中に置く。図１に示すように、シリンジプランジャを引いて、白血球除去媒体の下流表面及び上流表面を通して、廃棄物容器からＰＢＳを注射筒の中に引き入れる。図１に示すように、ＰＢＳを注射筒中に引き入れた後、シリンジプランジャを注射筒から引き出す一方で、装置出口は廃棄物容器中のＰＢＳと接触したままである。次いで、各注射筒中のＰＢＳは、重力によって、上流表面及び下流表面を通して、廃棄物容器中に排出する。上記のように、別の容量のＰＢＳを、媒体を通して引き、排出させて洗浄を繰り返す。
[0053]米国特許第６５４４７５１号に一般的に記載されているＰＢＳ中６％デキストラン７０を含む溶出液５ｍＬを、各装置の出口から入口まで通過させ、溶出した白血球を回収する。
[0054]流入液、流出液並びに溶出した白血球及び赤血球の数を数える。結果は以下の通りである。
Figure 2013126413
[0055]各試料では、対照と比較して、白血球の８５％超が捕捉され、対照と比較して白血球の６０％超が回収され、対照と比較して１％以下の赤血球が、溶出した白血球中に存在する。
実施例２
[0056]この実施例は、本発明の実施形態により白血球を精製及び回収しながらの赤血球混入の減少を示している。
[0057]入口ポート２及び出口ポート３、供給バッグ（血液バッグ）４、廃棄物バッグ６、白血球サンプリングバッグ９、シリンジ７、注入ポート８及びクランプ１０〜１３を有するフィルター装置１を示す、この実施例を実施するために使用する系１００を、図２に示す。
[0058]フィルター装置は、白血球除去媒体を備えるピュアセル（ＰＵＲＥＣＥＬＬ）（登録商標）ＰＸＬＡ Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｆｉｌｔｅｒｓ ｆｏｒ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）とする。フィルター装置１の入口ポート２を、管及び「Ｙ」コネクタを通して、血液バッグ４及び白血球サンプリングバッグ９に接続し、装置出口ポート３を別の「Ｙ」コネクタを通して廃棄物バッグ６及びシリンジ７に接続した注入ポート８につながる管に接続する。
[0059]シリンジを、溶出液で満たし、ポート８に取り付け、クランプ１２を閉じる。
[0060]流れを制御するために、入口ポートと血液バッグとサンプリングバッグとの間（クランプ１０及び１１）、及び出口ポートと廃棄物バッグと注入ポートとの間（クランプ１２及び１３）の管にクランプを置く。全てのクランプは、最初は閉じておく。
[0061]血液バッグは、標準的な血液バンク手順によって、ドナーから収集し、抗凝固剤と混合した血液５０ｍＬを含んでいる。系を垂直に配置し、クランプ１０及び１３を開けると、血液は重力によって濾過され、廃棄物容器６中に流れ、白血球はフィルター装置１中の白血球除去媒体上に捕捉される。
[0062]クランプ１３を閉じ、クランプ１２を開け、ＰＢＳ洗浄液２０ｍＬをシリンジ７によって注入ポート８を通して注入し、洗浄液が白血球除去媒体の下流表面及び上流表面を通過し、血液バッグ４中に流れるようにする。クランプ１０及び１３を再度開き、洗浄液を重力によってフィルター装置を通し廃棄物バッグ６中に排出させる。
[0063]新しいＰＢＳを使用して洗浄手順をもう一度繰り返す。
[0064]シリンジ７を溶出液（ＰＢＳ中６％デキストラン４０）で満たし、注入ポート８に接続する。
[0065]クランプ１０及び１３を閉じ、クランプ１１及び１２を開き、溶出液２４μＬをシリンジ７から注入ポート８に注入して、溶出液によってサンプリングバッグ９中に白血球を溶出し、流す。
[0066]ある実験については、洗浄液を廃棄物バッグ中に排出せず、他の実験については、洗浄液を廃棄物バッグ６中に排出する。さらに、洗浄を使用せずに白血球を回収し、種々の濾過についての結果を比較する。
[0067]結果は以下の通りである（溶出緩衝液中への回収割合）。
Figure 2013126413
[0068]結果は、洗浄を使用すると、赤血球混入が洗浄なしと比較して６６％超減少したことを示している。
実施例３
[0069]この実施例は、本発明の実施形態により、白血球を精製及び溶解することができ、白血球核酸を分析することができることを示している。
[0070]フィルター装置は、Ｌｅｕｋｏｓｏｒｂ白血球除去媒体を備える２５ｍｍアクロディスク（登録商標）シリンジフィルター（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）とする。
[0071]新たに収集したドナーの血液の９ｍＬ試料を、ＥＤＴＡ抗凝固剤で処理し、以下のように処理する。流入液及び流出液白血球の数を数える。
[0072]第１の実験のために、装置の入口ポートを、空の５ｍＬ注射筒に接続し、出口ポートを廃棄物容器につながる管に接続し、新たに収集したドナーの血液の９ｍＬ試料を、ＥＤＴＡ抗凝固剤で処理し、フィルターを通して、重力によって排出する。濾過した血液は捨てる。
[0073]新たな５ｍＬ注射筒（プランジャを含む）を、装置の入口ポートに接続し、装置の出口ポートに接続した管を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）約８μＬを含む廃棄物容器中に置く。シリンジプランジャを引いて、白血球除去媒体の下流表面及び上流表面を通して、容器からＰＢＳを注射筒の中に引き入れる。ＰＢＳを注射筒中に引き入れた後、シリンジプランジャを注射筒から引き出す一方で、装置出口は廃棄物容器中のＰＢＳと接触したままである。次いで、各注射筒中のＰＢＳは、重力によって、上流表面及び下流表面を通して、廃棄物容器中に排出する。上記のように、別の容量のＰＢＳを、媒体を通して引き、排出させて洗浄を繰り返す。
[0074]ｐＨ調整した溶解／結合溶液２．５ｍＬを、シリンジを使用して媒体に通過させ、溶解物回収管に回収する。溶解物にヌクレアーゼフリーの水２．５ｍＬ及びプロテイナーゼＫを添加する。「ロイコロック（商標）Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｇｌｏｂｉｎ ｍＲＮＡ−Ｄｅｐｌｅｔｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒｏｍ Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ Ｓａｍｐｌｅｓ」、Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ、Ｃａｔａｌｏｇ＃ＡＭ１９２３、ＡＭ１９３３、ＡＭ１９３４、（Ｍａｎｕａｌ １９２３Ｍ Ｒｅｖｉｓｉｏｎ Ｂ）Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ（２００７）（「ロイコロック（商標）Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｍａｎｕａｌ」）に記載されているように全ＲＮＡを単離する。
[0075]第２の実験では、ロイコロック（商標）Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｍａｎｕａｌに記載されている手順の後、血液をフィルターに通過させ、白血球を単離、安定化、溶解し、全ＲＮＡをロイコロック（商標）Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｍａｎｕａｌに記載されているように単離する。
[0076]各実験で、白血球捕捉の効率、ＲＮＡ収率並びに２６０及び２８０ｎｍでの吸光度の光学濃度比（Ａ２６０／２８０）を測定する。
[0077]結果は以下の通りである。
Figure 2013126413
[0078]この実施例は、本発明の実施形態による、白血球精製及び全ＲＮＡ収率の改善を示している。
実施例４
[0079]この実施例は、本発明の実施形態により、白血球を精製及び溶解することができ、白血球ゲノムＤＮＡを分析することができることを示している。
[0080]実施例１に記載するように白血球を精製及び回収する。
[0081]溶出した白血球の２００μＬ一定分量を、当技術分野で知られているようにフェノール／クロロホルム抽出を使用して処理してゲノムＤＮＡを単離する。単離したＤＮＡを、ＵＶ分光光度法、アガロースゲル電気泳動及びＰＣＲによって分析する。
[0082]結果は以下の通りである（ここでＫ＝１０００である）。
Figure 2013126413
[0083]得られたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動は、高分子量ＤＮＡが、回収した白血球から単離されることを示している。ＤＮＡは、ＰＣＲ及びアメロゲニンプライマーを使用した増幅によって示されるように、無傷及び増幅可能である。
実施例５
[0084]この実施例は、様々な層の白血球除去媒体を使用して、本発明の実施形態により、白血球を精製及び溶解することができ、白血球核酸を分析することができることを示している。
[0085]フィルター装置は、４又は８層のＬｅｕｋｏｓｏｒｂ白血球除去媒体を備える２５ｍｍアクロディスク（登録商標）シリンジフィルター（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）とする。
[0086]新たに収集したドナーの血液の９ｍＬ試料を、ＥＤＴＡ抗凝固剤で処理し、１０μＬシリンジ中に引き、以下のように処理する。流入液及び流出液白血球の数を数える。
[0087]装置の入口ポートを、充填したシリンジに接続し、出口ポートを廃棄物容器につながる管に接続し、シリンジプランジャを押し、血液試料を１秒当たり３〜５滴の流速でフィルターに通過させる。濾過した血液は捨てる。
[0088]新たな５ｍＬ注射筒（プランジャを含む）を、装置の入口ポートに接続し、装置の出口ポートに接続した管を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）約８μＬを含む廃棄物容器中に置く。シリンジプランジャを引いて、白血球除去媒体の下流表面及び上流表面を通して、容器からＰＢＳを注射筒の中に引き入れる。ＰＢＳを注射筒中に引き入れた後、シリンジプランジャを注射筒から引き出す一方で、装置出口は廃棄物容器中のＰＢＳと接触したままである。次いで、各注射筒中のＰＢＳは、重力によって、上流表面及び下流表面を通して、廃棄物容器中に排出する。上記のように、別の容量のＰＢＳを、媒体を通して引き、排出させて洗浄を繰り返す。
[0089]ｐＨ調整した溶解／結合溶液２．５ｍＬを、シリンジを使用して媒体に通過させ、溶解物回収管に回収する。溶解物にヌクレアーゼフリーの水２．５ｍＬ及びプロテイナーゼＫを添加する。「ロイコロック（商標）Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｇｌｏｂｉｎ ｍＲＮＡ−Ｄｅｐｌｅｔｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒｏｍ Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ Ｓａｍｐｌｅｓ」、Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ、Ｃａｔａｌｏｇ＃ＡＭ１９２３、ＡＭ１９３３、ＡＭ１９３４、（Ｍａｎｕａｌ １９２３Ｍ Ｒｅｖｉｓｉｏｎ Ｂ）Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ（２００７）（「ロイコロック（商標）Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｍａｎｕａｌ」）に記載されているように全ＲＮＡを単離する。
[0090]白血球捕捉の効率、ＲＮＡ収率並びに２６０及び２８０ｎｍでの吸光度の光学濃度比（Ａ２６０／２８０）を測定する。
[0091]結果は以下の通りである。
Figure 2013126413
実施例６
[0092]この実施例は、本発明の実施形態により白血球を精製及び回収しながらの赤血球及び血小板混入の減少を示している。
[0093]この実施例を実施するために使用する系を図２に示す。
[0094]フィルター装置は、白血球除去媒体を備えるピュアセル（登録商標）ＰＸＬＡ Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｆｉｌｔｅｒｓ ｆｏｒ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）とする。フィルター装置１の入口ポート２を、管及び「Ｙ」コネクタを通して、血液バッグ４及び白血球サンプリングバッグ９に接続し、装置出口ポート３を別の「Ｙ」コネクタを通して廃棄物バッグ６及びシリンジ７に接続した注入ポート８につながる管に接続する。系をベンチトップに水平に配置し、廃棄物バッグをベンチの側面からつるす。
[0095]抗凝固剤及び空気１０ｍＬと混合した全血５０ｍＬを含む供給バッグを、バッグがベンチトップ上のフィルターの２インチ上になるように箱の上に置く。逆流を防ぐために、廃棄物バッグをベンチトップの下につるす。クランプを開き、血液が供給バッグからフィルターを通り廃棄物バッグ中に流れるようにする。フィルターより下の管をクランプし、２０、４０若しくは６０ｍＬの総洗浄容量について２０ｍＬの増加で、又は１回の４０ｍＬ若しくは６０ｍＬの増加で、ＰＢＳ又はＰＢＳ中６％デキストラン７０のＰＢＳ／デキストラン溶液を使用して、注入ポートを通してフィルターを逆洗し、洗浄液を供給バッグ中へ流す。対照については、フィルターを逆洗しない。
[0096]洗浄液及び細胞を供給バッグ中で混合し、供給バッグがフィルターの２インチ上になり、廃棄物バッグがベンチの側面から吊り下がるように系を再度ベンチトップ上に配置する。混合物は供給バッグからフィルターを通り廃棄物バッグ中へ流れる。
[0097]特定の洗浄容量が達成されるまで、洗浄手順を繰り返す。
[0098]結果を分析する。逆洗なしは、約１４％の赤血球混入をもたらし、２０ｍＬのＰＢＳ逆洗は、赤血球混入を約６．５％に減らし、２×２０ｍＬのＰＢＳ逆洗は、赤血球混入を約３．４％に減らし、３×２０ｍＬのＰＢＳ逆洗は、赤血球混入を約１．８％に減らす。
[0099]逆洗なしの白血球回収は約６１％であり、２０ｍＬ及び２×２０ｍＬのＰＢＳ逆洗については約６６％であり、３×２０ｍＬのＰＢＳ逆洗については約６３％である。
[0100]逆洗なしは、約１９％の血小板混入をもたらし、２０ｍＬのＰＢＳ逆洗も同様である。２×２０ｍＬのＰＢＳ逆洗は、血小板混入を約１３％に減らし、３×２０ｍＬのＰＢＳ逆洗は、血小板混入を約６％に減らす。
[0101]ＰＢＳ／デキストランに関して、逆洗なしは、約１４％の赤血球混入、約６９％の白血球回収及び約２２％の血小板混入をもたらす。
[0102]ＰＢＳ／デキストランの使用は、赤血球混入（２０ｍＬのＰＢＳ／デキストランについては約８％；２×２０ｍＬのＰＢＳ／デキストランについては約３％）及び血小板混入（２０ｍＬのＰＢＳ／デキストラン及び２×２０ｍＬのＰＢＳ／デキストランについては約９％）を減らす。しかしながら、ＰＢＳ／デキストランの使用は、逆洗なしと比較して白血球回収を減らす（逆洗なしについては約６９％、２０ｍＬのＰＢＳ／デキストランについては約６６％；２×２０ｍＬのＰＢＳ／デキストランについては約５６％）。
[0103]別の実験では、対照と２×２０ｍＬのＰＢＳ逆洗、４０ｍＬの１回逆洗及び６０ｍＬの１回逆洗の結果を比較すると、３つの逆洗について結果は概して類似しているが（対照と比較して、全て白血球回収の増加、並びに低い赤血球及び血小板混入を示している）、２×２０ｍＬの逆洗は約１８％の赤血球混入をもたらし、他の逆洗は約８％赤血球混入をもたらす（対照についての約２２％と比較して）。
実施例７
[0104]この実施例は、本発明の実施形態により白血球を回収している間のＤＭＳＯ濃度の減少を示している。
[0105]ＥＤＴＡ抗凝固剤を含むバキュテナー（ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ）（登録商標）チューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）中にドナーの血液を収集する。血液を処理してバフィーコートを得て単離する。
[0106]１０％ＤＭＳＯ及び９０％同ドナー血漿を含む凍結保護液を調製、冷却及びバフィーコートと混合する。凍結保護液と混合したバフィーコートの６ｍＬ試料を２つ得る。
[0107]試料を濾過し、この実施例における白血球を、デキストランを含む溶出液ではなくＰＢＳで溶出することを除いて、実施例１に一般的に記載するように白血球を洗浄及び溶出する。
[0108]流入液、流出液及び溶出した白血球細胞の数を数える。さらに、タンパク質濃度の変化は、ＤＭＳＯ濃度の減少と相関するので、最初の総タンパク質濃度を測定し、溶出した白血球含有液中の総タンパク質濃度も測定する。結果は以下の通りである。
Figure 2013126413
[0109]結果は、ＤＭＳＯ濃度が、白血球を回収している間に約９０％減少し得ることを示している。
実施例８
[0110]この実施例は、本発明の実施形態により血小板混入を最小化しながら白血球を精製及び回収することができることを示している。
[0111]実施例１に一般的に記載するように、血液試料を濾過し、装置を使用して白血球を洗浄及び溶出する。
[0112]流入液、流出液及び溶出した白血球及び血小板の数を数える。結果は以下の通りである（ここで、Ｋ＝１０００である）。
Figure 2013126413
実施例９
[0113]この実施例は、本発明の実施形態により白血球を精製及び回収し、閉鎖系を維持しながらの赤血球混入の減少を示している。
[0114]入口ポート２及び出口ポート３、供給バッグ（血液バッグ）４、廃棄物バッグ６、白血球サンプリングバッグ９、洗浄液を含むシリンジ７、溶出液を含むシリンジ８及びクランプ１０〜１４を有するフィルター装置１を示す、この実施例を実施するために使用する系１００を図３に示す。
[0115]フィルター装置は、白血球除去媒体を備えるピュアセル（登録商標）ＰＸＬＡ Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｆｉｌｔｅｒｓ ｆｏｒ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）とする。フィルター装置１の入口ポート２を、管及び「Ｙ」コネクタを通して、血液バッグ４及び白血球サンプリングバッグ９に接続し、装置出口ポート３を「Ｙ」コネクタを通して廃棄物バッグ６につながる管並びにシリンジ７及び８につながる別の「Ｙ」コネクタに接続する。
[0116]流れを制御するために、入口ポートと血液バッグとサンプリングバッグとの間（クランプ１０及び１１）、並びに、出口ポートと廃棄物バッグと洗浄及び溶出シリンジとの間（クランプ１２〜１４）の管にクランプ１０〜１４を置く。全てのクランプは、最初は閉じておく。
[0117]血液バッグは、標準的な血液バンク手順によって、ドナーから収集し、抗凝固剤と混合した血液５０ｍＬを含んでいる。クランプ１０及び１３を開けると、血液は重力によって濾過され、廃棄物バッグ６中に流れ、白血球はフィルター装置１中の白血球除去媒体上に捕捉される。
[0118]クランプ１３を閉じ、クランプ１２を開け、ＰＢＳ２０ｍＬをシリンジ７によって注入し、洗浄液が白血球除去媒体の下流表面及び上流表面を通過し、血液バッグ４中に流れるようにする。クランプ１２を閉じ、クランプ１３を再度開き、洗浄液を重力によってフィルター装置を通し廃棄物バッグ６中に排出させる。
[0119]新しいＰＢＳを使用して洗浄手順をもう一度繰り返す。洗浄液を廃棄物バッグ６中に排出させる。
[0120]クランプ１０及び１３を閉じる。クランプ１１及び１４を開いて、溶出液２４μＬをシリンジ８から注入して、溶出液によってサンプリングバッグ９中に白血球を溶出し、流す。
[0121]結果は、実施例２の結果と同様に、洗浄を使用すると、洗浄なしと比較して赤血球混入が減少したことを示している。さらに、この実施例は、閉鎖系を維持しながら、本方法の実施形態を実施することができることを示している。
[0122]本明細書に引用されている刊行物、特許出願及び特許を含む全ての参考文献は、これによって、各参考文献が参照により組み込まれることが個々に及び明確に示され、本明細書にその全体が示されているのと同程度に、参照により組み込まれる。
[0123]本発明を記載する上で（特に、以下の特許請求の範囲の文脈において）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び同様の指示対象の使用は、本明細書中に特に指示がない又は文脈により明確に否定されない限り、単数及び複数の両方を含むと解釈すべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特に注記しない限り、非限定（ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ）用語（すなわち、「〜を含むがこれに限定されない」を意味する）と解釈すべきである。本明細書の値の範囲の列挙は、本明細書に特に指示しない限り、範囲内に入る各別個の値を個々に指す簡略法として役立つことを意図しているに過ぎず、各別個の値は、本明細書に個々に列挙されているように、本明細書中に組み込まれる。本明細書に記載されている全ての方法は、本明細書に特に指示がない又は文脈により明確に否定されない限り、任意の適当な順で行うことができる。特に主張しない限り、本明細書に提供する任意の及び全ての実施例、又は代表的な言語（例えば、「など」）の使用は、本発明をよりよく明らかにすることを意図しているに過ぎず、本発明の範囲を限定しない。本明細書中のいかなる言語も、本発明の実施に必須のものとしての任意の請求していない要素を示すものとして解釈すべきではない。
[0124]本発明を実施するために本発明者らが知っている最良の形態を含む本発明の好ましい実施形態を本明細書に記載する。これらの好ましい実施形態の変形は、上記記載を読めば当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者がこのような変形を適当な方法で使用すると期待し、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載するのとは別の方法で実施されることを意図している。したがって、本発明は、準拠法により許可されるように、これに添付する特許請求の範囲に列挙する主題の全ての修正及び同等物を含む。さらに、その全ての可能な変形における上記要素の任意の組み合わせは、本明細書に特に指示がない又は文脈により明確に否定されない限り、本発明により包含される。

Claims (16)

  1. （ａ）白血球を含む体液又は白血球を含む凍結保護液を上流表面及び下流表面を有する多孔性白血球除去媒体に通過させるステップであって、前記液が前記上流表面から前記下流表面まで通過し、白血球が前記白血球除去媒体によって保持される、ステップと、
    （ｂ）洗浄液を前記下流表面から前記上流表面まで前記白血球除去媒体に通過させるステップと、
    （ｃ）前記洗浄液を重力によって前記上流表面から前記下流表面まで前記白血球除去媒体に通過させるステップと
    を含む、白血球を精製する方法。
  2. 前記体液又は前記凍結保護液を重力によって前記多孔性白血球除去媒体に通過させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記体液又は前記凍結保護液を減圧によって前記多孔性白血球除去媒体に通過させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
  4. 追加の洗浄液を使用して、（ｂ）及び（ｃ）を少なくとも１回繰り返すステップをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記凍結保護液がＤＭＳＯを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記洗浄液を前記下流表面から前記上流表面まで前記白血球除去媒体に通過させるステップが、前記上流表面の上流に減圧を作り出すステップを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記洗浄液を前記下流表面から前記上流表面まで前記白血球除去媒体に通過させるステップが、前記下流表面の下流に陽圧を作り出すステップを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  8. 溶出液を前記下流表面から前記上流表面まで前記白血球除去媒体に通過させることによって、前記白血球除去媒体から白血球を溶出するステップと、前記溶出した白血球を回収するステップとをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記保持されている白血球を溶解するステップをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記溶解した白血球の核酸を処理するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
  11. 前記溶解した白血球の核酸を精製するステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記溶解した白血球の核酸を分析するステップをさらに含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
  13. 前記溶解した白血球の全ＲＮＡを測定するステップを含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記溶解した白血球からｍＲＮＡを除去するステップを含む、請求項１２に記載の方法。
  15. マルチウェル装置を使用して行われ、前記装置が複数のウェルを有し、各ウェルが多孔性白血球除去媒体を有し、別個の部分の体液及び洗浄液が、別個のウェル中の前記白血球除去媒体を通過する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記溶出した白血球を対象に投与するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
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