DE102021106915A1

DE102021106915A1 - Zellkulturkammer und Verfahren zur Kultivierung von Zellen und zur in vitro-Herstellung von Zellschichten und Organmodellen

Info

Publication number: DE102021106915A1
Application number: DE102021106915.7A
Authority: DE
Inventors: Knut Rennert; Martin Raasch; Nancy Blaurock-Möller; Katja Graf; Nader Abdo
Original assignee: Dynamic42 GmbH
Current assignee: Dynamic42 GmbH
Priority date: 2021-03-19
Filing date: 2021-03-19
Publication date: 2022-09-22
Also published as: EP4308680A1; WO2022195124A1; JP2024511944A; CA3212075A1; US20240010993A1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Zellkulturkammer (1) zur in vitro-Herstellung und Kultivierung von Zellschichten und Organmodellen mit zwei übereinander angeordneten und durch eine poröse Membran (8) mit zwei Seitenflächen voneinander getrennten und durchströmbaren ersten und zweiten Kanälen (3. 4), wobei durch die Seitenflächen der Membran (8) jeweils ein Zellsubstrat (9, 10) gebildet ist.Gekennzeichnet ist die Zellkulturkammer (1) dadurch, dass mindestens die Innenwände der ersten und der zweiten Kanäle (3, 4) aus Polybutylenterephtalat (PBT) bestehen.Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Kultivierung von humanen oder tierischen Zellen, insbesondere von Lebersinusoidalen Endothelzellen, allein und in Ko-Kultur mit Hepatozyten und Immunzellen.

Description

Die Erfindung betrifft eine Zellkulturkammer zur Kultivierung von Zellen und zur in vitro-Herstellung von Zellschichten als auch Organmodellen sowie ein Verfahren zur Kultivierung und zum verbesserten Funktionserhalt insbesondere von Lebersinusoidalen Endothelzellen (LSEC) allein als auch in Ko-Kultur mit leberspezifischen Zelltypen.
Aus dem Stand der Technik sind Vorrichtungen, insbesondere Zellkulturkammern, bekannt, die eine in vitro Kultur und Untersuchung von Zellkulturen unter perfundierenden Bedingungen erlauben. Dabei können die jeweiligen Zellkulturen mit Flüssigkeiten oder auch Gas- und Aerosolgemischen umspült bzw. inkubiert und somit Bedingungen simuliert werden, die den physiologischen Bedingungen in vivo sehr nahekommen. Außerdem eignen sich derartige Zellkulturkammern dazu, um Wirkungen und gegebenenfalls auftretende Wechselwirkungen zwischen einer oder mehreren Zellkulturen und einem Medium oder mehreren Medien sowie im Medium enthaltener Testsubstanzen zu untersuchen (z. B. in den Bereichen Pharmakokinetik (PK) und Pharmakodynamik (PD), Absorptions-, Distributions-, Metabolismus, Exkretions- und Toxikologie (ADMET)-Studien, Substanz-Sensitivitätstests und Substanz-Sicherheitstests).
Zellkulturkammern sind beispielsweise in der WO 2015/169287 A1 beschrieben. Diese umfassen zwei Kanäle, die durch eine poröse Membran voneinander getrennt sind. Als Material für solche Zellkulturkammern werden oft Kunststoffe eingesetzt, die biokompatibel sind und sich fertigungstechnisch zudem gut auch in komplexe Formen bringen lassen. Insbesondere sind solche Materialien für die Verarbeitung mittels verschiedener Spritzgusstechniken geeignet. Beispiele solcher Kunststoffe sind Polyurethane (PU), Polyimide, Styrene (SEBS), Polypropylene (PP), Polystyrene (PS), Polycarbonate (PC) und zyklische Polyolefine (COP und COC). Daneben werden Zellkulturkammern aus Polydimethylsiloxanen (PDMS) hergestellt und z. B. für die Kultur komplexer Zell-/ Organmodelle verwendet (z. B. WO 2017/096282 A1 , WO 2019/164962 A1 ). Die Anwendung PDMS-basierter Chips für komplexe Zell-/Organmodelle gestaltet sich jedoch aufwändig, da das PDMS im Gegensatz zu biokompatiblen, spritzgussfähigen Kunststoffen vorher zwingend aktiviert werden muss, um überhaupt für Zellkulturen geeignet zu sein. Dies erfolgt zum Beispiel durch das Einbringen von Aktivierungslösungen in Verbindung mit UV-Bestrahlung und mehreren Waschschritten. Diese Vorabprozeduren sind nicht in jedem Labor beim Endanwender problemlos durchführbar und bergen ein gewisses Fehlerpotential vor dem Start der eigentlichen Zellkultur.
Um die zu untersuchenden Systeme aus Zellkulturen und Medien so wenig wie möglich zu beeinflussen, sollten die Materialien der Zellkulturkammern im Idealfall inert sein. Allerdings ist beispielsweise von dem häufig verwendeten Material PDMS bekannt, dass dieses gegenüber einigen chemischen Verbindungen hohe Bindekapazitäten aufweist (Auner et al., (2019): Chemical-PDMS-binding kinetics and implications for bioavailability in microfluidic devices; Lab Chip 19: 864-874). Derartige Bindekapazitäten können einen schwer abzuschätzenden Einfluss auf Untersuchungen haben, die mit aus PDMS bestehenden Zellkulturkammern durchgeführt werden. So adsorbieren z. B. Substanzen mit einem logP größer 1,8 und einem Hydrogen donor count von 0 stark an PDMS, was eine Wirkstofftestung und die Interpretation der erhaltenen Daten erheblich erschwert. Beispielsweise besitzt die Substanz Propiconazol einen logP von 3,72 und einen sogenannten Hydrogen donor count von 0. Es ist sehr hydrophob und kann in PDMS-Chips nach 24 Stunden nur noch mit weniger als 30% der Ausgangskonzentration im Kulturmedium nachgewiesen werden, da es irreversibel an PDMS bindet (Auner et al. 2019).
Der hier dargelegten Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, eine verbesserte Zellkulturkammer und deren Verwendung vorzuschlagen, mittels denen die aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile reduziert werden.
Die Aufgabe wird mit den Gegenständen der unabhängigen und nebengeordneten Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstände der abhängigen Ansprüche.
Die Aufgabe wird mit einer Zellkulturkammer zur Kultivierung von Zellen und in vitro-Herstellung von Zellschichten und Organmodellen gelöst. Die erfindungsgemäße Zellkulturkammer weist mindestens zwei übereinander angeordnete und durch eine poröse Membran mit zwei Seitenflächen voneinander getrennte und durchströmbare Kanäle auf, wobei durch die Seitenflächen der Membran jeweils ein Zellsubstrat gebildet wird.
Gekennzeichnet ist die Vorrichtung dadurch, dass mindestens die Innenwände des ersten und des zweiten Kanals aus Polybutylenterephthalat (PBT) bestehen.
PBT ist ein Polymer, das zur Herstellung von Produkten verwendet wird, die einer hohen mechanischen Belastung unterliegen und/oder die wiederholt mit heißen Medien in Kontakt gelangen. Typische Verwendungen von PBT sind beispielsweise Gleitlager, Ventilteile, Schrauben, Teile für Haushaltsgeräte wie Kaffeemaschinen, Eierkocher, Toaster oder Haartrockner. PBT ist für die Spritzguss-Verarbeitung sehr gut geeignet.
Dieses für die Verwendung in Zellkulturkammern ungewöhnliche Material zeigte in Versuchen sehr geringe Bindekapazitäten gegenüber einer Reihe von Bestandteilen der verwendeten Medien, so dass ein Einfluss des Materials der Zellkulturkammer auf die in einer solchen Zellkulturkammer erfolgenden Untersuchungen vorteilhaft reduziert werden kann. So haben die Erfinder in Tests zur Wirkstoffadsorption unter anderem mit Propiconazol und Troglitazon gefunden, dass PBT für Wirkstofftestungen von Substanzen bis zum logP von 3,72 (logP Propiconazol: 3,72; logP Troglitazon: 3,60) sehr gut geeignet ist. Nach einer Inkubationsdauer von 24h sind mindestens 80% der Ausgangskonzentration des Propiconazols bzw. des Troglitazons im Kulturmedium nachweisbar (vergleiche 3a, 3b).
Die erfindungsgemäße Zellkulturkammer kann für die Kultivierung von Zellkulturen und Organmodellen sowie für deren Untersuchung (z. B. eine Echtzeit-Beobachtung über optische Lösungen, wie Mikroskopie) verwendet werden. Dabei können die Zellkulturen/Organmodelle mit Medien definierter Zusammensetzung unter ebenfalls bekannten und gegebenenfalls regelbaren Umgebungsbedingungen (z. B. Temperatur, Luftdruck, Flussrate und Scherstress, relative Ausrichtung der Zellkulturkammer, Sauerstoff, pH-Wert) versorgt werden. Vorteilhaft kann die Zellkulturkammer auch zur Kultivierung von wenigstens zwei verschiedenen Zelltypen verwendet werden. Die Kultivierung von wenigstens zwei verschiedenen Zelltypen wird hierin auch als Ko-Kultur oder Ko-Kultivierung bezeichnet. Eine solche Ko-Kultur kann für eine weitere Annäherung der Modellumgebung an in vivo-Bedingungen sorgen. Eine solche Ko-Kultur von wenigstens zwei verschiedenen Zelltypen in der Zellkulturkammer etabliert im Sinne der Erfindung ein Organmodell.
Eine spezifische Verwendung der erfindungsgemäßen Zellkulturkammer besteht darin, sogenannte Lebersinusoidale Endothelzellen (liver sinusoidal endothelial cells; LSEC) zu kultivieren und bei Bedarf zu untersuchen. Vorteilhaft können die LSEC in der Zellkulturkammer auch in Ko-Kultur mit weiteren Leberzellen, wie insbesondere Hepatozyten, Kupffer-Zellen/Makrophagen und/oder Stellat-Zellen, kultiviert werden. LSEC, allein und in Ko-Kultur mit weiteren Leberzellen, sind ein wichtiges Testsystem für die Untersuchung einer Vielzahl von Funktionen und Wechselwirkungen der Leber als einem der zentralen Stoffwechselorgane des Körpers, insbesondere von Säugetieren. Allerdings ist die Kultivierung dieser LSEC allein als auch in Ko-Kultur mit weiteren Leberzellen sehr anspruchsvoll. Es soll nachfolgend ein kurzer Überblick gegeben werden.

Lebersinusoidale Endothelzellen sind spezialisierte Endothelzellen der Leber, die sich durch das Fehlen einer ausgeprägten Basalmembran und das Vorhandensein kleiner offener Poren, Fenestrae genannt, auszeichnen. Die einzigartige durchlässige Struktur der LSEC ermöglicht dem Blutplasma den freien Zugang zum zwischen den LSEC und den Hepatozyten befindlichen Disse-Raum. Dadurch können Hepatozyten kleine Moleküle, z. B. Nährstoffe, austauschen, ohne dass ein direkter Kontakt mit dem Blutstrom besteht. Zudem übernehmen LSEC im Körper spezifische Funktionen, wie die sogenannte Clearance von Makromolekülen, die Produktion von Gerinnungsfaktoren und das Adhärieren von Immunzellen, z. B. bei Leberschädigung. Weiterhin zeichnen diese sich durch spezifische Marker, wie beispielsweise Faktor VIII, Stabilin-2, LSECtin und CD32b (siehe Tabelle 1), aus. Es wird vermutet, dass LSEC direkt an der medikamenteninduzierten Lebertoxizität beteiligt sind, weshalb sie interessant für tiefergehende Wirkstoff-Testungen sind. Tabelle 1: Bekannte Lebersinusoidale Endothelzell-Marker und deren Funktion

Marker	Bezeichnung	Funktion	Nachweismethode
CD31 (PECAM-1)	Thrombozyten-Endothelzellen-Adhäsionsmolekül	Steuerung der Leukozyten-Transmigration	Immunfluoreszenz (IF), Durchflusszytometrie, Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)
CD32b	FcgRIlb	Inhibitorischer Rezeptor für IgG	Immunhistochemie (IHC), IF Western Blotting (WB), FACS
CD206	Mannose-Rezeptor	Phagozytose von Pathogenen	IF, WB
Faktor VIII	Blutgerinnungsfaktor VIII	Unterstützung der Blutgerinnung, Ko-Faktor für Faktor IXa	IF
FcRn	Neonataler IgG Fc Rezeptor	Recycling von IgG und Serum Albumin	IF
LSECtin (CLEC4G)	Sinusoidales Endothelzellen C-Typ Lectin	Lectin-Rezeptor, Pathogen-Bindungsfaktor	IF
L-SIGN (CD209L oder CLEC4M)	Leber/Lymphknotenspezifisches, intrazelluläres Adhäsionsmolekül 3-bindendes Nicht-Integrin	Typ II-integrales Membranprotein, Pathogen-Erkennungsrezeptor	IHC, IF FACS
LYVE-1	endothelialer Hyaluronsäurerezeptor-1	nicht aufgeklärt, mögliche Funktion: Hyaluronsäure Transport und turnover, Förderung der HA Lokalisation auf Endotheloberfläche	IHC, IF FACS
MHC I	HLA-A,-B, -C	Bindet und präsentiert Peptide von Proteasome (intrazellulär) abgebauten Proteinen, Präsentieren der Peptide für zytotoxische T Zellen	IF, FACS
MHC II	HLA-DR-DP-DQ	Präsentation lysosomal abgebauter extrazellulärer Pathogene für T Helferzellen	IF, FACS
Stabilin-2		Angiogenese, Scavenger-Rezeptor, Lymphozyten Homing, Zelladhäsion	IHC, IF WB
VAP-1	Vaskuläres Adhäsionsprotein-1; AOC3	Lymphozyten-Adhäsionsmolekül, Monoamin-Oxidase	IF
vWF	von Willebrand Faktor	Trägerprotein des Blutgerinnungsfaktor VIII	IF
Fenestrae	Poren mit Durchmessern zwischen 100-150nm, bedecken 20% der LSEC Oberfläche	Clearance von alten Blutbestandteilen	Rasterelektronenmikro skopie (SEM)

Besondere Anforderungen bei der Verwendung der LSEC als Modellsystem sind durch den Umstand bedingt, dass die LSEC gemeinhin nach Isolation innerhalb von wenigen Stunden bis Tagen ihre Funktionalität und spezifischen Marker (siehe Tabelle 1) verlieren. Sie sind dann beispielsweise nicht mehr oder nur noch bedingt zur Überprüfung der Toxizität von Wirkstoffen, z. B. bei der Überprüfung des Beitrages der Immunzellen zur Hepatotoxizität, geeignet. Die Erfindung schlägt Lösungen vor, mittels denen die Funktionalitäten von LSEC allein und in Ko-Kultur mit weiteren leberspezifischen Zelltypen erheblich länger erhalten werden können. Dazu können beispielsweise die Kanäle derart ausgebildet sein, dass in dem ersten Kanal vaskuläre Bedingungen eines Blutgefäßes unter Zuhilfenahme von LSEC nachgebildet werden können. Die LSEC können allein oder in Ko-Kultur mit weiteren Zellen, insbesondere Kupffer-Zellen, kultiviert werden.
Kupffer-Zellen, die residenten Makrophagen der Leber, sind in vivo im hepatischen Sinusoid lokalisiert, wodurch sie eine Überwachungsfunktion ausüben, indem sie die Leber in die Lage versetzen, auf Pathogene und Schäden zu reagieren. Kupffer-Zellen sind in der Lage, eine beispielsweise durch Wirkstoffe hervorgerufene Entzündung oder phänotypische Veränderungen präzise zu regulieren, was zu einer unterschiedlichen Expression und Sekretion von pro- oder anti-entzündlichen Mediatoren (z. B. IL-1β, TNF, IL-6, IL-10) führt. Diese kritische Regulierung der Entzündungsreaktion macht sie zu einem wichtigen Bestandteil von in vitro-Modellen von Lebererkrankungen sowie von in vitro-Screening-Modellen für Medikamententoxizität, die durch entzündungsbedingte Herabregulation von Medikamenten-metabolisierenden Enzymen und/oder Medikamententransportern entsteht. Kupffer-Zellen/Makrophagen spielen dadurch eine essenzielle Rolle bei der Entwicklung von Nebenwirkungen von Substanzen/Wirkstoffen. In der Leber regulieren Kupffer-Zellen/Makrophagen zusammen mit LSEC die Immunantwort. Sie spielen z. B. eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der nichtalkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD) und der Nichtalkoholischen Steatohepatitis (NASH). Es gibt zudem Hinweise darauf, dass Kupffer-Zellen bei einigen Medikamenten die Leber vor Wirkstoff-induzierter Leberschädigung (Drug induced liver injury, DILI) schützen, indem sie hepatoprotektive Zytokine, einschließlich IL-10 und IL-6, freisetzen. Bei anderen Medikamenten wurde gezeigt, dass Kupffer-Zellen durch die Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen, einschließlich TNF, IL-1β und IL-6, die je nach Kontext entweder schützend oder schädigend wirken können, wesentlich zur DILI beitragen. In einigen Fällen kann die Neigung eines Medikaments, DILI zu induzieren, in vitro nur dann aufgedeckt werden, wenn Kupffer-Zellen vorhanden und auf eine proinflammatorische Reaktion ausgerichtet sind. Die erfindungsgemäße Zellkulturkammer bietet den großen Vorteil, dass Kupffer-Zellen zusammen mit LSEC unter physiologischen Bedingungen ko-kultiviert werden können. Gezielte in vitro DILI-Tests unter körpernahen Konditionen werden somit ermöglicht.
In dem zweiten Kanal können hepatische Bedingungen nachgebildet werden. Die hepatischen Bedingungen können beispielsweise unter Zuhilfenahme von Hepatozyten erzeugt werden. LSEC und Hepatozyten in Ko-Kultur können ein Organmodell einer Säugetier-Leber bilden. Die Hepatozyten können allein oder in Ko-Kultur mit weiteren Zellen, insbesondere Stellat-Zellen, kultiviert werden.
Stellat-Zellen (HSCs) sind im „ruhenden“ Zustand als Speicher von Vitamin A und als antigen-präsentierende Zellen in der Leber beschrieben. Eine Aktivierung der Stellat-Zellen ist der kritische Schritt zur Entwicklung einer Leberfibrose. Er geht einher mit dem Verlust der Vitamin A Speicherung und führt unter der Stimulation von zellulären Mediatoren, Zytokinen und Chemokinen aus verletzten oder entzündlichen Zellen, zur Transdifferentiation. Im Anfangsstadium der Fibrogenese verwandeln sich HSCs in proliferative und kontraktile Myofibroblasten. Diese beschleunigen die Sekretion von extrazellulärer Matrix und vermindern den Abbau der extrazellulären Matrixelemente, was schließlich zur Fibrogenese führt. Zusammen mit den Kupffer-Zellen leisten sie einen signifikanten Beitrag zur Entwicklung von NAFLD, NASH und Leberfibrose. Die Ko-Kultur von Stellat-Zellen mittels der erfindungsgemäßen Zellkulturkammer kann beispielsweise das Studium der Mechanismen der Fibrogenese ermöglichen, insbesondere durch Tests von potentiell beteiligten Mediatoren oder Signalmolekülen.
Die poröse Membran zwischen dem ersten und dem zweiten Kanal wird vorteilhaft mit einer Dicke aus einem Bereich von 10 bis 20 µm, insbesondere aus einem Bereich von 10 bis 13 µm, ausgewählt. Beispielsweise weist die Membran eine Dicke von 12 µm auf. Eine Membrandicke oberhalb von 20-50 µm erschwert den Stoff- und löslichen Faktor-Austausch zwischen der vaskulären und der hepatischen Kammer. Zudem wird ein Einwandern von Immunzellen in das Lebergewebe durch hohe Membrandicken erschwert und beeinflusst die Ergebnisse aus Wirkstofftestungen negativ. Die Membran kann bevorzugt aus einem rigiden Material, wie Polyethylenterephtalat (PET), bestehen. Alternativ kann die Membran auch aus einem flexiblen Material, wie einem thermoplastischen Elastomer (TPE), bestehen. Die Porengröße der Membran liegt vorteilhaft in einem Bereich von 0,4 µm bis 8 µm. Es hat sich gezeigt, dass Porengrößen von mehr als 3 µm, beispielsweise 5 µm, 6 µm, 7 µm oder 8 µm den Austausch an löslichen Faktoren und das Einwandern von Immunzellen in den hepatischen Kanal erleichtern. Die Membran kann eine zusätzliche Oberflächenstrukturierung aufweisen, die beispielsweise durch Laserstrukturieren erzeugt werden kann. Eine solche Strukturierung kann vorteilhaft zur Manipulation von Zellwachstum und/oder zur Manipulation der strömungsmechanischen Eigenschaften der Membran (beispielsweise um vorbestimmte Flussprofile zu etablieren) eingestellt sein.
Ferner können die Membran und/oder die Kanäle beispielsweise mit Sauerstoffplasma plasmabehandelt sein. Unpolare Werkstoffe, v. a. Kunststoffe mit langen Polymerketten, besitzen eine sehr niedrige Oberflächenenergie (i.d.R. 20-40 mN/m; zum Vergleich PDMS nur 20 mN/m), die nicht mit der hohen Oberflächenspannung von wässrigen Flüssigkeiten, wie sie regulär in der Zellkultur vorkommen, übereinstimmt. Polare Werkstoffe wie zum Beispiel PET (44 mN/m) und PBT (48 mN/m) liegen leicht darüber. Die Oberflächenenergie von Kunststoffen besteht aus einem dispersen und einem polaren Anteil. Vor allem der polare Anteil der Oberflächenenergie ist sehr gering. Durch die Plasmabehandlung wird die Oberflächenenergie bedeutend heraufgesetzt (insgesamt bis zu 80-90 mN/m), vor allem deren polarer Anteil. Zusätzlich werden die Oberflächen von eventuell vorhandenen Trennmitteln befreit und funktionalisiert. Bei diesem Prozess entstehen durch die Behandlung mit Sauerstoffplasma reaktive Sauerstoffspezies, welche Polymerbindungen aufbrechen und angreifbar für chemisch-biologische Wechselwirkungen machen oder zusätzliche Hydroxygruppen in das PBT-Polymer einfügen. Hierdurch wird die Membran- und/oder Kanal-Oberfläche hydrophiler, was in einer verbesserten Beschichtbarkeit mit biologischen Komponenten (wie Kollagen, Fibronektin, Laminin), einer verbesserten Zelladhäsion und einer deutlichen Reduktion der Adsorption von hydrophoben Substanzen resultiert.
Der Plasmabehandlung kann ein Reinigungsschritt vorgelagert sein, indem die Zellkulturkammer für beispielsweise 10 min in Isopropanol oder Ethanol inkubiert wird. Die eigentliche Plasmabehandlung der getrockneten Kammern kann insbesondere im Niederdruckplasmaverfahren erfolgen. Dafür werden die (gereinigten) Zellkulturkammern in eine Vakuumkammer aus z. B. Borosilikatglas gestellt und bei Niederdruck von <100 Pa (< 1 mbar) für bis zu 20 min mit Sauerstoffplasma behandelt. Das Sauerstoffplasma kann durch Kurzwellenanregung mit einem Hochfrequenzgenerator bei 13,56 MHz und bis zu 200 W Leistung erzeugt werden.
Der erste und der zweite Kanal sind in einem vorteilhaften Betriebszustand der Zellkulturkammer übereinander angeordnet. Das bedeutet, dass der erste Kanal bezüglich der Schwerkraftwirkung oberhalb des zweiten Kanals angeordnet ist. Eine solche Anordnung erleichtert beispielsweise die Beobachtung der Zellen mittels eines inversen Mikroskops, sodass oberhalb der Zellkulturkammer der erforderliche Freiraum zum Manipulieren der Zellkulturkammer erhalten bleibt. Inbegriffen in dieses Verständnis sind auch Ausgestaltungen der Zellkulturkammer, bei denen der erste Kanal bis zu 60° gegenüber der Wirkrichtung der Schwerkraft geneigt über dem zweiten Kanal angeordnet ist, was beispielsweise durch eine schräge Anordnung der Membran zwischen dem ersten und zweiten Kanal erreicht werden kann, sowie Betriebslagen der Zellkulturkammer, die bis zu 60° gegenüber der Wirkrichtung der Schwerkraft geneigt sind.
Die Erfindung stellt ein Modellsystem bereit, in dem unter spezifischen, körperähnlichen Kulturbedingungen insbesondere humane LSEC, allein und in Ko-Kultur mit weiteren leberspezifischen Zelltypen, für mindestens 4 Tage, insbesondere für bis zu 14 Tage, sowohl ihre Marker als auch ihre funktionalen Eigenschaften erhalten bleiben. So ist die Expression der folgenden LSEC-Marker im Modellsystem bis zu 14 Tage nachweisbar: CD31, CD206, vWf, Faktor VIII, LSECtin, L-SIGN, LYVE-1, Stabilin-2, VAP-1, FcRn, MHC I und MHC II.
Dieser Fortschritt wird neben der Materialbeschaffenheit des PBT durch weitere optionale Verbesserungen erreicht. So kann in einer Ausführung der erfindungsgemäßen Vorrichtung mindestens eine Seitenfläche der Membran mit einem Gemisch beschichtet sein, welches Fibronektin und/oder Kollagen I und/oder Kollagen IV enthält. Der Begriff „beschichtet“ schließt ein, dass das Fibronektin und/oder Kollagen I und/oder Kollagen IV chemisch (kovalent oder nichtkovalent) an die Membran gebunden ist/sind. Dabei liegt das Fibronektin in einer Konzentration von 5 µg/ml, das Kollagen I in einer Konzentration von 100 bis 300 µg/ml und das Kollagen IV in einer Konzentration von 100 bis 300 µg/ml vor. Die Beschichtung kann in weiteren Ausführungsbeispielen auf beiden Seitenflächen der Membran vorhanden sein. Für bestimmte Verwendungen kann es vorteilhaft sein, wenn kein Kollagen I enthalten ist, da dieses beispielsweise bei Fibrose vermehrt in der Leber gebildet wird und damit keinen typischen physiologischen Zustand repräsentiert.
Es ist in weiteren Ausführungen der Erfindung möglich, dass an mindestens eine der Seitenflächen der Membran Dextran-Ketten gekoppelt sind, an denen Fibronektin-Peptide oder RGD-Peptide oder Vitronectin-Peptide oder Bone-Sialoprotein-Peptide mit RGD-Sequenz (Argenin-Glycin-Asparaginsäure) gebunden sind. Die RGD-Sequenz dient insbesondere der Vermittlung der Zelladhäsion.
Es ist auch möglich, dass an mindestens eine der Seitenflächen der Membran Heparin-Ketten gekoppelt sind, an denen Fibronektin-Peptide oder FGF-Peptide mit RGD-Sequenz oder RGD-Peptide allein oder Vitronectin-Peptide mit RGD-Sequenz oder Bone-Sialoprotein-Peptide mit RGD-Sequenz gebunden sind. FGF-Peptide sind Peptide des Fibroblasten Wachstumsfaktors (fibroblast growth factor).
Liegt eine zuvor genannte Beschichtung der Membran vor, können die LSEC folgende Marker bis zu 14 Tage im Modellsystem aufweisen: CD32b, CD31, vWf, Faktor VIII, LSECtin, L-SIGN, Stabilin-2, VAP-1, LYVE-1, FcRn, MHC I und MHC II.
Die erfindungsgemäße Zellkulturkammer kann in einem Verfahren zur Kultivierung von humanen oder tierischen Zellen, wie beispielsweise Zellen der Maus, der Ratte, des Schweins oder des Hunds, etc. verwendet werden.
Bei diesem Verfahren wird durch mindestens einen der Kanäle permanent oder temporär ein Kulturmedium gefördert.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Zellen vorzugsweise auf einer apikalen Seite der Membran kultiviert. In dem hierin gemeinten Sinn bedeutet „apikal“, dass die Zellkultur von dem Kulturmedium auf der Seite umspült wird, die der Membran zugewandt ist. Insbesondere ist dies die nach oben, also der Erdanziehungskraft entgegen, gerichtete Seitenfläche der Membran. Apikal kultivierte Zellen wachsen also auf der Membranseite, die vom Kulturmedium umspült wird.
Das Kulturmedium kann jedoch auch basolateral mit der Zellkultur in Kontakt gebracht werden. Ein basolateraler Kontakt mit apikal kultivierten Zellen liegt demnach bei einem Kontakt via der porösen Membran vor.
Besonders bevorzugt kann die erfindungsgemäße Zellkulturkammer in einem Verfahren zur Kultivierung von LSEC verwendet werden. Die LSEC können allein oder in Ko-Kultur mit weiteren leberspezifischen Zelltypen kultiviert werden; eine Ko-Kultur mit weiteren leberspezifischen Zelltypen wird hierin als Lebermodell bezeichnet.
Für die Kultur von LSEC wird ein bevorzugt apikal in dem ersten Kanal anliegendes vaskulares Kulturmedium (LSEC Medium; ECM) verwendet. Dieses kann ein basales Endothelzell-Grundmedium, wie M199 oder MCDB, umfassen, in dem 0-20% humanes Serum und/oder 0-20% FCS (fetal calf serum), 0-10 ng/ml HGF (hepatocyte growth factor), 0-10 ng/ml EGF (epidermal growth factor), 0-10 ng/ml bFGF (basic fibroblast growth factor), 0-20 ng/ml IGF-I, 0-5 ng/ml VEGF (vascular endothelial growth factor), 0-50 µM Hydrocortison, 0-5 mM Ascorbinsäure und/oder 0-4% ITS (Insulin/Transferrin/Selenium) und Heparin (0-5U/ml) enthalten sind. Insbesondere zur Ko-Kultur mit Hepatozyten und/oder Stellat-Zellen kann ein bevorzugt basolateral in dem zweiten Kanal anliegendes hepatisches Grundmedium, wie Williams E Medium, genutzt werden, in dem 0-20% FCS (fetal calf serum) und/oder 0-20% humanes Serum, 0-5 mM -Glutamin oder Glutamax, 0-10 µg/ml Insulin, 0-4% MCB, 0-5 µM Dexamethason, 0-50 µM Hydrocortison und 0-5% DMSO enthalten sind. Das hepatische Kulturmedium kann mit Hepatozyten und/oder Stellat-Zellen angeimpft sein. Vorteilhaft kann das Kulturmedium frei von Zusätzen tierischen Ursprungs hergestellt sein.
Es hat sich erwiesen, dass die Funktionalität einer LSEC-Zellkultur verlängert werden kann, wenn diese in Ko-Kultur mit weiteren Zellen (wiederum sowohl apikal als auch basolateral) kultiviert wird. Dabei wirken sich insbesondere ko-kultivierte Zellen, wie Hepatozyten, Stellat-Zellen und Immunzellen, wie z. B. Kupffer-Zellen/ Makrophagen, im Vergleich zu Zellkulturen ohne Ko-Kultur vorteilhaft auf die Erhaltung der Funktionalitäten aus. Vorteilhaft ist hier, wenn die genutzten Zellen zum Aufbau des Lebermodells den identischen HLA (human leukocyte antigen)-Status aufweisen.
Vorteilhaft wird die Scherrate bzw. Flussrate des Kulturmediums in mindestens einem der Kanäle so gewählt, dass diese vergleichbar mit den im Körper auftretenden Scherraten ist. Beispielsweise werden in dem ersten Kanal vaskuläre Bedingungen (eines Blutgefäßes) nachgebildet. In dem zweiten Kanal können hepatische Bedingungen nachgebildet werden. Dies wird beispielsweise erreicht, indem durch den ersten Kanal ein apikales Kulturmedium mit einer am Lebersinusoid angelegten Scherrate ausgewählt aus einem Bereich von >0,2 bis 1 dyn/cm², bevorzugt zwischen 0,5 und 0,8 dyn/cm² und durch den zweiten Kanal ein basolaterales Kulturmedium mit einer Scherrate ausgewählt aus einem Bereich von größer Null bis 0,2 dyn/cm² gefördert wird. Insbesondere bei einer Zellkultur mit LSEC wird die Scherrate in dem ersten Kanal besonders bevorzugt auf etwa 0,7 dyn/cm² eingestellt, was den physiologischen vaskulären Bedingungen in der Leber entspricht. Die in dem zweiten Kanal eingestellte Scherrate vermeidet weitgehend ein ungewolltes Absetzen von z. B. transmigrierten Immunzellen in Richtung der Schwerkraftwirkung weg von der Membran und die Anhäufung von Stoffwechselendprodukten der Hepatozyten. Die Abmaße der Kanäle können diesbezüglich angepasst und daher unterschiedlich sein. Beispielsweise kann der zweite Kanal eine geringere Breite und/oder eine größere Höhe als der erste Kanal aufweisen.
Der Sauerstoffgehalt im Kulturmedium, insbesondere im apikalen Medium, wird vorteilhaft auf einen Wert von 15% am Kanal-Einlass und 3 bis 5% am Kanal-Auslass eingestellt. Die Verwendung der erfindungsgemäßen Zellkulturkammer sowie das verwendete Kulturmedium, die angegebenen Scherraten, eine Verschaltung zweier Kanäle einer Zellkulturkammer oder mehrerer Zellkulturkammern miteinander und gegebenenfalls die Einstellung von Hypoxie-Bedingungen z. B. durch Anordnung der Zellkulturkammer(n) in einem Hypoxie-Schrank, erlauben die Einstellung der genannten Sauerstoffgehalte.
Die erfindungsgemäße Zellkulturkammer kann in weiteren Verwendungen beispielsweise zur Kultivierung von Darmzellen, von Lungenzellen und/oder von Lungenbläschenzellen und in vitro-Herstellung von Zellschichten bzw. Organmodellen dieser Zelltypen benutzt werden.
Zur Etablierung eines Lebermodells kann die Membran in einem vorgelagerten Schritt mit Proteinen der extrazellulären Matrix beschichtet und apikal mit LSEC, bevorzugt in Ko-Kultur mit Kupffer-Zellen besiedelt werden. Insbesondere basolateral kann die Membran alternativ oder zusätzlich mit Hepatozyten, vorteilhaft in Ko-Kultur mit Stellat-Zellen, besiedelt werden. Ferner können dem apikalen Kulturmedium oder den Kulturmedien Immunzellen, wie beispielsweise Monozyten, Makrophagen, T-Zellen, B-Zellen, Neutrophile, beigegeben werden. Dadurch ist es möglich, definierte Immunzell-Populationen über die apikale Seite zu perfundieren und den Einfluss dieser Immunzellen auf das Lebermodell zu überprüfen.
Zur Etablierung eines Darmmodells kann die Membran in einem vorgelagerten Schritt mit Proteinen der extrazellulären Matrix beschichtet und bevorzugt apikal mit intestinalen Endothelzellen, bevorzugt in Ko-Kultur mit Immunzellen, besiedelt werden. Insbesondere basolateral kann die Membran alternativ oder zusätzlich mit Darm-Epithel- und/oder mit glatten Muskelzellen und/oder Immunzellen besiedelt werden. Ferner können dem Kulturmedium oder den Kulturmedien Immunzellen, wie beispielsweise Monozyten, Makrophagen, T-Zellen, B-Zellen, Neutrophile, beigegeben werden. Die Darmmodelle können apikal wie basolateral mit Scherraten von 0-3 dyn/cm² kultiviert werden. Zudem können dem basolateralen Kulturmedium Mikroorganismen (z. B. Teile des Mikrobioms) zugesetzt werden, um beispielsweise den Einfluss solcher Mikroorganismen auf das Darmmodell zu untersuchen.
Zur Etablierung eines Lungenmodells kann die Membran in einem vorgelagerten Schritt mit Proteinen der extrazellulären Matrix beschichtet und bevorzugt apikal mit pulmonalen Epithelzellen (z. B. small airway-Epithelzellen, alveolare Epithelzellen), bevorzugt in Ko-Kultur mit Immunzellen, besiedelt werden. Insbesondere basolateral kann die Membran mit pulmonalen Endothelzellen als auch in apikal/basolateral vertauschter Anordnung besiedelt werden. Ferner können dem Kulturmedium oder den Kulturmedien Immunzellen, wie beispielsweise Monozyten, Makrophagen, T-Zellen, B-Zellen, Neutrophile, beigegeben werden. Die Lungenmodelle können apikal wie basolateral mit Scherraten von 0-2 dyn/cm² kultiviert werden. Zudem können die Epithelzellen nach Erreichen hoher Konfluenz ohne Medium kultiviert werden, um eine Air-Liquid-Interphase, wie im Körper, auszubilden.
Um physiologische Wirkungen von Wirkstoffen oder Signalmolekülen oder Mikroorganismen etc. auf die kultivierten Zellen, Zellschichten oder Organmodelle mittels einer erfindungsgemäßen Zellkulturkammer zu untersuchen, können die kultivierten Zellen, Zellschichten oder Organmodelle mit Wirkstoffen oder Molekülen oder Mikroorganismen versetzt werden, indem diese in die Zellkulturkammer eingespült werden. Beispielsweise kann mit Erreichen eines gewünschten Besiedlungsstatus ein zu untersuchender Wirkstoff beziehungsweise mehrere zu untersuchende Wirkstoffe dem Kulturmedium oder einem anderen flüssigem Trägermedium in jeweils gewünschten Dosierungen apikal oder basolateral zugesetzt und die Zellkultur damit umspült (perfundiert) werden. Als Messwerte können beispielsweise Eigenschaften des aus dem jeweiligen Kanal austretenden Kulturmediums erfasst werden. Bei geeigneter Gestaltung der Zellkulturkammer und deren optischer Eigenschaften können mikroskopische Untersuchungen, beispielsweise direkte und/oder fluoreszenzbasierte Beobachtungen der adhärent an der Membran wachsenden Zellen und/oder der ko-kultivierten Zellen durchgeführt werden. Ebenso kann mit Signalmolekülen oder Mikroorganismen verfahren werden.
Ein großer Vorteil der Erfindung ist die Möglichkeit der Nachgestaltung unterschiedlicher Bedingungen in den Kanälen. Insbesondere können in einem der beiden Kanäle die Bedingungen eines Blutgefäßes nachgebildet werden, was als vaskuläre Bedingungen bezeichnet werden kann. In Bezug auf die Membran kann dieser Kanal als vaskuläre Seite bezeichnet werden. In dem anderen Kanal können beispielsweise die Bedingungen in einem Lebergewebe nachempfunden werden, was als hepatische Bedingungen beziehungsweise in Bezug auf die Membran als hepatische Seite bezeichnet werden kann. Auf der hepatischen Seite, die insbesondere durch den unteren Kanal gegeben ist, wird mittels des Kulturmediums eine zwar geringe, aber hinreichend große Scherrate erzeugt, die ein unerwünschtes Absetzen von Zellen weg von der Membran erheblich reduziert. Die Kanäle der erfindungsgemäßen Zellkulturkammer weisen außerdem aufgrund ihrer Materialeigenschaften eine geringe Adsorption von Verbindungen auf, die in einem Kulturmedium enthalten sind. Vorteilhaft werden dadurch die Ergebnisse von Experimenten wenig beeinflusst.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand eines Ausführungsbeispiels sowie anhand von Grafiken zu durchgeführten Versuchen noch weiter veranschaulicht. Dabei zeigen:

1 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Zellkulturkammer mit zwei Kanälen und einer in Ko-Kultur besiedelten Membran;
2 eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Zellkulturkammer mit vier Kanälen in einer Explosionsdarstellung;
3a eine grafische Darstellung der Ergebnisse eines Versuchs zur Adsorptionswirkung von PBT in zwei erfindungsgemäßen Zellkulturkammern;
3b eine grafische Darstellung der Ergebnisse eines weiteren Versuchs zur Adsorptionswirkung von PBT in zwei erfindungsgemäßen Zellkulturkammern;
4 eine grafische Darstellung der Ergebnisse eines Versuchs zur Freisetzung von LDH (Lactatdehydrogenase) über einen Zeitraum von 10 beziehungsweise 14 Tagen im Vergleich mit einer erfindungsgemäßen Zellkulturkammer und den Bedingungen der Zelllyse;
5 eine grafische Darstellung der Ergebnisse eines Versuchs zur Freisetzung von ASAT (Aspartat-Aminotransferase) über einen Zeitraum von 10 beziehungsweise 14 Tagen im Vergleich mit einer erfindungsgemäßen Zellkulturkammer und den Bedingungen der Zelllyse;
6 eine grafische Darstellung der Ergebnisse eines Versuchs zum Nachweis der Synthese und Freisetzung von Albumin über einen Zeitraum von 10 beziehungsweise 14 Tagen im Vergleich mit einer erfindungsgemäßen Zellkulturkammer und den Bedingungen der Zelllyse;
7 eine grafische Darstellung der Ergebnisse eines Versuchs zum Nachweis der Synthese und Freisetzung von Harnstoff über einen Zeitraum von 10 beziehungsweise 14 Tagen im Vergleich mit einer erfindungsgemäßen Zellkulturkammer und den Bedingungen der Zelllyse;
8 eine grafische Darstellung der Ergebnisse eines Versuchs zum Nachweis von Interleukin-1 beta über einen Zeitraum von 10 beziehungsweise 14 Tagen im Vergleich mit einer Kultivierung in einer erfindungsgemäßen Zellkulturkammer und unter Zugabe von LPS;
9 eine grafische Darstellung der Ergebnisse eines Versuchs zum Nachweis von Interleukin-10 über einen Zeitraum von 10 beziehungsweise 14 Tagen im Vergleich mit einer Kultivierung in einer erfindungsgemäßen Zellkulturkammer und unter Zugabe von LPS; und
10 eine grafische Darstellung der Ergebnisse eines Versuchs zum Nachweis von Interleukin-6 über einen Zeitraum von 10 beziehungsweise 14 Tagen im Vergleich mit einer Kultivierung in einer erfindungsgemäßen Zellkulturkammer und unter Zugabe von LPS.

Eine erfindungsgemäße Zellkulturkammer 1 gemäß der 1 umfasst ein Gehäuse 2, das mindestens in den Bereichen eines ersten Kanals 3 und eines zweiten Kanals 4 aus Polybutylenterephthalat (PBT) besteht. Jeder der Kanäle 3, 4 weist einen Einlass 5 und einen Auslass 6 auf, die dem Zustrom beziehungsweise dem Ableiten eines Kulturmediums 7 in beziehungsweise aus den jeweiligen Kanälen 3, 4 dienen. Der erste Kanal 3 und der zweite Kanal 4 sind voneinander durch eine poröse Membran 8 getrennt. In dem ersten Kanal 3, der zugleich einen apikalen Bereich der Zellkulturkammer 1 darstellt, ist eine Zellkultur 9, beispielsweise aus Lebersinusoidalen Endothelzellen, auf einer dem ersten Kanal 3 zugewandten Seitenfläche der Membran 8, die als apikale Seite 8.1 der Membran bezeichnet wird, angesiedelt.
Auf einer dem zweiten Kanal 4 zugewandten Seitenfläche der Membran 8, die als basolaterale Seite 8.2 der Membran bezeichnet wird, ist eine optional vorhandene Ko-Kultur 10, die Hepatozyten enthält, angesiedelt. Die Membran 8 ist beispielsweise 12 µm dick und besteht aus PET.
Die Kanäle 3, 4 weisen jeweils eine Breite B, quer dazu eine Höhe H und eine nicht bezeichnete Tiefe senkrecht zur Zeichnungsebene auf.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung werden in dem relativ zur Schwerkraftwirkung oben angeordneten ersten Kanal 3 vaskuläre Bedingungen beispielsweise eines Blutgefäßes nachgebildet, während in dem zweiten Kanal 4 hepatische Bedingungen nachgestellt werden.
Die Scherrate im Modell wird für die vaskuläre Seite und die hepatische Seite eingestellt, indem durch den ersten Kanal 3 ein apikales Kulturmedium 7a mit einer Scherrate von 0,7 dyn/cm² und durch den zweiten Kanal 4 ein basolaterales Kulturmedium 7b mit einer Scherrate von >0 bis 0,2 dyn/cm² gefördert wird.
Die Beschichtung der Membran 8 besteht im Ausführungsbeispiel aus einem Gemisch von Fibronektin/ Kollagen I und Kollagen IV (Fibronektin 5µg/ml, Kollagen I 0,3mg/ml, Kollagen IV 100µg/ml). Eine Kultivierung der Zellkulturen 9, 10 erfolgt in zelltyp- und spezies-spezifischen Medien mit spezifischen Formulierungen. Das apikale Kulturmedium 7a des ersten Kanals 4 (ECM) enthält 10% humanes Serum sowie Wachstumsfaktoren, Antioxidantien und ITS in jeweils geeigneten und dem Fachmann geläufigen Konzentrationen. Das basolaterale Medium 7b des zweiten Kanals 4 enthält Wachstumsfaktoren, ein Kollagen IV/ I Gemisch sowie ITS jeweils in geeigneten und dem Fachmann geläufigen Konzentrationen.
Die Zugabe von spezifischen Medien von basolateraler Seite kann durch die Kultur von Hepatozyten und ggf. Stellat-Zellen in zellspezifischem Medium 7b in dem zweiten Kanal 4 ersetzt werden. Zudem haben auf apikaler Seite (erster Kanal 3) Makrophagen einen positiven Einfluss auf die Eigenschaften/Funktionalität der Zellkultur 9.
Nicht näher dargestellt sind eine Pumpeinheit je Kanal 3, 4 zur gesteuerten Förderung des jeweiligen Kulturmediums 7, 7a, 7b und eine Steuerung zur Ansteuerung der Pumpeinheiten. Zusätzlich können verschiedene Sensoren (z. B. für Sauerstoff, pH-Wert, Laktat, TEER) vorhanden sein, mittels deren Messwerten die Zellkulturen 9 und 10 untersucht werden können. Die Sensoren können mit der Steuereinheit verbunden sein, um beispielsweise die Zusammensetzung und/oder die Scherrate bzw. Flussrate des jeweiligen Kulturmediums 7, 7a, 7b in Abhängigkeit der erfassten Messwerte zu regulieren.
Ein zweites Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Zellkulturkammer 1 mit zwei ersten Kanälen 3 und zwei zweiten Kanälen 4 (nicht sichtbar) ist in 2 in einer Explosionsdarstellung gezeigt. Das Gehäuse 2 wird aus einer oberen Abdeckung 2.1, einer unteren Abdeckung 2.2 und einem Mittelstück 2.3 in Form eines Spritzgussformstücks gebildet. Das Mittelstück 2.3 enthält die Ausformungen der Kanäle 3 und 4, die jeweils durch eine eingelegte Membran 8 voneinander getrennt werden.
Die 3a und 3b zeigen Ergebnisse von Versuchen zur Adsorptionswirkung von PBT in zwei erfindungsgemäßen Zellkulturkammern 1 unterschiedlicher Ausführung. Mit der Bezeichnung „Chip PBT-BC1“ ist eine erste Ausführung der Zellkulturkammer 1 und mit „Chip PBT-BC2“ eine zweite Ausführung bezeichnet. Die erste Ausführung weist für den ersten Kanal 3 eine Breite B von 34,6 mm, eine Tiefe T von 6,56 mm und eine Höhe H von 0,7 mm auf. Der zweite Kanal 4 besitzt die Maße 44,8 mm, 3,6 mm und 0,8 mm (B/T/H). Die entsprechenden Maße für die zweite Ausführung „Chip PBT-BC2“ der Zellkulturkammer 1 betragen 34,6 mm, 8,06 mm und 0,7 mm (B/T/H) für den ersten Kanal 3 und 49,4 mm, 5,61 mm und 1,0 mm (B/T/H) für den zweiten Kanal 4.
Die Grafik der 3a zeigt den prozentualen Anteil (RTC - ratio to control) von im Kulturmedium 7 verbliebenen und nachweisbaren Propiconazol (logP 3,72) nach einer Inkubationszeit von 4 Stunden und nach 24 Stunden. Im Vergleich ist eine Kontrolle in Form einer Stammlösung (100µM) mit Propiconazol angegeben. Die Grafik der 3b zeigt den prozentualen Anteil von im Kulturmedium 7 verbliebenen Troglitazon (logP 3,60). Auch im Beispiel der 3b wurden Proben nach 4 Stunden und nach 24 Stunden Inkubationszeit entnommen, die mit einer Kontrolle in Form einer Troglitazon-Stammlösung (64µM) verglichen wurden. Den beiden Grafiken ist jeweils zu entnehmen, dass in beiden Ausführungen der erfindungsgemäßen Zellkulturkammer 1 auch nach 24 Stunden noch mehr als 85% des Propiconazols (3a) bzw. mehr als 80% des Troglitazons (3b) im Kulturmedium 7 nachgewiesen werden konnten.
Die 4 und 5 zeigen die zeitlichen Verläufe der Freisetzung von LDH (Lactatdehydrogenase; 4) beziehungsweise von ASAT (Aspartat-Aminotransferase; 5) von in einer erfindungsgemäßen Zellkulturkammer 1 über einen Zeitraum von 10 beziehungsweise 14 Tagen kultivierten Lebersinusoidalen Endothelzellen in Ko-Kultur mit Makrophagen und Hepatozyten im Vergleich zur Zelllyse. LDH und ASAT sind Enzyme, die bei Zellschädigungen freigesetzt werden und sich daher zur Bewertung des Vitalitäts-Zustands eines Organs oder von Geweben und Zellen eignen. Zu sehen ist eine gegenüber der Zelllyse signifikant geringere Freisetzung von LDH beziehungsweise ASAT durch die kultivierten Zellen selbst nach 14 Tagen.
In den 6 und 7 sind die Konzentrationen von Albumin (6) und Harnstoff (7) von in einer erfindungsgemäßen Zellkulturkammer 1 über einen Zeitraum von 10 beziehungsweise 14 Tagen kultivierten Lebersinusoidalen Endothelzellen in Ko-Kultur mit Makrophagen und Hepatozyten im Vergleich zur Zelllyse gezeigt. Albumin und Harnstoff können als Ausdruck vorhandener und intakter Syntheseprozesse in Lebergewebe beziehungsweise Hepatozyten angesehen werden. Es ist zu erkennen, dass sowohl in den 10-Tages-Kulturen als auch in den 14-Tages-Kulturen auch nach 10 beziehungsweise 14 Tagen Konzentrationen über 1300 µg/l Albumin beziehungsweise mehr als 0,7 mmol/l Harnstoff nachgewiesen werden können.
Die 8 zeigt die Ergebnisse eines Versuchs zum Nachweis von Interleukin-1 beta (IL-1b) über einen Zeitraum von 10 beziehungsweise 14 Tagen. Zusätzlich wurde in einige Proben am zehnten Tag und am vierzehnten Tag Lipopolysaccharide (LPS) zugegeben, um die Aktivierbarkeit von im Lebermodell enthaltenen Immunzellen (Makrophagen) zu überprüfen und es wurden die jeweiligen Reaktionen dargestellt. Die Zugabe von LPS, als sogenannter pyrogener Stoff, stellt einen im Fachgebiet üblichen Test auf Endotoxine dar. Immunzellen, wie Makrophagen, reagieren auf diesen Stimulus mit erhöhter Freisetzung an Zytokinen. Die Ergebnisse zeigen einen deutlichen Anstieg der Konzentration des IL-1beta nach der Zugabe von LPS. Daraus lässt sich ableiten, dass Makrophagen in Ko-Kultur mit den untersuchten Lebersinusoidalen Endothelzellen und Hepatozyten auch nach 10 beziehungsweise nach 14 Tagen in der Lage waren, auf ein Endotoxin mit einer Immunantwort zu reagieren. Dies ist wichtig, um Immunzell-vermittelte Nebenwirkungen von Wirkstoffen aufdecken zu können.
Im Grundsatz gleiche Ergebnisse werden für das Interleukin-10 (IL-10; 9) und Interleukin-6 (IL-6; 10) erhalten.
Bezugszeichenliste

1: Zellkulturkammer
2: Gehäuse
2.1: obere Abdeckung
2.2: untere Abdeckung
2.3: Mittelstück
3: erster Kanal
4: zweiter Kanal
5: Kanal-Einlass
6: Kanal-Auslass
7: Kulturmedium
7a: apikales Kulturmedium
7b: basolaterales Kulturmedium
8: Membran
8.1: apikale Seite der Membran
8.2: basolaterale Seite der Membran
9: Zellkultur
10: Ko-Kultur
B: Breite
H: Höhe

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 2015/169287 A1 [0003]
WO 2017/096282 A1 [0003]
WO 2019/164962 A1 [0003]

Claims

Zellkulturkammer (1) zur Kultivierung von Zellen und in vitro-Herstellung von Zellschichten und Organmodellen umfassend: - einen ersten durchströmbaren Kanal (3); - einen zweiten durchströmbaren Kanal (4); - eine poröse Membran (8); wobei - die beiden Kanäle (3, 4) übereinander angeordnet und durch die Membran (8) voneinander getrennt sind, - die Membran (8) eine zu dem ersten Kanal (3) orientierte erste Seitenfläche und eine zu dem zweiten Kanal (4) orientierte zweite Seitenfläche aufweist, - durch die Seitenflächen der Membran (8) jeweils ein Zellsubstrat (9, 10) gebildet ist, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens die Innenwände des ersten Kanals (3) und des zweiten Kanals (4) aus Polybutylenterephthalat bestehen.
Zellkulturkammer (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran (8) eine Dicke ausgewählt aus einem Bereich von 10 bis 20 µm, insbesondere aus einem Bereich von 10 bis 13 µm aufweist.
Zellkulturkammer (1) nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran (8) aus Polyethylenterephtalat oder thermoplastischen Elastomer (TPE) besteht.
Zellkulturkammer (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine Seitenfläche der Membran (8) eine zusätzliche Oberflächenstrukturierung aufweist.
Zellkulturkammer (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine Seitenfläche der Membran (8) und/oder wenigstens einer der Kanäle (3, 4) plasmabehandelt ist.
Zellkulturkammer (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Seitenfläche der Membran (8) mit einem Gemisch beschichtet ist, wobei das Gemisch Fibronektin, Kollagen I und Kollagen IV enthält und das Fibronektin in einer Konzentration von 5 µg/ml, das Kollagen I in einer Konzentration von 0,3 mg/ml und das Kollagen IV in einer Konzentration von 100 µg/ml vorliegt.
Zellkulturkammer (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass an mindestens eine der Seitenflächen der Membran (8) Dextran-Ketten gekoppelt sind, an denen Fibronektin-Peptide oder RGD-Peptide oder Vitronectin-Peptide oder Bone-Sialoprotein-Peptide mit RGD-Sequenz gebunden sind.
Zellkulturkammer (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass an mindestens eine der Seitenflächen der Membran (8) Heparin-Ketten gekoppelt sind, an denen Fibronektin-Peptide oder FGF-Peptide mit RGD-Sequenz oder RGD-Peptide allein oder Vitronectin-Peptide mit RGD-Sequenz oder Bone-Sialoprotein-Peptide mit RGD-Sequenz gebunden sind.
Zellkulturkammer (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass an mindestens eine der Seitenflächen der Membran (8) humanes Kollagen I und/oder humanes Kollagen IV mit einer Konzentration von jeweils mehr als 100 µg/ml gekoppelt ist.
Verfahren zur Kultivierung von humanen oder tierischen Zellen unter Verwendung einer Zellkulturkammer (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Zellen auf einer apikalen Seite (8.1) der Membran (8) kultiviert werden und in dem ersten Kanal (3) und/oder in dem zweiten Kanal (4) ein Kulturmedium (7) gefördert wird.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Zellen auf einer basolateralen Seite (8.2) der Membran (8) kultiviert werden und in dem ersten Kanal (3) und/oder in dem zweiten Kanal (4) ein Kulturmedium (7) gefördert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die kultivierten Zellen Lebersinusoidale Endothelzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei in dem ersten Kanal (3) vaskuläre Bedingungen nachgebildet werden und in dem zweiten Kanal (4) hepatische Bedingungen nachgebildet werden, indem durch den ersten Kanal (3) ein apikales Kulturmedium (7a) mit einer Scherrate ausgewählt aus einem Bereich von >0,2 bis 1 dyn/cm², insbesondere aus einem Bereich zwischen 0,5 und 0,8 dyn/cm² und durch den zweiten Kanal (4) ein basolaterales Kulturmedium (7b) mit einer Scherrate ausgewählt aus einem Bereich von größer Null bis einschließlich 0,2 dyn/cm² gefördert wird.
Verfahren nach Anspruch 13, bei dem durch mindestens einen der Kanäle (3, 4) ein Kulturmedium (7) gefördert wird, wobei der Sauerstoffgehalt in dem Kulturmedium (7) an einem Einlass (5) des Kanals (3, 4) auf einen Wert von 15% eingestellt wird und an einem Auslass (6) des Kanals (3, 4) auf einen Wert zwischen 3% und 5% eingestellt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, bei dem die Lebersinusoidalen Endothelzellen mit Kupffer-Zellen und/oder Hepatozyten und/oder Stellat-Zellen ko-kultiviert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die kultivierten Zellen intestinale Endothelzellen und/oder intestinale Epithelzellen und/oder intestinale glatte Muskelzellen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die kultivierten Zellen pulmonale Epithelzellen und/oder pulmonale Endothelzellen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 18, bei dem ein Wirkstoff und/oder ein Signalmolekül in die Zellkulturkammer eingespült wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 19, bei dem Immunzellen und/oder Mikroorganismen in die Zellkulturkammer eingespült werden.