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Die Erfindung liegt auf dem technischen Gebiet der Kultivierung von biologischen Zellen und Geweben mit organähnlicher Funktion in mikrophysiologischem Maßstab und stellt eine mikrophysiologische Nachbildung der Aderhaut und Blut/Retina-Schranke als in vitro-Testsystem bereit.
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Zell- und Stammzell-basierte in vitro-Modelle werden entwickelt, welche ethisch problematische und auch kostenintensive Tiermodelle bei der Erforschung genetischer oder idiopathischer Erkrankungen des tierischen oder menschlichen Körpers und bei der Entwicklung prophylaktischer und therapeutischer Wirkstoffe dagegen ersetzen können. Wichtig ist auch die Beantwortung der Frage, ob und inwieweit in Tiermodellen gefundene Ergebnisse auf den Menschen übertragbar sind, vor allem, wenn sich gezeigt hat, dass tierische Gewebe oder Zellen andere Strukturen, Zelldichten oder, auf zellulärer Ebene, andere Enzym- oder Rezeptorausstattung besitzen, so dass die direkte Übertragung vom Tiermodell auf den Menschen eigentlich nicht angezeigt wäre. Auch hier kann das in vitro-Modell helfen, wenn es gelingt, die unterschiedlichen Zell- und Gewebeeigenschaften dort zu reproduzieren und dann unter kontrollierten Bedingungen vergleichen zu können.
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Mikrophysiologische (MPS) oder so genannte „Organ-on-a-Chip“ (OoaC) Systeme ermöglichen die Kultivierung von isolierten tierischen oder menschlichen Zellen. Die Zellen können aus definierten Zelllinien aber auch aus Primärzellen gewonnen von menschlichen Gewebe (Biopsat) sowie embryonalen Ursprungs oder aus induziert pluripotenten Stammzellen (iPSZ) abgeleitet werden. Diese können dann unter möglichst physiologischen Bedingungen kultiviert werden, um zum Beispiel spezifische Gewebetypen wie Lunge, Herz, Darm oder Niere nachzubilden. Dabei wurden inzwischen auch komplexe, insbesondere iPS-basierte Organsysteme aus mehreren Zelltypen, so genannte Organoide, entwickelt, die unter dem Einfluss weniger externer Signalmoleküle bei der in vitro-Differenzierung weitgehend selbstständig und selbstorganisierend entstehen können. Beispiele dafür sind Retina-Organoide, die in speziell ausgebildeten mikrophysiologischen Bioreaktoren kultiviert und als in vitro-Testsystem für die menschliche Retina herangezogen werden können (
DE 10 2017 217 738 A ). Mehrlagige Bioreaktoren mit mehreren übereinander liegenden, gegebenenfalls durch semipermeable Membranen voneinander abgetrennten Kammern oder Kanälen zur Co-Kultivierung mehrere Zell- und Gewebetypen sind grundsätzlich bekannt.
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Die Choriocapillaris ist die Endverästelung der Aderhaut (Choroidea) des Wirbeliterauges und bildet eine zur Netzhaut hin gelegene Gefäßschicht, die insbesondere bei Primaten und Menschen die Versorgung der äußeren Netzhautschichten vermittelt. Die Choriocapillaris besteht aus einem feinen Netz gefensterter Kapillaren die oberhalb der Basalmembran des retinalen Pigmentepithels (RPE) ein durch Endverbindungen charakterisiertes segmentiert versorgtes Geflecht bildet. Die Choriocapillaris wird dabei mit der Schicht (Lamina vasculosa) aus nächstgrößeren Gefäßen über Senkarteriolen und -venolen versorgt Eingebettet in Bindegewebe ist sie stark pigmentiert. Die Lamina suprachoroidea besteht aus einem elastischen Bindegewebe und aus pigmentierten Bindegewebszellen. Sie kleiden die äußerste Schicht der Aderhaut des Auges aus. Die Aderhaut weist neuroektodermale Melanozyten auf, welche neben der Synthese von Melanin auch als Teil des Immunsystems fungieren. Die Melanozyten verteilen sich dreidimensional über die gesamte Aderhaut.
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Die mit der Aderhaut einerseits eng verbundenen Endothelzellen der Blutgefäße und die mit der Aderhaut andererseits eng verbundenen Epithelzellen des retinalen Pigmentepithels (RPE) bilden gemeinsam die so genannte Blut/Retina-Schranke, die Barriere für den Übertritt von Stoffen aus dem Blut in die Netzhaut des Auges - und umgekehrt. Für die Erforschung neuer Therapiemöglichkeiten bestimmter mit der Aderhautfunktion korrelierbarer Augenerkrankungen wie der altersabhängigen Makuladegeneration (AMD), der der diabetischen Retinopathie, vor allem bei Patienten mit Diabetes Typ I, oder der Kurzsichtigkeit sind Erkenntnisse zur Funktion der Blut/Retina-Schranke und des Zusammenspiels der beteiligten Zelltypen und Geweben in der Aderhaut von großer Wichtigkeit. Leider zeigt sich, dass gerade hier etablierte Tiermodelle ungeeignet sind oder die mit den Tiermodellen gewonnenen Erkenntnisse nicht einfach und direkt auf die Situation im Menschen übertragbar sind. So besitzen beispielsweise andere Primaten oder Affen, einen anderen Gewebeaufbau oder andere Zelldichten in der Aderhaut als der Mensch. Auch können genetisch determinierte Erkrankungen des Menschen nicht gut im Tiermodell nachgebildet und untersucht werden. Hier wäre der Rückgriff auf Testsysteme basierend auf genetisch erkrankten menschlichen Zellen wünschenswert.
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Zurzeit sind keine in vitro-Testsysteme, welche die grundlegenden Funktionen der Aderhaut (Choroidea) und der Blut/Retina-Schranke verwertbar umsetzen können, bekannt. Bisherige in vitro-Testsysteme der Aderhaut oder Blut/Retina-Schranke bestehen hauptsächlich aus zweidimensionalen, 2D-Monolagen von Epithelzellen und Endothelzellen, die auf einer semipermeablen Membran in einem Bioreaktor aufgebracht sind, um eine Barriere nach Art der Blut/Retina-Schranke, zwischen einem simulierten Blutfluss in dem Bioreaktor auf der Seite der Endothelzellen und den Epithelzellen, zu imitieren.
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Zum Beispiel bei der feuchten Form der AMD wachsen neue, unnormale Blutgefäße aus der Aderhaut unter und in die Netzhaut ein. Aus diesen neuen, undichten Gefäßen tritt Flüssigkeit aus, was zur Erblindung führ. An solchen Vorgängen sind die Verbände der verschiedenen Zelltypen der Aderhaut beteiligt, einschließlich der Melanozyten.
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Es zeigt sich, dass die Aderhaut, je nach Spezies, eine unterschiedliche Dichte an Melanozyten aufweist. Die Dichte der Melanozyten in der menschlichen Aderhaut ist gegenüber derjenigen in anderen Primaten oder Affen um ein Vielfaches geringer. Auch unterscheidet sich die Dichte der Melanozyten der Aderhaut zwischen menschlichen Individuen, ähnlich wie die Pigmentierung der Haut, um ein Vielfaches.
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Nachteilig ist, dass in bekannten in vitro-Modellen oder in vitro-Testsystemen wesentliche Zelltypen der Aderhaut wie die Melanozyten nicht vorhanden sind.
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Der vorliegenden Erfindung lag daher das technische Problem zugrunde, verbesserte Verfahren und Mittel bereitzustellen, um physiologisch relevante in vitro-Testsysteme der tierischen oder menschlichen Aderhaut, insbesondere der Funktion der Blut/Retina-Schranke, zu etablieren, besonders um solche in vitro-Testsysteme der Aderhaut zu etablieren, worin auch Melanozyten in einer physiologisch dem in vivo-Zustand ähnlichen Weise kultiviert werden können, und besonders, worin die Melanozyten in unterschiedlichen Zelldichten enthalten sein können.
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Das technische Problem wird gelöst durch eine neuartige In vitro-Gewebekulturanordnung auf Basis eines insbesondere mikrophysiologischen Bioreaktors und Aderhautzellen, worin Melanozyten, auch bei hohen Zelldichten, in einer dreidimensionalen Anordnung sowie unter physiologisch ähnlichen Extrazellulären Matrix (ECM) kultiviert sind und deren gleichbleibende Vitalität über die Dauer des Einsatzes des in vitro-Testsystems zu gewährleisten. Der Gegenstand der Erfindung ist in Anspruch 1 charakterisiert. Das ist besonders eine in vitro-Gewebekulturanordnung, welche folgende Elemente enthält oder im Wesentlichen daraus besteht: einen Bioreaktor mit einer ersten Kammer, eine in dieser ersten Kammer angeordnete dreidimensionale 3D-Melanozytenkultur, die (isolierte) Melanozyten, die in einem Hydrogel eingebettet sind, enthält oder daraus besteht. Weiter weist die erfindungsgemäße Anordnung eine an die erste Kammer anschließende zweite Kammer des Bioreaktors auf sowie eine erste semipermeable Membran, welche die zweite Kammer des Bioreaktors von der ersten Kammer des Bioreaktors abgrenzt, wobei die zu der ersten Kammer hin weisende Membranseite dieser ersten semipermeablen Membran an die 3D-Melanozytenkultur in der ersten Kammer grenzt und besonders an dieser direkt anliegt. Weiter weist die erfindungsgemäße Anordnung eine in der zweiten Kammer des Bioreaktors lokalisierte oder angeordnete, insbesondere konfluente, erste 2D-Endothelzellschicht, enthaltend (isolierte) Endothelzellen, auf, wobei diese erste 2D-Endothelzellschicht auf der zur zweiten Kammer hin weisenden Membranseite der ersten semipermeablen Membran, insbesondere als Einzellschicht oder Monolage (Monolayer), aufliegt.
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In einer besonderen Ausgestaltung weist die erfindungsgemäße Anordnung außerdem in dem Bioreaktor eine an die zweite Kammer anschließende dritte Kammer des Bioreaktors auf sowie eine zweite semipermeable Membran, welche diese dritte Kammer des Bioreaktors von der vorgenannten zweiten Kammer des Bioreaktors abgrenzt, und wobei eine, insbesondere konfluente, zweite 2D-Endothelzellschicht, enthaltend isolierte Endothelzellen, in dieser zweiten Kammer des Bioreaktors lokalisiert oder angeordnet ist, wobei diese zweite 2D-Endothelzellschicht auf der zur zweiten Kammer hin weisenden Membranseite der zweiten semipermeablen Membran, ebenfalls insbesondere als Monolayer, aufliegt.
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In einer besonderen Variante dieser besonderen Ausgestaltung weist die erfindungsgemäße Anordnung außerdem eine in der vorgenannten dritten Kammer des Bioreaktors lokalisierte oder angeordnete konfluente erste 2D-Epithelzellschicht, enthaltend (isolierte) Epithelzellen auf, wobei diese 2D-Epithelzellschicht auf der zur dritten Kammer hin weisenden Membranseite der zweiten semipermeablen Membran, ebenfalls insbesondere als Monolayer, aufliegt.
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In besonderen Ausgestaltungen dieser erfindungsgemäßen Anordnungen weisen diese außerdem in dem Bioreaktor eine an die vorgenannte erste Kammer anschließende vierte Kammer des Bioreaktors auf sowie eine dritte semipermeable Membran, welche diese vierte Kammer des Bioreaktors von der dritten Kammer des Bioreaktors abgrenzt, wobei die zu der ersten Kammer hin weisende Membranseite dieser dritten semipermeablen Membran an die 3D-Melanozytenkultur in der ersten Kammer grenzt und besonders an dieser direkt anliegt, wobei eine, insbesondere konfluente, dritte 2D-Endothelzellschicht, enthaltend isolierte Endothelzellen, in dieser vierten Kammer des Bioreaktors lokalisiert oder angeordnet ist, wobei diese dritte 2D-Endothelzellschicht auf der zu der vierten Kammer hin weisenden Membranseite der dritten semipermeablen Membran, ebenfalls insbesondere als Monolayer, aufliegt. Bevorzugt ist in dem Aufbau dieser Ausgestaltung der in vitro-Gewebekulturanordnung vorgesehen, dass die 3D-Melanozytenkultur zwischen dieser ersten semipermeablen Membran und der dritten semipermeablen Membran eingebettet ist.
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Die Erfindung sieht also besonders vor, eine 3D-Melanozytenkultur, enthaltend oder bestehend aus in Hydrogel eingebetteten Melanozyten, mit 3D-Strukur benachbart zu mindestens einer 2D-Endothelzellschicht, das heißt besonders einem Monolayer, aus Endothelzellen zu kultivieren. Dadurch wird eine kontrollierbare physiologisch adäquate Interaktion zwischen den Melanozyten und den Endothelzellen ermöglicht, und es können spezifische Parameter dieser Zell- oder Gewebeinteraktion gezielt als in vitro-Testsystem getestet werden. Eine physiologisch adäquate Versorgung der Zellen des 3D-Melanozytenkultur und der benachbart liegenden 2D-Endothelzellschicht in der erfindungsgemäßen Anordnung wird vorteilhafterweise ermöglicht. Es wird so ein in vitro-Testsystem basierend auf einer organtypischem Sandwichkultur, welche die komplexe Struktur und Funktion der Aderhaut in vivo widerspiegelt, bereitgestellt.
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Gemäß bevorzugter Ausgestaltungen der Erfindung, ist die in vitro-Gewebekulturanordnung dabei als mikrophysiologischer Reaktor ausgeführt, das heißt insbesondere, dass die Kammern in dem Bioreaktor übereinander geschichtet angeordnet sind. Besonders ist der Bioreaktor dabei als mikrophysiologischer Bioreaktor ausgebildet und die Kammern des Bioreaktors sind als sogenannte Kanäle oder Kanalstrukturen in dem mikrophysiologischen Bioreaktor ausgebildet. Solche Kammern, Kanäle oder Kanalstrukturen weisen in dem mikrophysiologischen Maßstab bevorzugt jeweils ein Kammervolumen von weniger als 10 µL, bevorzugt von 1 bis 5 µL auf.
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Vorteilhafterweise erlauben Bioreaktoranordnungen in mikrophysiologischem Maßstab die Interaktion zwischen Zellen und Geweben in denselben Dimensionen wie im lebenden Organ vorgefunden als in vitro-Testsystem zu realisieren und damit sinnvoll zu untersuchen. Die vorliegende Erfindung stellt zum ersten Mal eine mikrophysiologische Nachbildung der Aderhaut und Blut/Retina-Schranke als in vitro-Testsystem bereit, welches dem physiologischen Zustand im lebenden Organ sehr nahe kommt. In alternativen Ausgestaltungen ist die Erfindung aber nicht auf den mikrophysiologischen Maßstab beschränkt; es können auch Bioreaktoren mit teilweise größeren Kammern, das heißt besonders Kammern mit größerem Füllvolumen, vorgesehen sein.
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Als Hydrogel sind insbesondere künstliche Hydrogele definierter chemischer Zusammensetzung auf Basis von Dextran-Vernetzersystemen, oder alternativ Kollagengele auf Basis von Kollagen oder Fibronektin-Gele vorgesehen. Besonders bevorzugt sind künstliche Hydrogele definierter chemischer Zusammensetzung die bevorzugt mit zusätzlichen Bindemotiven versehen sind.
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Die Erfindung erlaubt die Einbringung eines definierten Hydrogels mit Melanozyten einerseits in unterschiedlichen Zelldichten, andererseits, bei unterschiedlichen Steifigkeiten, das heißt rheologischen Eigenschaften, bedingt durch die Vernetzerstärke oder Proteindichte des Hydrogels, in ein mikrophysiologisches in vitro-Testsystem. Dadurch lässt sich die Kultivierungsbedingungen für die Melanozyten in dem in vitro-Testsystem genau an dem in vivo-Zustand anpassen, sei es, dass die melanozytenarme Aderhaut eines Menschen nachgebildet werden soll, sei es, dass der Einfluss unterschiedlicher Melanozytendichte auf die Funktion der Blut/Retina-Schranke oder der Immunreaktion in der Aderhaut untersucht werden soll.
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Bevorzugt sind die isolierten Melanozyten, welche zur erfindungsgemäß eingesetzten 3D-Melanozytenkultur verwendet werden, ausgewählt aus unmittelbar aus menschlichem oder tierischem Gewebe isolierten Melanozyten, induziert pluripotenten Stammzellen (iPS) und embryonalen Stammzellen. Menschliche embryonale Stammzellen sowie insbesondere auch Teile von Organen des lebenden Menschen sind ausgenommen.
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Bevorzugt sind die isolierten Endothelzellen, welche zur erfindungsgemäß eingesetzten 2D-Endothelzellschicht verwendet werden, ausgewählt aus unmittelbar aus menschlichem oder tierischem Gewebe isolierten Endothelzellen, induziert pluripotenten Stammzellen (iPS) und embryonalen Stammzellen. Bevorzugt sind mikrovaskuläre Endothelzellen. Menschliche embryonale Stammzellen sowie insbesondere auch Teile von Organen des lebenden Menschen sind ausgenommen.
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Bevorzugt sind die isolierten Epithelzellen, welche zur erfindungsgemäß eingesetzten 2D-Epithelzellschicht verwendet werden, ausgewählt aus unmittelbar aus menschlichem oder tierischem Gewebe isolierten Epithelzellen, induziert pluripotenten Stammzellen (iPS) und embryonalen Stammzellen. Besonders bevorzugt sind die Epithelzellen retinale Pigmentepithelzellen (RPE) oder epithelartige Zelllinien, wie ARPE-19. Menschliche embryonale Stammzellen sowie insbesondere auch Teile von Organen des lebenden Menschen sind ausgenommen.
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Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen mikrophysiologischen Bioreaktors können die Schichten und Kanäle mittels Abformung von Polydimethylsiloxan (PDMS) an mikrostrukturierten Siliziumwafern hergestellt werden. Die Herstellung des Bioreaktors ist aber nicht auf dieses Material limitiert, und weitere Materialen wie Glas, PC sowie PET und deren Kombination sind möglich. Eine Mikrostrukturierung der jeweiligen Abgussformen (Master), wird insbesondere durch UV-Lithographie beispielsweise mittels Fotolack realisiert. Der Zusammenbau des Bioreaktors kann in mehreren Schritten stattfinden: Beispielsweise wird zuerst auf einen Objektträger-Glas einer Stärke von beispielsweise 0,17 mmm bis 1 mm, insbesondere nach Aktivierung im Sauerstoffplasma, eine Perfusionskanal-Schicht auf einer Trägerfolie, aufgebracht und zur mechanischen Verbindung angedrückt. Um die Verbindung zu verstärken, kann dieser Materialverbund in einem Konvektionsofen beispielsweise bei 60 °C bis 80 °C erhitzt werden. Zur Erzeugung des Perfusionskanal des, wird anschließend die Trägerfolie abgezogen, sodass eine Perfusionskanal-Schicht, welche schließlich eine der Kammern des Bioreaktors bildet, auf dem Trägerglas verbleibt.
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Die semipermeablen Membranen sind bevorzugt aus Materialen wie PET aufgebaut. Sie besitzen bevorzugt eine Porengröße von 4 bis 5 µm sowie eine bevorzugte Dicke von 10 bis 30 µm.
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Die Aufbringung einer semipermeablen Membran auf dieser Kammer oder Kanal-Schicht erfolgt beispielsweise wie folgt: Es werden vorab die Durchgangslöcher für die Zu- und Abläufe in den darunter liegenden Schichten geschaffen. Eine insbesondere funktionalisierte semipermeable Membran wird in die dafür vorgesehene Einlagefläche eingelegt. Als nächster Schritt, eine weitere Kanal-Schicht aufgelegt und angedrückt und der gesamte Sandwich beispielsweise für die Dauer von 10 bis 24 Stunden in einem Konvektionsofen auf 60 °C bis 80 °C erhitzt. Mehrere solcher schichtweise hergestellten Anordnungen können dabei auf einem gemeinsamen Träger nebeneinander angeordnet sein.
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Die Erfindung stellt in einem weiteren Aspekt auch Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen in vitro-Gewebekulturanordnung bereit. Diese Verfahren enthaltend zumindest die folgenden Schritte (c) und (d):
- (c) Aussäen von isolierten Endothelzellen in eine zweite Kammer eines Bioreaktors, bei einer solchen Orientierung des Bioreaktors in Bezug auf den Schwerkraftvektor, dass Endothelzellen auf eine zu dieser zweiten Kammer weisenden Membranseite einer ersten semipermeablen Membran, welche die zweite Kammer von einer ersten Kammer des Bioreaktors abgrenzt, absinken und sich insbesondere dort anheften, und
- (d) Kultivieren der auf dieser Membranseite der ersten semipermeablen Membran abgesunkenen Endothelzellen mit der Maßgabe, dass dabei Endothelzellen auf dieser Membranseite adhärieren und dort insbesondere zu einer konfluenten ersten 2D-Endothelzellschicht auswachsen.
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Diese erfindungsgemäßen Verfahren enthaltend außerdem die folgenden Schritte (g) und (e):
- (g) Einbringen einer Suspension von isolierten Melanozyten suspendiert in einem flüssigen Hydrogel-Precursor in diese erste Kammer des Bioreaktors und
- (h) Aushärtenlassen des Hydrogel-Precursors zu einem Hydrogel, so dass in der ersten Kammer eine 3D-Melanozytenkultur gebildet wird, worin isolierte Melanozyten in dem Hydrogel eingebettet sind.
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Diese erfindungsgemäßen Verfahren enthalten bevorzugt außerdem die folgenden Schritte (e) und (f):
- (e) Aussäen von isolierten Endothelzellen in diese zweite Kammer des Bioreaktors, bei einer solchen Orientierung des Bioreaktors in Bezug auf den Schwerkraftvektor, dass Endothelzellen auf eine zu der zweiten Kammer hin weisenden Membranseite einer zweiten semipermeablen Membran, welche die zweite Kammer von einer dritten Kammer des Bioreaktors (100) abgrenzt, absinken und sich insbesondere dort anheften, und
- (f) Kultivieren der auf dieser Membranseite der zweiten semipermeablen Membran (150) abgesunkenen Endothelzellen, so dass Endothelzellen auf der dieser Membranseite adhärieren und dort insbesondere zu einer konfluenten zweiten 2D-Endothelzellschicht auswachsen.
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Der Schwerkraftvektor wird dabei dergestalt ausgenutzt, dass der Bioreaktor so gedreht wird, dass die entsprechenden Zellen entlang des Schwerkraftvektors absinken können. Dazu ist es erforderlich, dass die Zellen in einer Suspension in die Kammer eingebracht werden, worin die Zellen absinken können.
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Erfindungsgemäß ist also besonders vorgesehen, dass in der zweiten Kammer oder dem zweiten Kanal des Bioreaktors zwei separate 2D-Endothelzellschichten ausgebildet sind, und zwar einerseits orientiert in Richtung der 3D-Melanozytenkultur in der benachbarten ersten Kammer beziehungsweise dem ersten Kanal, und andererseits orientiert in Richtung einer dazu insbesondere gegenüberliegend benachbarten dritten Kammer beziehungsweise dritten Kanal. Auf diese Weise kann zweite Kammer, welche beiderseits mit einer 2D-Endothelzellschicht belegt ist, als in vitro-Modell eines Gefäßes dienen, welches einerseits Kontakt zu den Melanozyten in der ersten Kammer, andererseits Kontakt zu einer bevorzugt in der dritten Kammer vorhandenen retinalen Pigmentepithelschicht (RPE) hält. So können in diesen zweiten Kanal der in vitro-Gewebekulturanordnung im Testbetrieb zu testende Wirksubstanzen appliziert werden, welche in vivo in das Gefäßsystem, das heißt in die Blutbahn, appliziert werden würden.
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In bevorzugten Varianten werden die Endothelzellschichten in der in vitro-Gewebekulturanordnung seitlich nacheinander aufgetragen, in einer besonders bevorzugten Variante wird zunächst die Endothelzellschicht, welche der 3D-Melanozytenkultur benachbart ist, aufgetragen. Bevorzugt ist daher ein Verfahren, worin die Schritte (c)-(d) zeitlich vor den Schritten (g)-(h) durchgeführt werden. In einer Variante werden die Schritte (c)-(f) zeitlich vor den Schritten (g)-(h) durchgeführt; in einer Variante werden die Schritte (c)-(d) zeitlich vor den Schritten (g)-(h) die Schritte (e)-(f) zeitlich nach den Schritten (g)-(h) durchgeführt.
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Alternativ oder zusätzlich ist bevorzugt vorgesehen, in der dritten Kammer des Bioreaktors eine Epithelzellschicht auszusäen, zwar auf der zur dritten Kammer hin weisenden Membranseite der zweiten semipermeablen Membran, besonders auf der gegen überliegenden Seite der zweiten semipermeablen Membran, das heißt auf der zu der zweiten Kammer hin weisenden Seite, wie vorstehend dargestellt, eine 2D-Endothelzellschicht angeordnet ist oder (noch) ausgesät wird. Die erfindungsgemäßen Verfahren enthalten daher bevorzugt außerdem die folgenden Schritte (a) und (b):
- (a) Aussäen von isolierten Epithelzellen in die dritte Kammer des Bioreaktors, bei einer solchen Orientierung des Bioreaktors in Bezug auf den Schwerkraftvektor, dass Epithelzellen auf die zu der dritten Kammer hin weisenden Membranseite der zweiten semipermeablen Membran, welche die zweite Kammer von einer dritten Kammer des Bioreaktors abgrenzt, absinken und sich insbesondere dort anheften, und
- (b) Kultivieren der auf dieser Membranseite der zweiten semipermeablen Membran abgesunkenen Epithelzellen, so dass Epithelzellen auf der dieser Membranseite adhärieren und dort zu einer insbesondere konfluenten ersten 2D-Epithelzellschicht auswachsen.
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In einer bevorzugten Variante ist vorgesehen, dass die Schritte (a)-(b) zeitlich vor den Schritten (c)-(h) durchgeführt werden.
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In weiteren Varianten ist zusätzlich vorgesehen, dass in einer vierten Kammer des Bioreaktors der hierin beschriebenen erfindungsgemäßen in vitro-Gewebekulturanordnung, eine dritte 2D-Endothelzellschicht ausgebildet wird, und zwar auf einer diese vierte Kammer von der ersten Kammer abgrenzenden dritten semipermeablen Membran. Die Besiedelung dieser zur vierten Kammer hin weisenden Membranseite der dritten semipermeablen Membran mit Endothelzellen erfolgt bevorzugt analog zu dem vorbeschriebenen Vorgehen, besonders bevorzugt ebenfalls unter Ausnutzung der betrieblichen Orientierung des Schwerkraftvektors, um die Endothelzellen auf diese Seite der dritten semipermeablen Membran absinken zu lassen.
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Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft in vitro-Testverfahren Verfahren und die Verwendung der erfindungsgemäßen in vitro-Gewebekulturanordnung in solchen Testverfahren. Besonders wird die Interaktion der verschiedenen Zelltypen und/oder der Integrität der Barriere, insbesondere der Epithelbarriere und/oder der Endothelbarriere, in der erfindungsgemäßen in vitro-Gewebekulturanordnung analysiert. Dies soll insbesondere erfolgen durch Messung der Stoffflüsse über die semipermeablen Membranen, mittels Bestimmung elektrischer Parameter (Impedanzmessung) oder mittels Lösungen aus fluoreszenzmarkierten Makromolekülen (z.B. Dextran) unterschiedlichen Molekulargewichtes zur Ermittlung der Transportrate der Makromoleküle über die Blut/Retina-Schranke.
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Abschließend kann das Gewebe aus der erfindungsgemäßen Anordnung durch histologische Präparation insbesondere in Bezug auf strukturelle Änderungen, aber auch in Bezug auf Änderungen in der Rezeptorausstattung untersucht werden. Die Analyse erfolgt hierbei insbesondere durch bildgebende Verfahren wie Hellfeld- und Fluoreszenz- sowie Konfokalmikroskopie und immunohistologische Färbung.
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Es ist auch vorgesehen, einzelne intakte Zellen oder Gewebe aus der erfindungsgemäßen Anordnung schonend herauszulösen. Die herausgelösten Zellen können kontinuierlichen Analyseverfahren wie der Flusszytometrie zugeführt werden, oder für die (spätere) Analyse molekularer Vorgänge in den herausgelösten Zellen, insbesondere der Genexpression, gesammelt werden. Alternativ oder zusätzlich ist die Analyse des so genannten Mediumüberstandes der aus den einzelnen Kanälen des Bioreaktors, insbesondere dem Endothelkanal, gewonnen und gesammelt werden kann, vorgesehen, insbesondere mittels antikörperbasierter Nachweisverfahren wie ELISA.
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Als zu testende Substanz kommt insbesondere auch zelluläres Material, besonders Immunzellen, besonders mononukleäre Zellen des peripheren Blutes, infrage, welche in mindestens eine der Kammern der erfindungsgemäßen Anordnung, bevorzugt in den Endothelkanal, gegeben werden. Bei gleichzeitiger oder anschließender Zugabe einer Substanz kann die Wirkung dieser Substanz auf die einsetzende Immunantwort untersucht werden. Ein Ansatz ist die Untersuchung der Einwanderung von Immunzellen, besonders von T-Zellen, aus dem Endothelkanal in das benachbarte Gewebe aus Melanozyten in Hydrogel. Ein anderer Ansatz ist die Untersuchung, ob die Immunreaktion durch die Zugabe einer zu prüfenden Substanz moduliert werden kann, was beispielsweise durch ein verstärktes Einwandern von Immunzellen, beispielsweise von T-Zellen, nachgewiesen werden kann und/oder durch eine verstärkte Proliferation der T-Zellen, die sich bereits in dem Gewebe aus Melanozyten und Hydrogel befinden, erkennbar wird.
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In einem ersten Ansatz wird die zu testende Substanz, gegebenenfalls anschließend an die Injektion von Zellmaterial, in einen mit den Endothelzellen besiedelten Kanal/Kammer gegeben. Dies entspricht besonders dem in vivo-Zustand der Verabreichung der Substanz in den Blutkreislauf. In einem alternativen Ansatz eines solchen Testverfahrens wird die zu testende Substanz alternativ oder zusätzlich in den mit den Epithelzellen besiedelten Kanal/Kammer gegeben. In einem weiteren alternativen Ansatz wird die zu testende Substanz alternativ oder zusätzlich in den mit den Melanozyten besiedelten Kanal/Kammer gegeben.
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Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Figuren und Beispiele näher beschrieben, ohne dass diese beschränkend zu verstehen wären.
- 1 zeigt eine schematische Schnittansicht einer ersten Ausführung der erfindungsgemäßen in vitro-Gewebekulturanordnung mit mindestens zwei Kammern (120, 140), worin in einem Bioreaktor (100) in einer ersten Kammer (120) eine 3D-Melanozytenkultur (200), worin isolierte Melanozyten (220) in einem Hydrogel (240) eingebettet sind, angeordnet ist. Eine zweite Kammer (140) des Bioreaktors (100) schließt sich an die erste Kammer (120) unmittelbar an. Eine erste semipermeable Membran (130) grenzt die zweite Kammer (140) von der ersten Kammer (120) ab. Dabei ist besonders vorgesehen, dass die zur ersten Kammer (120) weisende Membranseite (132) der ersten semipermeablen Membran (130) an der 3D-Melanozytenkultur (200) anliegt. In der zweiten Kammer (140) ist eine erste 2D-Endothelzellschicht (310) angeordnet, die auf der zur zweiten Kammer (140) hin weisenden Membranseite (134) der ersten semipermeablen Membran (130) aufliegt. Dadurch ist die erste 2D-Endothelzellschicht (310) von der 3D-Melanozytenkultur (200) nur durch die erste semipermeable Membran (130) getrennt, aber semipermeabel verbunden.
- 2 zeigt eine schematische Schnittansicht einer weiteren Ausführung der erfindungsgemäßen in vitro-Gewebekulturanordnung mit vier Kammern (120, 140, 160, 180), worin in dem Bioreaktor (100) in einer ersten Kammer (120) eine 3D-Melanozytenkultur (200), worin isolierte Melanozyten (220) in einem Hydrogel (240) eingebettet sind, angeordnet ist. Eine zweite Kammer (140) des Bioreaktors (100) schließt sich an die erste Kammer (120) unmittelbar an. Eine erste semipermeable Membran (130) grenzt die zweite Kammer (140) von der ersten Kammer (120) ab. Die zur ersten Kammer (120) weisende Membranseite (132) der ersten semipermeablen Membran (130) liegt an der 3D-Melanozytenkultur (200) an. In der zweiten Kammer (140) ist eine erste 2D-Endothelzellschicht (310) angeordnet, die auf der zur zweiten Kammer (140) hin weisenden Membranseite (134) der ersten semipermeablen Membran (130) aufliegt. Eine dritte Kammer (160) des Bioreaktors (100) schließt sich an die zweite Kammer (140) unmittelbar an, und zwar besonders auf einer der angrenzenden ersten Kammer (120) gegenüberliegenden Seite der zweiten Kammer (140). Eine zweite semipermeable Membran (130) grenzt die dritte Kammer (160) von der zweiten Kammer (140) ab. In dieser Ausführung ist in der zweiten Kammer (140) noch eine zweite 2D-Endothelzellschicht (320) angeordnet, die auf der zur zweiten Kammer (140) hin weisenden Membranseite (152) der zweiten semipermeablen Membran (150) aufliegt. In der dritten Kammer (160) des Bioreaktors (100) ist außerdem eine 2D-Epithelzellschicht (400) angeordnet, die auf der zur dritten Kammer (160) hin weisenden Membranseite (154) der zweiten semipermeablen Membran (150) aufliegt. Dadurch ist die zweite semipermeable Membran (150) beidseitig besiedelt und die zweite 2D-Endothelzellschicht (320) ist von der 2D-Epithelzellschicht (400) durch diese Membran (150) getrennt, aber semipermeabel verbunden. In der hier dargestellten Ausführung mit vier Kammern ist außerdem besonders eine vierte Kammer (180) auf der gegenüberliegenden Seite der ersten Kammer (120) ausgebildet, die von der ersten Kammer (120) durch eine dritte semipermeable Membran (170) abgegrenzt wird. Dabei ist besonders vorgesehen, dass die zur ersten Kammer (120) weisende Membranseite (172) der dritten semipermeablen Membran (170) an der 3D-Melanozytenkultur (200) anliegt. In der vierten Kammer (180) des Bioreaktors (100) ist dabei besonders eine dritte 2D-Endothelzellschicht (330) angeordnet, die auf der zur vierten Kammer (180) hin weisenden Membranseite (174) der dritten semipermeablen Membran (174) aufliegt. Dadurch ist auch die dritte 2D-Endothelzellschicht (330) von der 3D-Melanozytenkultur (200) nur durch die dritte semipermeable Membran (170) getrennt, aber semipermeabel verbunden.
- 3 zeigt eine schematische Draufsicht einer typischen praktischen Ausführung des in vitro-Testsystems (100) mit drei Kanalstrukturen, besonders gemäß 4 mit einem Kanal (160) für das Aussäen von retinalen Pigmentzellen, einem weiteren Kanal (140) für das Aussähen von Endothelzellen und einem Kanal (130) zur Beladung eines dort vorgelegten Hydrogels mit Melanozyten.
- 4 zeigt eine schematische Schnittansicht einer Ausführung des in vitro-Testsystems mit drei Kanalstrukturen (120, 140, 160) die jeweils durch zwei semipermeable Membranen (130, 150) voneinander abgetrennt sind. In der obersten Kanalstruktur (160) ist eine 2D-Monolage aus Epithelzellen (400), vorzugsweise retinale Pigmentepithelzellen, auf die oberste semipermeable Membrane (150) aufgebracht. Bei der in der Mitte angeordneten Kanalstruktur (140) ist jeweils eine 2D-Monolage aus Endothelzellen (310, 320), vorzugsweise mikrovaskuläre Endothelzellen, auf die Unterseite (152) der obersten semipermeablen Membran (150) und auf der Oberseite (134) der unteren semipermeablen Membran (130) aufgebracht. In der untersten Kanalstruktur (120) ist an der Unterseite (132) der unteren semipermeablen Membran (130) ein Hydrogel (240) mit Melanozyten (220), eingebracht, das eine 3D-Melanozytenkultur (200) bildet.
- 5 zeigt schematische Draufsichten der Ausführung des in vitro-Testsystems mit drei Kanalstrukturen gemäß 3, die für die unterschiedlich eingesetzten Zelltypen partiell verschlossen (5A) oder geöffnet (5B) werden oder mit einem konstanten Fluss aus Nährmedium umspült werden (5C) können.
- 6 zeigt eine schematische Schnittansicht einer Ausführung des in vitro-Testsystems und die Einbringung der verschiedenen Zelltypen; A: Aussäen von retinalen Pigmentepithelzellen in den obersten Kanal für die Erzeugung einer 2D-RPE-Monolage (400) auf der Oberseite der semipermeablen Membran; B: Aussäen von Endothelzellen in den mittleren Kanal, in vitro-Testsystem wird auf den Kopf gestellt für die Erzeugung einer 2D-Endothelzellmonolage (320) auf der Unterseite der semipermeablen Membran; C: in vitro-Testsystem wird zurück gedreht für die Erzeugung einer zweiten 2D-Endothelzellmonolage (310) auf der Oberseite der semipermeablen Membran; D: in den unteren Kanal wir ein Hydrogel gegeben und mit Melanozyten besiedelt, um die 3D-Melanozytenkultur zu bilden; E: im Testbetrieb werden in den mit Endothelzellen belegten mittleren Kanal Substanzen und/oder Immunzellen (500) appliziert.
- 7 zeigt Zelldichten von Melanozyten in einem Hydrogel in der erfindungsgemäßen in vitro-Anordnung: A: Hydrogel + Melanozyten in einer Zelldichte die der menschlichen Aderhaut entspricht; B: Hydrogel + Melanozyten in einer Zelldichte, die der Aderhaut eines Primaten entspricht.
- 8 zeigt die dreidimensionale Verteilung von Hydrogel + Melanozyten der erfindungsgemäßen in vitro-Anordnung, ermittelt und dargestellt mittels der Autofluoreszenz des durch die Melanozyten gebildeten Melanins.
- 9 zeigt die schematische Schnittansicht einer weiteren Ausführung des in vitro-Testsystems mit zwei Kanalstrukturen (120, 160) die durch eine semipermeable Membran (150) voneinander getrennt sind. In den oberen Kanal (160) werden Endothelzellen oder Epithelzellen (320) eingebracht als 2D-Monolage. Im unteren Kanal (120) wird ein Hydrogel (240) mit Melanozyten (220) eingebracht; in den unteren Kanal (120) werden ebenfalls Endothelzellen (310) eingebracht, die sich an dem ausgehärteten Hydrogel außen anlagern.
- 10 zeigt Melanozyten eingebettet in ein Kollagenhydrogel in der erfindungsgemäßen in vitro-Anordnung, die mittels einer lebend/tot-Färbung (vital = Fluoresceindiacetat, nicht vital = Propidiumiodid (PI)) angefärbt worden sind: A: bei einer Konzentration von 3 mg/mL; B; bei einer Konzentration von 2 mg/mL; C: bei einer Konzentration von 1 mg/mL; D zeigt ein Balkendiagramm der für Propidiumiodid (PI) positiv (toten) Zellen: Die Anzahl die PI-positiven Zellen sinkt signifikant mit der Verringerung der Gelkonzentration und führt im Umkehrschluss zu einer höheren Vitalität.
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Herstellung eines mikrophysiologischen in vitro-Choroidea-Testsystems
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Zur Herstellung des Testsystems werden in einen mikrophysiologischen Bioreaktor Melanozyten, Endothelzellen und Epithelzellen ausgesät. Die Schritte sind wie folgt:
- 1) Aussäen von Epithelzellen, vorzugsweise retinalen Pigmentepithelzellen, in der obersten Kanalstruktur Bioreaktors, die dort eine 2DMonolage bilden: Hierfür werden Ausgang des Endothelkanals des Bioreaktors verschlossen, Ausgang des retinal Pigmenepithelkanals verschlossen, Ausgang des Melanozyten + Hydrogel Kanal verschlossen. Zelllösung mit retinal Pigmentepithelzellen wird in den Einlass des retinal Pigmentepithelkanals eingespült und über den Ausgang des Endothelzellkanals ausgespült.
- 2) Aussäen von Endothelzellen, vorzugsweise mikrovaskulären Endothelzellen, in der mittleren Kanalstruktur, wobei: a) eine erste 2D-Monolage aus besagten Endothelzellen auf die Oberseite der zweiten semipermeablen Membran erzeugt wird, und b) eine zweite 2D-Monolage aus besagten Endothelzellen auf die Unterseite der ersten semipermeablen Membran erzeugt wird. Hierfür werden der Eingang des Endothelkanals verschlossen, Ausgang und Eingang des retinal Pigmentepithelkanals verschlossen, Ausgang des Hydrogel + Melanozyten Kanals verschlossen. Zelllösung wird in den Ausgang des Endothelkanals eingespült und über den Ausgang des Melanozytenkanals ausgespült. Es wird somit eine erste 2D-Monolage erzeugt, dadurch das eine Zelllösung in besagten Kanal eingespült wird und das in vitro-Testsystem auf den Kopf gestellt wird um ein Absinken der Endothelzellen auf die Unterseite der ersten semipermeablen Membran zu ermöglichen. Die zweite 2D-Monolage wird auf der Oberseite der zweiten semipermeablen Membran erzeugt, dadurch, dass das in vitro-Testsystem nach einer gewissen Zeit (15 Minuten) wieder zurückgedreht wird.
- 3) Einbringen einer Lösung aus Melanozyten und Hydrogel in die unterste Kanalstruktur. Dabei kann das Verhältnis von Melanozyten zu Hydrogel, die Melanozyten-Zelldichte der Aderhaut von Menschen oder Primaten nachbilden. Bei dem Hydrogel kann es sich um native ECM handeln wie Collagen, Fibronectin oder synthetische Hydrogele wie auf Basis von Dextran. Hierfür werden Eingang und Ausgang des retinalen Pigmentepithelkanals verschlossen. Nährmedium wird bei einer konstanten Flussrate (5 µl/Stunde) in den Eingang des Endothelkanals eingespült und über dessen Ausgang ausgespült. Gleichzeitig wird eine flüssige Lösung aus Hydrogel + Melanozyten in den Eingang des Melanozytenkanals eingespült und dessen Ausgang ausgespült. Das Hydrogel härtet/verfestigt sich im Anschluss im Kanal.
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Mikrophysiologische 3D-Melanozytenkultur auf Basis von Kollagen-Hydrogel
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Modifikation der Kollagen Dichte/Porosität hinsichtlich einer optimalen Vitalität der Melanozyten sowie der Möglichkeit das sich besagte Zellen an das Hydrogel anheften/adhärieren können. Bei einer höheren Kollagenkonzentration (3mg/ml) nimmt die Vitalität stark ab, ebenso können nur eine geringe Anzahl an Melanozyten an das Gel anheften/adhärieren. Dies zeigt sich dadurch, dass diese Zellen sich kugelig ausformen sind. Bei niedrigeren Konzentrationen (2 mg/ml - 1 mg/ml) nimmt die Vitalität signifikant zu und die Zellen können zu einem höheren Anteil an das Hydrogel anheften/adhärieren. Eine optimale Kollagen Konzentration wurde mit 1 mg/ml gefunden, die auch hinsichtlich der Handhabung für das spätere einspülen in den Chip eine bessere Viskosität aufweist. Höhere Konzentration von Kollagen (3 und 2 mg/ml) lassen sich nur schwer pipettieren und somit zusammen mit den Zellen in den Reaktor einspülen.
