EP3137598A1 - Gewinnung von gehirnregion-spezifischen neuronalen kulturen aus dreidimensionalen gewebekulturen von stammzellen - Google Patents

Gewinnung von gehirnregion-spezifischen neuronalen kulturen aus dreidimensionalen gewebekulturen von stammzellen

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EP3137598A1
EP3137598A1 EP15708820.4A EP15708820A EP3137598A1 EP 3137598 A1 EP3137598 A1 EP 3137598A1 EP 15708820 A EP15708820 A EP 15708820A EP 3137598 A1 EP3137598 A1 EP 3137598A1
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EP
European Patent Office
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cells
cell culture
neuronal
stem cells
cell
Prior art date
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Pending
Application number
EP15708820.4A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Olaf Schröder
Corina Ehnert
Alexandra Voss
Benjamin Bader
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Neuroproof GmbH
Original Assignee
Neuroproof GmbH
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Filing date
Publication date
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Pending legal-status Critical Current

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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Definitions

  • the invention relates to neuronal cell culture methods and their use as well as cell cultures produced therewith.
  • the invention relates to a method of producing a neuronal planar cell culture comprising the use of stem cells, e.g. human induced pluripotent stem cells pre-differentiated in a three-dimensional cell aggregate comprising at least two regions corresponding to different brain regions, referred to as cerebral organoid, and taking progenitor cells from a region corresponding to a particular brain region and on a planar support , eg an MEA neurochip, further cultivated.
  • the result is a neural planar cell culture in which the cells form a neural network and have an electrical or electrophysi logical activity that is specific to the particular brain region.
  • Such a cell culture may e.g. in high throughput screening for the testing of substances for neurological effect.
  • a test of drugs in terms of effects on neuronal cells is of great interest for the development of new drugs against neurological disorders such as epilepsy, Parkinson's, Alzheimer's, depression, etc.
  • In vivo studies are usually limited by the complexity of conducting electrical leads from multiple sites and the influence of interconnections with other brain regions.
  • Neuronal cell cultures can be obtained from primary cultures in which cells are taken from a late embryonic stage or postnatally. These are already programmed quite far in their neural development. The in vivo situation is defined by a local neuronal morphological and functional circuit structure. Regardless of the lack of the genetically defined, layered network architecture of the cell bodies, the primary neural networks share many of the characteristics of their source tissue, e.g. phenotypic cell types, receptors, ion channels, intrinsic electrical membrane properties, synaptic development and plasticity. Numerous individual findings have shown that cultures obtained from primary cultures in many ways correspond to the situation of the original tissue.
  • Brain region-specific networks With dissociated neuronal cell cultures taken from specific areas of the brain (eg, cortex, hippocampus, thalamus, spinal cord), brain region specific characteristics and pathological situations can be well mapped.
  • Various working groups have confirmed in animal models that substances in these Brain region-specific networks also electrically induce brain region-specific changes in network activity relevant to the in vivo situation (Gramowski et al., 2000, Xia et al., 2003a, Xia et al., 2003b).
  • the primary neuronal cell cultures develop from a mixture of different types of neurons and types of glial cells.
  • Primary neural networks are composed of different brain region-specific neuron types, such as e.g. Pyramidal cells, motor neurons, various interneurons. Furthermore, they also differentiate various glial cell types, such as astrocytes, microglia and, to a small extent, oligodendrocytes.
  • the glial cells fulfill various functions here.
  • the astrocytes have important auxiliary functions for the metabolism, e.g. Maintaining pH, potassium levels, nutrient supply and recycling and delivery of neurotransmitters.
  • the microglia cells are macrophages located in the brain and act here as the first and main immune system in the central nervous system.
  • the neuronal properties of substances can be studied by evaluating and characterizing the specific changes in neuronal network activity on microelectrode arrays (MEAs).
  • MEAs microelectrode arrays
  • Such network cell cultures are spontaneously active and pharmacologically accessible for several months. It has been shown that these primary cell cultures can be stably reproduced with their brain region-specific receptors (Gramowski et al., 2006, Johnstone et al, 2010) and so have functional and morphological properties e.g. in the frontal cortex and auditory cortex (Xia et al, 2003b), in the spinal cord (Gramowski et al., 2000), and in the striatum (Schock et al., 2010).
  • brain region-specific networks also respond to the applied substances in a substance-specific manner (Gramowski et al., 2004).
  • Xia and Gross (2003a) in their functional electrophysiological studies of ethanol and the antidepressant fluoxetine on primary cortical networks, show excellent agreement between their results and experimental animal studies.
  • the neuronal network activity patterns specific to brain region as well as to substance enable the generation of effect profiles of substances or pathological states with the help of pattern recognition methods and similarity analyzes.
  • the pharmacological and neurotoxic effects of new drug candidates in CNS drug development can be predicted earlier and more rapidly by analyzing functional changes in the networks in spatial and temporal resolution (Johnstone et al., 2010, Gramowski et al., 2010).
  • potential mechanisms of action can be elucidated, which can accelerate the preclinical development of drugs acting in the CNS.
  • NeuroProof technology routinely uses murine neural networks on MEAs to quantify substance effects by measuring the effects of substances on electrophysiological activity patterns.
  • various phenotypic assays of brain region-specific networks such as the frontal cortex, hippocampus, midbrain, thalamus, hypothalamus and spinal cord are used. These are usually cultured in vitro for 4 weeks until the networks and their network activity are differentiated.
  • These complex microcircuits of mature cortical cultures (4 weeks in vitro) have been shown to exhibit functionally very similar network activity in terms of activity levels, synchrony and oscillatory behavior, such as cortical in vivo network activity.
  • Neuronal primary cell cultures of human origin are very limited possible.
  • the use of primary embryonic cell cultures is of ethical concern and their availability is limited. Therefore, these human primary cell cultures are not suitable for routine screening of drugs.
  • animal e.g.
  • murine cells permit only limited predictability of the effects of substances, it would be desirable to increasingly use human stem cells and cells derived therefrom for drug tests. So far, microcircuits similar to those in the vzvo situation could not be found in neuronal cultures derived from human stem cells.
  • such cultures are not suitable because they are extremely limited in their predictive value.
  • Stem cells have a strong self-renewal capacity that allows these cells to regenerate damaged tissue. Because of this, they are widely recognized as an important biological source in regenerative medicine and medical device development. Stem cell-based technologies are already a very valuable new industry subgroup in the future of the medical / clinical industry and will have a major impact on other industries. In particular, induced stem cell differentiation is used to obtain functionally superior, tissue-specific differentiated cells from stem cells, which is already recognized as the core technology of the stem cell industry and will continue to evolve significantly.
  • Pluripotent human stem cells retain the ability to differentiate into every cell type of the body and are thus considered an attractive source of differentiated cells.
  • Tissue-specific differentiated cells from human stem cells provide a great opportunity for basic research in areas of human embryonic development, cell therapy, efficacy testing, cytotoxicity and especially for testing drug candidates.
  • the group of Yamanaka (Takahashi et al., 2006) successfully developed a de-differentiation strategy with transcription factors. Since then, it has been possible to generate these human induced pluripotent stem cells (iPS), which have been shown to be similar to human embryonic stem cells, from human body cells (Park et al., 2008; Takahashi et al., 2007; Yu et al., 2007). This advance enabled the use of patient derived iPS cells and resulted in rapid growth of this technology. In addition, tissue-specific differentiation offers great opportunities for testing the efficacy, cytotoxicity and function of drug candidates.
  • iPS human induced pluripotent stem cells
  • pluripotent stem cells induced from already differentiated body cells enabled the development of specific cells from patients, which can be observed in real time. In addition, they have made it possible to correct some neuronal-specific anomalies through pharmacological intervention in tissue culture.
  • the comparison of iPS cells from healthy individuals and patients identified differences in the stages of differentiation of stem cells into functional neurons, which also offers opportunities for pharmacological intervention (Vaccarino et al 201la, b).
  • mouse pluripotent stem cells such as embryonic stem cells
  • embryonic stem cells have been widely used for differentiation in in vitro studies. They form complex three-dimensional cell aggregates called embryoid bodies (embryoid bodies, EBs).
  • EBs embryoid bodies
  • cells of the neuronal line (Bain et al., 1995) and glial cell lines (Brüst le et al., 1999) can be generated from murine pluripotent stem cells.
  • Some of the early brain development processes are present in this microenvironment of an EB, allowing for an arbitrary collection of precursors and differentiated cells from different lineages.
  • OBs organoid bodies
  • Cell cultures derived from these human embryoid bodies contain cells that express different protein or mRNA markers that are characteristic of at least two different cell types (WO2001053465A1).
  • Embryoid bodies develop when stem cells are cultured under conditions that provide three-dimensional contact of the cells, e.g. the culture in hanging drops, in suspension culture, etc. (DE 102004025080, WO 20051 13747 AI, Wobus et al, 1988,).
  • the resulting embryoid bodies contain different cells of all three cotyledons.
  • differentiation factors it is possible to deliberately produce larger amounts of a specific cell type or to produce embryoid bodies with a specific cell type composition. For example, networks of neuronal cells and glial cells, but also simple neuromuscular networks could be produced. It is proposed to use such embryoid bodies for the testing of active ingredients (DE 102004025080 Al).
  • More complex structures than those in embryoid bodies are formed in organoids, which requires scaffolding for 3D cell culture.
  • the structure and design of the 3D framework are crucial to organize diverse cells.
  • the biological interaction between the cells and the scaffold is controlled by the material properties and scaffolding properties required for optimal cell adhesion, proliferation and differentiation, and the three-dimensional cellular architecture required for organotypic SD cultures to build. Therefore, compared to in vitro stem cell cultures differentiated and cultured in 2D, it is of considerable advantage to reproduce the tissue anatomy in a 3D culture.
  • the recent advancement of 3D cultural techniques has therefore allowed to design very specific cocultures and to integrate stem cells (Haycock 201 1).
  • knowledge of the optimal spatial and temporal microenvironment is critical to the success of organo-typical and tissue-specific differentiations such as those of the cortex or other brain regions.
  • radial glial cells For example, during development of the mammalian cortex, a particular family of glial cells, the so-called radial glial cells, produces layer-specific subtypes of excitatory neurons in a defined chronological order. Here, the neurons of the lower layers are formed first, followed by those of the upper layers, which then migrate through the lower layers of the cerebral cortex (Franco et al., 2012).
  • human pluripotent stem cells are predifferentiated in vitro to form first cortical stem and progenitor cells, which then form cortical projection neurons in a defined temporal order, before they become electrically active and spontaneously active, have active synaptogenesis, and thus form new neuronal interconnections (Gaspard et al., 2009; Shi et al., 2012).
  • WO2013063588 A1 describes the generation of three-dimensional organoids from explants of human tissue for long-term culture, and the use for the screening of possible therapeutics.
  • EP 1088096 A1 describes the testing of active substances on organoids from muscle and nerve cells.
  • WO2001053465 Al describes cells that can be obtained from human embryoid bodies. Among other things, the production of neural networks and their use is disclosed, for example, for drug testing. On the other hand, the inventors have set themselves the task of providing a new method for the production of cell cultures, which is a better test system for active substances, as it can be adapted more specifically to certain pathological conditions and therefore better results on an in vivo situation transmissible results , This object is solved by the subject of the claims.
  • the invention relates to a method of producing a neuronal planar cell culture, comprising steps of
  • pre-differentiated stem cells in a three-dimensional cell aggregate comprising at least two regions corresponding to different brain regions, and
  • c) further cultured on a planar support to produce a neuronal planar cell culture in which the cells form a neural network and have electrical activity specific to the particular brain region.
  • a planar cell culture results from the cells being cultured on a planar support.
  • the cells grow in one plane, that is to say essentially two-dimensionally, the cells obviously having a discrete height.
  • Three-dimensional means in connection with the invention that the cells not only grow in one plane, but also form three-dimensional structures. As a result, morphologically and physiologically different structures are formed as explained above. Appropriate measures (e.g., as outlined in Lancaster et al., 2013) can be used to produce three-dimensional cell aggregates comprising at least two regions corresponding to different brain regions. Simple three-dimensional cell aggregates are the spheres known in the art, but more complex organoids can also be used which are also known in the art. Both are referred to as cerebral organoid in the context of the invention. The cell aggregates may also comprise three, four, five, six, seven, eight, nine, ten or more regions corresponding to different brain regions.
  • hippocampus cerebellum, midbrain, striatum, amygdala, brain stem, thalamus, hypothalamus, basal ganglia, spinal cord, cortex, subcortical nuclei, olfactory bulb, optic nerve, retina, dorsal root ganglia and pituitary gland.
  • the cell aggregate comprises a plurality of cells.
  • cells are removed from a region and further cultured corresponding to a particular brain region.
  • the cell culture produced corresponds to a culture of cells from that one brain region.
  • cells from several regions corresponding to two or more brain regions can also be taken from a cerebral organoid in an experiment in parallel so that, for example, by means of an organoid, e.g. can create a cortex cell culture, a hippocampus cell culture, and / or a thalamic cell culture, depending on what regions are represented in the organoid, and as needed.
  • an organoid e.g. can create a cortex cell culture, a hippocampus cell culture, and / or a thalamic cell culture, depending on what regions are represented in the organoid, and as needed.
  • step b) cells from at least two regions which correspond to a particular brain region are removed (preferably initially separately), wherein these cells are cultured in coculture, in particular in mixed culture, in step c).
  • a co-culture is a culture of different cell types from different brain regions on a planar support, which facilitates communication of cell types from different brain regions, e.g. via neuronal compounds and / or soluble messengers that can be delivered into the medium allowed.
  • a mixed culture is a preferred co-culture in which the different brain regions are mixed and then cultured in appropriate cells.
  • a co-culture is also e.g. in different, possibly separate regions of a cell culture vessel possible, if communication is possible.
  • a co-culture or mixed culture preferably not all cells of the organoid are co-cultured. In particular, cells corresponding to another brain region and present in the organoid can be separated.
  • step b) the cells are removed at a stage which is already terminally differentiated neurons, and also their direct progenitor cells, since in order to form a neural network with electrical activity, the plasticity is increased.
  • the neuron type is already defined.
  • the region corresponding to a particular brain region, from which the cells in b) are taken, has at least one molecular marker for this brain region.
  • Examples of molecular markers for particular brain regions are distinguishable between the developing but differentiable status and the differentiated status.
  • Examples of developing area markers include:
  • markers can be used for specific dividing lines of brain areas, such as FGF8 (brain stem / midbrain border), SHH (diencephalon / midbrain border); BMP, Wnts, SHH (Local Forebrain Limits and Organizer).
  • differentiated marker markers include (in addition to the example markers mentioned above), among others:
  • NPY NPY, AGRP, POMC, CART and Orexin-A for the hypothalamus
  • One or more such molecular markers may be, e.g. after staining with fluorescently labeled antibodies, to identify the region of the organoid corresponding to a particular brain region.
  • the detection of markers can also take place at the RNA level.
  • the stem cells may comprise a detectable transgene, wherein the transgene is operably linked to a promoter that effects expression of the transgene in a particular brain region.
  • a suitable detectable transgene is, for example, the green fluorescent protein (GFP), or similar singularly existing proteins, RNA or DNA markers, or a labeled cell type-specific fusion product such as GFP or His or similar markers which bind to cell-type specific proteins, RNA or DNA were fused.
  • GFP green fluorescent protein
  • plasmid constructs these can be integrated into the undifferentiated iPS cells, for example by viral transduction or transfection, which thus leads to a cell type and differentiation stage-specific labeling of cells. This marks a defined region within the organoid.
  • multiple regions can be labeled simultaneously, with distinguishable detectable transgenes should be used.
  • a detection of the transgene is used to select the cells to be removed.
  • the promoters of the aforementioned markers can be used for this purpose, for example.
  • the region corresponding to a particular brain region from which the cells in b) are taken may be identified upon removal by infrared spectroscopy.
  • the region may be identified microscopically visually by morphological and anatomical structural relationships.
  • the selection of the correct region after collection and culture can be made by comparing the electrical activity of the cell culture with typical neuronal cell cultures from the particular region, e.g. be stored in a database, be verified. Alternatively, in this way, the particular brain region can be identified retrospectively.
  • the stem cells used to produce the cerebral organoids are adult stem cells or pluripotent stem cells, more preferably induced pluripotent stem cells.
  • the use of human stem cells is basically preferred, in particular human pluripotent, preferably human induced pluripotent stem cells can be used.
  • no human embryos are used or destroyed in the production of the stem cells.
  • It may also be non-human, e.g. to be mouse, rat or monkey stem cells, e.g. to non-human embryonic stem cells.
  • Stem cells from umbilical cord blood can also be used by humans.
  • the stem cells are stem cells isolated from a preferably human patient, again preferably induced pluripotent stem cells.
  • the planar support may e.g. a cell culture dish, wherein an analysis of the electrical activity, e.g. based on calcium signaling and corresponding imaging techniques is possible.
  • the planar support is preferably a microelectrode array (MEA) neurochip.
  • MEA microelectrode array
  • the electrical network activity of the neurons is recorded, analyzed and characterized and classified at the level of action potential patterns.
  • Neuroactive substances change the tissue-specific activity patterns in a specific way and can thus be characterized by changes in their electrical properties in the network.
  • a corresponding profile can be created by a multivariate data analysis developed and available from NeuroProof GmbH (Rostock, DE), which analyzes more than 200 features describing electrical activity.
  • the outstanding advantage of MEA technology over other neuronal cell electrical assessment techniques is the simultaneous recording of electrical signals in multi-cellular networks, which also allow communication between neurons to be studied.
  • the population of neurons analyzed when analyzed with an MEA chip typically comprises between at least 6 and a maximum of 256, usually between 10 and 50 cells.
  • the neurons in the cultures form networks with neighboring neurons. A communication of the neurons of a network via electrical and / or chemical synapses.
  • MEA Neurochips are available from the University of North Texas Center for Network Neuroscience (CNNS).
  • These 5x5 cm 2 glass chips have a central matrix with a diameter of 2 mm 2 , which includes 64 (or in another embodiment 2 x 32) passive electrodes and indium-tin interconnects embedded in silicone and as gold-plated free electrodes end up.
  • the electrode diameter is 20 ⁇ , the minimum distance between the electrodes is 40 ⁇ .
  • the MEA chips are deposited in a dissipation chamber (CNNS) on the preamplifier station (Plexon Inc, Dallas TX, USA), which contains a temperature control and 64 pre-amplifiers. The extracellular action potentials are recorded using a computer-controlled 64-channel amplifier system (Plexon Inc, Dallas TX, USA).
  • action potentials of up to four different neurons can be derived from each electrode.
  • the individual signals are separated and recorded using their action potential form using the recording software.
  • signals from up to 256 neurons can be recorded on a 64-electrode MEA neurochip.
  • the amplitude of the extracellular signals is in the range of 15 to 1800 ⁇ .
  • the sampling frequency of the signals is 40 kHz. This makes it possible to analyze not only the temporal sequence of the action potentials but also their course (waveform).
  • the times of the occurrence of the action potentials are continuously recorded in chronological order (spiketrains).
  • Action potentials are generated individually or in bursts (groups of rapidly successive action potentials).
  • the characteristics of this network Work communication can be analyzed with a variety of features based on the electrical activity of individual neurons. These features describe the synchrony and connectivity of the networks and their pharmacological influence.
  • the bursts can be defined with the software NPWaveX developed by NeuroProof (NeuroProof GmbH, Rostock, DE).
  • the networks of different tissues can be distinguished based on their electrical fingerprint, which is expressed in the activity of the neurons, the burst structure, the regularity of the occurrence of the bursts, and the synchronicity.
  • the temporal sequence of action potentials is characteristic for the various brain regions. These networks can be used to study the function of individual brain regions that are relevant to certain diseases.
  • the brain region-specific activity patterns may also be pharmacologically influenced.
  • stem cells predifferentiate in three-dimensional cultures, biologically relevant cellular signaling pathways and intercellular communication are formed. Compared with the two-dimensional differentiation of stem cells into different types of neurons, this technology has the advantage that the in vivo organ situation is better mapped. The complex morphology and interconnection of cells and regions allow biologically relevant cell-cell contacts and cell-matrix interactions. This allows similar physiological response patterns to be achieved as in vivo.
  • planar cultures produced according to the invention are more suitable for the investigation of drugs on their physiological activity as three-dimensional cell clusters which can be used according to the prior art:
  • Two-dimensional cultures have less ischemic conditions, since efficient gas exchange with the surrounding medium is ensured.
  • physiologically specific cell cultures according to the invention physiologically better predictive tests can be carried out for pharmacological questions.
  • the isolation of specific neurons, neuronal groups or regions from the cerebral organoids and their further cultivation on microelectrode arrays allows the individual electrical analysis of individual neurons and neuron groups in their network in their region-specific properties.
  • Dissociated neurons from different brain regions of the mouse exhibit typical patterns of activity resulting from the specific composition of various excitatory and inhibitory types of neurons. These patterns and their changes can be characterized after application of substances.
  • These two-dimensional cell cultures are particularly useful for the pharmacological study of the networks because Substance effects can be examined directly on the cells in concentration-response curves.
  • the present invention thus also provides a method for testing a substance comprising steps of:
  • a) produces a neuronal planar cell culture with the method according to the invention, b) analyzes the cells,
  • a substance may be an already known drug with neuronal effects, but also a substance not previously characterized in this respect. It may be, for example, a Protein, a peptide, a lipid, a sugar, a nucleic acid, an antibody or a low molecular weight (up to 900 g / mol) molecule.
  • the invention also provides a method for evaluating the differentiation of a neuronal planar cell culture comprising steps of:
  • a) produces a neuronal planar cell culture with the method according to the invention, b) analyzes the cell culture.
  • Such a method is e.g. useful to study neuronal developmental disorders, or to gain further insight into the physiological and / or pathological development of the brain and / or cerebral organoids. It can also be used to optimize cerebral organoid culture conditions, particularly with respect to the preparation of planar neuronal cell cultures of the invention that correspond to particular brain regions. This method further allows the identification of biological markers, as well as their changes in the expression pattern that are formed or modified in the development of a disease, or may lack and allow the creation of a personalized disease pattern specific to the patient from which the source cells were taken, from which the stem cells are derived.
  • the invention also provides a method for diagnosing or classifying a pathological condition, comprising steps of:
  • a) with the method according to the invention produces a neuronal planar cell culture from stem cells of a patient with a pathological condition
  • the invention also provides a method for optimizing the drug therapy of a patient comprising steps of: a) using the method according to the invention to produce a neuronal planar cell culture from stem cells of a patient,
  • the optimization of the therapy may be an optimization of the dose of a drug and / or a selection of a therapeutically effective drug.
  • the analysis can be based on that one
  • a) analyzes the morphology of the cells, and / or
  • analyzing expression pattern of the cells preferably using a method selected from the group comprising detection of markers by fluorescence microscopy, spectroscopic assay, immunohistochemical assay, immunocytochemical assay, FACS, immunoassay, enzymatic assay, protein assay, electrophoretic and chromatographic assay, HPLC, Western blot, Northerblot, Southerblot, luminescence detection assay, ELISA binding assay and colorimetric assay, and / or
  • the cells can be analyzed in a high-throughput screening by photometric measurements of the activity in multiwell format or, preferably, by recording the electrical activity of the neurons with microelectrode arrays in multiwell format.
  • Suitable software for analyzing electrical activity is available from Neuroproof GmbH, Rostock, Germany (NPWaveX).
  • the invention also relates to a neuronal planar cell culture which can be produced by a method according to the invention.
  • the stem cells may be derived from a human patient with a pathological condition, for the first time in vitro analysis and thus systematic testing of patient neurons from a particular brain region, e.g. allowed on a MEA neurochip.
  • the cell culture according to the invention may also comprise a co-culture or mixed culture of cells which does not occur physiologically in this form, eg a co-culture or Mixed culture of cells from cortex and hippocampus, amygdala and hippocampus, striatum and frontal cortex, midbrain and cortex and other combinations.
  • the cell culture is a human neuronal cell culture present on an MEA neurochip.
  • Fig. 1 Native activity of various tissue-specific neuronal cell cultures from murine embryos on MEAs.
  • C midbrain
  • Hc hippocampus
  • FIG. 2 A Native activity of a murine hippocampal network in which the hippocampus was prepared on embryonic day E17. A shows a synchronous, ictal activity in the form of population bursts lasting> 5 s. An application of 50 ⁇ carbamazepine to the same network prevented the long population bursts. All neurons are still active and generate short bursts (B). Shown are the timestamps (spikes) of 10 neurons over a period of 80 s each.
  • the inventors were able to show that networks from certain brain regions express specific patterns of activity. These can be clearly differentiated on the basis of the native Spike Trains.
  • the culture was carried out in serum-containing cell culture medium with glucose.
  • the cell density was adjusted tissue-specific.
  • 300 ⁇ of this cell suspension were transferred to the electrode field on the MEA neurochips.
  • 100 ⁇ of feeder cells were added outside the electrode field, which serve to condition the networks but can not form any physical contacts with the neurons to be analyzed.
  • the 204 activity-descriptive features used include features that describe the general activity of the networks, the burst structure, the regularity of the occurrence of the bursts, and the synchronicity of the networks.
  • the four tissues may differ in some of these features. All datasets were used to compare the native activity of the networks. Cross-validation was performed to check if the different culture types differ from each other. For this purpose, a classifier with 90% each randomly selected data sets was trained. Subsequently, the remaining 10% of these records were then classified against the learning dataset. The% allocation of the native activity in the respective tissues was determined. It could be shown that all native activities of the tissue-specific networks with a high recognition rate (85% -96%) can be classified in the activity of the respective brain regions. The activity patterns of the different tissues can therefore be quantified.
  • a feature score was identified to evaluate descriptive features for tissue differentiation.
  • the features listed in the table are features that are among the top 15 descriptive features of all 204 features.
  • FC frontal cortex
  • SC spinal cord
  • Mb + FC midbrain + frontal cortex
  • Hc hippocampus
  • Cells that are specific to a particular brain region e.g. the hippocampus, are identified, e.g. by staining with fluorescently labeled antibodies against a marker specific for this region (e.g., parvalbumin, cholecystokinin, somatostatin, calretinin, NRP2, DZF9, PROX1 for the hippocampus).
  • a marker specific for this region e.g., parvalbumin, cholecystokinin, somatostatin, calretinin, NRP2, DZF9, PROX1 for the hippocampus.
  • the identified regions are isolated from the remaining, unlabeled organoid by means of microsections, and the organoid piece removed is enzymatically digested in order to separate the cells.
  • the enzymatic comminution should be carried out by incubation in papain and DNase in a C0 2 incubator at 37 ° C. Thereafter, the tissue-enzyme mixture is centrifuged for 4 min at 800 rpm. The supernatant is carefully withdrawn with a serological pipette and discarded. The cell pellet is titrated with a serological pipette until the cell suspension appears cloudy. Thereafter, the centrifuge tube is allowed to stand for 5 minutes to allow larger cell aggregates to settle.
  • the supernatant is then transferred to a new 50 ml centrifuge tube and processed further.
  • the cell count is determined by means of a Neubauer counting chamber and the cell number is set to an optimized value.
  • Each electrode field is given a drop of 300,000 cells each.
  • the cell suspension should then be applied to the electrode pads of the MEA neurochips previously treated with poly-D-lysine and laminin for better attachment of the cells.
  • the MEA Neurochips with the Cell Suspension Drops are in the Incubated incubator, after about 2 h, the chips are filled with 3 ml of cell culture medium (such as DMEM or Neurobalsalmedium with the appropriate additives for better growth of the cells).
  • the cultivation is carried out in an incubator at 37 ° C and a C0 2 content, which is adapted to the cell culture medium.
  • the cells are fed every 3-4 days by replacing 1/3 of the medium with fresh medium.
  • an antimitotic treatment may be performed by adding FDU (fluoro-deoxy-uridines) and uridines to the culture medium. This prevents the further proliferation of the glial cells. The two antimitotics were gradually removed with each further change of medium. The time of stable electrical activity is determined and determined for substance screening.
  • FDU fluoro-deoxy-uridines
  • uridines uridines
  • the type of cells or the corresponding brain regions can be confirmed again with the help of markers and / or transgenes.
  • the electrical activity - as described in Example 1 for murine cells - can be analyzed with MEA neurochips. If testing of a substance is intended, the electrical activity can be analyzed before and after exposure to the substance.
  • Haycock 2011 3D cell culture a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695: 1-15

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Abstract

Die Erfindung betrifft neuronale Zellkulturverfahren und ihre Verwendung sowie damit hergestellte Zellkulturen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer neuronalen planaren Zellkultur, bei dem man Stammzellen, z.B. humane induzierte pluripotente Stammzellen, in einem dreidimensionalen Zellaggregat vordifferenziert, welches mindestens zwei Regionen umfasst, die unterschiedlichen Gehirnregionen entsprechen, und welches als zerebrales Organoid bezeichnet wird, und Progenitor-Zellen aus einer Region, die einer bestimmten Gehirnregion entspricht, entnimmt und auf einem planaren Träger, z.B. einem MEA-Neurochip, weiter kultiviert. Dabei entsteht eine neuronale planare Zellkultur, bei der die Zellen ein neuronales Netzwerk bilden und eine elektrische bzw. elektrophysiologische Aktivität aufweisen, die für die bestimmte Gehirnregion spezifisch ist. Eine derartige Zellkultur kann z.B. im Hochdurchsatzscreening für das Testen von Substanzen auf neurologische Wirkung verwendet werden.

Description

Gewinnung von Gehirnregion-spezifischen neuronalen Kulturen aus dreidimensionalen Gewebekulturen von Stammzellen
Die Erfindung betrifft neuronale Zellkulturverfahren und ihre Verwendung sowie damit hergestellte Zellkulturen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer neuronalen planaren Zellkultur, bei dem man Stammzellen, z.B. humane induzierte pluripotente Stammzellen, in einem dreidimensionalen Zellaggregat vordifferenziert, welches mindestens zwei Regionen umfasst, die unterschiedlichen Gehirnregionen entsprechen, und welches als zerebrales Organoid bezeichnet wird, und Progenitor-Zellen aus einer Region, die einer bestimmten Gehirnregion entspricht, entnimmt und auf einem planaren Träger, z.B. einem MEA-Neurochip, weiter kultiviert. Dabei entsteht eine neuronale planare Zellkultur, bei der die Zellen ein neuronales Netzwerk bilden und eine elektrische bzw. elektrophysio logische Aktivität aufweisen, die für die bestimmte Gehirnregion spezifisch ist. Eine derartige Zellkultur kann z.B. im Hochdurchsatzscreening für das Testen von Substanzen auf neurologische Wirkung verwendet werden.
Ein Test von Wirkstoffen in Bezug auf Wirkungen bei neuronalen Zellen ist für die Entwicklung neuer Medikamente gegen neurologische Erkrankungen wie Epilepsie, Parkinson, Alzheimer, Depressionen usw. von großem Interesse. In vivo Studien sind meistens limitiert durch die Komplexität in der Durchführung von elektrischen Ableitungen von mehreren Stellen und durch den Einfluss der Verschaltungen mit anderen Gehirnregionen.
Neuronale Zellkulturen können aus Primärkulturen gewonnen werden, bei denen Zellen aus einem späten embryonalen Stadium oder postnatal entnommen werden. Diese sind also schon recht weit in ihrer neuronalen Entwicklung programmiert. Die in vivo Situation ist jeweils durch eine lokale neuronale morphologische und funktionelle Schaltkreisstruktur definiert. Unabhängig von dem Fehlen der genetisch definierten, geschichteten Netzwerkarchitektur der Zellkörper, teilen die primären neuronalen Netzwerke viele Eigenschaften ihres Ursprunggewebes, wie z.B. phänotypische Zelltypen, Rezeptoren, Ionenkanäle, intrinsische elektrische Membraneigenschaften, die synaptische Entwicklung und die Plastizität. In zahlreichen Einzelbefunden konnte gezeigt werden, dass aus Primärkulturen gewonnene Kulturen in vielfältiger Weise der Situation des Ursprungsgewebes entsprechen.
Mit dissoziierten neuronalen Zellkulturen, die aus spezifischen Gebieten des Gehirns entnommen werden (z.B. Kortex, Hippocampus, Thalamus, Rückenmark) können Hirnregionspezifische Eigenschaften und pathologische Situationen sehr gut abgebildet werden. Verschiedene Arbeitsgruppen haben in Tiermodellen bestätigt, dass Substanzen in diesen Gehirnregion-spezifischen Netzwerken elektrisch auch Gehirnregion-spezifische Änderungen in der Netzwerkaktivität induzieren, die für die in vivo Situation relevant sind (Gramowski et al, 2000, Xia et al. 2003a, Xia et al. 2003b).
Wie in ihrem Ursprungsgewebe entwickeln sich die primären neuronalen Zellkulturen aus einem Gemisch verschiedener Neuronentypen und Gliazelltypen. Primäre neuronale Netzwerke setzen sich aus verschiedenen Gehirnregion-spezifischen Neuronentypen zusammen, wie z.B. Pyramidenzellen, Motoneuronen, diversen Interneuronen. Des Weiteren differenzieren sie auch diverse Glia-Zelltypen, wie Astrozyten, Mikroglia und zu einem geringen Anteil auch Oligodendrozyten aus. Wie auch im Gehirn erfüllen die Gliazellen hier verschiedenste Funktionen. Die Astrozyten haben wichtige Hilfsfunktionen für den Metabolismus, wie z.B. die Aufrechterhaltung des pH- Werts, des Kaliumspiegels, der Versorgung mit Nährstoffen und dem Recycling und Bereitstellung von Neurotransmittern. Die Mikroglia-Zellen sind im Gehirn angesiedelte Makrophagen und agieren hier als erste und hauptsächliche Immunabwehr im zentralen Nervensystem.
Die neuronalen Eigenschaften von Substanzen können untersucht werden, indem man die durch sie bewirkten spezifischen Änderungen in der Aktivität neuronaler Netzwerke auf Mikroelektroden-Arrays (MEAs) evaluiert und charakterisiert. Solche Netzwerk-Zellkulturen sind über mehrere Monate spontan aktiv und pharmakologisch zugänglich. Es wurde gezeigt, dass diese primären Zellkulturen stabil mit ihren Gehirnregion-spezifischen Rezeptoren reproduziert werden können (Gramowski et al, 2006, Johnstone et al, 2010) und so funktionale und morphologische Eigenschaften z.B. in Frontalkortex und auditorischem Kortex (Xia et al, 2003b), im Rückenmark (Gramowski et al., 2000) und im Striatum (Schock et al, 2010) untersucht werden können.
Diese Gehirnregion-spezifischen Netzwerke reagieren auch in einer Substanz-spezifischen Weise auf die applizierten Substanzen (Gramowski et al., 2004). Xia und Gross (2003a) zeigen in ihren funktionalen elektrophysio logischen Studien von Ethanol und dem Antidepressivum Fluoxetin auf primären kortikalen Netzwerken eine hervorragende Übereinstimmung ihrer Ergebnisse mit Untersuchungen aus experimentalen Studien an Tieren.
Die sowohl für Gehirnregion als auch für Substanz spezifischen Aktivitätsmuster der neuronalen Netzwerke ermöglichen mit Hilfe von Mustererkennungsmethoden und Ähnlichkeitsanalysen die Erstellung von Wirkungsprofilen von Substanzen oder pathologischen Zuständen. Dadurch können die pharmakologischen und neurotoxischen Effekte von neuen Substanzkandidaten in der ZNS-Medikamentenentwicklung früher und schneller vorhergesagt werden, indem man funktionale Änderungen in den Netzwerken in einer räumlichen und zeitlichen Auflösung analysiert (Johnstone et al., 2010; Gramowski et al., 2010). Dadurch können potentielle Wirkmechanismen aufgeklärt werden, was die präklinische Entwicklung von im ZNS wirkenden Medikamenten beschleunigen kann.
Die NeuroProof Technologie (Neuroproof GmbH, Rostock, Deutschland) verwendet murine neuronale Netzwerke auf MEAs routinemäßig zur Quantifizierung von Substanzeffekten durch die Messung der Einflüsse von Substanzen auf elektrophysiologische Aktivitätsmuster. Hier kommen verschiedene phänotypische Assays von Gehirnregion-spezifischen Netzwerken wie dem Frontalkortex, Hippocampus, Mittelhirn, Thalamus, Hypothalamus und Rückenmark zum Einsatz. Diese werden in der Regel für 4 Wochen in vitro kultiviert, bis die Netzwerke und deren Netzwerkaktivität ausdifferenziert sind. Es wurde gezeigt, dass diese komplexen Mikroverschaltungen von ausgereiften kortikalen Kulturen (4 Wochen in vitro) eine funktional sehr ähnliche Netzwerkaktivität hinsichtlich der Aktivitätsstärke, der Synchronität und des Oszillationsverhaltens zeigen, wie die kortikale in vivo Netzwerkaktivität.
Neuronale Primärzellkulturen humanen Ursprungs sind sehr limitiert möglich. Besonders die Verwendung von primären embryonalen Zellkulturen ist aus ethischen Gründen bedenklich, und ihre Verfügbarkeit ist begrenzt. Daher sind diese humanen primären Zellkulturen nicht für ein Routine- Screening von Wirkstoffen geeignet. Da die Verwendung tierischer, wie z.B. muriner Zellen aber nur bedingt eine gute Vorhersagbarkeit der Wirkungen von Substanzen erlauben, wäre es erstrebenswert, humane Stammzellen und daraus entwickelte Zellen vermehrt für Wirkstofftestungen einzusetzen. Bisher konnten aber bei aus humanen Stammzellen gewonnen neuronalen Kulturen Mikroschaltkreise ähnlich der in vzvo-Situation nicht gefunden werden. Für eine Verwendung zur Testung von Substanzen für pharmakologische Zwecke sind solche Kulturen nicht geeignet, da sie in ihrer Prädiktivität extrem limitiert sind.
Stammzellen weisen eine starke Selbsterneuerungskapazität auf, die es diesen Zellen ermöglicht, beschädigtes Gewebe zu regenerieren. Deswegen sind sie weithin als eine wichtige biologische Quelle in der regenerativen Medizin und Medizintechnik Entwicklung anerkannt. Stammzellbasierte Technologien bilden bereits eine sehr wertvolle neue Industrieuntergruppe in der Zukunft der medizinisch/klinischen Industrie und werden große Auswirkungen auf andere Industriebereiche haben. Insbesondere die induzierte Stammzelldifferenzierung wird verwendet, um funktionell überlegene, gewebespezifisch differenzierte Zellen aus Stammzellen zu erhalten, was bereits als Kerntechnologie der Stammzellindustrie anerkannt ist und diese deutlich weiter entwickeln wird.
Pluripotente menschlichen Stammzellen behalten die Fähigkeit, in jeden Zelltyp des Körpers zu differenzieren und gelten somit als attraktive Quelle für differenzierte Zellen. Gewebespezifisch differenzierte Zellen aus menschlichen Stammzellen bieten eine große Möglichkeit für die Grundlagenforschung in Gebieten der menschlichen Embryonalentwicklung, Zelltherapie, Wirksamkeitsprüfung, Zytotoxizität und vor allem zur Testung von Wirkstoffkandidaten. Im Jahr 2006 wurde von der Gruppe von Yamanaka (Takahashi et. al. 2006) erfolgreich eine de-Differenzierungsstrategie mit Transkriptionsfaktoren entwickelt. Seitdem ist es möglich, diese menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS), von denen gezeigt wurde, dass sie den menschlichen embryonalen Stammzellen ähnlich sind, aus menschlichen Körperzellen zu generieren (Park et. al. 2008; Takahashi et. al. 2007; Yu et. al. 2007). Dieser Fortschritt ermöglichte die Verwendung von aus Patienten stammenden iPS-Zellen und hatte ein schnelles Wachstum dieser Technologie zur Folge. Darüber hinaus bietet die gewebespezifische Differenzierung große Chancen für die Prüfung der Wirksamkeit, der Zytotoxizität und der Funktion von Wirkstoffkandidaten.
Das Verfahren, aus bereits differenzierten Körperzellen induzierte pluripotente Stammzellen zu bilden, ermöglichte die Entwicklung von spezifischen Zellen aus Patienten, welche in Echtzeit beobachtet werden können. Darüber hinaus haben sie ermöglicht, einige neuronal- spezifischen Anomalien durch einen pharmakologischen Eingriff in Gewebekulturen zu korrigieren. Darüber hinaus wurden durch den Vergleich von iPS-Zellen aus gesunden Individuen und Patienten Unterschiede in den Stadien der Differenzierung von Stammzellen zu funktionellen Neuronen identifiziert, was ebenso Möglichkeiten für eine pharmakologische Intervention bietet (Vaccarino et. al. 201 la,b).
Aktuelle Arbeiten in der Neuropsychiatrie mit iPS-Zellen von Patienten konzentrieren sich auf Erkrankungen, welche spezifische genetische Defizite aufweisen, wodurch bisher unbekannte Pathologien mit wenig bzw. unbekannter Herkunft aufgedeckt wurden und eine pharmakologische Interventionen ermöglicht wurde (Vaccarino et. al. 201 lb).
Für ein Testen von Wirkstoffen muss üblicherweise ein breites Spektrum von differenzierten Zellen in verschiedene und spezialisierte Zellkulturen separat hergestellt werden. Bei Verwendung herkömmlicher adulter Stammzellen mit einem begrenzten Differenzierungsspektrum erfordert dies gewöhnlich die Züchtung der differenzierten Zellkulturen aus unterschiedlichen Ausgangsstammzellen mit oft sehr unterschiedlichen Anforderungen an die Wachstumsbedingungen. Dies ist in der Regel mit einem großen Aufwand an Zeit und Kosten verbunden. Dieser Nachteil kann durch Verwendung pluripotenter embryonaler Stammzellen, die in unterschiedlichste Zelltypen aller drei Keimblätter differenzieren können, teilweise vermieden werden, dies ist jedoch durch bereits erwähnte ethische Gründe stark limitiert. Überdies sind selbst bei der Verwendung pluripotenter embryonaler Stammzellen in diesen herkömmlichen Testsystemen mehrere verschiedene und räumlich getrennte Zellkulturen erforderlich. Ein weiterer, wesentlicher Nachteil dieser Zellmonokulturen besteht darin, dass die Wirkung einer Substanz auf einen Verbund verschiedener Zellen, wie er in einem natürlichen Gewebe oder Organ vorliegt, nicht untersucht werden kann.
In der Vergangenheit wurden pluripotente Stammzellen der Maus wie embryonale Stammzellen weithin zur Differenzierung für in vitro Studien verwendet. Sie bilden komplexe dreidimensionale Zellaggregate, die als embryoide Körper bezeichnet werden (embryoid bodies, EBs). Durch diesen Zwischenschritt können Zellen der neuronalen Linie (Bain et. al. 1995) sowie Gliazelllinien ( Brüst le et. al. 1999) aus murinen pluripotenten Stammzellen erzeugt werden. Einige der frühen Gehirnentwicklungsprozesse sind in dieser Mikroumgebung eines EB's vorhanden, was einer willkürlichen Ansammlung von Vorläufer und differenzierten Zellen aus verschiedenen Linien ermöglicht. Diese Studien haben das wissenschaftliche Feld der Embryoidkörper und komplexeren Organoiden (organoids, organoid bodies, OB 's) aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen eröffnet. Zellkulturen, die aus diesen menschliche Embryoidkörpern abgeleitete sind, enthalten Zellen, die unterschiedliche Protein-oder mRNA-Marker exprimieren, die charakteristisch für mindestens zwei verschiedene Zelltypen sind (WO 2001053465 AI).
Embryoidkörper entwickeln sich, wenn Stammzellen unter Bedingungen kultiviert werden, die für einen dreidimensionalen Kontakt der Zellen sorgen, wie z.B. die Kultur in hängenden Tropfen, in Suspensionskultur usw. (DE 102004025080, WO 20051 13747 AI , Wobus et al, 1988,). Die entstehenden Embryoidkörper enthalten verschiedene Zellen aller drei Keimblätter. Durch Einsatz von Differenzierungsfaktoren können gezielt größere Mengen eines bestimmten Zelltyps hergestellt bzw. Embryoidkörper mit einer bestimmten Zelltyp- Zusammensetzung erzeugt werden. Es konnten beispielsweise Netzwerke aus neuronalen Zellen und Gliazellen, aber auch einfache neuromuskuläre Netzwerke hergestellt werden. Es wird vorgeschlagen, derartige Embryoidkörper für das Testen von Wirkstoffen zu verwenden (DE 102004025080 AI).
Komplexere Strukturen als die in Embryoidkörpern werden in Organoiden gebildet, was ein Gerüst für ein 3D-Zellkultur erforderlich macht. Hierbei sind der Aufbau und das Design des 3D-Gerüstes von entscheidender Bedeutung, um verschiedenartige Zellen zu organisieren. Innerhalb dieser 3D-Matrix wird die biologische Wechselwirkung zwischen den Zellen und dem Gerüst gesteuert durch die Materialeigenschaften und die Gerüsteigenschaften, welche für eine optimale Zelladhäsion, Proliferation und Differenzierung erforderlich sind, und die dreidimensionale zelluläre Architektur, welche erforderlich ist, um organotypische SD- Kulturen zu bilden. Im Vergleich zu in vitro Stammzellkulturen, die in 2D differenziert und kultiviert werden, ist es daher von erheblichem Vorteil, die Gewebeanatomie in einer 3D Kultur zu reproduzieren. Die jüngere Weiterentwicklung der 3D Kulturtechniken hat daher ermöglicht, sehr spezifische Kokulturen zu entwerfen und Stammzellen zu integrieren (Haycock 201 1). Dennoch ist das Wissen über die optimale räumlich und zeitlich Mikroumgebung entscheidend für den Erfolg von organo typischen und Gewebe-spezifischen Differenzierungen wie die des Kortex oder anderer Hirnregionen.
Beispielsweise erzeugt während der Entwicklung des Säugerkortex eine bestimmte Familie von Gliazellen, die sogenannten radialen Gliazellen, Schicht-spezifische Subtypen von exzitatorischen Neuronen in einer definierten zeitlichen Reihenfolge. Hier werden die Neuronen der unteren Schichten zuerst gebildet, gefolgt von denen der oberen Schichten, welche dann durch die unteren Schichten der Hirnrinde wandern (Franco et. al. 2012).
In 2D-Kulturen aus embryonalen pluripotenten Stammzellen wurde gezeigt, dass es möglich ist, menschliche zerebrale neokortikale Stammzellen und funktionelle Neurone aller Klassen von kortikalen Projektionsneuronen zu bilden. Dabei wird der Prozess der kortikalen Entwicklung rekapituliert. Zunächst werden in vitro die menschlichen pluripotenten Stammzellen vordifferenziert, um erste kortikale Stamm- und Vorläuferzellen zu bilden, die dann kortikale Projektionsneurone in einer definierten zeitlichen Reihenfolge bilden, bevor diese spontan elektrisch aktiv werden und Aktionspotentiale aufweisen sowie aktive Synaptogenese betreiben und somit neue neuronale Verschaltungen bilden (Gaspard et. al. 2009; Shi et. al. 2012).
Lancaster et. al. (2013, Nature 501 : 373-9) haben ein dreidimensionales Organoid- kultursystem entwickelt, welches aus menschlichen pluripotenten Stammzellen gebildet wurde und verschiedene diskret entwickelte und voneinander abhängige Hirnregionen aufweist. Dazu gehört u.a. eine Großhirnrinde, welche eine Vorläuferzellpopulation enthält, welche in der Lage ist, reife kortikale Neuronensubtypen zu produzieren und zu organisieren. Außerdem rekapitulieren diese zerebralen Organoide die Merkmale der menschlichen kortikalen Entwicklung, nämlich eine charakteristische Organisation in Zonen aus Vorläufern, wie der subventrikulären Zone, welche die in vivo auftretenden äußeren radialen Gliazellen enthält. Diese jüngste Entwicklung eines neuen dreidimensionalen Kultursystem für die Differenzierung von zerebralen Organoiden aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen ermöglicht die „in vitro Montage" eines menschlichen embryonalen Gehirnäquivalents, das die Entwicklung des Gehirn rekapituliert. Diese Organoide enthalten Vorläuferpopulationen, die sich in kortikale Neuronen-Subtypen entwickeln können, was die in vitro Untersuchung komplexer Hirnerkrankungen ermöglichen könnte, von denen geeignete Tiermodelle fehlen (Muzio & Consalez 2013). Cerebrale Organoide oder cerebrale organoide Körper, die aus pluripotenten humanen Stammzellen hergestellt werden können, weisen verschiedene (mindestens zwei) diskrete Regionen auf, in denen bekannte, für Gehirnregionen spezifische molekulare Markerproteine nachgewiesen werden können.
WO2013063588 AI beschreibt die Generierung von dreidimensionalen Organoiden aus Explantaten menschlichen Gewebes zur Langzeitkultur, und die Nutzung zum Screening von möglichen Therapeutika. EP 1088096 AI beschreibt das Testen von Wirkstoffen an Organoiden aus Muskel- und Nervenzellen.
WO2001053465 AI beschreibt Zellen, die aus humanen embryoiden Körpern gewonnen werden können. Unter anderem wird die Herstellung neuronaler Netzwerke und deren Verwendung zum Beispiel zum Testen von Wirkstoffen offenbart. Dem gegenüber stellten sich die Erfinder die Aufgabe, ein neues Verfahren zur Herstellung von Zellkulturen zur Verfügung zu stellen, die ein besseres Testsystem für Wirkstoffe darstellen, da es spezifischer auf bestimmte pathologische Zustände angepasst werden kann und daher besser auf eine in vivo Situation übertragbare Ergebnisse ergibt. Diese Aufgabe wird durch den Gegenstand der Ansprüche gelöst.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer neuronalen planaren Zellkultur, Schritte umfassend, bei denen man
a) Stammzellen in einem dreidimensionalen Zellaggregat vordifferenziert, welches mindestens zwei Regionen umfasst, die unterschiedlichen Gehirnregionen entsprechen, und
b) Zellen aus mindestens einer Region, die einer bestimmten Gehirnregion entspricht, entnimmt und
c) auf einem planaren Träger weiter kultiviert, wobei eine neuronale planare Zellkultur entsteht, bei der die Zellen ein neuronales Netzwerk bilden und eine elektrische Aktivität aufweisen, welche für die bestimmte Gehirnregion spezifisch ist.
Eine planare Zellkultur ergibt sich daraus, dass die Zellen auf einem planaren Träger kultiviert werden. Dadurch wachsen die Zellen in einer Ebene, also im wesentlichen zweidimensional, wobei die Zellen selbstverständlich eine diskrete Höhe aufweisen.
Dreidimensional bedeutet im Zusammenhang mit der Erfindung, dass die Zellen nicht nur in einer Ebene wachsen, sondern auch dreidimensionale Strukturen ausbilden. Dadurch bilden sich, wie eingangs erläutert, morphologisch und physiologisch unterschiedliche Strukturen aus. Durch geeignete Maßnahmen (z.B. erläutert in Lancaster et al., 2013) lassen sich dreidimensionale Zellaggregate herstellen, die mindestens zwei Regionen umfassen, die unterschiedlichen Gehirnregionen entsprechen. Einfache dreidimensionale Zellaggregate sind die im Stand der Technik bekannten Sphären, es können aber auch komplexere Organoide verwendet werden, die ebenfalls im Stand der Technik bekannt sind. Beides wird im Rahmen der Erfindung als zerebrales Organoid bezeichnet. Die Zellaggregate können auch drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn oder mehr Regionen umfassen, die unterschiedlichen Gehirnregionen entsprechen. Als unterschiedliche Gehirnregionen werden im Rahmen der Erfindung bezeichnet: Hippocampus, Kleinhirn, Mittelhirn, Striatum, Amygdala, Stammhirn, Thalamus, Hypothalamus, Basalganglien, Rückenmark, Kortex, subkortikale Kerne, Riechkolben, optischer Nerv, Retina, Spinalganglien und Hypophyse. Es können also z.B. Zellen entnommen werden, die Hippocampus, Kleinhirn, Mittelhirn, Striatum, Amygdala, Stammhirn, Thalamus, Hypothalamus, Basalganglien, Rückenmark, Kortex, subkortikale Kerne, Riechkolben, optischer Nerv, Retina, Spinalganglien und Hypophyse entsprechen.
Das Zellaggregat umfasst eine Vielzahl von Zellen. Im Allgemeinen werden zur Herstellung von Zellen einer erfindungsgemäßen neuronalen Zellkultur Zellen einer Region entnommen und weiter kultiviert, die einer bestimmten Gehirnregion entsprechen. Damit entspricht die hergestellte Zellkultur einer Kultur von Zellen aus dieser einen Gehirnregion.
Selbstverständlich können aus einem zerebralen Organoid in einem Experiment parallel auch Zellen aus mehreren Regionen entnommen werden, die zwei oder mehr Gehirnregionen entsprechen, so dass man mit Hilfe eines Organoids z.B. eine Kortex-Zellkultur, eine Hippo- campus-Zellkultur, und/oder eine Thalamus-Zellkultur anlegen kann, je nachdem, was für Regionen in dem Organoid vertreten sind, und je nach Bedarf.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in Schritt b) Zellen aus mindestens zwei Regionen, die einer bestimmten Gehirnregion entsprechen, entnommen (bevorzugt zunächst separat), wobei diese Zellen in Schritt c) in Co-Kultur, insbesondere in Mischkultur kultiviert werden. Eine Co-Kultur ist eine Kultur verschiedener Zelltypen aus verschiedenen Gehirnregionen auf einem planaren Träger, welche eine Kommunikation der Zelltypen aus verschiedenen Gehirnregionen, z.B. über neuronale Verbindungen und/oder lösliche Botenstoffe, die ins Medium abgegeben werden können, erlaubt. Eine Mischkultur ist eine bevorzugte Co-Kultur, bei der die verschiedenen Gehirnregionen entsprechenden Zellen gemischt und dann kultiviert werden. Alternativ ist eine Co-Kultur auch z.B. in verschiedenen, ggf. separaten Regionen eines Zellkulturgefäßes möglich, sofern eine Kommunikation möglich ist. Bei einer Co-Kultur oder Mischkultur werden bevorzugt nicht alle Zellen des Organoids gemeinsam kultiviert. Insbesondere können Zellen, die einer weiteren Gehirnregion entsprechen und in dem Organoid vorliegen, abgetrennt werden.
In Schritt b) werden die Zellen in einem Stadium entnommen, in dem es sich bereits um terminal differenzierte Neurone, und auch noch um deren direkte Progenitor-Zellen handelt, da zur Ausbildung eines neuronalen Netzwerks mit elektrischer Aktivität so die Plastizität erhöht wird. Der Neuronentypus ist dabei aber bereits festgelegt.
Die Region, die einer bestimmten Gehirnregion entspricht und aus der die Zellen in b) entnommen werden, weist mindestens einen molekularen Marker für diese Gehirnregion auf.
Beispiele für molekulare Marker für bestimmte Gehirnregionen sind unterscheidbar zwischen dem sich entwickelnden, aber von anderen Gebieten abgrenzbaren Status und dem ausdifferenzierten Status. Beispiele für Marker sich entwickelnder Gebiete sind unter anderem:
- GBX2, PAX2, für das Stammhirn;
- SHH, Wnt5, Notch für das Mittelhirn;
OTX2, PAX6 für das Diencephalon;
- Cerebrus, Dickkopf, FOXG 1 , SIX3 , NKX2- 1 für das Vorderhirn; - Marker der Nodal, BMP, Hedgehog, Wnt/ß-Catenin Signalwege und NPY, AGRP, POMC und CART für den Hypothalamus;
- EMX1 , FGF und SHH für die Kortexbildung und -Struktuierung
Hox, Pax, Pou, Lim für das Kleinhirn.
Weiterhin können diverse Marker für spezifische Trennlinien von Gehirnarealen genutzt werden, wie zum Beispiel FGF8 (Stammhirn/Mittelhirngrenze), SHH (Diencephalon/ Mittelhirngrenze); BMP, Wnts, SHH (lokale Vorderhirngrenzen und Organisierer).
Beispiele für Marker ausdifferenzierter Gebiete sind (zum Teil neben den zuvor genannten Beispielmarkern) unter anderem:
- Nurrl, PITX3 und Tyrosinhydroxylase für das Mittelhirn;
LIM-HD und HOX Gene für die Rückenmarksidentität;
Parvalbumin, Cholecystokinin, Somatostatin, Calretinin, NRP2, DZF9, PROX1 für den Hippocampus;
- Emxl , AUTS2, TSHZ2, LM04, Calretinin, CTIP2, SATB2 für den Cortex;
- NPY, AGRP, POMC, CART und Orexin-A für den Hypothalamus;
- Lhx2/9, Meisl/2, lrx3. LHX1, Mathl, Pdelc für das Kleinhirn,
GAD65, GAD67, Calbindin, Calretinin, Dopaminrezeptoren 1 und 2, Somatostatin, Parvalbumin, tyrosine hydroxylase für das Striatum;
- KROX20, ISL1 für das Stammhirn.
Ein oder mehrere derartige molekulare Marker können, z.B. nach Anfärbung mit fiuoreszenzmarkierten Antikörpern, zur Identifizierung der Region des Organoids verwendet werden, die einer bestimmten Gehirnregion entspricht. Die Detektion von Markern kann auch auf RNA-Ebene stattfinden.
Optional können die Stammzellen ein detektierbares Transgen umfassen, wobei das Transgen funktionell mit einem Promotor verbunden ist, der eine Expression des Transgens in einer bestimmten Gehirnregion bewirkt. Ein geeignetes detektierbares Transgen ist z.B. das grün- fiuoreszierende Protein (GFP), oder ähnliche singulär bestehende Proteine, RNA- oder DNA- marker, oder ein markiertes Zelltyp-spezifisches Fusionsprodukt wie z.B. GFP- oder His- oder ähnliche Marker, welche an zelltyp-spezifische Proteine, -RNA oder DNA fusioniert wurden. Beim Einsatz von z.B. Plasmidkonstrukten können diese in die undifferenzierten iPS- Zellen integriert werden, z.B. durch virale Transduktion oder Transfektion, was somit zu einer für Zelltyp- und Differenzierungsstadium spezifischen Markierung von Zellen führt. Damit wird eine definierte Region innerhalb des Organoids markiert. Auch mehrere Regionen können gleichzeitig markiert werden, wobei unterscheidbare detektierbare Transgene verwendet werden sollten. Dabei dient eine Detektion des Transgens zur Auswahl der zu entnehmenden Zellen. Die Promotoren der zuvor genannten Marker können hierfür zum Beispiel verwendet werden. Alternativ oder zusätzlich kann die Region, die einer bestimmten Gehirnregion entspricht und aus der die Zellen in b) entnommen werden, bei der Entnahme mittels Infrarotspektroskopie identifiziert werden.
In einer anderen Ausführungsform kann die Region mittels morphologischer und anatomischer Strukturzusammenhänge mikroskopisch auf visuellem Wege identifiziert werden.
Die Auswahl der korrekten Region kann nach der Entnahme und Kultur durch einen Vergleich der elektrischen Aktivität der Zellkultur mit typischen neuronalen Zellkulturen aus der bestimmten Region, welche z.B. in einer Datenbank abgelegt sein können, verifiziert werden. Alternativ kann auf diese Weise die bestimmte Gehirnregion im Nachhinein identifiziert werden.
Bevorzugt sind die zur Herstellung der zerebralen Organoide eingesetzten Stammzellen adulte Stammzellen oder pluripotente Stammzellen, besonders bevorzugt induzierte pluripotente Stammzellen. Im Rahmen der Erfindung ist die Verwendung von humanen Stammzellen grundsätzlich bevorzugt, insbesondere können humane pluripotente, bevorzugt humane induzierte pluripotente Stammzellen verwendet werden. Bevorzugt werden bei der Herstellung der Stammzellen keine humanen Embryos verwendet oder zerstört. Es kann sich auch um nicht-humane, z.B. um Maus-, Ratten- oder Affen- Stammzellen handeln, z.B. um nicht-humane embryonale Stammzellen. Auch Stammzellen aus Nabelschnurblut können, auch vom Menschen, eingesetzt werden.
In einer Ausführungsform sind die Stammzellen aus einem bevorzugt humanen Patienten isolierte Stammzellen, auch hier bevorzugt induzierte pluripotente Stammzellen.
Der planare Träger kann z.B. eine Zellkulturschale sein, wobei eine Analyse der elektrischen Aktivität, z.B. auf Basis von Calcium-Signalling und entsprechenen Bildgebungsverfahren möglich ist.
Der planare Träger ist bevorzugt ein Mikroelektroden-Array (MEA) -Neurochip. Dies hat den Vorteil, dass die elektrische Aktivität der Zellen einfach und genau sowohl auf Zellebene als auch auf Populationsebene analysiert werden kann. Dabei wird die elektrische Netzwerkaktivität der Neurone aufgezeichnet, analysiert und auf Ebene der Aktionspotenzial- Muster charakterisiert und klassifiziert. Neuroaktive Substanzen verändern die gewebetypischen Aktivitätsmuster in spezifischer Art und Weise und können somit über Veränderungen ihrer elektrischen Eigenschaften im Netzwerk charakterisiert werden. Ein entsprechendes Profil kann durch eine von NeuroProof GmbH (Rostock, DE) entwickelte und dort erhältliche multivariate Datenanalyse erstellt werden, bei der mehr als 200 die elektrische Aktivität beschreibende Merkmale analysiert werden. Der herausragende Vorteil der MEA-Technologie gegenüber anderen Techniken zur elektrischen Untersuchung neuronaler Zellen ist die gleichzeitige Aufzeichnung der elektrischen Signale in multi-zellulären Netzwerken, bei denen auch die Kommunikation zwischen den Neuronen untersucht werden kann.
Die Population der analysierten Neuronen umfasst bei Analyse mit einem MEA-Chip üblicherweise zwischen mindestens 6 und maximal 256, üblicherweise zwischen 10 und 50 Zellen. Neben den analysierten Zellen befinden sich noch weitere, elektrisch nicht aktive Zellen in der Kultur, die wichtige Funktionen für die Aufrechterhaltung der Funktionen der Neurone erfüllen. Die Neuronen bilden in den Kulturen Netzwerke mit benachbarten Neuronen. Eine Kommunikation der Neurone eines Netzwerkes erfolgt über elektrische und/oder chemische Synapsen.
Die Technologie wurde 1972 von Thomas et al. erstmals beschrieben und von Guenter Gross weiterentwickelt (Gross et al, 1977). Alle elektrisch aktiven Zellen können auf diese MEA Chips aufgebracht werden, um ihre extrazellulären Aktionspotenziale zu registrieren. Die Ableitung spontan aktiver, selbst-organisierter neuronaler Netzwerke auf diesen MEA Chips ermöglicht die Untersuchung des neuroaktiven Potenzials von Testsubstanzen durch die Aufzeichnung der extrazellulären Aktionspotenziale einer Vielzahl einzelner Neurone über mehrere Stunden. MEA Neurochips sind z.B. vom Center for Network Neuroscience (CNNS) der University of North Texas erhältlich. Diese 5x5 cm2 Glas Chips besitzen eine zentrale Matrix mit einem Durchmesser von 2 mm2, die 64 (oder in einer anderen Ausführung 2 mal 32) passive Elektroden und Indium- Zinn-Leiterbahnen umfasst, die in Silikon eingebettet sind und als vergoldete freie Elektroden enden. Der Elektroden-Durchmesser beträgt 20 μιη, der minimale Abstand zwischen den Elektroden beträgt 40 μιη. Die MEA Chips werden in einer Ableitkammer (CNNS) auf der Vorverstärker-Station (Plexon Inc, Dallas TX, USA) aufgebracht, welche eine Temperaturkontrolle und 64 Vorverstärker enthält. Die Aufnahme der extrazellulären Aktionspotenziale erfolgt mit einem Computer-kontro liierten 64-Kanal Verstärker System (Plexon Inc, Dallas TX, USA). Nach Einstellung der Schwelle für das Rauschen können von jeder Elektrode Aktionspotenziale von bis zu vier verschiedenen Neuronen abgeleitet werden. Die einzelnen Signale werden anhand ihrer Aktionspotenzial- Form mit Hilfe der Aufnahme-Software voneinander getrennt und aufgezeichnet. Dadurch können auf einem 64 Elektroden MEA-Neurochip Signale von bis zu 256 Neuronen aufgezeichnet werden. Die Amplitude der extrazellulären Signale liegt im Bereich von 15 bis 1800 μν. Die Abtast-Frequenz der Signale ist 40 kHz. Dadurch ist es möglich, neben der zeitlichen Abfolge der Aktionspotenziale auch deren Verlauf (Waveform) zu analysieren.
Die Zeitpunkte des Auftretens der Aktionspotenziale werden in zeitlicher Abfolge fortlaufend aufgezeichnet (Spiketrains). Aktionspotenziale werden einzeln oder in Bursts (Gruppen schnell aufeinanderfolgender Aktionspotenziale) generiert. Die Eigenschaften dieser Netz- werk-Kommunikation kann mit einer Vielzahl von Merkmalen, die auf der elektrischen Aktivität einzelner Neurone beruhen, analysiert werden. Diese Merkmale beschreiben die Synchronität und Konnektivität der Netzwerke und deren pharmakologische Beeinflussung. Die Bursts können mit der von NeuroProof entwickelten Software NPWaveX (NeuroProof GmbH, Rostock, DE) definiert werden.
Die Netzwerke aus den verschiedenen Geweben können auf Grundlage ihres elektrischen Fingerprints, die sich in der Aktivität der Neurone, der Burststruktur, der Regelmäßigkeit des Auftretens der Bursts und der Synchronität äußert, voneinander unterschieden werden. Die zeitliche Abfolge der Aktionspotenziale ist charakteristisch für die verschiedenen Gehirnregionen. In diesen Netzwerken lässt sich die Funktion einzelner Gehirnregionen studieren, die für bestimmte Krankheiten relevant sind. Die Hirnregionen-spezifische Aktivitätsmuster können auch pharmakologisch beeinflusst werden.
Wenn Stammzellen in dreidimensionalen Kulturen vordifferenzieren, werden biologisch relevante zelluläre Signalwege und interzelluläre Kommunikation ausgebildet. Gegenüber der zweidimensionalen Ausdifferenzierung von Stammzellen in verschiedene Neuronentypen hat diese Technologie den Vorteil, dass die in vivo Organsituation besser abgebildet wird. Die komplexe Morphologie und Verschaltung der Zellen und Regionen erlauben biologisch relevante Zell-Zell-Kontakte und Zell-Matrix-Interaktionen. Dadurch können ähnliche physiologische Antwortmuster wie in vivo erreicht werden.
Die erfindungsgemäß hergestellten planaren Kulturen sind jedoch besser für die Untersuchung von Wirkstoffen auf deren physiologische Aktivität geeignet als dreidimensionale Zellverbände, die nach dem Stand der Technik verwendet werden können:
zweidimensionale Kulturen weisen weniger ischämische Zustände auf, da ein effizienter Gasaustausch mit dem umgebenden Medium gewährleistet ist,
es findet eine bessere elektrische Kopplung der Neurone mit den Elektroden der
MEA-Chips statt. Daher erhält man ein verbessertes Signal-Rausch- Verhältnis, die Neurone sind pharmakologisch direkt zugänglich für Wirkstoffe. In dreidimensionalen Strukturen müssen die Wirkstoffe zunächst durch den gesamten
Gewebeverband diffundieren, um an ihren Wirkort zu gelangen.
Mit erfindungsgemäßen, für Gehirnregion spezifischen Zellkulturen lassen sich daher für pharmakologische Fragestellungen physiologisch bessere prädiktive Tests durchführen.
Ein Routine- Screening von Substanzeffekten mit primären humanen neuronalen Zellen ist nicht möglich. Die pharmakologische Untersuchung der Eigenschaften neuronaler Netzwerke in zweidimensionalen Zellkulturen erfolgte bisher durch Verwendung von dissoziierten Zellen aus Gehirnen von Mäusen oder Ratten. Die Verwendung erfindungsgemäßer Neuronen- kulturen stellt daher einen enormen Vorteil gegenüber herkömmlichen Screening- Verfahren in der frühen Wirkstoff-Testung dar, weil sie die Prädiktivität der Aussagen über die Wirksamkeit deutlich verbessert.
Der Vorteil der Verwendung humaner Zellen liegt in der deutlich höheren Prädiktivität gegenüber Tiermodellen, die die humane Physiologie nicht adäquat abbilden. Dadurch können enorme Kosten in der Wirkstofftestung eingespart werden, weil etwa 90% aller Substanzen, die in Hochdurchsatz-Screeningverfahren (HTS) identifiziert werden in der klinischen Phase nicht bestehen. Dies liegt zum einen an der geringen Übertragbarkeit der Effektivität der Substanzen von Testverfahren, bei denen tierische Zellen verwendet werden, in die humane Physiologie und zum anderen an Nebenwirkungen, die in Tiermodellen nicht vorhersagbar waren.
Die Isolation spezifischer Neuronen, Neuronengruppen oder Regionen aus den zerebralen Organoiden und deren Weiterkultivierung auf Mikroelektroden-Arrays erlaubt die individuelle elektrische Analyse einzelner Neurone und von Neuronengruppen in ihrem Netzwerk in ihren Region-spezifischen Eigenschaften. Dissoziierte Neuronen aus verschiedenen Hirnregionen der Maus weisen typische Aktivitätsmuster auf, die durch die spezifische Zusammensetzung aus verschiedenen erregenden und hemmenden Neuronentypen entstehen. Diese Muster und deren Veränderungen können nach Applikation von Substanzen charakterisiert werden. Diese zwei-dimensionalen Zellkulturen eignen sich besonders für die pharmakologische Untersuchung der Netzwerke, weil Substanzeffekte unmittelbar an den Zellen in Konzentrations- Wirkungs-Kurven untersucht werden können. Die Analyse der Spiketrains und einer Vielzahl daraus abgeleiteter Merkmale, die die allgemeine Aktivität, die Burst- struktur, die Regelmäßigkeit der Bursts und die Synchronität und Konnektivität der Neurone beschreiben, ermöglicht eine multiparametrische Datenanalyse und eine anschließende Klassifikation der Substanzen in verschiedene Substanzklassen, wie bspw. Antikonvulsiva, Antipsychotika, Antidepressiva, Analgetika etc.
Die vorliegende Erfindung stellt damit auch ein Verfahren zum Testen einer Substanz zur Verfügung, welches Schritte umfasst, bei denen man
a) mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine neuronale planare Zellkultur herstellt, b) die Zellen analysiert,
c) die zu testende Substanz in Kontakt mit der neuronalen planaren Zellkultur bringt, d) die Zellen nochmals analysiert, wobei eine Wirkung der Substanz sich durch einen Vergleich der Zellen vor und nach In- Kontakt-Bringen mit der Substanz ergibt.
Eine Substanz kann ein bereits bekanntes Medikament mit neuronalen Effekten sein, aber auch eine bisher nicht in dieser Hinsicht charakterisierte Substanz. Es kann sich z.B. um ein Protein, ein Peptid, ein Lipid, einen Zucker, eine Nukleinsäure, einen Antikörper oder ein niedermolekulares (bis 900 g/mol) Molekül handeln.
Ein beispielhaftes erfindungsgemäße Verfahren zum Testen einer Substanz ist in der parallel eingereichten Anmeldung der Neuroproof GmbH „Verfahren zum Testen neuroaktiver Substanzen" offenbart, welches mit erfindungsgemäß hergestellten neuronalen planaren Zellkulturen, welche von Stammzellen (z.B. humanen induzierten pluripotenten Stammzellen) abgeleitet sind, durchgeführt werden kann.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Bewertung der Differenzierung einer neuronalen planaren Zellkultur zur Verfügung, welches Schritte umfasst, bei denen man
a) mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine neuronale planare Zellkultur herstellt, b) die Zellkultur analysiert.
Ein solches Verfahren ist z.B. nützlich, um neuronale Entwicklungsstörungen zu untersuchen, oder um weitere Erkenntnisse über die physiologische und/oder pathologische Entwicklung des Gehirns und/oder von zerebralen Organoiden zu erlangen. Es kann auch genutzt werden, um Kulturbedingungen für zerebrale Organoide, insbesondere in Bezug auf die Herstellung von erfindungsgemäßen planaren neuronalen Zellkulturen, die bestimmten Gehirnregionen entsprechen, zu optimieren. Dieses Verfahren ermöglicht weiterhin die Identifikation biologischer Marker, sowie deren Änderungen im Expressionsmuster, die bei der Entstehung einer Erkrankung gebildet oder modifiziert werden, oder fehlen können und erlauben die Erstellung eines personifizierten Krankheitsmusters spezifisch für den Patienten, von dem die Ursprungszellen entnommen wurden, aus denen die Stammzellen abgeleitet sind.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Diagnose oder Klassifikation eines pathologischen Zustands, zur Verfügung, welches Schritte umfasst, bei denen man
a) mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine neuronale planare Zellkultur aus Stammzellen eines Patienten mit einem pathologischen Zustand herstellt,
b) die Zellkultur analysiert, wobei man das Ergebnis der Analyse mit dem Ergebnis der Analyse einer entsprechenden Zellkultur von Patienten mit bekannten pathologischen Zuständen und/oder Gesunden vergleicht.
Dabei kann es nützlich sein, eine Datenbank aufzubauen, die entsprechende Analyseergebnisse von Patienten mit bekannten pathologischen Zuständen und/oder Gesunden enthält. Auf Software-Basis können dann z.B. Analyseergebnisse eines Patienten mit Ergebnissen aus der Datenbank verglichen werden, um den pathologischen Zustand zu klassifizieren bzw. die Erkrankung zu diagnostizieren.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Optimierung der medikamentösen Therapie eines Patienten zur Verfügung, welches Schritte umfasst, bei denen man a) mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine neuronale planare Zellkultur aus Stammzellen eines Patienten herstellt,
b) die Zellen analysiert,
c) ein zu testendes Medikament in Kontakt mit der neuronalen planaren Zellkultur bringt, d) die Zellen nochmals analysiert,
wobei eine Wirkung des Medikaments sich durch einen Vergleich der Zellen vor und nach In- Kontakt-Bringen mit dem Medikament ergibt.
Dabei kann die Optimierung der Therapie eine Optimierung der Dosis eines Medikaments und/oder eine Auswahl eines therapeutisch wirksamen Medikaments sein.
Die Analyse kann darauf beruhen, dass man
a) die Morphologie der Zellen analysiert, und/oder
b) Expressionsmuster der Zellen analysiert, bevorzugt unter Verwendung einer Methode, welche ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend, Nachweis von Markern mit Fluoreszenzmikroskopie, spektroskopischem Assay, Immunhistochemischem Assay, Immuncytochemischem Assays, FACS, Immunoassay, enzymatischem Assay, Proteinassay, elektrophoretischem und chromatographischem Assay, HPLC, Westernblot, Northerblot, Southerblot, Lumineszenzdetektionsassay, ELISA- Bindungsassay und kolorimetrischem Assay, und/oder
c) die elektrische Aktivität der Zellen analysiert, bevorzugt auf einem MEA-Neurochip, mehr bevorzugt mit einem Spike Train Analyseverfahren oder Klassifikationsverfahren.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann man die Zellen in einem Hochdurchsatz- Screening durch photometrische Messungen der Aktivität im Multiwell-Format oder, bevorzugt, durch Aufzeichnung der elektrischen Aktivität der Neurone mit Mikroelektroden- Arrays im Multiwell-Format analysieren.
Geeignete Software zur Analyse der elektrischen Aktivität, insbesondere zur Analyse von Spike Trains oder zur Klassifikation, ist von Neuroproof GmbH, Rostock, Deutschland, erhältlich (NPWaveX).
Gegenstand der Erfindung ist auch eine neuronale planare Zellkultur, welche durch ein erfindungsgemäßes Verfahren herstellbar ist.
Dabei können die Stammzellen von einem humanen Patienten mit einem pathologischen Zustand abgeleitet sein, was erstmalig die in vitro Analyse und damit systematische Testung von Patienten-Neuronen aus einer bestimmten Gehirnregion, z.B. auf einem MEA-Neurochip erlaubt.
Die erfindungsgemäße Zellkultur kann auch eine Co-Kultur oder Mischkultur von Zellen umfassen, die physiologisch in dieser Form nicht vorkommt, z.B. eine Co-Kultur oder Mischkultur von Zellen aus Kortex und Hippocampus, Amygdala und Hippocampus, Striatum und Frontalkortex, Mittelhirn und Kortex und weitere Kombinationen.
In einer Ausführungsform ist die Zellkultur eine humane neuronale Zellkultur ist, die auf einem MEA-Neurochip vorliegt.
Legende
Fig. 1 Native Aktivität verschiedener Gewebe-spezifischer neuronaler Zellkulturen aus murinen Embryonen auf MEAs. A: Frontalkortex (FC), B: Rückenmark (SC), C: Mittelhirn (Mb+FC), D: Hippocampus (Hc). Es sind jeweils die Spiketrains mehrerer Neurone (jede Zeile entspricht der Aktivität eines Neurons) über eine Länge von 60 s dargestellt.
Fig. 2 A Native Aktivität eines murinen Hippocampus Netzwerkes, bei dem der Hippocampus am Embryonaltag E17 präpariert wurde. In A ist eine synchrone, iktale Aktivität in Form von Populationsbursts einer Dauer von >5 s zu erkennen. Eine Applikation von 50 μΜ Carbamazepin auf dasselbe Netzwerk führte zur Verhinderung der langen Populationsbursts. Alle Neurone sind aber noch aktiv und generieren kurze Bursts (B). Dargestellt sind die Timestamps (Spikes) von 10 Neuronen über eine Dauer von jeweils 80 s.
Beispiel 1
Die Erfinder konnten zeigen, dass Netzwerke aus bestimmten Gehirnregionen spezifische Aktivitätsmuster ausprägen. Diese lassen sich an Hand der nativen Spike Trains deutlich voneinander unterscheiden.
Aus embryonalen Mäusen an Tag 15-19 wurden verschiedene Hirnregionen (Gewebe des Frontalkortex (FC), Hippocampus (Hc), Mittelhirn, Mittelhirn+Frontalkortex (Mb+FC), Rückenmark (SC)) herauspräpariert, die Zellen anschließend enzymatisch und mechanisch dissoziert und auf Microelektroden- Array-Chips über 27 bis 35 Tage, meist über 4 Wochen, kultiviert.
Die Kultivierung erfolgte in serumhaltigem Zellkulturmedium mit Glucose. Die Zelldichte wurde Gewebe-spezifisch eingestellt. Auf die MEA Neurochips wurden jeweils 300 μΐ dieser Zellsuspension auf das Elektrodenfeld gebracht. Außerhalb des Elektrodenfeldes wurden zusätzlich jeweils 100 μΐ Fütterzellen gebracht, welche der Konditionierung der Netzwerke dienen, aber keinerlei physische Kontakte mit den zu analysierenden Neuronen ausbilden können.
Ab Tag 28 in vitro (28 DIV) wurde die native Aktivität dieser neuronalen Zellkulturen mit extrazellulären Ableitungen aufgezeichnet und analysiert. Die native Aktivität der Kulturen aus den verschiedenen embryonalen Hirnregionen wurde multiparametrisch analysiert und es wurde eine Klassifikation durchgeführt.
Die verwendeten 204 Aktivitäts-beschreibenden Merkmale beinhalten Merkmale, die die generelle Aktivität der Netzwerke, die Burst- Struktur, die Regelmäßigkeit des Auftretens der Bursts und die Synchronität der Netzwerke beschreiben. Die vier Gewebe lassen sich in einigen dieser Merkmale voneinander unterscheiden. Alle Datensätze wurden genutzt, um die native Aktivität der Netzwerke miteinander zu vergleichen. Eine Kreuzvalidierung wurde durchgeführt, um zu überprüfen, ob sich die verschiedenen Kultur-Typen voneinander unterscheiden. Dazu wurde ein Klassifikator mit 90% jeweils zufällig ausgewählten Datensätzen trainiert. Anschließend wurden jeweils die verbleibenden 10% dieser Datensätze gegen das Lern-Datenset klassifiziert. Dabei wurde die % Zuordnung der nativen Aktivität in die jeweiligen Gewebe ermittelt. Es konnte gezeigt werden, dass sich alle nativen Aktivitäten der Gewebe-spezifischen Netzwerke mit einer hohen Erkennungsrate (85%-96%) in die Aktivität der jeweiligen Hirnregionen einordnen lassen. Die Aktivitätsmuster der verschiedenen Gewebe können also quantifiziert werden.
Es wurde ein Merkmal-Score zur Bewertung deskriptiver Merkmale für die Unterscheidung der Gewebe ermittelt. Die in der Tabelle genannten Merkmale sind Merkmale, die sich unter den 15 am besten beschreibenden Merkmalen aller 204 Merkmale befinden.
Tabelle 1: Merkmale, die die verschiedenen Gewebe sehr gut voneinander unterscheiden
Die Kulturen aus Frontalkortex (FC), Rückenmark (SC), Mittelhirn+Frontalkortex (Mb+FC) und Hippocampus (Hc) wiesen Gewebe-spezifische Muster auf (Fig. 1). FC-Kulturen sind durch eine hoch synchrone Burstaktivität und wenig Interburst- Spikes gekennzeichnet (Fig. 1A).
Für eine Kreuzvalidierung der 4 Gewebe FC, SC, Mb+FC und Hc wurde die native Aktivität aller Datensätze mit 204 Aktivitäts-beschreibenden Merkmalen analysiert. Der Klassifikator wurde mit 90% zufällig ausgewählter Datensätze (DS) angelernt. Die restlichen 10% der jeweiligen Datensätze wurden anschließend dagegen klassifiziert. Die jeweilige Anzahl der Datensätze (DS) ist in Tabelle 2 angegeben. Die Zahlen in der Tabelle geben die Zuordnung in die jeweiligen Gewebe an (in %).
Tabelle 2: Kreuzvalidierung der automatischen Zuordnung zu bestimmten Gehirnregionen
Beispiel 2
Gemäß dem Verfahren von Lancaster et al., 2013, werden zerebrale Organoide hergestellt.
Zellen, die einer bestimmten Gehirnregion, z.B. dem Hippocampus, entsprechen, werden identifiziert, z.B. indem sie mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen einen für diese Region spezifischen Marker (z.B. Parvalbumin, Cholecystokinin, Somatostatin, Calretinin, NRP2, DZF9, PROX1 für den Hippocampus) angefärbt werden.
Die identifizierten Regionen werden z.B. mittels Mikrosektion vom restlichen, unmarkierten Organoid isoliert, das entnommene Organoidstück enzymatisch verdaut, um die Zellen zu vereinzeln. Die enzymatische Zerkleinerung soll durch eine Inkubation in Papain und DNase im C02-Brutschrank bei 37 °C erfolgen. Danach wird das Gewebe-Enzym-Gemisch für 4 min bei 800 U/min zentrifugiert. Der Überstand wird mit einer serologischen Pipette vorsichtig abgezogen und verworfen. Das Zellpellet wird mit einer serologischen Pipette titriert, bis die Zellsuspension trüb erscheint. Danach wird das Zentrifugenröhrchen für 5 min stehen gelassen, damit sich größere Zellverbände absetzen. Der Überstand wird dann in ein neues 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt und weiter verarbeitet. Die Zellzahl wird mittels einer Neubauer-Zählkammer ermittelt und die Zellzahl auf einen optimierten Wert eingestellt. Auf jedes Elektrodenfeld wird ein Tropfen mit jeweils 300.000 Zellen gegeben.
Die Zellsuspension soll dann auf die Elektrodenfelder der MEA-Neurochips aufgebracht werden, die zuvor mit Poly-D-Lysin und Laminin zum besseren Anheften der Zellen behandelt wurden. Die MEA Neurochips mit den Zellsuspensions-Tropfen werden im Brutschrank inkubiert, nach etwa 2 h werden die Chips mit jeweils 3 ml Zellkulturmedium (wie DMEM oder Neurobalsalmedium mit den entsprechenden Zusätzen zum besseren Wachstum der Zellen) aufgefüllt. Die Kultivierung erfolgt in einem Brutschrank bei 37°C und einem C02 Gehalt, der dem Zellkulturmedium angepasst wird. Die Zellen werden alle 3-4 Tage gefüttert, indem jeweils 1/3 des Mediums durch frisches Medium ersetzt wurden. Wenn die Gliazellen konfluent sind, wird ggf. eine antimitotische Behandlung durch Zugabe von FDU (Fluoro-Desoxy-Uridine) und Uridine ins Kulturmedium durchgeführt. Dies verhindert die weitere Proliferation der Gliazellen. Die beiden Antimitotika wurden bei jedem weiteren Mediumwechsel ausschleichend wieder entfernt. Der Zeitpunkt einer stabilen elektrischen Aktivität wird bestimmt und für ein Substanzscreening festgelegt.
Optional kann der Typ der Zellen bzw. die entsprechende Gehirnregionen nochmals mit Hilfe von Markern und/oder Transgen bestätigt werden.
Nach Ausbildung des Netzwerks kann die elektrische Aktivität - wie in Beispiel 1 für murine Zellen beschrieben - mit MEA-Neurochips analysiert werden. Wenn ein Testen einer Substanz beabsichtigt ist, kann die elektrische Aktivität vor und nach In Kontakt Bringen mit der Substanz analysiert werden.
Beispiel 3
In murinen Netzwerken des Hippocampus können spontane lang andauernde (>5 s) hoch synchrone, iktagene Bursts auftreten, deren Dauer durch Applikation von Antikonvulsiva, wie beispielsweise Carbamazepin oder Valproat verringert wird (Fig. 2).
Bei Netzwerken aus Neuronen, die aus hippocampalen Regionen aus Organoiden entnommen und weiterkultiviert werden, die aus pluripotenten Stammzellen von Patienten generiert wurden, sollen vergleichbare iktagene Ereignisse analysiert werden. Dadurch soll es möglich werden, eine Anfälligkeit für Epilepsien auch in Patienten/Probanden vorhersagen zu können, auch wenn Epilepsien noch nicht manifestiert sind oder klinisch durch EEG Ableitungen nachgewiesen werden konnten.
Weiterhin soll es möglich sein, in vitro eine Vorhersage über den Erfolg einer pharmakologischen Behandlung treffen zu können. Vor allem bei der Temporallappenepilepsie gibt es eine hohe Zahl von Patienten, die auf Therapien nicht adäquat ansprechen. Das hier beschriebene Verfahren würde eine Vorabtestung verschiedener Medikamente erlauben, bevor eine pharmakologische Therapie am Patienten begonnen wird. Somit kann auch eine eventuelle Entstehung von Resistenzen vermieden werden oder nach geeigneten additiven oder Kombinationstherapien gesucht werden. Dies hätte einen enormen Vorteil für die Patienten, weil eine für sie personaliserte Therapie entwickelt werden kann und auch durch eine langwierige Therapiefmdung auftretende Nebenwirkungen eingeschränkt oder gar verhindert werden.
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Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Herstellung einer neuronalen planaren Zellkultur, Schritte umfassend, bei denen man
a) Stammzellen in einem dreidimensionalen Zellaggregat vordifferenziert, welches mindestens zwei Regionen umfasst, die unterschiedlichen Gehirnregionen entsprechen, und
b) Zellen aus mindestens einer Region, die einer bestimmten Gehirnregion entspricht, entnimmt und
c) auf einem planaren Träger weiter kultiviert, wobei eine neuronale planare Zellkultur entsteht, bei der die Zellen ein neuronales Netzwerk bilden und eine elektrische Aktivität aufweisen, die für die bestimmte Gehirnregion spezifisch ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die in b) entnommenen Zellen Zellen aus einer Gehirnregion entsprechen, welche ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend: Hippocampus, Kleinhirn, Mittelhirn, Striatum, Stammhirn, Thalamus, Hypothalamus, Amygdala, Rückenmark und Kortex, umfassend Frontalkortex, auditorischer Kortex, primärer motorischer Kortex, primärer visueller Kortex, primärer sensorischer Kortex, Broca Zentrum, Temporallappen, Wernicke Zentrum und pareto okzipitales Assoziationsareal.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Region, die einer bestimmten Gehirnregion entspricht und aus der die Zellen in b) entnommen werden, mindestens einen molekulare Marker für diese Gehirnregion aufweist, wobei die Stammzellen optional ein detektierbares Transgen umfassen, welches funktionell mit einem Promotor verbunden ist, der eine Expression des Transgens in einer bestimmten Gehirnregion bewirkt, wobei eine Detektion des Transgens zur Auswahl der zu entnehmenden Zellen dient.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Region, die einer bestimmten Gehirnregion entspricht und aus der die Zellen in b) entnommen werden, bei der Entnahme mittels Infrarotspektroskopie identifiziert wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) Zellen aus mindestens zwei Regionen, die einer bestimmten Gehirnregion entsprechen, entnommen werden, wobei diese Zellen in Schritt c) in Co-Kultur oder Mischkultur kultiviert werden.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen humane Stammzellen sind, insbesondere humane pluripotente Stammzellen.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen aus einem bevorzugt humanen Patienten isolierte Stammzellen sind.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der planare Träger ein Mikroelektroden-Array-Neurochip ist.
9. Verfahren zum Testen einer Substanz, dadurch gekennzeichnet, dass man
a) mit dem Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche eine neuronale planare Zellkultur herstellt,
b) die Zellen analysiert,
c) die zu testende Substanz in Kontakt mit der neuronalen planaren Zellkultur bringt, d) die Zellen nochmals analysiert,
e) wobei eine Wirkung der Substanz sich durch einen Vergleich der Zellen vor und nach In-Kontakt-Bringen mit der Substanz ergibt.
10. Verfahren zur Bewertung der Differenzierung einer neuronalen planaren Zellkultur, dadurch gekennzeichnet, dass man
a) mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8 eine neuronale planare Zellkultur herstellt,
b) die Zellkultur analysiert.
11. Verfahren zur Diagnose eines pathologischen Zustands, dadurch gekennzeichnet, dass man
a) mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8 eine neuronale planare Zellkultur aus Stammzellen eines Patienten mit einem pathologischen Zustand herstellt,
b) die Zellkultur analysiert, wobei man das Ergebnis der Analyse mit dem Ergebnis der Analyse einer entsprechenden Zellkultur von Patienten mit bekannten pathologischen Zuständen vergleicht.
12. Verfahren zur Optimierung der medikamentösen Therapie eines Patienten, dadurch gekennzeichnet, dass man
a) mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8 eine neuronale planare Zellkultur aus Stammzellen eines Patienten herstellt,
b) die Zellen analysiert,
c) ein zu testendes Medikament in Kontakt mit der neuronalen planaren Zellkultur bringt, d) die Zellen nochmals analysiert, wobei eine Wirkung des Medikaments sich durch einen Vergleich der Zellen vor und nach In-Kontakt-Bringen mit dem Medikament ergibt, wobei die Optimierung der Therapie optional eine Optimierung der Dosis eines Medikaments oder eine Auswahl eines therapeutisch wirksamen Medikaments ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9-12, dadurch gekennzeichnet, dass man bei der Analyse
a) die Morphologie der Zellen analysiert, und/oder
b) Expressionsmuster der Zellen analysiert, bevorzugt unter Verwendung einer Methode, welche ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Nachweis von Markern mit Fluoreszenzmikroskopie, spektroskopischem Assay, Immunhisto- chemischem Assay, Immuncytochemischem Assays, FACS, Immunoassay, enzymatischem Assay, Proteinassay, elektrophoretischem und chromatographischem Assay, HPLC, Westernblot, Northerblot, Southerblot, Lumineszenz- detektionsassay, ELISA-Bindungsassay und kolorimetrischem Assay, und/oder c) die elektrische Aktivität der Zellen analysiert, bevorzugt auf einem MEA- Neurochip, mehr bevorzugt mit einem Spike Train Analyseverfahren oder Klassifikationsverfahren.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man die Zellen in einem Hochdurchsatz-Screening durch photometrische Messungen der Aktivität im Multiwell-Format oder, bevorzugt, durch Aufzeichnung der elektrischen Aktivität der Neurone mit Mikroelektroden-Arrays im Multiwell-Format analysiert.
15. Neuronale Zellkultur, herstellbar durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, wobei bevorzugt
a) die Stammzellen von einem humanen Patienten mit einem pathologischen Zustand abgeleitet sind,
b) die Zellkultur eine Co-Kultur von Zellen umfasst, die physiologisch nicht vorkommt, und/oder
c) die Zellkultur eine humane neuronale Zellkultur ist, die auf einem MEA- Neurochip vorliegt.
EP15708820.4A 2014-03-11 2015-03-10 Gewinnung von gehirnregion-spezifischen neuronalen kulturen aus dreidimensionalen gewebekulturen von stammzellen Pending EP3137598A1 (de)

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