EP1402258A2 - Verfahren zur bestimmung der interaktionen zwischen keratinocyten und neuronen - Google Patents

Verfahren zur bestimmung der interaktionen zwischen keratinocyten und neuronen

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EP1402258A2
EP1402258A2 EP02760192A EP02760192A EP1402258A2 EP 1402258 A2 EP1402258 A2 EP 1402258A2 EP 02760192 A EP02760192 A EP 02760192A EP 02760192 A EP02760192 A EP 02760192A EP 1402258 A2 EP1402258 A2 EP 1402258A2
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EP
European Patent Office
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neurons
keratinocytes
cells
skin
effects
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02760192A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Gilles Pauly
Jean-Luc Contet-Audonneau
Louis Danoux
Lauriane Ulmann
Emmanuel M. Jover
Rémy SCHLICHTER
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BASF Health and Care Products France SAS
Original Assignee
Cognis France SAS
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Publication date
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Publication of EP1402258A2 publication Critical patent/EP1402258A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01N33/5058—Neurological cells

Definitions

  • the invention is in the field of cosmetic and / or dermatological examination methods and relates to a method for determining the interactions between keratinocytes and neurons from spinal ganglia and a device for determining the interactions between these two cell types and the use of these two cell types to investigate different effects the interaction between these two cell types.
  • the skin as the largest organ in human beings carries out numerous vital processes. In addition to its protective functions against environmental influences, the skin is involved in various metabolic, storage and regulatory processes in the body. It is closely connected to the rest of the body through the bloodstream and through the lymphatic and nervous systems. It is made up of several layers and is equipped with blood vessels, nerves and sensory organs.
  • the epidermis As the outermost layer, the epidermis (epidermis) forms the actual protective layer against the environment.
  • keratinocytes are mainly found in the skin's epidermis. These cells play a crucial role in the growth and differentiation of the cells. They form the keratin, which is used to build up the layer of the skin.
  • the human skin is endowed with numerous nerves. A distinction is made between two types of nerves, the autonomic or vegetative nerves and the sensory or cerebrospinal nerves.
  • the sensory nerves transmit the external and internal skin stimuli to the epidermis.
  • the cell bodies of these nerve cells, the so-called neurons, are combined as collections outside the central nervous system in so-called ganglia.
  • ganglia are called spinal ganglia or DRG (dorsal root ganglia) and come from dorsal sensitive nerve roots.
  • DRG diode root ganglia
  • the neurons have several cell processes; the long nerve fibers are called neurites, the short, highly branched fibers are called dendrites.
  • the neurons are connected to other cells via synapses.
  • type A ⁇ and type C which extend in the peripheral direction and from which the free nerve endings terminate Form nerve plexus.
  • This plexus nerve is located directly above the dermis and penetrates into the epidermis.
  • the sub-epidermal nerve plexus is responsible for the detection of stimulation of nociceptors.
  • Nociceptors are nerve cells in the skin that are used to absorb tissue-damaging or potentially tissue-damaging stimuli. These are free nerve endings, ie. H. the peripheral processes of these neurons, whose cell bodies lie in ganglia along the spine (spinal ganglia), end without special end organs in the tissue. Nociceptors are sensitive to mechanical, thermal and chemical stimuli. These stimuli are converted into electronic impulses (transduction) and passed on to the spinal cord. The extensions of the nociceptors are very thin nerve fibers with a relatively low line speed.
  • Keratinocytes are able to produce a variety of substances. These include both cytokines, such as a protein called NGF (nerve growth factor), and molecules with autocrine and paracrine effects. Under normal conditions, these substances are not produced and are therefore not secreted. Due to the influence of external stimuli and stimulations, the cells are stimulated to produce these substances, which are then involved in signal transmission as signal substances. Cytokines and chemokines regulate the proliferation and differentiation of elemental skin components and are produced as an immune response and in inflammation when the stimulation of production was caused by a wound or lesion.
  • cytokines such as a protein called NGF (nerve growth factor)
  • NGF nerve growth factor
  • chemokines regulate the proliferation and differentiation of elemental skin components and are produced as an immune response and in inflammation when the stimulation of production was caused by a wound or lesion.
  • the metabolism of keratinocytes can be influenced by messenger molecules or neurotransmitters of the nerve endings of the plexus nerve (cf. Huang IT, Lin WM, Shun CT, Hsieh ST, Influence of cutaneous nerves on keratinocyte proliferation and epidermal thickness in mice. Neuroscience, 94: 965 -973, 1999). This shows that the mutual influence between keratinocytes and sensory neurons begins at an early stage of cutaneous development.
  • the complex object of the invention was therefore to provide a method with which it is possible to carry out in vitro examinations which provide a model that is as realistic as possible for analyzing the interaction between neurons and keratinocytes. It should be possible to investigate the fast and slow interaction of these two cell types with this method.
  • Another object of the invention was to provide a method using a model that allows both the cultivation of animal cells and the cultivation of human cell lines.
  • the method according to the invention should enable the investigation of pathogenic mediators and the identification and optimization of new active ingredients and methods for cosmetics and for the treatment of cutaneous diseases. Furthermore, it should be possible to investigate different interactions that are triggered by the effects of various factors such as stress factors or the like. In particular, it should be possible to clarify which interactions are triggered by these effects on the formation of the horny layer of the skin or on the secretion of different molecules that are synthesized by keratinocytes in response to stimulation.
  • the invention relates to a method for determining interactions between keratinocytes and neurons, in which the two cell types are cultured in co-culture in two separate compartments which allow the passage and exchange of nerve fibers and soluble factors.
  • the method serves to determine interactions between keratinocytes and neurons from spinal ganglia, especially the dorsal ganglia (DRG).
  • spinal ganglia especially the dorsal ganglia (DRG).
  • Keratinocyte used according to the invention denotes cells from the epidermis, which are also referred to as epithelial cells. Keratinocytes form the keratin which is used to build up the horny layer of the skin and are also able to produce a large number of substances. These include Both cytokines, such as the growth factor NGF (nerve growth factor) and molecules with autocrine and paracrine effects. Under normal conditions, these substances are not produced and therefore not secreted.
  • cytokines such as the growth factor NGF (nerve growth factor)
  • NGF nerve growth factor
  • cytokines and chemokines regulate the proliferation and differentiation of elemental skin components and are produced as an immune response and in inflammation if the stimulation of production by a wound or lesion sion was caused.
  • neurons are to be understood as nerve cells as a whole.
  • the terms neuron and nerve cell are used synonymously. These are composed of a cell nucleus or cell body and several cell processes, the so-called nerve fibers. Neurons in the sense of the invention are the sensory or cerebrospinal nerves. The sensory nerves transmit the external and internal skin stimuli to the epidermis.
  • the cell bodies of the neurons or nerve cells are combined as collections outside the central nervous system in so-called ganglia.
  • ganglia These ganglia are called spinal ganglia or DRG (dorsal root ganglia) and come from dorsal sensitive nerve roots.
  • the neurons have several cell processes; the long nerve fibers are called neurites, the short, highly branched fibers are called dendrites.
  • the neurons are connected to other cells via synapses.
  • type A ⁇ and type C which extend in the peripheral direction and of which the free nerve endings form the nerve plexus.
  • This plexus nerve is located directly above the dermis and penetrates into the epidermis.
  • the sub-epidermal nerve plexus is responsible for the detection of stimulation of nociceptors.
  • Nociceptors are nerve cells in the skin that are used to absorb tissue-damaging or potentially tissue-damaging stimuli. These are free nerve endings, i.e. H. the peripheral processes of these neurons, whose cell bodies lie in ganglia along the spine (spinal ganglia), end without special end organs in the tissue. Nociceptors are sensitive to mechanical, thermal and chemical stimuli. These stimuli are converted into electronic impulses (transduction) and passed on to the spinal cord. The extensions of the nociceptors are very thin nerve fibers with a relatively low line speed.
  • the neurons or nerve cells from spinal ganglia can be animal cells or human cells that are present in normal or modified cell lines.
  • neuroblasts are a type of modified neuron that is derived from neuronal tumors.
  • the term “co-culture” is to be understood as a possibility with which the two cell types neurons and keratinocytes are cultivated spatially separated in two compartments, that is to say two physically separate sub-areas, but an exchange and passage of soluble factors The exchange of keratinocytes and whole nerve cells is prevented.
  • the cells can be cultivated in the same medium under the same conditions.
  • the possible cultivation in two compartments can be achieved according to the invention by means of a device in which a separating disc or partition is used
  • the vessel is divided into two compartments.
  • the partition or partition is preferably adhered to the vessel with a mixture of cellulose and lubricants.
  • the vessel is preferably a Petri dish.
  • the partition or partition can be a membrane, pla tte, disc, wall or a ring, preferably it is a ring.
  • the material of this partition or the partition is freely selectable between materials that do not dissolve and are not destroyed by the cultivation conditions of the two cell types and / or the adhesive material. Glass is preferably used as the material for the cutting disc or partition.
  • the sensory neurons are cultivated in the center of the ring and the keratinocytes in the outer compartment. The development This "co-culture" can be examined with the aid of microscopes. The migration or the passage of neurites under the partition or partition, preferably the ring by microcrossing through the cellulose lubricant layer, was found.
  • the method according to the invention provides a model which is comparable to physiological conditions which prevail between keratinocytes and nerve cell bodies which are located in the ganglia. Under physiological conditions, the cell types are only connected by nerve fibers and synapses and are therefore spatially separated from one another.
  • the device for the method according to the invention allows separate stimulation of the two cell types in the different compartments.
  • This stimulation can be chemical, mechanical, or electronic.
  • all means are suitable as lubricants in the sense of the invention which form a layer with cellulose which makes it possible for the partition disk or partition according to the invention to adhere to the vessel according to the invention for producing the device according to the invention from two compartments.
  • These are preferably oils, silicone oils, waxes, wax esters, fats, soaps, salts of fatty acids or mixtures thereof, in particular those which show the desired properties at temperatures greater than or equal to 30 ° C., preferably at the cultivation temperatures of the cells.
  • the preferred lubricants are usually also used as greases or oils for sealing centrifuges.
  • the present invention encompasses the knowledge that the lubricants can be chosen by the person skilled in the art depending on the partition material selected or on the desired adhesive properties and on the desired degree of viscosity of the cellulose lubricant layer.
  • the ratio of the proportions by weight of the amount of lubricant used in relation to the proportion by weight of cellulose used can be from 10/90 to 90/10.
  • a ratio of 30 parts of lubricant to 70 parts of cellulose is preferred; a ratio of 50 parts of lubricant to 50 parts of cellulose is particularly preferred.
  • soluble factors are understood to mean all substances which, under the cultivation conditions of the device according to the invention, dissolve in the culture medium and are capable of the membrane or the layer of cellulose and lubricant which serves to adhere the separating disc or partition to penetrate and thus to get into the neighboring compartment.
  • These factors can be substances which are selected from the group which is formed by growth factors which are produced by the keratinocytes, in particular the nerve growth factor NGF; neurotransmitter; Active substances that cause cell innervation, ions such as sodium, potassium, calcium and / or chloride ions.
  • the chemical composition of the neurotransmitters can be divided into amino acids [e.g. B. glycine, L-glutamic acid, 4-aminobutyric acid (GABA)], amino acid derivatives (e.g. Acetylcholine), monoamines (mostly catecholamines such as L-noradrenaline, L-adrenaline, dopamine, but also serotonin, adenosine, adenosine 5'-di- and triphosphate), peptides (neuropeptides, e.g. bradykinin, Enkephalins, endorphins, substance P) and gaseous oxides (nitrogen monoxide, carbon oxide).
  • amino acids e.g. B. glycine, L-glutamic acid, 4-aminobutyric acid (GABA)
  • amino acid derivatives e.g. Acetylcholine
  • monoamines mostly catecholamines such as L-noradrenaline,
  • the keratinocytes and neurons are animal cells or the keratinocytes and neurons from spinal ganglia to be cultivated are human cell lines.
  • the animal neurons are neurons from newborn rats which have already reached their natural maturation. This can be seen as a supplementary condition for a good reproducibility of the results in contrast to the use of embryonic neurons.
  • the cell lines of human neurons are nerve cells of the dorsal ganglia or cell lines of human neurons such as the cell line HD10.6.
  • Cell lines of human neuroblasts such as SK-N-AS, SK-N-Fl, SK-N-DZ, SK-PN -DW, SK-N-MC and SK-N-SH or cell lines of neuroblasts from rodents, especially mice and rats, such as ND27, ND7 / 23, ND-C, ND15, ND8 / 34, ND3 and BE (2) - M17.
  • the method according to the invention is used to characterize released substances and / or intervening receptors from the two cell types, in particular from neuromediators and / or cytokines and / or steroids.
  • the substances and / or receptors to be characterized can be both soluble factors in the sense of the invention or substances and / or receptors which are transmitted from the nerve endings of the neurons in the compartment of the keratinocytes through the layer of cellulose and lubricant via the nerve endings to be released.
  • these substances and / or receptors can lead to innervation of the keratinocytes and stimulate the metabolism of the keratinocytes. The stimulation of the metabolism of the keratinocytes can then lead to an increased release of substances, in particular cytokines.
  • pathogenic keratinocytes are used to carry out tests which are selected from the group formed by: testing pathogenic mediators which are responsible for cutaneous diseases, testing the mechanisms of action of active substances which are used for treating cutaneous diseases, identification new active ingredients as well as identification and optimization of new treatment methods for cutaneous diseases, especially psoriasis,
  • Pathogenic mediators in the sense of the invention are understood to mean mediators which can cause or cause diseases, such as chemical substances, viruses, mites, microorganisms such as bacteria or fungi. In the sense of the invention, these pathogenic mediators lead to diseases of the skin, since the keratinocytes are attacked and damaged.
  • the cutaneous diseases whose mediators can be examined using the method according to the invention and for which new active substances and their mechanisms of action can be identified in order to optimize new treatment methods include, in principle, all known skin diseases which have not yet been researched. Eczema, scabies or scabies are preferred, Chronic skin diseases such as nettle fever and psoriasis have been examined, and psoriasis in particular.
  • Psoriasis is a chronic skin disease with the formation of sharply defined, occasionally itchy red spots of various sizes and shapes, which are covered with silver-white scales.
  • the cause of the disease is a disturbance in the metabolism of the upper layers of the skin with the accelerated formation of cells of the epidermis. Triggers of a psoriasis manifestation can e.g. B. Infections and injuries.
  • the method according to the invention is used to investigate the mechanisms of action of active substances on human cell lines for cosmetic agents, preferably cosmetic agents for the skin and / or scalp.
  • the method according to the invention is used to identify and optimize treatment methods for sensitive skin.
  • the method according to the invention is used to investigate the development of interactions between keratinocytes and neurons, in particular to investigate the formation of neurites and / or dendrites in the compartment of the keratinocytes.
  • One way of studying the development of interactions between keratinocytes and neurons is to observe and characterize the interactions using a microscope. At the border to the partition or partition in the compartment of the keratinocytes it can be observed, among other things, whether nerve fibers have penetrated the membrane or the layer of cellulose and lubricant.
  • Immunocytochemical methods using different antibodies can be used to identify the cells.
  • anti-PGP 9.5 can be used as antibodies which mark the branching of the nerve fibers.
  • Anti-synaptotagmins can also be used, which mark vesicular proteins that play a crucial role in the exocytosis of synaptic vesicles, or, for example, anti-peripherins, which mark filaments of the cytoskellet.
  • Antibodies against neuropeptides such as substance P or CGRP (Calcitonin Gene-Realted Peptide) can also be used.
  • specific antibodies against keratin 14 can be used to identify the keratinocytes.
  • the method according to the invention is used to investigate interactions between keratinocytes and neurons which are triggered by effects which are selected from the group formed by skin aging effects, effects by stress factors, effects by the influence of chemical substances and effects by mechanical or electrical stimulation of neurons and / or keratinocytes,
  • skin aging effects can be, for example, natural skin aging processes in which the restricted metabolism of the cells leads to a reduced synthesis of substances that are crucial for the structure of the skin.
  • skin aging processes caused by oxidation, skin aging processes caused by radical reactions and bacterial and hormonal effects Conditional changes in the skin, e.g. acne, are understood to mean this.
  • Another object of the invention is a method for examining effects of stress factors on the formation of multi-layered epithelia and in particular on the formation of the horny layer of the skin by using keratinocytes on a substrate, such as collagen gel, in co-culture containing cells selected from the group formed by fibroblasts, neurons, glia cells, melanocytes and Langerhans cells.
  • stress factors are in principle all factors which influence the interaction between keratinocytes and neurons, preferably stress factors which stimulate the metabolism of the cell types and, in particular, stress factors which are selected from the Group formed by UV radiation, heat shock, osmotic shock and environmental pollution such as heavy metal pollution, ozone or the like.
  • Another object of the invention is a method for the investigation of effects by chemical substances on the formation of multi-layered epithelia and in particular on the formation of the horny layer of the skin by using keratinocytes on a substrate, such as collagen gel, in co-culture containing cells selected from the group formed by fibroblasts, neurons, glia cells, melanocytes and Langerhans cells.
  • the cells are animal cells or human cell lines, in particular the cells or cell lines which are also preferred for the first object of the invention.
  • the methods of the further objects of the invention are preferably used to investigate mechanisms of action of active ingredients for cosmetic and / or pharmaceutical compositions for the skin and / or scalp,
  • Another object of the invention is a device for determining interactions between keratinocytes and neurons, in particular neurons from spinal ganglia, especially neurons of the dorsal ganglia (DRG), according to the interactions described above, in which the two cell types are cultivated in co-culture in two separate compartments which allow the passage and exchange of nerve fibers and / or soluble factors.
  • the possible cultivation in two compartments can be achieved according to the invention by a device in which a vessel is divided into two compartments by a partition disk or partition.
  • the partition disk or partition is preferably adhered to the vessel with a mixture of cellulose and lubricants.
  • the vessel is preferably a petri dish.
  • the separating disc or partition can be a membrane, plate, disc, wall or a ring, preferably a ring.
  • the material of this partition or the partition is freely selectable between materials that do not dissolve and are not destroyed by the cultivation conditions of the two cell types and / or the adhesive material. Glass is preferably used as the material for the cutting disc or partition.
  • the sensory neurons are cultivated in the center of the ring and the keratinocytes in the outer compartment.
  • the development of this "co-culture” can be examined with the aid of microscopes.
  • the device according to the invention provides a model which is comparable to physiological conditions which prevail between keratinocytes and nerve cell bodies which are located in the ganglia. Under physiological conditions, the cell types are only connected by nerve fibers and synapses and are therefore spatially separate from one another Cut.
  • the device according to the invention allows separate stimulation of the two cell types in the different compartments.
  • This stimulation can be chemical, mechanical, or electronic.
  • all means are suitable as lubricants in the sense of the invention which form a layer with cellulose which makes it possible for the partition disk or partition according to the invention to adhere to the vessel according to the invention for producing the device according to the invention from two compartments.
  • These are preferably oils, silicone oils, waxes, wax esters, fats, soaps, salts of fatty acids or mixtures thereof, in particular those which show the desired properties at temperatures greater than or equal to 30 ° C., preferably at the cultivation temperatures of the cells.
  • the preferred lubricants are usually also used as greases or oils for sealing centrifuges.
  • the present invention encompasses the knowledge that the lubricants can be chosen by the person skilled in the art depending on the partition material selected or on the desired adhesive properties and on the desired degree of viscosity of the cellulose lubricant layer.
  • the ratio of the proportions by weight of the amount of lubricant used in relation to the proportion by weight of cellulose used can be from 10/90 to 90/10 be.
  • a ratio of 30 parts of lubricant to 70 parts of cellulose is preferred; a ratio of 50 parts of lubricant to 50 parts of cellulose is particularly preferred.
  • Another object of the invention is the use of keratinocytes and / or neurons, in particular neurons from spinal ganglia, especially neurons of the dorsal ganglia (DRG), in co-culture to investigate the interaction between these cells, in particular to investigate the effects on the interaction described above of these cells.
  • the cells are animal cells or human cell lines, in particular the cells or cell lines which are also preferred for the first subject of the invention.
  • the methods according to the invention preferably the first subject of the invention as well as the device according to the invention and the uses according to the invention, enable detailed investigations of the interactions and mutual signaling between sensory neurons and keratinocytes. Among other things, the following examinations are possible:
  • n Human cell lines are used in the methods according to the invention for the search for active substances and for the investigation of cutaneous diseases for cosmetic uses.
  • the neurons were obtained from tissues from newborn rats according to the method of Scott or Dichter, described in: 1.
  • Scott BS Adult mouse dorsal root ganglia neurons in cell culture, J. Heurohiol, 8: 417-427, 1977 and 2 " Dichter MA, Fischhach GD, The action potential of chick dorsal root ganglion neurones maintained in cell culture, J. Physiol, 267: 281-298, 1977.
  • the neurons from newborn rats, which were at most one week old, were placed in a petri dish PBS given and chilled. They were cleaned with a scalpel to suppress the branching of the nerve fibers.
  • the cells were then washed twice with PBS without calcium ions and without magnesium ions and subjected to an enzymatic trypsin treatment (0.05%). After the cell suspension had been obtained, the supernatant of the solution was centrifuged at 150 G for 8 min. The residue was washed and placed in DMEM medium.
  • the cellular suspension containing neurons and glia cells was counted using a particle counter (Mallassey slide). The suspension was then cultivated at a density of 150,000 cells / cm 2 .
  • the keratinocytes were cultivated according to the method of Rheinwald et al. described in: Rheinwald JG, Green H, Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from Single cells, Cell, 6: 331-434, 1975. Newborn rats, which were a maximum of 24 hours old, were examined Cold anesthetized and killed. Subsequently, about 1 cm 2 large pieces of skin were cut out and digested enzymatically by trypsin (0.2%).
  • the cells were cultivated in a vessel which had previously been loaded with poly-lysine or collagen in order to achieve cell adhesion. Keratinocytes were only cultivated on collagen, while the neurons could be cultivated on both media. The cultivation was carried out at 37 ° C. For co-cultivation, a glass ring with a mixture of cellulose and lubricant was attached and fixed in a petri dish. The neurons were cultivated in the inner compartment and the keratinocytes outside the ring in the outer compartment.
  • the neuroblasts were incubated for 4 days in a KCI solution of 50mM, the intracellular calcium level was determined by means of a fluorescence measurement.
  • the ratio F350 / F380 - fluorescence at the wavelength of light absorption to fluorescence at the wavelength of emission - was plotted as a function of time (see Figure 1).
  • neuroblast cell lines can represent markers for the functions of the sensory neurons.

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Abstract

Vorgeschlagen wird ein Verfahren zur Bestimmung von Interaktionen zwischen Keratinocyten und Neuronen aus Spinalganglien bei dem die beiden Zelltypen in Co-Kultur in zwei separaten Kompartimenten kultiviert werden, welche den Durchlass und den Austausch von Nervenfasern und/oder löslichen Faktoren zulassen, sowie eine Vorrichtung zur Bestimmung der Interaktionen zwischen diesen beiden Zelltypen und die Verwendung dieser beiden Zelltypen zur Untersuchung von unterschiedlichen Effekten auf die Interaktion zwischon diesen beiden Zelltypen.

Description

Verfahren zur Bestimmung der Interaktionen zwischen Keratinocyten und Neuronen
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der kosmetischen und/oder dermatologischen Untersuchungsmethoden und betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Interaktionen zwischen Keratinocyten und Neuronen aus Spinalganglien sowie eine Vorrichtung zur Bestimmung der Interaktionen zwischen diesen beiden Zelltypen und die Verwendung dieser beiden Zelltypen zur Untersuchung von unterschiedlichen Effekten auf die Interaktion zwischon diesen beiden Zelltypen.
Stand der Technik
Die Haut als das größte Organ des Menschen übt zahlreiche lebenswichtige Prozesse aus. Neben ihren Schutzfunktionen gegenüber Umwelteinflüssen ist die Haut an verschiedenen Stoffwechsel-, Speicherungs- und Regulationsvorgängen des Körpers beteiligt. Sie ist mit dem übrigen Körper durch den Blutkreislauf sowie durch das Lymph- und Nervensystem eng verbunden. Sie ist aus mehreren Schichten aufgebaut und mit Blutgefäßen, Nerven und Sinnesorganen ausgestattet.
Als äußerste Schicht bildet die Epidermis (Oberhaut) die eigentliche Schutzschicht gegenüber der Umwelt. In der Epidermis der Haut finden sich neben anderen Zelltypen hauptsächlich Keratinocyten. Diese Zellen spielen eine entscheidende Rolle beim Wachstum und der Differenzierung der Zellen. Sie bilden das Keratin, welches zum Aufbau der Homschicht der Haut verwendet wird. Die menschliche Haut ist mit zahlreichen Nerven ausgestattet. Man unterscheidet zwei Arten von Nerven, die autonomen oder auch vegetativen Nerven und die sensorischen oder auch cerebrospinalen Nerven. Die sensorischen Nerven leiten die äußeren und die inneren Hautreize an die Epidermis weiter. Die Zellkörper dieser Nervenzellen, die sogenannten Neuronen sind als Ansammlungen ausserhalb des Zentralnervensystems in sogenannten Ganglien zusammengeschlossen. Diese Ganglien werden als Spinalganglien oder als DRG (dorsal root ganglia) bezeichnet und stammen aus dorsalen sensiblen Nervenwurzeln. Neben diesem Zellkörper besitzen die Neuronen mehrere Zellfortsätze; die langen Nervenfasern werden als Neurite bezeichnet, die kurzen, stark verästelten Fasern nennt man Dendrite. Über Synapsen werden die Neuronen mit anderen Zellen verbunden. Unter den vielen Arten von Nervenzellen, welche diese Ganglien formen gibt es die vom Typ Aδ und vom Typ C, welche sich in periphere Richtung ausweiten und von denen die freien Nervenenden den nervus plexus bilden. Dieser nervus plexus liegt direkt oberhalb der Dermis und penetriert in die Epidermis hinein. Der sub-epidermale nervus-plexus ist verantwortlich für die Erkennung der Stimulierung von Nozizeptoren.
Nozizeptoren (Nozisensoren) sind Nervenzellen in der Haut, die der Aufnahme von gewebsschädigenden oder potentiell gewebsschädigenden Reizen dienen, Es handelt sich dabei um freie Nervenendigungen, d. h. die peripheren Fortsätze dieser Neurone, deren Zellkörper in Ganglien entlang der Wirbelsäule (Spinalganglien) liegen, enden ohne spezielle Endorgane im Gewebe. Nozizeptoren sind gegenüber mechanischen, thermischen und chemischen Reizen empfindlich. Diese Reize werden in elektronische Impulse umgewandelt (Transduktion) und zum Rückenmark weitergeleitet. Bei den Fortsätzen der Nozizeptoren handelt es sich um sehr dünne Nervenfasern mit relativ niedriger Leitungsgeschwindigkeit.
Keratinocyten sind in der Lage eine Vielzahl von Substanzen zu produzieren. Darunter finden sich sowohl Cytokine, wie beispielsweise ein Protein, welches als Nerven-Wachstumsfaktor NGF (nerv growth factor) bezeichnet wird, als auch Moleküle mit autokrinen und parakrinen Effekten. Unter normalen Bedingungen werden diese Substanzen nicht produziert und damit auch nicht sekretiert. Durch den Einfluß äußerer Reize und Stimulierungen werden die Zellen jedoch dazu angeregt diese Substanzen zu produzieren, die dann als Signalsubstanzen an der Signalübertragung beteiligt sind. Cytokine und Chemokine regulieren die Proliferation und die Differentiation elementarer Hautbestandteile und werden als Immunantwort und bei Entzündungen produziert, wenn die Stimulierung der Produktion durch eine Wunde oder Läsion hervorgerufen wurde.
Der Metabolismus der Keratinocyten kann durch Messenger Moleküle oder Neurotransmitter der Nervenenden des nervus plexus beeinflußt werden (vgl: Huang IT, Lin WM, Shun CT, Hsieh ST, Influence of cutaneous nerves on keratinocyte proliferation and epidermal thickness in mice. Neuroscience, 94: 965-973, 1999). Hier zeigt sich, dass die gegenseitige Beeinflussung zwischen Keratinocyten und sensorischen Neuronen bereits in einem frühen Stadium der kutanen Entwicklung einsetzt.
Studien an der Haut und an der sensorischen Innervierung der Haut durch Nervenzellen liefern einen wichtigen Beitrag zur Physiologie der Nervenzellen und für kosmetische und pharmazeutische Untersuchungen. Die zum Stand der Technik zählenden in vivo Studien zur Interaktion zwischen sensorischen Nervenzellen und Keratinocyten nutzen Abschnitte von Nerven ohne den Zellkörper und untersuchen den Einfluss auf Keratinocyten. Die Abschnitte der Nervenenden werden dabei in eine neue Umgebung gebracht was zu einer Verfälschung der eigentlichen Interaktionen führt. Die natürlichen Bedingungen sind durch diese in vivo Studien einerseits aufgrund der wichtigen Distanz zwischen den Keratinocyten in der Epidermis und den Neuronen und andererseits aufgrund der entscheidenden Anzahl an Molekülen die zur Innervierung der Interaktion benötigt werden, sehr schwierig nachzustellen. Diese Art der Studien sind für eine verlässliche Aussage zur Interaktion zwischen Neuronen und Keratinocyten nicht geeignet. Sie lassen auch keinen Schluss zu über die unterschiedlichen Effekte auf die Interaktion und auf die Bildung von Hautzellen, die durch verschiedene Faktoren wie Umwelteinflüsse oder Strassfaktoren ausgelöst werden.
Einige vereinfachte Studien zur Interaktion von Keratinocyten und Neuronen wurden in vitro bereits durchgeführt um die Signalübertragung der Nervenenden in der Epidermis zu verstehen (vgl.: 1. Reeh PW, Sensory receptors in mammalian skin in an in vitro preparation, Neurosci. Leu., 66: 141-146, 1986 - 2. Reeh PW, Sensory receptors in a mammalian skin-nerve in vitro preparation, Prog. Brain Res., 74: 271-276). In diesen Studien wurden jedoch keine kompletten Neuronen mit Zellkörper und Nervenenden untersucht. In anderen in vitro Untersuchungen zur Differenzierung von sensorischen Neuronen wurde der Einfluss auf die Bildung von Geweben untersucht, indem die Neuronen auf einer Mono-Schicht der betreffenden Gewebe kultiviert wurden (vgl.: Hall AK, Ai X, Hickman GE, MacPhedran SE, Nduaguba CO, Robertson CP, The generation of neuronal heterogeneity in a rat sensory ganglion, J. Neurosci, 17: 2775-2784, 1997).
Eine in vitro Untersuchung, bei der Keratinocyten und sensorische Neuronen gemeinsam kultiviert wurden, wird beschrieben von Steinschneider et al. in Steinschneider R, Quelven E, Grousson J, Laurent JC, Screening of molecules with anti-infiammatory properties and for sensitive skin applications using rat sensory neurons cultured or not with human keratinocytes, Cosm'ing, 16-18 May, Saint-Malo Franc, 200. Der Nachteil dieser in vitro Untersuchnung ist jedoch, dass die Keratinocyten und Neuronen nebeneinander gemeinsam kultiviert werden und in einem direkten Kontakt stehen. Die natürlich vorkommende räumliche Trennung der Zellen, die über Nervenfasern und Synapsen überbrückt wird, kann durch dieses Modell nicht nachgestellt werden, sodass die erhaltenen Ergebnisse der eigentlichen Interaktionen zwischen diesen Zelltypen nicht korrekt wiedergegeben werden können. Desweiteren werden Zelltypen unterschiedlicher Herkunft aus unterschiedlichen Organismen nebeneinander kultiviert, was ebenfalls zu einer Verfälschung natürlicher Bedingungen führt. Die komplexe Aufgabe der Erfindung hat somit darin bestanden, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem es möglich wird, in vitro Untersuchungen durchzuführen, die ein möglichst realitätsnahes Modell zur Analyse der Interaktion zwischen Neuronen und Keratinocyten liefern. Es sollte möglich werden mit diesem Verfahren die schnelle und die langsame Interaktion dieser beiden Zelltypen zu untersuchen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung hat darin bestanden, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, bei dem ein Modell verwendet wird, welches sowohl die Kultivierung tierischer Zellen als auch die Kultivierung menschlicher Zelllinien erlaubt.
Desweiteren sollte das erfindungsgemäße Verfahren die Untersuchung pathogener Mediatoren sowie die Identifizierung und Optimierung neuer Wirkstoffe und Methoden für die Kosmetik und für die Behandlung kutaner Krankheiten ermöglichen. Weiterhin sollte es möglich werden, unterschiedliche Interaktionen zu untersuchen, die ausgelöst werden durch Effekte der unterschiedlichsten Faktoren wie Stressfaktoren oder ähnliches. Besonders sollte geklärt werden können, welche Interaktionen durch diese Effekte auf die Bildung der Hornschicht der Haut oder auf die Sekretion unterschiedlicher Moleküle, die von Keratinocyten als Reaktion auf Stimulierung synthetisiert werden, ausgelöst werden.
Beschreibung der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Interaktionen zwischen Keratinocyten und Neuronen, bei dem die beiden Zelltypen in Co-Kultur in zwei separaten Kompartimenten kultiviert werden, welche den Durchlass und den Austausch von Nervenfasern und löslichen Faktoren zulassen. Insbesondere dient das Verfahren zur Bestimmung von Interaktionen zwischen Keratinocyten und Neuronen aus Spinalganglien, speziell der Dorsalganglien (DRG).
Der erfindungsgemäß verwendete Begriff „Keratinocyten" bezeichnet Zellen aus der Epidermis, die auch als Epithelzellen bezeichnet werden. Keratinocyten bilden das Keratin, welches zum Aufbau der Hornschicht der Haut verwendet wird und sind weiterhin in der Lage eine Vielzahl von Substanzen zu produzieren. Darunter finden sich sowohl Cytokine, wie beispielsweise der Wachstumsfaktor NGF (nerv growth factor) als auch Moleküle mit autokrinen und parakrinen Effekten. Unter normalen Bedingungen werden diese Substanzen nicht produziert und damit auch nicht sekretiert. Durch den Einfluß äußerer Reize und Stimulierungen werden die Zellen jedoch dazu angeregt diese Substanzen zu produzieren, die dann als Signalsubstanzen an der Signalübertragung beteiligt sind. Cytokine und Chemokine regulieren die Proliferation und die Differentiation elementarer Hautbestandteile und werden als Immunantwort und bei Entzündungen produziert, wenn die Stimulierung der Produktion durch eine Wunde oder Läsion hervorgerufen wurde. Unter Neuronen sind im Sinne der Erfindung Nervenzellen als Ganzes zu verstehen. Die Begriffe Neuron und Nervenzelle werden synonym verwendet. Diese setzen sich zusammen aus einem Zellkern oder Zellkörper und mehreren Zellfortsätzen, den sogenannten Nervenfasern. Neuronen im Sinne der Erfindung sind die sensorischen oder auch zerebrospinalen Nerven. Die sensorischen Nerven leiten die äußeren und die inneren Hautreize an die Epidermis weiter. Die Zellkörper der Neuronen oder Nervenzellen sind als Ansammlungen ausserhalb des Zentralnervensystems in sogenannten Ganglien zusammensgeschlossen. Diese Ganglien werden als Spinalganglien oder als DRG (dorsal root ganglia) bezeichnet und stammen aus dorsalen sensiblen Nervenwurzeln. Neben diesem Zellkörper besitzen die Neuronen mehrere Zellfortsätze; die langen Nervenfasern werden als Neurite bezeichnet, die kurzen, stark verästelten Fasern nennt man Dendrite. Natürlicherweise werden die Neuronen über Synapsen mit anderen Zellen verbunden. Unter den vielen Arten von Nervenzellen, welche diese Ganglien formen gibt es die vom Typ Aδ und vom Typ C, welche sich in periphere Richtung ausweiten und von denen die freien Nervenenden den nervus plexus bilden. Dieser nervus plexus liegt direkt oberhalb der Dermis und penetriert in die Epidermis hinein. Der sub-epidermale nervus-plexus ist verantwortlich für die Erkennung der Stimulierung von Nozizeptoren.
Nozizeptoren (Nozisensoren) sind Nervenzellen in der Haut, die der Aufnahme von gewebsschädigenden oder potentiell gewebsschädigenden Reizen dienen. Es handelt sich dabei um freie Nervenendigungen, d. h. die peripheren Fortsätze dieser Neurone, deren Zellkörper in Ganglien entlang der Wirbelsäule (Spinalganglien) liegen, enden ohne spezielle Endorgane im Gewebe. Nozizeptoren sind gegenüber mechanischen, thermischen und chemischen Reizen empfindlich. Diese Reize werden in elektronische Impulse umgewandelt (Transduktion) und zum Rückenmark weitergeleitet. Bei den Fortsätzen der Nozizeptoren handelt es sich um sehr dünne Nervenfasern mit relativ niedriger Leitungsgeschwindigkeit.
Bei den Neuronen bzw. Nervenzellen aus Spinalganglien kann es sich um tierische Zellen oder um menschliche Zellen handeln, die in normalen oder modifizierten Zelllinien vorliegen. So sind beispielsweise Neuroblasten ein Typ modifizierter Neurone, die aus Nervenzelltumoren gewonnen werden.
Unter dem Begriff „Co-Kultur" ist im Sinne der Erfindung eine Möglichkeit zu verstehen, mit der die beiden Zelltypen Neuronen und Keratinocyten zwar räumlich getrennt in zwei Kompartimenten also zwei physikalisch voneinander getrennten Teilbereichen kultiviert werden, jedoch ein Austausch und ein Durchlass von löslichen Faktoren und Nervenfasern möglich ist. Der Austausch von Keratinocyten und ganzen Nervenzellen wird verhindert. Die Zellen können in dem gleichen Medium unter gleichen Bedingungen kultiviert werden. Die mögliche Kultivierung in zwei Kompartimenten kann erfindungsgemäß errreicht werden durch eine Vorrichtung, bei der durch eine Trennscheibe oder Trennwand ein Gefäß in zwei Kompartimente geteilt wird. Bevorzugt wird die Trennscheibe oder Trennwand mit einer Mischung aus Cellulose und Schmiermitteln an das Gefäß angehaftet. Bei dem Gefäß handelt es sich bevorzugt um eine Petrischale. Bei der Trennscheibe oder Trennwand kann es sich um eine eine Membran, Platte, Scheibe, Wand oder einen Ring handeln, bevorzugt handelt es sich um einen Ring. Das Material dieser Trennscheibe oder der Trennwand ist im Prinzip frei wählbar zwischen Materialien, die sich durch die Kultivierungsbedingungen der beiden Zelltypen und/oder dem Haftungsmaterial nicht auflösen und nicht zerstört werden. Bevorzugt verwendet man als Material für die Trennscheibe oder Trennwand Glas. In einer bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die sensorischen Neuronen im Zentrum des Ringes kultiviert und die Keratinocyten in dem äußeren Kompartiment. Die Entwicklung dieser „Co-Kultur" kann mit Hilfe von Mikroskopen untersucht werden. Die Migration oder der Durchlass von Neuriten unter der Trennscheibe oder Trennwand, bevorzugt dem Ring durch Mikrocrossing durch die Cellulose-Schmiermittelschicht konnte gefunden werden. Diese Migration gewährleistet eine Interaktion der beiden Zelltypen trotz räumlicher Trennung der Zellkörper. Das erfindungsgemäße Verfahren liefert ein Modell welches vergleichbar ist mit physiologischen Bedingungen die zwischen Keratinocyten und Nervenzellkörpern, welche in den Ganglien lokalisiert sind, vorherrschen. Unter physiologischen Bedingungen sind die Zelltypen nur durch Nervenfasern und Synapsen verbunden und damit räumlich voneinander getrennt,
Die Vorrichtung für das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt eine getrennte Stimulierung der beiden Zelltypen in den unterschiedlichen Kompartimenten. Diese Stimulierung kann sowohl chemisch, mechanisch als auch elektronisch sein. Bei der chemischen Stimulierung nur einer Zellart muss gewährleistet sein, dass diese Substanzen nicht oder zumindest nur sehr eingeschränkt die Schicht aus Cellulose und Schmiermittel durchdringen können.
Als Schmiermittel im Sinne der Erfindung sind prinzipiell alle Mittel geeignet, die mit Cellulose eine Schicht bilden, die es ermöglicht die erfindungsgemäße Trennscheibe oder Trennwand an das erfindungsgemäße Gefäß zur Herstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung aus zwei Kompartimenten anzuhaften. Bevorzugt handelt es sich um Öle, Siliconöle, Wachse, Wachsester, Fette, Seifen, Salze von Fettsäuren oder Mischungen daraus, insbesondere um solche, die bei Temperaturen größer oder gleich 30 °C, bevorzugt bei den Kultivierungstemperaturen der Zellen die gewünschten Eigenschaften zeigen. Die bevorzugten Schmiermittel werden üblicherweise auch als Fette oder Öle zum Abdichten für Zentrigugen genutzt. Die vorliegende Erfindung umfaßt die Erkenntnis, dass die Schmiermittel vom Fachmann je nach gewähltem Trennwandmaterial oder je nach gewünschten Hafteigenschaften und nach gewünschtem Viskositätsgrad der Cellulose- Schmiermittelschicht gewählt werden können. Das Verhältnis der Gewichtsanteile der Einsatzmenge an Schmiermittel im Verhältnis zum Gewichtsanteil an eingesetzter Cellulose kann von 10/90 bis zu 90/10 betragen. Bevorzugt ist ein Verhältnis von 30 Anteilen Schmiermittel zu 70 Anteilen Cellulose, besonders bevorzugt ist ein Verhältnis von 50 Anteilen Schmiermittel zu 50 Anteilen Cellulose.
Im Sinne der Erfindung versteht man unter „lösliche Faktoren" alle Substanzen.die sich unter den Kultivierungsbedingungn der erfindungsgemäßen Vorrichtung in dem Kulturmedium lösen und in der Lage sind, die Membran oder die Schicht aus Cellulose und Schmiermittel, die zur Haftung der Trennscheibe oder Trennwand dient, zu durchdringen und so in das benachbarte Kopartiment zu gelangen. Bei diesen Faktoren kann es sich um Substanzen handeln, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die gebildet wird von Wachstumsfaktoren die von den Keratinocyten gebildet werden, insbesondere der Nerven-Wachstumsfaktor NGF; Neurotransmittem; Wirkstoffe, die eine Innervierung der Zellen hervorrufen, Ionen wie beispielsweise Natrium-, Kalium- Calcium- und/oder Chloridionen.
Die Neurotransmitter können nach ihrer chemischen Beschaffenheit unterschieden werden in Aminosäuren [z. B. Glycin, L-Glutaminsäure, 4-Aminobuttersäure (GABA)], Aminosäure-Derivate (z. B. Acetylcholin), Monoamine (meist Catecholamine wie z. B. L-Noradrenalin, L-Adrenalin, Dopamin, aber auch Serotonin, Adenosin, Adenosin-5'-di- u. triphosphat), Peptide (Neuropeptide, z. B. Bradykinin, Enkephaline, Endorphine, Substanz P) und gasförmige Oxide (Stickstoffmonoxid, Kohlenstoffoxid).
In besonderen Ausführungsformen der Erfindung handelt es sich bei den Keratinocyten und Neuronen, insbesondere Neuronen aus Spinalganglien, um tierische Zellen oder es handelt sich bei den zu kultivierenden Keratinocyten und Neuronen aus Spinalganglien um menschliche Zelllinien.
In weiteren besonderen Ausführungsformen handelt es sich bei den tierischen Neuronen um Neuronen aus neugeborenen Ratten, welche ihre natürliche Reifung bereits erreicht haben. Dieses kann als eine ergänzende Bedingung für eine gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse im Gegensatz zur Verwendung von embryonalen Neuronen angesehen werden.
Bei den Zelllinien menschlicher Neuronen handelt es sich um Nervenzellen der Dorsalganglien oder Zelllinien menschlicher Neurone wie beispielsweise die Zelllinie HD10.6., Zelllinien menschlicher Neuroblasten wie SK-N-AS, SK-N-Fl, SK-N-DZ, SK-PN-DW, SK-N-MC und SK-N-SH oder Zellinien von Neuroblasten von Nagetieren, insbesondere Mäusen und Ratten, wie ND27, ND7/23, ND-C, ND15, ND8/34, ND3 und BE(2)-M17.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt zur Charakterisierung freigesetzter Substanzen und/oder intervenierender Rezeptoren aus den beiden Zelltypen, insbesondere von Neuromediatoren und/oder Cytokinen und/oder Steroiden. Bei den zu charakterisierenden Substanzen und/oder Rezeptoren kann es sich sowohl um lösliche Faktoren im Sinne der Erfindung handeln oder um Substanzen und/oder Rezeptoren, die von den durch die Schicht aus Cellulose und Schmiermittel penetrierten Nervenenden der Neuronen im Kompartiment der Keratinocyten über die Nervenenden freigesetzt werden. Diese Substanzen und /oder Rezeptoren können als Neuromediatoren zu einer Innervierung der Keratinocyten führen und den Metabolismus der Keratinocyten anregen. Die Stimulierung des Metabolismus der Keratinocyten kann dann zu einer vermehrten Ausschüttung von Substanzen führen, insbesondere von Cytokinen.
In einer besondere Ausführungsform der Erfindung werden pathogene Keratinocyten verwendet um Untersuchungen durchzuführen, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die gebildet wird von: Untersuchung pathogener Mediatoren die verantwortlich sind für kutane Krankheiten, Untersuchung der Wirkmechanismen von Wirkstoffen die zur Behandlung kutaner Krankheiten verwendet werden, Identifizierung neuer Wirkstoffe sowie Identifizierung und Optimierung neuer Behandlungsmethoden kutaner Krankheiten, insbesondere Psoriasis,
Als pathogene Mediatoren im Sinne der Erfindung werden Mediatoren verstanden, die Krankheiten erregen oder verursachen können, wie beispielsweise chemische Stoffe, Viren, Milben, Mikroorganismen wie Bakterien oder Pilze. Im Sinne der Erfindung führen diese pathogenen Mediatoren zu Krankheiten der Haut, da die Keratinocyten angegriffen und geschädigt werden. Zu den kutanen Krankheiten deren Mediatoren mit dem erfindungsgemäßen Verfahren untersucht werden können und für die neue Wirkstoffe und deren Wirkmechanismen identifiziert werden können um neue Behandlungsmethoden zu optimieren, zählen prinzipiell alle bekannten und zur Zeit noch nicht erforschten Hautkrankheiten, Bevorzugt werden Ekzeme, Skabies oder Krätze, chronische Hautkrankheiten wie Nesselfieber und Psoriasis untersucht und insbesondere Psoriasis. Bei Psoriasis handelt es sich um eine chronische Hautkrankheit mit Bildung scharf begrenzter, gelegentlich juckender roter Herde von unterschiedlicher Größe und Gestalt, die mit silberweißen Schuppen bedeckt sind. Die Ursache der Krankheit liegt in einer Störung des Stoffwechsels der oberen Hautschichten mit beschleunigter Bildung von Zellen der Epidermis. Auslöser einer Psoriasis-Manifestation können z. B. Infektionen und Verletzungen sein.
In einer weiteren Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Untersuchung der Wirkmechanismen von Wirkstoffen an humanen Zelllinien für kosmetische Mittel verwendet, bevorzugt kosmetische Mittel für Haut und/oder Kopfhaut.
In einer weiteren Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizierung und Optimierung von Behandlungsmethoden für sensitive Haut verwendet.
In einer weiteren Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Untersuchung der Entwicklung von Interaktionen zwischen Keratinocyten und Neuronen, insbesondere zur Untersuchung der Bildung der Neuriten und/oder Dendriten im Kompartiment der Keratinocyten verwendet.
Eine Möglichkeit der Untersuchung der Entwicklung von Interaktionen zwischen Keratinocyten und Neuronen ist die Beobachtung und Charakterisierung der Interaktionen mit Hilfe eines Mikroskopes. An der Grenze zur Trennscheibe oder Trennwand im Kompartiment der Keratinocyten kann unter anderem beobachtet werden, ob Nervenfasern die Membran oder die Schicht aus Cellulose und Schmiermittel penetriert haben.
Weitere Techniken, die zur Charakterisierung der Interaktion als Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden, sind Techniken wie Elektrophysiologie, Patch- Clamp-Technik, und Calcium-Analyse durch Lumineszenz und/oder Fluoreszenz, sowie Immunofluoreszenz.
Zur Identifizierung der Zellen können Immunocytochemische Verfahren verwendet werden, bei dem unterschiedliche Antikörper eingesetzt werden. Für Neuronen können beispielsweise anti-PGP 9,5 als Antikörper verwendet werden, welche die Verzweigung der Nervenfasern markieren. Es können weiterhin anti-synaptotagmine eingesetzt werden, welche vesiculare Proteine markieren, die eine entscheidende Rolle bei der Exocytose synaptischer Vesikel einnehmen, oder z.B. anti-peripherine, welche Filamente des Cytoskellets markieren. Antikörper gegen Neuropeptide wie beispielsweise Substanz P oder CGRP (Calcitonin Gene-Realted Peptide) können ebenfalls verwendet werden. Zur Identifizierung der Keratinocyten können beispielsweise spezifische Antikörper gegen Keratin 14 verwendet werden. In einer weiteren Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren verwendet zur Untersuchung von Interaktionen zwischen Keratinocyten und Neuronen die ausgelöst werden durch Effekte, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die gebildet wird von Hautalterungseffekten, Effekte durch Stressfaktoren, Effekte durch den Einfluss chemischer Substanzen und Effekte durch mechanische oder elektrische Stimulierung von Neuronen und/oder Keratinocyten,
Im Sinne der Erfindung können Hautalterungseffekte beispielsweise natürliche Hautalterungsprozesse sein, bei denen der eingeschränkte Metabolismus der Zellen zu einer verminderten Synthese von Substanzen führt, die für den Aufbau der Haut entscheidend sind, Weiterhin können oxidativ bedingte Hautalterungsvorgänge, durch radikalische Reaktionen bedingte Hautalterungsvorgänge sowie bakteriell wie hormonell bedingte Hautveränderungen, z, B. Akne darunter verstanden werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Untersuchung von Effekten durch Stressfaktoren auf die Bildung von multigeschichteten Epithelien und insbesondere auf die Bildung der Hornschicht der Haut durch Verwendung von Keratinocyten auf einem Substrat, wie beispielweise Kollagengel, in Co-Kultur, enthaltend Zellen ausgewählt aus der Gruppe, die gebildet wird von Fibroblasten, Neuronen, Glia-Zellen, Melanocyten und Langerhanszellen.
Im Sinne der Erfindung werden unter Stressfaktoren prinzipiell alle Faktoren bezeichnet, die einen Einfluß auf die Interaktion zwischen Keratinocyten und Neuronen ausüben, bevorzugt handelt es sich um Stressfaktoren, die den Metabolismus der Zelltypen stimulieren und insbesondere handelt es sich um Stressfaktoren, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die gebildet wird von UV-Strahlung, Hitzeschock, osmotischer Schock und Umweltverschmutzungen, wie beispielsweise Schwermetallbelastung, Ozon oder ähnliches.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Untersuchung von Effekten durch chemische Substanzen auf die Bildung von multigeschichteten Epithelien und insbesondere auf die Bildung der Hornschicht der Haut durch Verwendung von Keratinocyten auf einem Substrat, wie beispielweise Kollagengel, in Co-Kultur, enthaltend Zellen ausgewählt aus der Gruppe, die gebildet wird von Fibroblasten, Neuronen, Glia-Zellen, Melanocyten und Langerhanszellen.
In besonderen Ausführungsformen der weiteren Gegenstände der Erfindung handelt es sich bei den Zellen um tierische Zellen oder um menschliche Zelllinien, insbesondere um die Zellen bzw Zelllinien, die auch für den ersten Gegenstand der Erfindung bevorzugt sind. Desweiteren werden durch die Verfahren der weiteren Gegenstände der Erfindung bevorzugt Wirkmechanismen von Wirkstoffen für kosmetische und/oder pharmazeutische Mittel für die Haut und/oder Kopfhaut untersucht,
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zur Bestimmung von Interaktionen zwischen Keratinocyten und Neuronen, insbesondere Neuronen aus Spinalganglien, speziell Neuronen der Dorsalganglien (DRG), gemäß den oben beschriebenen Interaktionen, bei der die beiden Zelltypen in Co-Kultur in zwei separaten Kompartimenten kultiviert werden, welche den Durchlass und den Austausch von Nervenfasern und/oder löslichen Faktoren zulassen. Die mögliche Kultivierung in zwei Kompartimenten kann erfindungsgemäß errreicht werden durch eine Vorrichtung, bei der durch eine Trennscheibe oder Trennwand ein Gefäß in zwei Kompartimente geteilt wird. Bevorzugt wird die Trennscheibe oder Trennwand mit einer Mischung aus Cellulose und Schmiermitteln an das Gefäß angehaftet. Bei dem Gefäß handelt es sich bevorzugt um eine Petrischale. Bei der Trennscheibe oder Trennwand kann es sich um eine Membran, Platte, Scheibe, Wand oder einen Ring handeln, bevorzugt handelt es sich um einen Ring. Das Material dieser Trennscheibe oder der Trennwand ist im Prinzip frei wählbar zwischen Materialien, die sich durch die Kultivierungsbedingungen der beiden Zelltypen und/oder dem Haftungsmaterial nicht auflösen und nicht zerstört werden. Bevorzugt verwendet man als Material für die Trennscheibe oder Trennwand Glas.
In einer bevorzugten Variante der erfindungsgemäßen Vorrichtung werden die sensorischen Neuronen im Zentrum des Ringes kultiviert und die Keratinocyten in dem äußeren Kompartiment. Die Entwicklung dieser „Co-Kultur" kann mit Hilfe von Mikroskopen untersucht werden. Die Migration oder der Durchlass von Neuriten unter der Trennscheibe oder Trennwand, bevorzugt dem Ring durch Mikrocrossing durch die Cellulose-Schmiermittelschicht konnte gefunden werden. Diese Migration gewährleistet eine Interaktion der beiden Zelltypen trotz räumlicher Trennung der Zellkörper. Das erfindungsgemäße Vorrichtung liefert ein Modell welches vergleichbar ist mit physiologischen Bedingungen die zwischen Keratinocyten und Nervenzellkörpern, welche in den Ganglien lokalisiert sind, vorherrschen. Unter physiologischen Bedingungen sind die Zelltypen nur durch Nervenfasern und Synapsen verbunden und damit räumlich voneinander getrennt.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung erlaubt eine getrennte Stimulierung der beiden Zelltypen in den unterschiedlichen Kompartimenten. Diese Stimulierung kann sowohl chemisch, mechanisch als auch elektronisch sein. Bei der chemischen Stimulierung nur einer Zellart muss gewährleistet sein, dass diese Substanzen nicht oder nur sehr eingeschränkt die Schicht aus Cellulose und Schmiermittel durchdringen können.
Als Schmiermittel im Sinne der Erfindung sind prinzipiell alle Mittel geeignet, die mit Cellulose eine Schicht bilden, die es ermöglicht die erfindungsgemäße Trennscheibe oder Trennwand an das erfindungsgemäße Gefäß zur Herstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung aus zwei Kompartimenten anzuhaften. Bevorzugt handelt es sich um Öle, Siliconöle, Wachse, Wachsester, Fette, Seifen, Salze von Fettsäuren oder Mischungen daraus, insbesondere um solche, die bei Temperaturen größer oder gleich 30 °C, bevorzugt bei den Kultivierungstemperaturen der Zellen die gewünschten Eigenschaften zeigen. Die bevorzugten Schmiermittel werden üblicherweise auch als Fette oder Öle zum Abdichten für Zentrigugen genutzt. Die vorliegende Erfindung umfaßt die Erkenntnis, dass die Schmiermittel vom Fachmann je nach gewähltem Trennwandmaterial oder je nach gewünschten Hafteigenschaften und nach gewünschtem Viskositätsgrad der Cellulose- Schmiermittelschicht gewählt werden können. Das Verhältnis der Gewichtsanteile der Einsatzmenge an Schmiermittel im Verhältnis zum Gewichtsanteil an eingesetzter Cellulose kann von 10/90 bis zu 90/10 betragen. Bevorzugt ist ein Verhältnis von 30 Anteilen Schmiermittel zu 70 Anteilen Cellulose, besonders bevorzugt ist ein Verhältnis von 50 Anteilen Schmiermittel zu 50 Anteilen Cellulose.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Keratinocyten und/oder Neuronen, insbesondere Neuronen aus Spinalganglien, speziell Neuronen der Dorsalganglien (DRG), in Co-Kultur zur Untersuchung der Interaktion zwischen diesen Zellen, insbesondere zur Untersuchung von oben beschriebenen Effekten auf die Interaktion dieser Zellen. In einer besonderen Ausführungsform des weiteren Gegenstandes der Erfindung handelt es sich bei den Zellen um tierische Zellen oder um menschliche Zelllinien, insbesondere um die Zellen bzw Zelllinien, die auch für den ersten Gegenstand der Erfindung bevorzugt sind. Die erfindungsgemäßen Verfahren, bevorzugt der erste Gegenstand der Erfindung sowie die erfindungsgemäße Vorrichtung und die erfindungsgemäßen Verwendungen ermöglichen die detailierten Untersuchungen der Interaktionen und gegenseitigen Signalisierung zwischen sensorischen Neuronen und Keratinocyten. Unter anderem werden folgende Untersuchungen möglich:
> die Effekte von Neuron-Keratinocyten Interaktionen, > die Rolle und der natürliche Charakter des Neuronen-Keratinocyten Kontaktes in der Entwicklung dieser zwei Zelltypen,
> die Effekte der Innervierung der mitotischen Aktivität der Keratinocyten,
> die Bestimmung der intrazellulären Konzentration an Calcium-lonen in Keratinocyten nach der elektrischen Stimulierung der Neuronen, > die Bestimmung der intrazellulären Konzentration an Calcium-lonen in Neuronen nach einer mechanischen oder chemischen Stimulierung der Keratinocyten,
> die Charakterisierung freigesetzter Substanzen und/oder Rezeptoren aus den beiden Zelltypen, insbesondere von Neuromediatoren und/oder Cytokinen,
> die Konsequenzen von Entzündungen, externen Stimulierungen, UV-Strahlung und anderen Effekten auf Neuronen und Keratinocyten und auf die Interaktion zwischen beiden Zelltypen,
> die Konsequenzen von natürlichen Hautalterungsprozessen für die Interaktionen zwischen Neuronen und Keratinocyten.
> eine detailiertere Charakterisierung der Interaktionen durch Techniken wie Elektrophysiologie (patch clamp) und durch Bildanalysen > die Suche nach Wirkstoffen mit einer Aktivität auf Neuronen, Neuropeptiden und Keratinocyten für kosmetische und/oder pharmazeutische Verwendungen.
> die Untersuchung kutaner Krankheiten in Verbindung mit der Interaktion zwischen Neuronen und Keratinocyten.
n Für die Suche nach Wirkstoffen und für die Untersuchung kutaner Krankheiten für kosmetische Verwendungen werden in den erfindungsgemäßen Verfahren menschliche Zelllinien verwendet.
Beispiele
1. Gewinnung der Neuronen aus Spinalganglien
Die Neuronen wurden erhalten aus Geweben von neugeborenen Ratten nach der Methode von Scott bzw. Dichter, beschrieben in: 1. Scott BS, Adult mouse dorsal root ganglia neurons in cell culture, J. Heurohiol, 8: 417-427, 1977 und 2„ Dichter MA, Fischhach GD, The action potential of chick dorsal root ganglion neurones maintained in cell culture, J. Physiol, 267: 281-298, 1977. Die Neuronen aus neugeborenen Ratten, die maximal eine Woche alt waren, wurden in eine Petrischale mit PBS gegeben und gekühlt. Sie wurden mit einem Skalpel gereinigt um die Verzweigung der Nervenfasern zu unterdrücken. Anschliesend wurden die Zellen zweifach mit PBS ohne Calcium- lonen und ohne Magnesium-Ionen gewaschen und einer enzymatischen Trypsin Behandlung (0,05 %) unterzogen. Nach Erhalt der Zellsuspension wurde der Überstand der Lösung 8 min bei 150 G zentrifugiert. Der Rückstand wurde gewaschen und in DMEM-Medium gegeben.
Die zelluläre Suspension enthaltend Neuronen und Glia-Zellen wurde mit einem Partikelzähler (Mallassey slide) ausgezählt. Die Suspension wurde anschliessend mit einer Dichte von 150000 Zellen/cm2 kultiviert.
2. Gewinnung der Keratinocyten
Die Keratinocyten wurden kultiviert entsprechend der Methode von Rheinwald et al. beschrieben in: Rheinwald JG, Green H, Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinising colonies from Single cells, Cell, 6: 331-434, 1975. Es wurden neugeborene Ratten, die maximal 24 Stunden alt waren, durch Kälte anesthesiert und getötet. Anschliessend wurden ca. 1 cm2 große Hautstückchen ausgeschnitten und durch Trypsin (0,2 %) enzymatisch verdaut.
3. Kultivierung der Zellen 4.
Die Zellen wurden kultiviert in einem Gefäß, welches vorher mit Poly-Lysin oder Collagen beschickt wurde um eine Zellhaftung zu erreichen. Keratinocyten wurden nur auf Collagen kultiviert, während die Neuronen auf beiden Medien kultiviert werden konnten. Die Kultivierung erfolgte bei 37 °C. Zur Co-Kultivierung wurde in eine Petrischale ein Glasring mit einer Mischung aus Cellulose und Schmiermittel angeheftet und fixiert. Die Neuronen wurden in dem inneren Kompartiment und die Keratinocyten ausserhalb des Ringes im äußeren Kompartiment kultiviert.
Je nach gewünschter Untersuchung wurden die Kultivierungszeiten und Bedingungen sowie die Techniken zur Auswertung der Ergebnisse variiert.
4. Untersuchungen zur funktionellen Charakteristik einer Zelllinie von Neuroblasten
a) Depolarisation der Cytoplasma-Membran durch KCI Zur Charakterisierung der biologischen Aktivität von Neuroblasten wurde die Technik der Calcium- Analyse angewandt, wobei Moleküle appliziert werden, die zu einer Veränderung des Calcium-Spiegels in den Zellen führen und nachfolgend die intrazelluläre Calciumkonzentration in den Neuronen gemessen wird.
Die Neuroblasten wurden über 4 Tage in einer KCI-Lösung von 50mM inkubiert, der intrazelluläre Calciumspiegel wurde über eine Fluoreszenzmessung bestimmt. Das Verhältnis F350/F380 - Fluoreszenz bei der Wellenlänge der Lichtabsorption zu Fluoreszenz bei der Wellenlänge der Emission - wurde als Funktion der Zeit aufgetragen (siehe Abbildung 1).
b) Aktivierung spezifischer Rezeptoren von Neuroblasten Zur Bestimmung der Aktivität spezifischer Rezeptoren der Neuroblasten wurde ebenfalls eine Calcium- Analyse durchgeführt, wobei die Zellen über 4 Tage mit ATP (100 μM) inkubiert wurden und nachfolgend der intracelluläre Calciumspiegel durch Fluoreszenzmessung aufgenommen wurde (siehe Abbildung 2).
c) Freisetzung spezifischer Neuropeptide aus den Neuroblasten
Über die Technik der Immunofluoreszenz und die Anwendung des speziellen Antikörpers „Substanz P" gegen Neuropeptide konnte die Freisetzung von Neuropeptiden in das Cyctoplasma für alle Neuroblastenzellen detektiert werden (siehe Abbildung 3 - dunkel abgebildete Zellen fluorezierten grün)
Die Untersuchungen a) bis c) zeigen, dass Neuroblasten - Zelllinien Marker für die Funktionen der sensorischen Neurone darstellen können.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung von Interaktionen zwischen Keratinocyten und Neuronen, bei dem die beiden Zelltypen in Co-Kultur in zwei separaten Kompartimenten kultiviert werden, welche den
Durchlass und den Austausch von Nervenfasern und/oder löslichen Faktoren zulassen.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Neuronen aus Spinalganglien stammen.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Keratinocyten und Neuronen aus Spinalganglien um tierische Zellen oder um menschliche Zellen in normalen oder modifizierten Zelllinien handelt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den tierischen Nervenzellen um Neuronen aus Spinalganglien von neugeborenen Ratten handelt.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Nervenzellen aus Spinalganglien um Zelllinien menschlicher Neuronen, Neuroblasten oder Neuroblasten von
Nagetieren handelt,
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Charakterisierung freigesetzter Substanzen und/oder intervenierender Rezeptoren aus den beiden Zelltypen, insbesondere von Neuromediatoren und/oder Cytokinen und/oder Steroiden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den verwendeten Keratinocyten um pathogene Keratinocyten handelt und Untersuchungen durchgeführt werden, die ausgewählt sind aus der Gruppe,die gebildet wird von: Untersuchung pathogener Mediatoren, die verantwortlich sind für kutane Krankheiten; Untersuchung der Wirkmechanismen von Wirkstoffen, die zur Behandlung kutaner Krankheiten verwendet werden; Identifizierung neuer Wirkstoffe; sowie Identifizierung und Optimierung neuer
Behandlungsmethoden kutaner Krankheiten, insbesondere Psoriasis,
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 , 2, 3 oder 5 zur Untersuchung der Wirkmechanismen von Wirkstoffen an humanen Zelllinien für kosmetische Mittel, bevorzugt kosmetische Mittel für Haut und/oder Kopfhaut.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 5 zur Identifizierung und Optimierung von Behandlungsmethoden für sensitive Haut.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Untersuchung der Entwicklung von Interaktionen zwischen Keratinocyten und Neuronen, insbesondere die Untersuchung der Bildung der Neuriten und/oder Dendriten im Kompartiment der Keratinocyten.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Interaktionen zwischen Neuronen und Keratinocyten weiterhin charakterisiert werden durch Techniken wie
Elektrophysiologie, Patch-Clamp-Technik, und Calcium-Analyse durch Lumineszenz und/oder Fluoreszenz, sowie Immunofluoreszenz.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Untersuchung von Interaktionen zwischen Keratinocyten und Neuronen die ausgelöst werden durch Effekte, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die gebildet wird von, Hautalterungseffekten, Effekte durch Stressfaktoren, Effekte durch den Einfluss chemischer Substanzen und Effekte durch mechanische oder elektrische Stimulierung von Neuronen und/oder Keratinocyten.
13. Verfahren zur Untersuchung von Effekten durch Stressfaktoren auf die Bildung von multigeschichteten Epithelium und insbesondere auf die Bildung der Hornschicht der Haut durch Verwendung von Keratinocyten auf einem Substrat, beispielweise Kollagengel, in Co-Kultur, enthaltend Zellen ausgewählt aus der Gruppe, die gebildet wird von Fibroblasten, Neuronen, Glia- Zellen, Melanocyten und Langerhanszellen,
14. Verfahren nach Anspruch 12 und/oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Stressfaktoren einen Einfluß auf die Interaktion zwischen Keratinocyten und Neuronen ausüben, bevorzugt handelt es sich um Stressfaktoren, die den Metabolismus der Zelltypen stimulieren und insbesondere handelt es sich um Stressfaktoren, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die gebildet wird von UV-Strahlung, Hitzeschock, osmotischem Schock und Umweltverschmutzung.
15. Verfahren zur Untersuchung von Effekten durch chemische Substanzen auf die Bildung von multigeschichteten Epithelium und insbesondere auf die Bildung der Hornschicht der Haut durch Verwendung von Keratinocyten auf einem Substrat, wie beispielweise Kollagengel, in Co-Kultur, enthaltend Zellen ausgewählt aus der Gruppe, die gebildet wird von Fibroblasten, Neuronen, Glia- Zellen, Melanocyten und Langerhanszellen.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Zellen um tierische Zellen oder um menschliche Zelllinien handelt.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16 zur Untersuchung der Wirkmechanismen von Wirkstoffen für kosmetische und/oder pharmazeutische Mittel für die Haut und/oder Kopfhaut.
18. Vorrichtung zur Bestimmung von Interaktionen zwischen Keratinocyten und Neuronen aus Spinalganglien gemäß Ansprüche 1 bis 12, bei der die beiden Zelltypen in Co-Kultur in zwei separaten Kompartimenten kultiviert werden, welche den Durchlass und den Austausch von Nervenfasern und/oder löslichen Faktoren zulassen.
19. Verwendung von Keratinocyten und/oder Neuronen aus Spinalganglien in Co-Kultur zur Untersuchung der Interaktion zwischen diesen Zellen, insbesondere zur Untersuchung von Effekten gemäß Anspruch 12, 14 und 15 auf die Interaktion dieser Zellen.
20. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Zellen um tierische Zellen oder um menschliche Zelllinien handelt,
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