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Technisches
Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Übertragen
eines ausgewählten
Moleküls, zum
Beispiel von Polynukleotiden, wie Gene, Proteine, physiologisch
aktive Moleküle
und andere, in Zellen sowie ein Verfahren zum Fusionieren von Zellen.
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Stand der
Technik
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Bei
der Gentechnik und der Entwicklung von Arzneimitteln auf dem Gebiet
der neueren medizinischen Wissenschaft, der Pharmazie und auf anderen Gebieten
ist es zunehmend wichtig, ausgewählte Moleküle, zum
Beispiel Polynukleotide, wie Gene, Proteine, physiologisch aktive
Moleküle,
Kandidaten für
Arzneimittel und andere, in Zellen zu transferieren und anschließend die
Funktion des Gens in den Zellen oder die physiologische Aktivität des physiologisch
aktiven Moleküls
in den Zellen zu untersuchen. Zur Zeit werden bei dem Transfer von
ausgewählten Molekülen das
Elektroporationsverfahren, das Genkanonenverfahren, das Liposomenverfahren,
das Zellfusionsverfahren, das Virusvektorverfahren und andere verwendet,
wobei aber bei keinem dieser Verfahren ausgewählte Moleküle immer in einem zufrieden
stellenden Maße
in die Zellen transferiert werden können.
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Das
Elektroporationsverfahren und das Genkanonenverfahren können auf
viele Zellen angewandt werden, wobei sie jedoch komplizierte Arbeitsabläufe erfordern.
Sie sind ferner schwierig für
HTS zu modifizieren. Das Liposomenverfahren ist deshalb problematisch,
da die Zellen, auf die dieses Verfahren angewandt werden kann, beschränkt sind.
Ferner sind alle Verfahren teuer und selbst, wenn sie für HTS modifiziert
werden könnten,
wären sie
extrem teuer. Ferner ist keines der genannten Verfahren zufrieden
stellend hinsichtlich der Effizienz der Übertragung.
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Journal
of Biomedical Materials Research, Bd. 51 (1), 2000, 136–145, beschreibt
einen röhrenförmigen Reaktor,
der zur Behandlung von Dacron- Scheiben
mit Kohlendioxid-Plasma verwendet wird, um die hydrophilen Eigenschaften
zu verbessern.
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International
Journal of Food Science and Technology 2003, 38, 889–892 offenbart
ein Verfahren zur Behandlung von Escherichia coli mit atmosphärischem
Gasplasma.
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Die
menschlichen und die Maus-Genanordnungen sind nun aufgeklärt und es
ist jetzt sehr wichtig, Gene mit unbekannter Funktion zu analysieren, um
ihre Funktionen aufzuklären.
In dieser Situation ist es unabdingbar, ein Gentransferverfahren,
das auf HTS anwendbar ist, zu entwickeln. Selbst bei HTS ist es
wünschenswert,
dass das Verfahren effizient ist und die funktionelle Analyse von
verschiedenen Genen ermöglicht.
Somit ist es sehr wichtig, ein hocheffizientes Gentransferverfahren
zu entwickeln, das für verschiedene
Zellen verwendet werden kann und nicht nur für spezifische limitierte Zellen.
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Eine
Aufgabe gemäß der vorliegenden
Erfindung besteht darin, die oben genannten im Stand der Technik
vorhandenen Probleme zu lösen
und ein hocheffizientes Verfahren zum Übertragen von ausgewählten Molekülen in verschiedene
Typen von Zellen, sowie ein Verfahren zum Fusionieren von Zellen bereit
zu stellen.
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Offenbarung
der Erfindung
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Wir
Erfinder haben gefunden, dass ein ausgewähltes Molekül, das um die Zelle vorliegt,
in die Zelle übertragen
wird, wenn die Zelle und/oder das ausgewählte Molekül mit kaltem Gasplasma behandelt
wird. Daraufhin wurde die vorliegende Erfindung vervollständigt. Wir
haben ferner herausgefunden, dass Zellen fusioniert werden, wenn
sie mit einem kalten Gasplasma behandelt werden.
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Im
Detail umfasst die Erfindung das folgende:
- (1)
Ein Verfahren zum Übertragen
eines ausgewählten
Moleküls
in eine Zelle, welches die Behandlung einer Zelle und/oder eines
ausgewählten
Moleküls
mit einem kalten Gasplasma umfasst, um so das ausgewählte Molekül, das um
die Zelle vorliegt, in die Zelle zu übertragen.
- (2) Ein ausgewähltes
Molekülübertragungsverfahren
nach (1), wobei das ausgewählte
Molekül zuvor
hergestellt wird, so dass es um die Zelle vorliegt, und die Zelle
dann mit kaltem Plasma behandelt wird.
- (3) Ein ausgewähltes
Molekülübertragungsverfahren
nach (1) oder (2), wobei das ausgewählte Molekül ein Polynukleotid ist.
- (4) Ein Verfahren zum Fusionieren von Zellen, welches die Behandlung
der Zellen mit Plasma umfasst.
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Die
ausgewählten
Moleküle,
auf die hier sich bezogen wird, sind Moleküle, die ausgewählt werden,
so dass sie in die beabsichtigten Zellen übertragen werden.
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Die
ausgewählten
Moleküle
umfassen hochmolekulare Verbindungen, niedermolekulare, physiologisch
aktive Substanzen und Kandidaten für Arzneimittel, zum Beispiel
Polynukleotide, wie DNA, RNA und ihre Derivate, und Proteine, wie
Signalübertragungsproteine,
transkriptionelle Kontrollfaktoren und ihre Derivate. Von diesen
ausgewählten
Molekülen
sind die Polynukleotide und ihre Derivate bevorzugt.
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Die
Zellen, auf die hier Bezug genommen wird, sind die beabsichtigen
Zellen, in die die ausgewählten
Moleküle übertragen
werden. Diese Zellen sind nicht spezifisch definiert. Beispiele
für diese
Zellen sind prokaryotische Zellen, wie Escherichia coli, Actinomyceten,
Bacillus subtilis, und eukaryotische Zellen, wie Hefe, tierische
Zellen und pflanzliche Zellen. Ferner sind auch Zellen mit einer
Lipiddoppelschichtstruktur, wie Erythrocyten-Ghosts und Liposomen,
innerhalb des Umfangs der Zellen gemäß der Erfindung.
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Um
die Übertragungseffizienz
der ausgewählten
Moleküle
in diese Zellen zu erhöhen,
ist es möglich,
Zellen zu verwenden, die gemäß einem
normalen Verfahren zur Erzeugung von kompetenten Zellen für den Gentransfer
gebildet werden. Falls erwünscht,
kann das Verfahren nach der Erfindung mit jedem anderen Gentransferverfahren
kombiniert werden, wie ein Liposomenverfahren unter Verwendung eines
kationischen Lipids, zum Beispiel Lipofectamin (GIBCO- BRL), oder Liposom,
wodurch die Effizienz des Verfahrens zur Übertragung von ausgewählten Molekülen in Zellen
weiter erhöht
werden kann.
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Das
kalte Gasplasma (kaltes Plasma im Nichtgleichgewichtszustand, kaltes,
schwach ionisiertes Plasma) für
die Verwendung gemäß der vorliegenden
Erfindung kann zum Beispiel durch Koronaentladung erzeugt werden.
Seine Eigenschaften können
in Abhängigkeit
von dem Typ und der Bedingung der Erzeugungseinheit variieren. Hinsichtlich des
Plasmas, das für
die Durchführung
der Erfindung verwendet wird, können
der Gastyp, die Plasmadichte, die Elektronentemperatur und die Behandlungszeit
in geeigneter Weise in Abhängigkeit
von den verwendeten Zellen und den ausgewählten Molekülen sowie von der Umgebung,
in der der Betrieb durchgeführt
wird, bestimmt werden. Hinsichtlich des Gastyps, der für das kalte
Gasplasma verwendet wird, ist wenigstens ein Gas bevorzugt, das
aus der Gruppe ausgewählt
wird, die aus Sauerstoff, Luft, Kohlendioxid, Stickstoff und Argon
besteht.
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Das
Erzeugungsgerät
für das
kalte Gasplasma, das bei der Erfindung verwendet wird, kann ein offenes
oder ein geschlossenes Gerät
sein. Hinsichtlich der Einfachheit bei der Behandlung von Zellen
ist ein offenes Gerät
bevorzugt. Ein spezifisches Beispiel für die Vorrichtung, die gemäß dem Verfahren nach
der Erfindung verwendet wird, ist in der 1 gezeigt.
Diese Vorrichtung umfasst eine elektrische Leitung und eine Gasleitung.
Die elektrische Leitung umfasst einen Signalgeber, einen linearen
Verstärker,
einen Anpassungsstromkreis und einen Zusatztransformator. Diese
dienen zur Steuerung der Parameter Spannung zwischen den Elektroden,
Entfernung zwischen den Elektroden, Frequenz, Pulsdauer, Nutzleistung
und anderen. Unter den kontrollierten Bedingungen wird der Kopf
für die
Erzeugung von verschiedenen Plasmen entladen. Andererseits passiertin
der Gasleitung ein einzelnes oder gemischtes, die aus einem Gaszylinder
oder einer Luftpumpe zugeführt
werden, durch ein Nadelventil, um eine in geeigneter Weise gesteuerte
Strömungsrate
zu erzeugen, und wird dem Kopf zugeführt. Das in dem Kopf erzeugte
Plasma wird durch das Gas zu der Probe geblasen, die vor dem Kopf
angeordnet ist. Um die Plasmabestrahlung unter geeigneten Bedingungen für jede Zellprobe,
verschiedene Typen von Organismen oder für ausgewählte Moleküle (einschließlich Gene,
niedermolekulare Substanzen, Proteine und andere) durchführen zu
können,
sollten diese Bedingungen variiert werden, um die Festsetzung der
Bedingungen für
das Plasma und seine Bestrahlung zu verändern.
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Eine
spezifische Ausführungsform
gemäß der vorliegenden
Erfindung umfasst die Entfernung der Kultur von den kultivierten,
adhäsiven
Zellen, die auf einem Zellkulturkit, wie einer Platte, kultiviert
wurden, oder von den Zellen, die durch Zentrifugation, Filtration
oder ähnliches
gesammelt wurden, und die anschließende Zugabe einer kleinen
Menge einer Lösung
eines ausgewählten
Moleküls
auf die Oberfläche
jeder Zelle. Anschließend
wird diese mit dem Plasma, das durch einen Plasmaerzeuger hergestellt wurde,
behandelt. Die Plasmabehandlungszeit kann im Allgemeinen zwischen
einigen Sekunden und einigen Dutzend Sekunden liegen, wobei dies
in Abhängigkeit
von dem Plasmazustand variieren kann. Nach der Plasmabehandlung
wird ein Medium zu den Zellen hinzugefügt und die Zellen werden weiter
darin kultiviert. Falls das ausgewählte Molekül ein Vektor ist, der ein Gen
oder etwas Ähnliches
enthält,
ist dies für
Genrekombinationsexperimente nützlich.
Falls das ausgewählte
Molekül
eine Kandidatensubstanz für
einen Arzneistoff ist, der auf ein spezifisches Molekül in den
Zellen abzielt, ist dies nützlich
für die
Selektion der Kandidaten.
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Die 1 ist
eine schematische Darstellung eines Gerätes für die Genübertragung oder die Zellfusion,
das bei dem Verfahren nach der Erfindung verwendet wird.
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Die 2 ist
eine schematische Darstellung der Beziehung zwischen der Plasmaerzeugereinheit (Elektrodenteil)
in dem Gerät
für den
Gentransfer oder die Zellfusion, das nach dem Verfahren der Erfindung
verwendet wird, und der Probe, die mit der Einheit zu behandeln
ist.
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Die 3, 4 und 5 zeigen
jeweils die Spektraldaten von Plasmen, die unter verschiedenen Bedingungen
in dem Gerät
erzeugt wurden, das für
den Gentransfer oder die Zellfusion in den Beispielen gemäß der Erfindung
verwendet wurde. Für
die Messung der Daten wurde ein Spektrophotometer, Otsuka Electronics' MCPD-3000, verwendet. In
einem Abstand von etwa 3 cm von dem Plasma wurde eine Sonde angeordnet,
um das Spektrum des Plasmas aufzunehmen.
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Beste Ausführungsform
der Erfindung
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Unter
Bezug auf die folgenden Beispiele wird nun die Erfindung näher im Detail
beschrieben, wobei die Erfindung jedoch nicht auf diese Beispiele
beschränkt
ist.
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Beispiel 1:
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Ein
Gerät wurde
gemäß 1 hergestellt, Die
Bedingungen des Plasmaerzeugers in diesem Gerät waren die folgenden: Die
Spannung zwischen den Elektroden betrug von einigen kV bis zu mehr
als 10 kV; der Abstand zwischen den Elektroden war zwischen 10 und
15 mm; die Frequenz betrug 20 bis 40 kHz; die Pulsdauer betrug 30
bis 90 Hz; die Nutzleistung war von 25 bis 100%; das Gas war ausgewählt aus
Luft, Stickstoff, Sauerstoff, Kohlendioxid, Argon oder Helium/Luft
= 1/1 und die Bestrahlungszeit betrug etwa 1 bis 5 Sekunden. Der
Abstand zwischen der Elektrode und der Probe war etwa 1 bis 3 cm.
Innerhalb des Bereiches wurde eine geeignete Bedingung für die Probe
ausgewählt.
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Mit
diesem Gerät
können
zum Beispiel Plasmen mit den Spektren gemäß den 3 bis 5 erzeugt
werden. Unter Verwendung des Plasmaerzeugungsgerätes wurde ein Gentransfer durchgeführt. Lungenfibroblasten
vom Chinesischen Hamster, CHL-Zellen, wurden in einer Zellkulturplatte
mit einem Durchmesser von 60 mm aufgetragen und über Nacht bei 37°C und unter
5% Kohlendioxid kultiviert. Die Zahl der Zellen, mit der die Kultur
begonnen wurde, betrug 1 × 106 Zellen/Vertiefung. Nachdem bestätigt wurde,
dass die Zellen an der Platte hafteten, wurde das Medium von der
Kulturplatte entfernt und 110 μl
einer GFP-Expressionsplasmid-Flüssigkeit
(1 μg/μl) wurde
auf die Zelloberfläche
gegeben. Dann wurde dies einer Plasmabestrahlung unter verschiedenen
Bedingungen mit dem oben erläuterten
Gerät unterworfen.
Sofort nach der Plasmabestrahlung wurde ein Medium hinzugefügt und die
Zellen wurden über
Nacht kultiviert. Dann wurden die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop
hinsichtlich der Expression des GFP-Proteins beobachtet und die
Zahl der exprimierenden Zellen pro Gesichtsfeld wurde bestimmt.
Ferner wurden die das GFP-Protein exprimierenden Zellen pro Gesamtzellzahl
in jeder Vertiefung durch FACS-Durchflusscytometrie
quantifiziert.
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Im
Ergebnis wurde eine GFP-Expression unter jeder Bedingung beobachtet.
Die Übertragungseffizienz
betrug maximal etwa 60% bei der mikroskopischen Beobachtung und
war etwa 5 bis 25% bei der FACS-Inspektion.
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Ein
Plasmaerzeuger, Plasma Surface Treater ST-7000, verkauft von KEYENCE,
ist ein Gerät des
gleichen Typs, wie das hier verwendete Gerät. Dieses kann ein Plasma mit
dem in der 5 gezeigten Spektrum erzeugen
und dies kann für
die Aufgabe gemäß der vorliegenden
Erfindung nützlich
sein.
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Beispiel 2:
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2-1) Übertragung in anhaftende Zellen
einer etablierten tierischen Zelllinie:
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Etablierte
tierische Zellen wurden auf eine Platte mit sechs Vertiefungen aufgetragen
und über Nacht
bei 37°C
und unter 5% Kohlendioxid kultiviert. Die Zahl der Zellen, Fibroblasten
des Chinesischen Hamsters, CHL-Zellen, die am Start der Kultur aufgetragen
wurde, betrug 1 × 106 Zellen/Vertiefung und die Zahl der Hela-Zellen,
abstammend von einem menschlichen Gebärmutterkrebs, war 2,5 × 105 Zellen/Vertiefung. Nachdem bestätigt wurde,
dass die Zellen an der Platte hafteten, wurde das Medium von der
Kulturplatte entfernt, und 50 μl
einer GFP-Expressionsplasmid (pEGFP-C1)-Flüssigkeit (μg/μl) wurden auf die Zelloberfläche gegeben.
Dies wurde dann einer Plasmabestrahlung mit einem Plasmaerzeuger unterworfen.
Die Bedingungen des Plasmaerzeugers waren die folgenden: Die Spannung
zwischen den Elektroden während
der Entladung betrug 10 bis 14 kV; der Abstand zwischen den Elektroden
war 13 mm; die Frequenz war 23,3 kHz; die Pulsdauer war 60 Hz; die
Nutzleistung war 50% und die Gasluftdurchflussmenge war 38 Liter/Minute.
Die Bestrahlung wurde für
etwa 3 Sekunden durchgeführt.
Der Abstand zwischen der Elektrode und der Probe wurde in geeigneter
Weise bestimmt. Sofort nach der Plasmabestrahlung wurde ein Medium
hinzugefügt, und
die Zellen wurden über
Nacht kultiviert. Dann wurden die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop
hinsichtlich der Expression des GFP-Proteins beobachtet und die
Zahl der exprimierenden Zellen pro Gesichtsfeld wurde bestimmt.
Ferner wurden die das GFP-Protein exprimierenden Zellen pro Gesamtzellzahl
in jeder Vertiefung durch FACS-Durchflusscytometrie quantifiziert.
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Im
Ergebnis wurde eine GFP-Expression in allen Zelltypen beobachtet.
Unter der Bedingung, dass die Spannung zwischen den Elektroden während der
Entladung 10 bis 14 kV war, der Abstand zwischen den Elektroden
13 mm betrug, die Frequenz 20 kHz war, die Pulsdauer 60 Hz war,
die Nutzleistung 50% war und die Gasluftdurchflussmenge 38 Liter/Minute
betrug, war die Übertragungseffizienz maximal
etwa 70% bei der mikroskopischen Beobachtung und betrug etwa 30%
bei der FACS-Inspektion (dies ist die Genübertragungseffizienz pro Gesamtzahl
der Zellen in der Schale), Die Übertragungseffizienz
mit Hela-Zellen ist bei den existierenden Verfahren gering, wobei
aber mit dem Verfahren gemäß der Erfindung
es möglich
wird, eine hohe Übertragungseffizienz
von etwa 70% oder so ähnlich in
einigen Bereichen zu erreichen.
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Beispiel 3 – Übertragung
in planktonische Zellen einer etablierten tierischen Zelllinie:
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Eine
Phosphatpuffer-Suspension von menschlichen, akut lymphoblastischen,
leukämischen,
von peripherem Blut abstammenden T-Zelllinie-Jurkatzellen, 2,25 × 107 Zellen/ml, wurde hergestellt. 25 μl der Zellsuspension
wurde mit der gleichen Menge einer GFP-Expressionsplasmidlösung (2 μg/μl) gemischt und die erzielte
Mischung wurde in eine frische Platte mit sechs Vertiefungen gegeben. Die
Menge betrug 50 μl/Vertiefung.
Diese wurde dünn
auf den Boden von jeder Vertiefung verteilt und dann mit Plasma
aus einem Plasmaerzeuger bestrahlt. Bei diesem Beispiel wurde der
Plasmaerzeuger wie in Beispiel 1 angetrieben. Sofort nach der Plasmabestrahlung
wurde ein Medium hinzugegeben, und die Zellen wurden über Nacht
bei 37°C
und unter 5% Kohlendioxid kultiviert. Dann wurden die Zellen unter
einem Fluoreszenzmikroskop hinsichtlich der Expression des GFP-Proteins beobachtet. Ferner
wurden die das GFP-Protein exprimierenden Zellen pro Gesamtzellzahl
in jeder Vertiefung mittels FACS-Durchflusscytometrie quantifiziert.
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Im
Ergebnis wurde eine GFP-Proteinexpression bei der Beobachtung unter
dem Fluoreszenzmikroskop bestätigt.
Die durch FACS bestätigte Übertragungseffizienz
war etwa 25%.
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Beispiel 4 – Übertragung
in Hirnrindezellen der Ratte:
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Eine
Ratten-Hirnrinde wurde wie folgt präpariert: Eine schwangere Ratte
(Wister, 17 Tage schwanger) wurde anästhesiert und der Uterus mit dem
Fetus wurde durch eine abdominale Operation herausgenommen und in
L-15 (GIBCO-BRL) gegeben. Dann wurde der Hirnrindenbereich von dem
Gesamtgehirn des Fetus abgetrennt, 40 ml einer 0,25% Trypsinlösung und
80 μl einer
1% DNAse Lösung wurden
zu dem Hirnrindenbereich hinzugefügt, der dann bei 37°C für 20 Minuten
inkubiert wurde. Der erzielte Überstand
wurde entfernt und 10 ml von FBS wurde zu dem Rest hinzugefügt. Dieser
wurde pipettiert, um die Zellen aufzulockern. Dies wurde dann durch
ein Zellsieb gegeben, und etwa 20 ml eines Neurobasal-Mediums (GIBCO-BRL)
wurden hinzugesetzt und die Zellen durch Zentrifugation gesammelt,
Für die
Kulturinitiation wurden die Zellen in einem Neurobasal-Medium (25 μM Glutaminsäure, 500 μM Glutamin,
30 nM NaSeO3, enthaltend Penicillin und
Streptomycin) suspendiert, so dass 5 × 105 Zellen/ml
vorlagen. Diese wurden in einer Platte mit sechs Vertiefungen bei
37°C und
unter 5% Kohlendioxid kultiviert.
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Nachdem
bestätigt
wurde, dass die Zellen an der Platte hafteten, wurde das Medium
von der Kulturplatte entfernt und 50 μl einer GFP-Expressionsplasmidflüssigkeit (1 μg/μl) wurden
auf die Zelloberfläche
gegeben. Dann wurde dies einer Plasmabestrahlung mit einem Plasmaerzeuger
unterworfen. Die Bedingungen für
den Plasmaerzeuger waren wie folgt: Die Spannung zwischen den Elektroden
während
der Entladung war 10 bis 14 kV; die Entfernung zwischen den Elektroden
war 13 mm; die Frequenz betrug 23,3 kHz; die Pulsdauer war 60 Hz;
die Nutzleistung betrug 50% und die Gasluftdurchflussmenge war 38
Liter/Minute. Die Bestrahlung wurde für etwa 1 Sekunde durchgeführt. Sofort
nach der Plasmabestrahlung wurde Medium hinzugefügt und die Zellen wurden über Nacht
kultiviert. Die Zellen wurden dann unter einem Fluoreszenzmikroskop
hinsichtlich der Expression des GFP-Proteins beobachtet.
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Im
Ergebnis wurden Zellen mit GFP-Proteinexpression gefunden. Die Übertragungseffizienz
war maximal 70% pro Gesichtsfeld. Eine Genübertragung in primär kultivierte,
tierische Zellen, wie hier gezeigt, ist bei den existierenden Genübertragungsverfahren
fast unmöglich.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung hat eine sichere, einfache und effiziente Genübertragung
in primär
kultivierte, tierische Zellen ermöglicht.
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Beispiel 5 – Übertragung
in Kleinhirn-Körnerzellen der
Ratte:
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Eine
9 Tage alte Wister-Ratte wurde mit Äther anästhesiert und ihr Gehirn wurde
herausgenommen. Das Kleinhirn wurde daraus herausgeschnitten und
die Hirnhaut wurde entfernt. Das Kleinhirn wurde in Stücke geschnitten
und 10 ml einer Papainlösung
(diese wurde hergestellt durch Mischen von 90 Einheiten Papain (Worthington-biochem)
in 10 ml eines Phosphatpuffers mit 2 mg DL-Cystein (Sigma) und 50 mg Albumin darin
gelöst,
wobei die erzielte Mischung bei 37°C für eine Weile stehen gelassen
wird, um diese zu aktivieren, und dann wurden 50 μl DNase I
(Takara) hinzugefügt
und vor Verwendung wurde dies filtriert und sterilisiert) wurde
hinzugegeben und bei 37°C
für etwa
30 Minuten geschüttelt.
6 ml Pferdeserum (HS) wurde hinzugegeben und zentrifugiert. Die
erzielte Gewebeablagerung wurde in einem Serummedium suspendiert
(5% PFCS und 5% HS, enthaltend DME/F12(1/1) Medium). Dies wurde
auf eine mit Polyethylenimin beschichtete Platte mit 6 Vertiefungen
gegeben, wobei 2,5 × 106 Zellen/Vertiefung erzielt wurden, Es wurde über Nacht
bei 37°C
unter 5% Kohlendioxid kultiviert. Das Medium wurde gegen ein Hoch-Kalium
(26 mM), 1 μM
AraC (Sigma) – enthaltendes
Medium (5% HS, Kaliumbicarbonat/2,1 g, 30 nM Na2SeO4 in MEM (Sigma)), ausgetauscht und die Zellen
wurden weiter für
5 Tage bei 37°C
unter 5% Kohlendioxid kultiviert. Nachdem bestätigt wurde, dass die Zellen
an der Platte gut hafteten, wurde das Medium von der Kulturplatte
entfernt und 50 μl
einer GFP-Expressionsplasmidflüssigkeit
(1 μg/μl) wurden
auf die Zelloberfläche
gegeben. Dann wurde dies einer Plasmabestrahlung mit einem Plasmaerzeuger
unterworfen und die Bedingungen für den Plasmaerzeuger waren die
folgenden: Die Spannung zwischen den Elektroden während der
Entladung war 10 bis 14 kV; der Abstand zwischen den Elektroden
betrug 13 mm; die Frequenz betrug 23,3 kHz; die Impulsperiode war
60 Hz; die Nutzleistung war 50% und die Gasluftdurchflussmenge war
38 Liter/Minute. Die Bestrahlung wurde für etwa 1 Sekunde durchgeführt. Sofort
nach der Plasmabestrahlung wurde Medium hinzugefügt, und die Zellen wurden über Nacht
kultiviert. Dann wurden die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop
hinsichtlich der Expression des GFP-Proteins beobachtet.
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Im
Ergebnis wurden Zellen mit einer GFP-Proteinexpression gefunden.
Die Übertragungseffizienz
war maximal 40% pro Gesichtsfeld. Ein Gentransfer in primär kultivierte,
tierische Zellen, wie hier gezeigt, ist mit existierenden Genübertragungsverfahren
fast unmöglich.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung ermöglicht
eine sichere, einfache und effiziente Genübertragung in primär kultivierte,
tierische Zellen.
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Beispiel 6 – Übertragung
in Hämendothelzellen,
die von der menschlichen Nabelvene abstammen (HUVEC):
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Die
Zellen wurden unter Verwendung von Total Kit (Toyobo) für normale,
menschliche Nabelvenen-Endothelzellen kultiviert.
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Normale
menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC) wurden in einer Platte
angeordnet, so dass 2,5 × 105 Zellen/Vertiefung vorlagen. Diese wurden über Nacht
bei 37°C
unter 5% Kohlendioxid kultiviert. Nachdem sichergestellt wurde,
dass die Zellen gut an der Platte hafteten, wurde das Medium von
der Kulturplatte entfernt und 50 μl
einer GFP-Expressionplasmidflüssigkeit
(1 μg/μl) wurde auf
die Zelloberfläche
gegeben. Dann wurde dies einer Plasmabestrahlung mit einem Plasmaerzeuger unterworfen.
Die Bedingungen für
den Plasmaerzeuger waren die folgenden: Die Spannung zwischen den
Elektroden während
der Entladung war 10 bis 14 kV; der Abstand zwischen den Elektroden
war 13 mm; die Frequenz betrug 23,3 kHz; die Pulsperiode war 60
Hz; die Nutzleistung war 50% und die Gasluftdurchflussmenge war
38 Liter/Minute. Die Bestrahlung wurde für etwa 1 Sekunde oder 3 Sekunden durchgeführt. Sofort
nach der Plasmabestrahlung wurde ein Medium hinzugefügt und die
Zellen wurden über
Nacht kultiviert. Dann wurden die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop
hinsichtlich der Expression des GFP-Proteins beobachtet.
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Im
Ergebnis wurde ein GFP-Gentransfer auch in die Hämendothelzellen, die von menschlichen
Nabelvenen abstammten, bestätigt.
Die Übertragungseffizienz
war höchstens
50% pro Gesichtsfeld. Ein Gentransfer in primär kultivierte, tierische Zellen,
wie hier gezeigt, ist mit existierenden Genübertragungsverfahren fast unmöglich. Das
Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung ermöglicht
einen sicheren, einfachen und effizienten Gentransfer in primär kultivierte,
tierische Zellen.
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Beispiel 7 – Differenzierungsinduktion
von PC12-Zellen im sympathischen Nervensystem:
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Dies
diente zur Untersuchung, ob die gemäß dem Verfahren der vorliegenden
Erfindung für
die Genübertragung
behandelten Zellen noch ihre Funktion aufrechterhalten. Konkret
wurden PC12-Zellen hinsichtlich ihrer Differenzierungspotenz in
sympathische Nervensysteme getestet.
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Ein
GFP-Gen wurde in PC12-Zellen gemäß dem Verfahren
nach der Erfindung, wie in Beispiel 1 dargestellt, übertragen.
NGF wurde der Kultur der Zellen bis auf 100 ng/ml hinzugefügt, und
die Zellen wurden für
6 Tage kultiviert. Dann wurde die Morphologie der PC12-Zellen, von
denen unter einem Fluoreszenzmikroskop bestätigt wurde, dass sie das GFP-Protein
exprimieren, beobachtet, um ihre Differenzierungspotenz in sympathische
Zellen zu überprüfen.
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Im
Ergebnis exprimierten die PC12-Zellen, welche das GFP-Gen besaßen, das
gemäß dem Verfahren
nach der Erfindung übertragen
wurde, das GFP-Protein
selbst 6 Tage nach der NGF-Zugabe, und zusätzlich unterstützte die
Zellmorphologiebeobachtung sicher die Nervenfortsatz-Ausdehnung
von den Zellen. Dies bestätigt,
dass das Genübertragungsverfahren
mit Unterstützung
durch die Plasmabestrahlung die Eigenschaft der Differenzierungspotenz
mit NGF in sympathische Zellen, die intrinsisch für PC12-Zellen
ist, nicht verändert.
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Beispiel 8 – CREB-Aktivierung
durch Genübertragung
in PC12-Zellen (Reportergentest):
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Dies
diente zur Untersuchung, ob die gemäß dem Verfahren der vorliegenden
Erfindung in Zellen transferierten Gene ihre Funktion in den Zellen
ausüben
können.
Konkret wurden PC12-Zellen, in die CREB und PKA transferiert wurden,
mittels Reportergentests analysiert, um festzustellen, ob CREB durch das
PKA-Gen aktiviert werden kann.
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Phäochromozytom-PC12-Zellen
der Ratte (ATCC Nr. CRL-1721) wurden zu 1 × 106 Zellen/Vertiefung
in Platten mit sechs Vertiefungen, die mit Collagen IV beschichtet
waren, angeordnet und über Nacht
bei 37°C
und unter 5 Kohlendioxid kultiviert. Nachdem bestätigt worden
war, dass die Zellen an der Platte hafteten, wurde das Medium aus
der Kulturplatte entfernt. Die Zellen wurden mit einer Mischung
behandelt, die hergestellt wurde durch Mischen eines PKA-Gens (pFC-PKA)
(1 μg/μl), eines CREB-Reportergens
(pCRE-Luc) mit einem Luciferasegen, das stromab mit der Wirkungssequenz
von aktiviertem CREB (1 μg/μl) und einem
internen Standard, Renilla-Luciferasegen (pRL-SV40) verbunden war,
wobei jeweils 17 μl
eingesetzt wurden. Die Behandlung wurde gemäß dem Verfahren nach der Erfindung
wie in Beispiel 2 durchgeführt,
um so die Gene gemeinsam in die PC12-Zellen zu transferieren. Einen
Tag nach dem Gentransfer wurden die PC12-Zellen auf Luciferaseaktivität getestet.
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Im
Ergebnis wurde ein signifikanter Luciferaseaktivitätsanstieg
bzw. ein signifikanter CREB-Transkriptionsaktivitätsanstieg
in den PKA-transferierten Zellen im Vergleich zu den mit einem Kontrollvektor transferierten
Zellen gefunden. Dies bestätigt,
dass das Gen, das in die PC12-Zellen einer etablierten Kulturzelllinie
gemäß dem Genübertragungsverfahren
und der assoziierten Plasmabestrahlung transferiert worden war,
seine Funktion in den Zellen ausübt,
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Beispiel 9 – CREB-Aktivierung
durch Genübertragung
in Kleinhirn-Körnerzellen
der Ratte (Reportergentest):
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Dies
diente zur Untersuchung, ob das gleiche Ergebnis, wie oben berichtet,
auch mit primär kultivierten,
tierischen Zellen erzielt werden kann, bei denen eine Genübertragung
mit konventionellen Verfahren schwierig ist. Dafür wurden die Kleinhirn-Körnerzellen
der Ratte in der gleichen Weise wie in dem Beispiel 8 behandelt.
Die Kleinhirn-Körnerzellen
der Ratte wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 5 etabliert.
Ein PKA-Gen (pFC-PKA) (1 μg/μl), ein CREB-Reportergen
(pCRE-Luc) mit einem Luciferasegen, das stromab mit der Wirkungssequenz
von aktiviertem CREB (1 μg/μl) und einem
internen Standard, Renilla-Luciferasegen (pRL-SV40), verbunden war,
wurden in die Zellen unter Verwendung eines Plasmaerzeugers gemäß dem Beispiel
2 gmeinsam transferiert, und die Zellen wurden dann für 1 Tag
kultiviert. Die Zellen wurden dann hinsichtlich ihrer Luciferaseaktivität getestet.
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Im
Ergebnis war die Luciferaseaktivität der primären Ratten-Neurozyten signifikant
erhöht
im Vergleich zu Zellen, in die ein Kontrollgen transferiert wurde.
Dies bestätigt
somit, dass das Plasmaübertragungsverfahren
selbst bei primären
Ratten-Neurozyten (Kleinhirn-Körnerzellen
der Ratte) keine Abnormalitöt
bei dem CREB Signalübertragungsweg
durch PKA ergibt.
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Aus
der obigen Darstellung wird deutlich, dass das mit der Plasmabestrahlung
zusammenhängende
Genübertragungsverfahren
es ermöglicht,
ein Gen selbst in primäre
Neurozyten zu übertragen,
bei denen ein Gentransfer mit konventionellen Methoden schwierig
ist, und dass das übertragene
Gen seine Funktion in den Zellen exprimieren kann. Ferner vereinfacht
das Verfahren den Reportergentest.
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Beispiel 10 – Apoptoseinduktion
durch eine BAD-Genübertragung
in Kleinhirn-Körnerzellen
der Ratte:
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Kleinhirn-Körnerzellen
der Ratte wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 5 präpariert.
Fünf Tage
nach AraC-Zugabe wurde das Medium von den Zellen entfernt. Eine
Lösung
mit einem die Apoptose induzierenden Gen, BAD-Gen (pcDNA3.1/GS-BAD) (1 μg/50 μl), wurde
zu 50 μl/Vertiefung
den Zellen hinzugefügt,
und die Zellen wurden einer Plasmabestrahlung unter den gleichen
Bedingungen wie in Beispiel 2 unterworfen. Sofort anschließend wurde
ein Medium hinzugegeben und die Zellen wurden über Nacht bei 37°C und unter
5% Kohlendioxid kultiviert. Damit wurde die Caspase-Aktivität der Zellen
mit CaspASE FITC-VAD-FMK in-situ Marker (Promega) gemessen, um zu
untersuchen, ob eine Apoptose in den Zellen induziert worden war.
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Im
Ergebnis wurde eine signifikante Caspase-Aktivität in den Zellen, in die das
BAD-Gen übertragen
wurde, im Vergleich zu den MOCK-Zellen, in die der Vektor alleine übertragen
wurde, gefunden. Dies bedeutet, dass Apoptoseinduzierte Zellen nachgewiesen
wurden.
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Zusätzlich wurden
die Zellen auf eine DNA-Fragmentierung unter Verwendung von APO-DIRECT
(Pharmingen) überprüft, um festzustellen,
ob in den Zellen, in die das BAD-Gen mit dem Verfahren gemäß der Erfindung übertragen
worden war, sicher eine Apoptose induziert worden war.
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Im
Ergebnis wurden Zellen mit einer signifikanten DNA-Fragmentierung
in den Zellen mit dem BAD-Gen nachgewiesen im Vergleich zu den MOCK-Zellen,
in die der Vektor alleine übertragen wurde.
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Diese
Ergebnisse bestätigen,
dass das BAD-Gen, welches in Kleinhirn-Körnerzellen
der Ratten mit dem Verfahren gemäß der Erfindung übertragen
wurde, eine Apoptose in den Zellen signifikant induzierte und seine
Funktion ausübte.
Gemäß den obigen
Ergebnissen wurde bestätigt,
dass ein Gen, welches in primäre
Kulturzellen mit dem Verfahren nach der Erfindung übertragen
wird, zuverlässig
seine Funktion in den Zellen ausübt.
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Beispiel 11 – Untersuchungen
auf Zellfusion mit von der Lunge des Chinesischen Hamsters abstammenden
CHL-Zellen, von menschlichem Gebärmutterkrebs
abstammenden Hela-Zellen und mit Phäochromozytom-PC12-Zellen der Ratte:
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In
der gleichen Weise wie in Beispiel 2 wurde ein GFP-Gen in CHL-Zellen
und in Hela-Zellen übertragen.
Diese Zellen wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop auf fusionierte
Zellen untersucht. Die Kerne der Zellen wurden mit Dif Quick (International Reagents)
angefärbt
und die fusionierten Zellen wurden unter dem Mikroskop beobachtet.
Die Kerne wurden wie folgt angefärbt:
Nach Behandlung mit dem Plasma wurden die Zellen für 1 Tag
kultiviert und die Kulturflüssigkeit
wurde von den Zellen abgesaugt. Dann wurden die an der Schale haftenden
Zellen mit einem Phosphatpuffer gewaschen und etwa 5 ml/Vertiefung
Methanol (Wako) wurden hinzugefügt. Die
Zellen wurden für
5 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Etwa 2 ml/Vertiefung der Färbeflüssigkeit
I wurden hinzugefügt
und sofort wieder abgesaugt. Dann wurden 2 ml/Vertiefung der Färbelösung II
hinzugefügt
und diese wurde auch sofort wieder abgesaugt. Die haftenden Zellen
wurden einige Male mit Ionenaustausgetauschtem Wasser gewaschen
und dann unter einem Mikroskop beobachtet.
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In
den CHL- und den Hela-Zellen, in die das GFP-Gen mit dem Verfahren
nach der Erfindung übertragen
wurde, wurden große
fusionierte Zellen gefunden. Nach Anfärbung des Zellkerns von diesen Zellen,
die mit Plasmabestrahlung behandelt wurden, wurde gefunden, dass
einige Zellen zusammen mit ihren Kernen fusioniert waren und dass
einige andere Zellen fusioniert waren, wobei mehrkernige Zellen
erhalten wurden.
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Andererseits
wurde ein GFP-Gen in Phäochromozytom-PC12-Zellen
der Ratte in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 übertragen,
wobei jedoch die Zahl der Zellen, die auf die Platte mit den sechs
Vertiefungen übertragen
wurden, 5 × 106/Vertiefung betrug und somit relativ groß war. NGF
wurde zu den Zellen in der gleichen Weise wie in Beispiel 7 zugegeben,
und die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Differenzierungspotenz überprüft.
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Auch
die fusionierten Zellen exprimierten das GFP-Protein sechs Tage
nach der NGF-Zugabe, und eine Nervenfortsatz-Ausdehnung wurde bei
den fusionierten Zellen eindeutig gefunden. Dies lässt die Vermutung
zu, dass die durch Plasmabestrahlung gebildeten, fusionierten Zellen
die intrinsische Eigenschaft der PC12-Zellen hinsichtlich der Differenzierungspotenz
mit NGF zu sympathischen Zellen behalten hatten.
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Beispiel 12 – Kombination
mit der Liposomenmethode:
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Dies
diente zur Untersuchung, ob das Verfahren nach der Erfindung eine
Genübertragung
in Zellen ermöglicht
und zwar selbst unter schwierigen Bedingungen bei einer durch Liposomen
unterstützen
Genübertragung.
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Bei
dem Liposomenverfahren werden ein Liposomenreagenz und ein Übertragungsplasmid
gemischt, um gemischte Partikel mit einer geeigneten Größe herzustellen,
und diese Partikel werden in Zellen eingeführt. Demgemäß muss bei dem Verfahren eine
vorbestimmte Zahl an Partikeln mit einer vorbestimmten Größe hergestellt
werden. Dieses Beispiel diente zur Untersuchung, ob die Genübertragungseffizienz
unter schwierigeren Bedingungen mit einer höheren Plasmidkonzentration
und einem höheren Liposomenreagenzgehalt
als unter den optimierten Bedingungen verbessert werden kann. Dafür wurde ein
GFP-Gen in die Zellen übertragen.
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Konkret
wurden zunächst
100 μg eines GFP-Expressionsplasmides
und 100 μl
von Lipofectin 2000 (GIBCO-BRL) gemischt und bei Raumtemperatur
für 15 Minuten
stehen gelassen, um ein Plasmid/Lipofectin-Konjugat zu erzeugen.
Von dem vorherigen Tag lagen CHL-Zellen kultiviert in einer Platte mit
sechs Vertiefungen vor, und der Kulturüberstand wurde von der Platte
entfernt. 200 μl
des Plasmid/Lipofectin-Konjugats wurden der Platte zugesetzt. Mit einem
Plasmaerzeuger wurde die Platte mit dem Plasma bestrahlt, Die Bedingungen
waren die folgenden: Die Frequenz war 23,3 kHz, die Pulsdauer betrug
60 Hz, die Nutzleistung war 50% und die Gasluftdurchflussmenge war
38 Liter/Minute. Sofort nach der Plasmabestrahlung wurde ein Medium
hinzu gegeben und die Zellen wurden bei 37°C unter 5% Kohlendioxid kultiviert.
Nach einer Kulturdauer von 1 Tag wurden die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop
beobachtet und die das GFP-Protein exprimierenden Zellen wurden
mittels FACS nachgewiesen.
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Selbst
bei diesen Bedingungen wurden einige Zellen gefunden, die das mit
einem Liposomenverfahren allein übertragene
GFP aufwiesen. In Kombination mit dem Verfahren nach der Erfindung waren
die Zellen, die das Gen enthielten, in dem Plasmabestrahlungsbereich
erhöht
im Vergleich zu dem Liposomenverfahren allein. Ferner wurde der Anteil
der Zellen mit dem übertragenen
Gen zu der Gesamtzellzahl in jeder Vertiefung mittels FACS bestimmt.
Es wurde gefunden, dass die Übertragungseffizienz
bei der Kombination mit dem Verfahren nach der Erfindung um das
1,6-fache im Vergleich zu dem Liposomenverfahren allein erhöht war.
Wenn das Verfahren nach der Erfindung mit einem anderen Genübertragungsverfahren
kombiniert wird, oder wenn ein Liposom oder ein anderer, das Liposom
ersetzender Träger,
der die Plasmidübertragung
in Zellen fördern
kann, zur Verwendung bei dem Verfahren nach der Erfindung eingebunden
wird, kann die Übertragungseffizienz
selbst bei schwierigen Zellen und unter schwierigen Bedingungen,
bei denen die Übertragungseffizienz
zuvor nicht gut war, verbessert werden.
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Beispiel 13:
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Hier
wurde ein Plasmaerzeuger hinsichtlich der Übertragung des GFP-Expressionsplasmides
in kultivierte Zellen getestet.
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Das
Verfahren war das folgende: Phäochromozytom-PC12-Zellen
der Ratte (ATCC Nr. CRL-1721) wurden zu 1 × 106 Zellen/Vertiefung
auf eine Platte mit sechs Vertiefungen, die mit Collagen IV beschichtet
war, aufgetragen und über
Nacht kultiviert. Nachdem sichergestellt worden war, dass die Zellen
an der Platte hafteten, wurde das Medium von der Kulturplatte entfernt
und 50 μl
einer GFP-Expressionsplasmidflüssigkeit
(1 μg/μl) wurde
auf die Zelloberfläche
aufgetragen. Dann wurde dies einer Plasmabestrahlung mit einem Plasmaerzeuger,
Plasma Surface Treater ST-7000 (von KEYENCE), unterworfen, Hinsichtlich
des Zustandes des Plasmaerzeugers ST-7000 war die Frequenz nach
einem der drei Zustände
von hoch, niedrig oder Metall eingestellt, und die Bestrahlung wurde
für etwa
5 Sekunden in jedem Einzelfall fortgesetzt. Sofort nach der Plasmabestrahlung
wurde ein Medium zugesetzt und die Zellen wurden über Nacht
kultiviert. Unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops wurden
die Zellen hinsichtlich der Expression des GFP-Proteins überprüft.
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Das
Ergebnis war das folgende: Unter allen Bedingungen wurde eine GFP-Expression in den Zellen
gefunden.
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Die Übertragungseffizienz
war am höchstens bei
der hohen Frequenzbedingung und lag zwischen 50 und 60%.
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Beispiel 14:
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Evans-Blau
(10 mg/ml physiologische Kochsalzlösung) wurde dünn über das
gesamte Abdomen von Nackt-Mäusen
(8 Wochen alt, weiblich, Nippon Charles River) unter Betäubung aufgetragen.
Unter Verwendung eines Plasmaerzeugers wurde dann eine Bestrahlung
mit Plasma durchgeführt.
Die Spannung zwischen den Elektroden während der Entladung lag bei
10 bis 14 kV; die Entfernung zwischen den Elektroden betrug 13 mm;
die Frequenz war 23,3 kHz; die Pulsdauer betrug 60 Hz; die Nutzleistung war
50% und die Gasluftdurchflussmenge betrug 38 Liter/Minute. Die Bestrahlung
wurde für
2,5 Sekunden durchgeführt,
Der Abstand zwischen der Elektrode und dem Abdomen betrug maximal
etwa 24 mm und war minimal 18 mm. Dies wurde für etwa 3 Minuten stehen gelassen
und dann wurde die Stelle mit der Auftragung von Evans-Blau vollständig mit
einer mit Wasser angefeuchteten Saugbaumwolle abgewischt und dann
mit einer Saugbaumwolle, die mit 70 Ethanol angefeuchtet war. Dann
wurde die Haut hinsichtlich einer Farbstoffablagerung überprüft. So behandelt
wurde die Maus mit einer anderen verglichen, die nur einer Plasmabestrahlung
unterworfen wurde, sowie mit einer weiteren Maus, die mit Evans-Blau
behandelt wurde, wobei aber keine Plasmabestrahlung durchgeführt wurde.
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Im
Ergebnis wurde keine Farbstoffablagerung bei den beiden Mäusen gefunden,
die nur einer Plasmabestrahlung unterworfen wurden bzw. die nur mit
Evans-Blau beschichtet waren, aber keiner Plasmabestrahlung unterworfen
wurde. Im Gegensatz dazu hatte die Maus, die mit Evans-Blau beschichtet war
und die einer Plasmabestrahlung unterworfen wurde, einige blaue
Flecken in der Plasma bestrahlten Region des Abdomens. Selbst nach
24 Stunden waren die Flecken noch zu sehen. Es wird somit angenommen,
dass Substanzen, deren Molekulargewicht auf dem Niveau von Evans-Blau
liegt, in Tiere mittels Plasmabestrahlung übertragen werden können.
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Bisher
wurde ein Bereicht angekündigt,
der besagt, dass ein Farbstoff perkutan in einzelne Tiere mittels
Bestrahlung mit kalten Ultraschallwellen übertragen werden kann (Katsuro
Tachibana; the Medical Department of Fukuoka University/the Society
of Molecular Biology of Japan, 2001). Die vorliegende Erfindung
lässt vermuten,
dass eine Substanzübertragung
in Tiere auch durch Plasmabestrahlung möglich ist.
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Gewerbliche
Anwendbarkeit
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Die
vorliegende Erfindung ermöglicht
eine hocheffiziente Übertragung
einer Reihe von ausgewählten
Molekülen
in verschiedene Zellen. Die Erfindung ermöglicht auch eine Zellfusion.
Ferner erfordert die Erfindung keinen komplizierten Betrieb hinsichtlich
der Anwendung eines elektrischen Feldes auf Proben unter Verwendung
von Elektroden wie bei der Elektroporation, und erfordert keine
umfangreichen Geräte
wie bei den Genkanonen.