JPH06303963A - 細胞培養用基盤作製方法 - Google Patents

細胞培養用基盤作製方法

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JPH06303963A
JPH06303963A JP5090292A JP9029293A JPH06303963A JP H06303963 A JPH06303963 A JP H06303963A JP 5090292 A JP5090292 A JP 5090292A JP 9029293 A JP9029293 A JP 9029293A JP H06303963 A JPH06303963 A JP H06303963A
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JP
Japan
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cell culture
gas plasma
temperature gas
reactor
base material
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Pending
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JP5090292A
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English (en)
Inventor
Hirokazu Sugihara
宏和 杉原
Yasushi Kobayashi
康 小林
Tadayasu Mitsumata
忠泰 光亦
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Panasonic Holdings Corp
Original Assignee
Matsushita Electric Industrial Co Ltd
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Publication date
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12MAPPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/20Material Coatings

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  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 基盤材料を各種低温ガスプラズマ中で処理
し、前記基盤材料に親水性表面を形成することにより、
接着性タンパク質またはポリアミノ酸を用いずに細胞接
着性の良い細胞培養用基盤を安価にかつ簡便に提供す
る。 【構成】 硬質ガラス表面に絶縁層としてNPIをス
ピンコートしたものを基盤材料とし、気圧10Torr
以下の低温ガスプラズマ発生装置反応器内に静置する。
13.56MHzの高周波電源を用い、反応器内にある
一組の電極に電圧をかけ、反応器内に高周波放電を発生
させる。このようにして生じた低温ガスプラズマ中に、
基盤材料を10分間放置した後、真空ポンプを停止し、
反応器内に濾紙を通して埃を除去した空気を徐々に導入
し、細胞培養用基盤を得る。低温ガスプラズマは、酸
素、空気、二酸化炭素、窒素のいずれかであることが好
ましい。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、細胞の培養、特に基盤
接着性が培養の可否の大きな要因となる神経細胞の培養
に用いる、細胞接着性の良い細胞培養用基盤の作製方法
に関する。
【0002】
【従来の技術】近年、医学、薬学等の分野で細胞培養を
用いた実験の有用性が認められてきている。特に、神経
生理学の分野では、細胞の医学的検討や電気素子として
の適用の可能性の検討などが、培養神経細胞を用いて、
活発に行われてきている。神経細胞は、培養基盤に接着
できなければ数時間以内に死滅する性質を有するので、
培養の可否は、培養用基盤の接着性に大きく影響され
る。
【0003】従来、接着性の高い培養用基盤を提供する
材料としては、ポリプロピレン、ポリスチレン等の有機
重合体が用いられてきた。また、これらの材料の細胞接
着性をさらに高めるため、基盤表面を、コラーゲン、ゼ
ラチン、ラミニン等の接着性タンパク質で薄くコートし
たり、ポリリジン、ポリオルニチン等のポリアミノ酸で
処理したりするのが普通であった。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】上述した従来の技術に
おいては、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン等の接着性
タンパク質が高価であり、細胞培養用基盤を得るのに費
用がかかりすぎるという問題点があった。
【0005】また、ポリリジン、ポリオルニチン等のポ
リアミノ酸も同様に高価である上、細胞毒性が強く、基
盤表面処理後充分な洗浄を怠ると、神経細胞が死滅する
という課題があった。
【0006】さらに、上記接着性タンパク質またはポリ
アミノ酸を用いた細胞培養用基盤作製法では、接着性タ
ンパク質またはポリアミノ酸の水溶液中に、処理したい
基盤を1時間程度浸漬し、その後純水で少なくとも3回
以上洗浄する必要があるため、処理時間がかかるという
課題があった。
【0007】さらにまた、ポリイミド等の、もともと細
胞接着性の余り良好でない物質表面を、上記接着性タン
パク質またはポリアミノ酸を用いた細胞培養用基盤作製
法で処理しても、良好な細胞接着性が得られ難いという
課題があった。このため、細胞培養用基盤の材質が著し
く限定されるという課題があった。
【0008】本発明は、かかる従来の問題点を解決し、
良好な細胞接着性を示す細胞培養用基盤を安価にかつ簡
便に得ることのできる細胞培養用基盤作製方法を提供す
ることを目的とする。
【0009】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するた
め、本発明の細胞培養用基盤作製方法は、基盤材料を低
温ガスプラズマ中で処理することにより、前記基盤材料
に親水性表面を形成するという構成を備えたものであ
る。
【0010】前記構成においては、低温ガスプラズマ
が、酸素、空気、二酸化炭素、窒素からなる群から選ば
れた少なくとも1種であることが好ましい。
【0011】
【作用】前記本発明の構成によれば、基盤材料を低温ガ
スプラズマ中で処理することにより、前記基盤材料に親
水性表面を形成するので、接着性タンパク質またはポリ
アミノ酸を用いずに、細胞接着性が高く、特に神経細胞
の培養に有効な細胞培養用基盤を安価にかつ簡便に作製
することができる。すなわち、基盤材料表面相の水素原
子などが解離しラジカルが形成され、これらが大気中で
酸化するか、または水分子の吸着によって水酸基などの
親水性分子構造を作るので、良好な細胞接着性を示す細
胞培養用基盤を作製することができる。
【0012】また、低温ガスプラズマが、酸素、空気、
二酸化炭素、窒素からなる群から選ばれた少なくとも1
種であるという本発明の好ましい構成によれば、低温ガ
スプラズマにさらされた基盤材料表面は、多くの場合不
均一にエッチングされるため、疎面化され、親水性と合
わせて細胞接着性の改善に役立つ。
【0013】
【実施例】本発明に供される絶縁基盤材料としては、絶
縁性高分子材料で有れば、特に限定されないが、細胞培
養後顕微鏡観察が可能な透明な基盤が好ましい。例え
ば、石英ガラス、鉛ガラス、ホウ珪酸ガラス等のガラ
ス、若しくは石英等の無機物質、または、ポリメタクリ
ル酸メチルまたはその共重合体、ポリスチレン、ポリ塩
化ビニル、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリカーボ
ネート、尿素樹脂、メラミン樹脂などの透明性を有する
有機物質等が挙げられる。
【0014】低温ガスプラズマは、酸素、空気、二酸化
炭素、窒素のいずれかを用いることが好ましい。作業の
簡便性からは、空気を用いるのが好ましく、特に親水性
を強める場合には、乾燥窒素を用いるのが好ましい。
【0015】基盤材料を低温ガスプラズマ中に放置する
時間は、特に限定されるものではないが、10秒以下で
は充分な接着性が得られ難く、30分以上では基盤に機
械的損傷を与える恐れがあるので、この間が望ましく、
特に5分〜15分が望ましい。
【0016】次に、具体的実施例として、石英ガラス基
盤上に絶縁層材料としてネガティブフォトセンシティブ
ポリイミド(以下NPIと略す)を1μm厚に塗布した
ものを基盤材料として用い、本発明の細胞培養用基盤作
製法を施し、さらに得られた細胞培養用基盤上で、ラッ
ト視覚皮質神経細胞を培養した例について、詳細に説明
する。
【0017】実施例1 基盤材料は機械的強度の強い透明な絶縁素材として、5
0×50×1mmの硬質ガラス(“IWAKI COD
E 7740 GLASS”[岩城硝子(株)製]以下
同じ)表面に、絶縁層としてNPIを、乾燥後の厚みが
1μmとなるようにスピンコートしたものを用いた。
【0018】基盤材料をグロー放電式の低温ガスプラズ
マ発生装置の反応器内に静置し、真空ポンプを用いて反
応器内の気圧を10Torr以下にした。反応器内の気
体は、空気とした。
【0019】しかるのち、13.56MHzの高周波電
源を用い、反応器内にある一組の電極に電圧をかけた。
各サイクルの電圧が放電開始電圧以上になった時点で、
反応器内に高周波放電が生じた。
【0020】高周波放電は、低温ガスプラズマと反応器
の壁の表面上に生じる電圧降下部分とから成り立つ。こ
のようにして生じた低温ガスプラズマ中に、基盤材料を
10分間放置した後、真空ポンプを停止し、反応器内に
濾紙を通して埃を除去した空気を徐々に導入し、細胞培
養用基盤を得た。
【0021】実施例2 次に、細胞培養用基盤上での神経細胞の培養について述
べる。実施例1のようにして作製した細胞培養用基盤上
で、神経細胞としてラット大脳視覚皮質を培養した。
【0022】以下、培養法について詳細に述べる。 (イ)妊娠後16〜18日を経過したSDラットの胎児
の脳を摘出し、氷冷したハンクス平衡塩液(以下HBB
Sと略す)に浸す。 (ロ)氷冷HBBS中の脳から視覚皮質を切り出し、イ
ーグル最小必須培地(以下MEMと略す)液中に移す。 (ハ)MEM液中で、視覚皮質をできるだけ細かく、最
大でも0.2mm角となるように切断する。 (ニ)細かく切断した視覚皮質を遠沈管(遠心分離用試
験管)に入れ、カルシウムおよびマグネシウムを含まな
いHBBS(以下CMF−HBBSと略す)で3回洗浄
した後、適量の同液中に分散する。 (ホ)上記(ニ)の遠沈管中に、トリプシンのCMF−
HBBS溶液(0.25重量%)を加え、全量を倍にす
る。緩やかに撹拌しながら、37℃で15分から20分
間恒温状態に保ち酵素反応を行わせた。 (ヘ)牛胎児血清(FCS)10vol.%を含むダルベッ
コ変更イーグル培地(DMEM)とHamF−12培地
を1対1の体積比で混合したDMEM/F−12混合培
地を、上記(ホ)を経た遠沈管中に加え、全量をさらに
倍にする。先端をバーナーであぶり口径を小さくしたパ
スツールピペットで、緩やかにピペッティングを繰り返
し(最大20回程度)、細胞をほぐす。 (ト)9806.65m/sec2 (すなわち1000
g)で約5分間遠心分離を行う。遠心分離終了後、上清
を捨て、沈澱をFCS5%を含むDMEM/F−12混
合培地に懸濁する。 (チ)上記(ト)および(チ)をあと2回(計3回)繰
り返す。 (リ)最終的に得られた沈澱を、5vol.%FCSを含む
DMEM/F−12混合培地に懸濁し、懸濁液中の細胞
濃度を赤血球計数板を用いて計測する。同様の培地を用
いて細胞濃度を2〜4×106 個/mlになるように調
整する。 (ヌ)細胞培養用基盤上に直径25mm、高さ6mmの
プラスティック製円筒を、基盤の中心とプラスティック
円筒の中心を合わせて接着することにより構成した細胞
培養用ウェル中に、あらかじめ5vol.%FCSを含むD
MEM/F−12混合培地500μlを加え、CO2
ンキュベータ内(空気濃度95vol.%、CO2 濃度5vo
l.%、相対湿度97%、温度37℃)で暖めておく。 (ル)上記(ヌ)のウェル中に、細胞濃度を調整した懸
濁液100μlを静かに加え、再びCO2 インキュベー
タ内に静置する。 (ヲ)上記(ル)の操作より3日後に、培地の半量を新
しいものと交換する。交換培地はFCSを含まないDM
EM/F−12混合培地を用いる。 (ワ)以降、4〜5日毎に上記と同様の培地交換をおこ
なう。
【0023】これら一連の操作により、細胞培養用基盤
上でラット大脳視覚皮質の神経細胞を培養することがで
きた。実施例1の操作を経ていない基盤材料(すなわち
低温プラズマ処理していない硬質ガラス)上にも、実施
例2の方法でラット大脳視覚皮質の神経細胞を培養し、
本実施例の細胞培養用基盤上で培養した場合と、細胞接
着率を比較した(これを比較例とする)。
【0024】細胞接着率は、細胞懸濁液を基盤上に加え
た1時間後に、基盤上の一定面積に存在する神経細胞数
と、培養開始後48時間後の、基盤上の一定面積に存在
する神経細胞数の比として求めた。
【0025】各々の基盤10枚に対しラット視覚皮質の
神経細胞の培養を試み、細胞接着率を測定したところ、
本実施例の細胞培養用基盤では、70〜90%、比較例
の基盤では、20〜50%であった。
【0026】なお、神経細胞の培養法については多くの
変法があり、本実施例の方法に限定されるものではな
い。
【0027】
【発明の効果】以上説明した通り、本発明によれば、基
盤材料を各種低温ガスプラズマ中で処理することによ
り、前記基盤材料に親水性表面を形成するので、接着性
タンパク質またはポリアミノ酸を用いずに、細胞接着性
が高く、特に神経細胞の培養に有効な細胞培養用基盤を
安価にかつ簡便に作製することができる。
【0028】また、低温ガスプラズマが、酸素、空気、
二酸化炭素、窒素からなる群から選ばれた少なくとも1
種であることにより、低温ガスプラズマにさらされた基
盤材料表面は、多くの場合不均一にエッチングされるた
め、疎面化され、親水性と合わせて細胞接着性の改善に
役立つ。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 基盤材料を低温ガスプラズマ中で処理す
    ることにより、前記基盤材料に親水性表面を形成するこ
    とからなる細胞培養用基盤作製方法。
  2. 【請求項2】 低温ガスプラズマが、酸素、空気、二酸
    化炭素、窒素からなる群から選ばれた少なくとも1種で
    ある請求項1に記載の細胞培養用基盤作製方法。
JP5090292A 1993-04-16 1993-04-16 細胞培養用基盤作製方法 Pending JPH06303963A (ja)

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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN102382763A (zh) * 2011-12-20 2012-03-21 北京思清源生物科技有限公司 一种等离子体微生物诱变育种设备
US9157059B2 (en) 2008-07-25 2015-10-13 Corning Incorporated Defined cell culturing surfaces and methods of use

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