JPH04330277A - 培養基質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【産業上の利用分野】生体内にある細胞を体外に取り出
して培養することは、生命科学、医学、薬学、農学等の
分野及びそれらを応用した産業において重要な技術とな
つている。現在では各種の培地、増殖因子、培養基質の
研究開発が進められた結果、多くの細胞種が培養系に移
されている。しかし、十分に機能を維持したり生体内と
同じ形態をとらせたりすることが困難な細胞もまだ多く
存在する。代表的な細胞に神経細胞がある。神経細胞は
その機能の高度な複雑さから未解明な点が非常に多く、
実験系が組み立てやすい安定した培養系の確立が切望さ
れているものである。

【０００２】

【従来の技術】神経細胞は、その形態が他の細胞とは著
しく異なり繊維状の細い神経突起を有している。この神
経突起を伸ばした形が神経細胞の本来の形態であり、こ
の状態を維持することが生体から取り出した神経細胞の
機能を生体外で検討する基本となる。数μｍ以下の細い
神経突起の伸展を良好に行なわせるためには、神経細胞
の培養基質への接着が問題となる。

【０００３】通常行なわれる細胞接着性を高める方法と
しては、ラミニン、コラーゲンなどの細胞接着性蛋白質
や、ポリリジン、ポリオルニチン、ポリアリルアミン他
のカチオン性ポリアミンあるいはこれらの混合物をガラ
スもしくは表面処理が施された培養用プラスチツク基質
にコーテイングする。多くの神経細胞では、これらのコ
ーテイングを行なわないと細胞接着や神経突起の伸展が
不充分で良好な培養が行えない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】細胞接着性蛋白質は、
生体から大量に採ることができるものではなく、また安
定性にも劣る。すなわち機能的には高いものではあるが
、実用的観点からは使いにくいものである。ポリアミン
系のものはこの物質自体に毒性があり、無血清条件で神
経細胞を培養する際にはむしろ負の要因となつてしまう
場合があり、すべての場合に用いることができるもので
はない。不安定な細胞接着性蛋白質や毒性を持つポリア
ミン類を慎重にコーテイングすることが不要な基質、高
い安定性と良好な培養性を示す基質は実用上おおきな有
用性を持つと言える。

【０００５】本発明者は、このような基質を開発すべく
鋭意研究を積重ねた結果、透明プラスチツクをフルオロ
カーボンの低温プラズマ処理したものが所期の効果を奏
することを見い出して本発明を完成するに至つた。

【０００６】すなわち、本発明は、従来のような不安定
な細胞接着性蛋白質や毒性を持つポリアミン類を慎重に
コーテイングする操作が不必要であり、高い安定性と良
好な培養性を示す神経細胞の新規培養基質を提供するこ
とを目的とするものである。さらに、本発明は、神経細
胞の培養を行なう際に、基質への接着性、神経突起の伸
展が良好な新規培養基質を提供することを目的とするも
のである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】このような目的を達成す
るための本発明の構成は、以下の（１）〜（４）の技術
的手段からなるものである。 （１）透明プラスチツクをフルオロカーボンの低温プラ
ズマ処理したことを特徴とする神経細胞の培養基質。 （２）透明プラスチツクをフルオロカーボンの低温プラ
ズマ処理し、次いでアンモニアの低温プラズマ処理した
ことを特徴とする神経細胞の培養基質。 （３）フルオロカーボンが、テトラフルオロメタン、ヘ
キサフルオロエタンないしはその混合物から選択される
前記（１）ないしは（２）記載の神経細胞の培養基質。 （４）透明プラスチツクがポリスチレン、ホリメチルペ
ンテン、メチルメタアクリレートポリスルホン、ポリエ
ーテルスルホン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカ
ーボネート、ポリフツ化ブビニリデンから選択される前
記（１）ないし（２）記載の神経細胞の培養基質。

【０００８】培養基質の形状は、フイルム、プレート、
デイツシユ等の細胞培養可能な形であればいずれも可能
である。培養している細胞を顕微鏡下観察することは通
常に行なわれることで培養基質としては透明性が必要で
ある。特殊な細胞−たとえば光感受性細胞−では不透明
基質が適当な場合がある。透明材料の代表的なものにガ
ラスがあり、現在も一部では使われているが、使い易さ
すなわち軽くて扱い易い、使い捨てできる価格の低さ等
の点からほとんどプラスチツク製に代わりつつある。

【０００９】一般的に、プラスチツクは単一組成で構成
されているのではなく成型性や安定性を高めるため各種
の添加剤が加えられている。これらが細胞に対して毒性
を示す場合があり、すべてのプラスチツクが用いうるも
のではない。また培養した細胞は免疫染色などの方法で
、その特徴を識別することも行なわれているが、この場
合、アルコール類、アミン類、弱酸、弱アルカリ等が使
われるためある程度の耐薬品性が必要である。これらの
ことから透明プラスチツクとしては、ポリスチレン、ポ
リメチルペンテン、メチルメタアクリレート、ポリスル
ホン、ポリエーテルスルホン、ポリエチレンテレフタレ
ートが好適である。ポリカーボネート、ポリフツ化ブビ
ニリデンなども幅広い用途を考えなければ使用すること
ができる。

【００１０】フルオロカーボンの低温プラズマ処理はサ
ンプルを入れたチヤンバーを減圧、次いで、フルオロカ
ーボンガスを導入する。サンプルを間に置いた２つの電
極に高周波（例えば１３、５６ＭＨＺ　が用いられる）
をかけることにより低温プラズマ処理が発生し表面処理
が行なわれる。導入するフルオロカーボン量は、高周波
ジエネレーターの大きさにもよるが、数百ｍＴｏｒｒま
で任意に設定できる。ガス種は、各種の使用可能なもの
があるが、テトラフルオロメタン、ヘキサフルオロエタ
ン及びその混合物が使い易く、好適である。フツ素ガス
も使用できるが取り扱いはやや難しい。処理時間は数十
秒から数十分の間が良い。ガス純度はグレードの高いも
のが必要である。低純度のものは表面の均一性の低下を
招く。アンモニアプラズマ処理も同様に行うが、処理時
間は数秒から数分の間が好適である。アンモニアの純度
も高いものが必要である。

【００１１】

【発明の効果】本発明の基質を用いて神経細胞の培養を
行なうと、良好な基質への接着、神経突起の伸展が認め
られる。すなわちこれまで用いられてきた細胞接着性蛋
白質などを用いる必要がないため、各種の細胞が産生す
る蛋白質、ペプチド、ホルモンなどの影響、効果をより
明確に調べることが可能となり神経細胞の研究では本発
明の培養基質は非常に有用なものとなり産業上の利便性
大なるものがある。以下、実施例により本発明をさらに
具体的に説明する。

【００１２】

【実施例】

実施例１．ポリスチレン、ポリメチルペンテンの直径３
５ｍｍのプラスチツクデイツシユ（住友ベークライト社
製）をテトラフルオロメタンの低温プラズマ処理した。 プラズマ重合装置（サムコ社製）のチヤンバー内にサン
プルを入れた後、０．０５Ｔｏｒｒに減圧、テトラフル
オロメタン（昭和電工社製、純度９９．９９９％を０．
２Ｔｏｒｒになるまで導入し、５０Ｗで５分間処理した
。この試料をＸＰＳ法（Ｘ線光電子分光法）による表面
分析を行つたところ表面のフツ素／炭素の原素比はポリ
スチレンで０．８ポリメチルペンテンで１．０であつた
。

【００１３】ラツト胎児（１８日胚）の海馬神経細胞の
無血清培養は以下のように行つた。５匹の胎児より海馬
部分を切り出し、直ちにパパイン（ワージントン社製）
液（１０ユニツト／ｍｌ）で酵素処理した。培地はＤＭ
Ｅ／Ｆ−１２（シグマ社製、以下ＤＦ培地）を用いてイ
ンシユリン（シグマ社製、５μｇ／ｍｌ相当量添加）、
トランスフエリン（シグマ社製、同５μｇ／ｍｌ）プロ
ジエステロン（シグマ社製、５μｇ／ｍｌ）を添加した
ものを用いた。前記酵素処理した細胞分散液を遠心分離
した後、ＤＦ培地で２×１０４　個／ｍｌの細胞液を各
デイツシユに２ｍｌずつ加えた。比較品は同形状の細胞
培養用デイツシユ（住友ベークライト社製）を用いた。 ３７℃の炭酸ガスインキユベーター（ＣＯ２　：５％）
中で、２日間培養した。顕微鏡下細胞を観察したところ
神経細胞の接着、神経突起の伸展、いずれも比較品に比
べ良好な状態が認められた。

【００１４】実施例２．実施例１で調整したポリスチレ
ンデイツシユをさらにアンモニアプラズマ処理した。ア
ンモニア（昭和電工社製、純度９９．９９９％）を０．
００５Ｔｏｒｒまで減圧したチヤンバー内に０．２Ｔｏ
ｒｒまで導入。５０Ｗで２分処理し、ＸＰＳ法により表
面にフツ素の他にアミン、アミドの基が導入されている
ことを確認し、細胞培養試験を行つた。ＤＦ培地（実施
例１と同じ）に牛胎児血清（ハイクローン社を添加（１
０％）した培地を用いた。ラツト新生児の脊髄後根神経
節を切り出し、０．１％のトリプシン（シグマ社製）で
４５分間、３７℃で酵素処理した遠心分離した後、上記
培地に神経栄養因子（ＮＧＦ，シグマ社製）を添加（５
０ｎｇ／ｍｌ）し、細胞分散液を調整、３×１０３　個
／ｍｌの分散液を２ｍｌ／デイツシユで加えた。比較品
を実施例１と同じものを用い、２日間培養した。本発明
の調整品では神経突起の伸展が比較品より優つているこ
とが認められた。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　透明プラスチツクをフルオロカーボン
   の低温プラズマ処理したことを特徴とする神経細胞の培
   養基質。
2. 【請求項２】　　透明プラスチツクをフルオロカーボン
   の低温プラズマ処理し、次いでアンモニアの低温プラズ
   マ処理したことを特徴とする神経細胞の培養基質。
3. 【請求項３】　　フルオロカーボンが、テトラフルオロ
   メタン、ヘキサフルオロエタンないしはその混合物から
   選択される請求項１ないしは２記載の神経細胞の培養基
   質。
4. 【請求項４】　　透明プラスチツクがポリスチレン、ホ
   リメチルペンテン、メチルメタアクリレート、ポリスル
   ホン、ポリエーテルスルホン、ポリエチレンテレフタレ
   ート、ポリカーボネート、ポリフツ化ビニリデンから選
   択される請求項１ないし２記載の神経細胞の培養基質。 【０００１】