CN112823204B - 培养材料及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明的课题在于提供形状稳定性优异，并且能够实现适于肝细胞培养的氧环境的培养材料。解决本发明课题的方法涉及一种包含4‑甲基‑1‑戊烯聚合物(X)的细胞、组织或器官的培养材料，培养面的水接触角为50°～100°，并且利用下述试验方法(A)得到的下垂距离为0～5mm，在温度23℃、湿度0％时的透氧度为4500～90000cm3/(m2×24h×atm)。试验方法(A)：制作与上述培养材料为相同材料，且与培养材料的培养面为相同厚度，纵×横为100mm×10mm的平板状的试验片。将上述试验片以相对于试验片的纵尺寸从试验台的水平的上表面向水平方向伸出50mm的状态固定于试验台。从固定时起3分钟后，测定从试验台伸出的上述试验片的前端从包含上述试验台的上表面的水平面向铅垂下方下垂的距离。其中，从上述固定到测定为止在室温下进行。
Description
技术领域
本发明涉及培养材料及其用途。
背景技术
细胞、组织、器官如果不在适于生长的条件下，则不能培养，因此需要与包含适当的营养的培养基(培养液)一起放入盘、培养板、烧瓶等培养容器中，并且培养容器需要静置于能够将温度、湿度、气体浓度保持于预定水平的培养箱内。
进一步，为了有效率地实现上述培养，必须进行充分且适当的氧供给。
为了向细胞的氧供给和培养基的pH调整用的二氧化碳供给，需要向培养容器内供给氧和二氧化碳等气体，因此由透气性低的玻璃、聚苯乙烯等原材料形成的培养容器在帽、盖等培养容器上部设置开口部，以确保气体从培养箱内供给至容器内部。然而，培养细胞通常粘附于培养容器底面的情况或者悬浮于底面附近的情况多，由于上表面被培养基所覆盖，因此培养基中的氧扩散速度成为限速因素，特别是向底部的培养细胞的氧供给不充分，妨碍细胞的增殖这样的问题一直以来广为人知。此外已知聚苯乙烯具有自身荧光，因此也存在用显微镜难以观察等问题(非专利文献1)。
为了促进向细胞供给氧，存在提高培养装置内的氧分压等手段，但是需要用于控制氧分压的专用的培养装置，一般而言与用于在大气下培养的培养装置相比成本高。此外，为了控制氧分压而使用的氧气瓶为助燃性气体，因此具有氧化发热、燃烧、爆炸的危险，与作为不燃性气体的氮气瓶、二氧化碳气瓶相比，氧气瓶的处理需要充分注意。作为简便并且实用的氧供给改善方法，已知如果使用将高透氧性的膜作为培养面的培养板，则能够简便地解决静置培养中的培养液层中的氧扩散控制的问题(非专利文献2)。
例如，东大的酒井等将高透氧性的聚二甲基硅氧烷(PDMS)用于培养容器底面，进行氧消耗速度大的肝细胞的培养。其结果报告有在市售的聚苯乙烯制板中看到的缺氧状态(厌氧的环境)得以消除，观察到了肝细胞的高度的自组织化现象(非专利文献3)。
作为高透氧性的材料，除了上述PDMS以外，研究了聚丁二烯(专利文献1)等橡胶材料。然而，由橡胶材料构成的透气性膜的强度弱而易于破裂，并且在加入培养基时易于产生弯曲，形状不稳定。如果培养容器产生弯曲，则由于容器的变形、随着变形产生的冲击，导致附着于培养容器内壁的细胞剥离、培养中的细胞聚集于弯曲的部位等无法有效率地培养细胞。此外，橡胶材料通常易于发生药剂物质的吸附、吸收，因此在药物开发筛选用途、诊断用途中的使用受到限制。
从透氧性的观点考虑，进行了将非极性的聚乙烯树脂、聚丙烯树脂等应用于培养容器的研究，但是如果为了保持充分的强度而调整膜厚，则存在透氧性会变得不充分、由于不透明而用显微镜难以观察等问题，仅用于袋状的培养容器等一部分培养容器。还已知为了将膜保持得薄，防止破裂、弯曲而在培养容器的底面设置支撑层的技术(专利文献5)，但是存在在观察细胞时，支撑层成为干扰这样的问题。
另一方面，作为优异的高透氧性的树脂材料，可举出聚4-甲基-1-戊烯树脂。专利文献1～4中公开了利用使用了聚4-甲基-1-戊烯树脂的膜的培养容器的技术。通过设法提高膜的热封性、柔软性，从而适合用于角状、袋状等的植物的生长、悬浮性细胞的培养容器，但是在适用于静置培养用的情况下，培养底面产生弯曲，因此不适合作为培养容器。此外，聚4-甲基-1-戊烯树脂在原样的情况下培养表面的疏水性高，如果用于培养基材，则存在细胞不能附着而剥落并死灭等问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本实开平1-112697号公报
专利文献2：日本特开平8-149973号公报
专利文献3：日本特开平11-137241号公报
专利文献4：日本特开2001-190267号公报
专利文献5：日本特开2016-077164号公报
非专利文献
非专利文献1：Stevens,K.M.,Oxygen requirements for liver in vitro.,Nature，206,199(1965)
非专利文献2：Xiao W，Shinohara M,Komori K,Sakai Y,Matsui H,OsadaT,A(2014):The importance of physiological oxygen concentrations inthe sandwichcultures of rat hepatocytes on gas-permeable membranes,Biotechnol.Prog.,30(6),1401-1410
非专利文献3：酒井康行，“肝培养中的氧供给的改善”，[online]，肝细胞研究会，[平成31年(2019年)4月9日检索]，互联网<http://hepato.umin.jp/kouryu/kouryu28.html>
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的发明人等认为为了在体外，以更接近体内的状态进行细胞、组织或器官(以下，称为细胞等)的培养，开发具有优异的氧供给能力，弯曲等变形少的培养材料是重要的。即，认为需要即使不仅仅依赖于利用培养箱进行的氧浓度控制，氧供给环境也严密地得以控制，形状也稳定的培养容器。因此，本发明的课题在于提供形状稳定性优异，特别是适于需要氧供给的、细胞、组织或器官的培养，不产生自身荧光且不损伤细胞观察性，不易吸附药剂的培养材料和培养容器。此外，对于附着性的细胞、组织或器官的培养而言，除了形状稳定性、氧供给性以外，能够保持细胞等的粘附性也是重要的。因此，本发明的第二课题在于提供适于培养附着性的细胞、组织或器官的培养器具。
用于解决课题的方法
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究。其结果发现具有以下构成的培养材料能够解决上述课题，由此完成了本发明。本发明为例如以下的〔1〕～〔14〕。
〔1〕一种培养材料，其为包含4-甲基-1-戊烯聚合物(X)的、细胞、组织或器官的培养材料，培养面的水接触角为50°～100°，并且利用下述试验方法(A)得到的下垂距离为0～5mm，在温度23℃、湿度0％时的透氧度为4500～90000cm3/(m2×24h×atm)。试验方法(A)：制作与上述培养材料为相同材料，且与上述培养材料的培养面为相同厚度，纵×横为100mm×10mm的平板状的试验片。将上述试验片以相对于试验片的纵尺寸从试验台的水平的上表面向水平方向伸出50mm的状态固定于试验台。从固定时起3分钟后，测定从试验台伸出的上述试验片的前端从包含上述试验台的上表面的水平面向铅垂下方下垂的距离。(其中，从上述固定到测定为止在室温下进行。)
〔2〕根据〔1〕所述的培养材料，上述4-甲基-1-戊烯聚合物(X)为选自4-甲基-1-戊烯均聚物(x1)、以及4-甲基-1-戊烯与选自乙烯和碳原子数3～20的α-烯烃(不包括4-甲基-1-戊烯)中的至少1种烯烃的共聚物(x2)中的至少1种聚合物。
〔3〕根据〔1〕或〔2〕所述的培养材料，以接种的大鼠原代培养肝细胞的细胞密度为1.0×105细胞/cm2～4.0×105细胞/cm2来进行下述试验方法(B)时，在上述细胞密度的范围的至少一点，1小时后的培养液中的溶解氧浓度为培养液中的饱和氧浓度的2～20％。试验方法(B)：在培养面积为2cm2的经胶原蛋白涂覆的培养容器中，用大鼠原代肝细胞用培养液0.5mL接种大鼠原代培养肝细胞，在温度37℃、二氧化碳浓度5.0％、氧浓度20％下进行培养，在接种24小时后，除去培养容器内的培养液之后，重新添加培养液0.5mL，在距离培养容器底面80μm的高度测定氧浓度1小时，其中，所述培养容器包含由聚乙烯构成的圆筒部、以及与上述培养材料为相同材料且构成为与上述培养材料的培养面相同厚度的平板状的底面部。
〔4〕根据〔3〕所述的培养材料，以接种的大鼠原代培养肝细胞的细胞密度为1.0×105细胞/cm2～4.0×105细胞/cm2来进行上述试验方法(B)时，在上述细胞密度的范围的至少一点，氧消耗速度为40～150pmol/s/105细胞。
〔5〕根据〔1〕～〔4〕中任一项所述的培养材料，其为膜、片或培养容器。
〔6〕根据〔5〕所述的培养材料，培养容器为培养皿、烧瓶、培养插件、培养板、培养瓶或袋。
〔7〕根据〔1〕～〔6〕中任一项所述的培养材料，对于培养面进行了微细加工。
〔8〕一种微流路器件，其包含〔7〕所述的培养材料。
〔9〕一种培养容器，其中，至少培养面由〔1〕～〔7〕中任一项所述的培养材料形成。
〔10〕根据〔9〕所述的培养容器，其具有至少一个孔。
〔11〕一种培养器具，其由〔1〕～〔7〕中任一项所述的培养材料、或者〔9〕或〔10〕所述的培养容器构成。
〔12〕根据〔11〕所述的培养器具，在培养面涂布有天然高分子材料、合成高分子材料或无机材料。
〔13〕一种细胞、组织或器官的培养方法，其具有在〔11〕或〔12〕所述的培养器具内培育细胞、组织或器官的工序。
〔14〕根据〔13〕所述的细胞、组织或器官的培养方法，细胞、组织或器官为肝细胞。
发明的效果
根据本发明，能够提供形状稳定性优异，并且能够实现适于细胞、组织或器官的培养的氧环境，不产生自身荧光且不损伤细胞观察性，不易吸附药剂的培养材料和培养容器。此外，能够提供保持了适于附着性的细胞、组织或器官的培养的细胞附着性的培养器具。
附图说明
图1为将实施例1的细胞利用相位差显微镜观察得到的照片。(上图：表示1天后，下图：表示7天后。)
图2为将比较例4的细胞利用相位差显微镜观察得到的照片。(上图：表示1天后，下图：表示7天后。)
图3为将比较例5的细胞利用相位差显微镜观察得到的照片。(上图：表示1天后，下图：表示7天后。)
图4为实施例10的利用荧光显微镜观察得到的培养材料的照片。(左图：DAPI滤光片，中图：GFP滤光片，右图：TexasRed滤光片)
图5为比较例6的利用荧光显微镜观察得到的培养材料的照片。(左图：DAPI滤光片，中图：GFP滤光片，右图：TexasRed滤光片)
具体实施方式
本发明大致分为四种方式。
作为本发明第一方式的培养材料为包含4-甲基-1-戊烯聚合物(X)的细胞、组织或器官的培养材料，培养面的水接触角为50°～100°，并且利用下述试验方法(A)得到的下垂距离为0～5mm，在温度23℃、湿度0％时的透氧度为4500～90000cm3/(m2×24h×atm)的培养材料。试验方法(A)：制作与上述培养材料为相同材料，且与培养材料的培养面为相同厚度，纵×横为100mm×10mm的平板状的试验片。将上述试验片以相对于试验片的纵尺寸从试验台的水平的上表面向水平方向伸出50mm的状态固定于试验台。从固定时起3分钟后，测定从试验台伸出的上述试验片的前端从包含上述试验台的上表面的水平面向铅垂下方下垂的距离。其中，从上述固定到测定为止在室温下进行。
作为本发明第二方式的培养容器的至少培养面由作为第一方式的培养材料形成。
作为本发明第三方式的培养器具是由作为第一方式的培养材料、或作为第二方式的培养容器构成的培养器具。
作为本发明的第四方式的细胞、组织或器官的培养方法是具有在作为第三方式的培养器具内培育细胞、组织或器官的工序的培养方法。
以下，对于本发明的具体实施方式进行详细说明，但是本发明并不受以下实施方式的任何限定，在本发明的目的的范围内，能够适当施加变更来实施。
关于数值范围的“A～B”的记载只要没有特别说明，就表示A以上B以下。例如，“1～5％”的记载是指1％以上5％以下。
<4-甲基-1-戊烯聚合物(X)>
在本发明中，“聚合物”这样的用语以包含均聚物和共聚物的含义来使用。同样地，在本发明中，“聚合”这样的用语以包含均聚和共聚的含义来使用。因此，所谓“4-甲基-1-戊烯聚合物(X)”，是包含4-甲基-1-戊烯的均聚物、以及4-甲基-1-戊烯与其它单体的共聚物的概念。另外，以下也将4-甲基-1-戊烯的均聚物记为4-甲基-1-戊烯均聚物(x1)。
作为4-甲基-1-戊烯与其它单体的共聚物，可以为无规共聚物、交替共聚物、嵌段共聚物、接枝共聚物的任一者。作为4-甲基-1-戊烯与其它单体的共聚物，由于基材的强度高(不易破裂，不易开裂)，弯曲也少，因此优选4-甲基-1-戊烯与选自乙烯和碳原子数3～20的α-烯烃(不包括4-甲基-1-戊烯)中的至少1种烯烃的共聚物(x2)。
作为4-甲基-1-戊烯聚合物(X)，优选为从4-甲基-1-戊烯均聚物(x1)、以及4-甲基-1-戊烯与选自乙烯和碳原子数3～20的α-烯烃(不包括4-甲基-1-戊烯)中的至少1种烯烃的共聚物(x2)中选择的至少1种聚合物，更优选为4-甲基-1-戊烯与选自乙烯和碳原子数3～20的α-烯烃(不包括4-甲基-1-戊烯)中的至少1种烯烃的共聚物(x2)。
作为上述烯烃，可举出例如，乙烯、丙烯、1-丁烯、1-己烯、1-庚烯、1-辛烯、1-癸烯、1-十四碳烯、1-十六碳烯、1-十七碳烯、1-十八碳烯、1-二十碳烯。上述烯烃能够根据培养材料所需要的物性来适当选择。例如，作为上述烯烃，从适度的透氧性和优异的刚性这样的观点考虑，优选为碳原子数8～18的α-烯烃，更优选为选自1-辛烯、1-癸烯、1-十二碳烯、1-十四碳烯、1-十六碳烯、1-十七碳烯和1-十八碳烯中的至少1种。如果烯烃的碳原子数在上述范围内，则聚合物的成膜加工性变得更良好，其结果是存在在成型时从辊、模具脱模时，不易发生由龟裂、端部的开裂导致的外观不良的倾向。因此，培养材料的次品产生率降低。
上述烯烃可以仅包含1种，此外，也可以将2种以上进行组合。从材料的强度的观点考虑，碳原子数优选为2以上，进一步优选为碳原子数10以上。在组合不同的2种以上的α-烯烃的情况下，特别优选将选自1-十四碳烯和1-十六碳烯中的至少1种与选自1-十七碳烯和1-十八碳烯中的至少1种进行组合。
由4-甲基-1-戊烯衍生的构成单元的含量优选为60～100摩尔％，更优选为80～98摩尔％。此外，由选自乙烯和碳原子数3～20的α-烯烃(不包括4-甲基-1-戊烯)中的至少1种烯烃衍生的构成单元的含量优选为0～40摩尔％，更优选为2～20摩尔％。另外，就上述构成单元的含量而言，将全部重复构成单元量设为100摩尔％。如果构成单元的含量在上述范围内，则能够获得加工性优异且均质的培养面，而且膜的韧性与强度的平衡良好，因此弯曲也变少。
上述4-甲基-1-戊烯聚合物(X)在不损害本发明的效果的范围内，可以具有由4-甲基-1-戊烯衍生的构成单元和由上述烯烃衍生的构成单元以外的构成单元(以下也称为“其它构成单元”)。其它构成单元的含量为例如0～10.0摩尔％。在上述4-甲基-1-戊烯聚合物具有其它构成单元的情况下，其它构成单元可以为1种也可以为2种以上。
作为衍生其它构成单元的单体，可举出例如，环状烯烃、芳香族乙烯基化合物、共轭二烯、非共轭多烯、官能乙烯基化合物、含有羟基的烯烃、卤代烯烃。作为环状烯烃、芳香族乙烯基化合物、共轭二烯、非共轭多烯、官能乙烯基化合物、含有羟基的烯烃和卤代烯烃，能够使用例如，日本特开2013-169685号公报的第[0035]～[0041]段所记载的化合物。
上述4-甲基-1-戊烯聚合物(X)可以单独使用1种，也可以将2种以上组合使用。
本发明的培养材料只要包含4-甲基-1-戊烯聚合物(X)即可，可以仅由4-甲基-1-戊烯聚合物(X)形成，也可以由包含4-甲基-1-戊烯聚合物(X)的组合物形成。
作为4-甲基-1-戊烯聚合物(X)，也能够使用市售品。具体而言，可举出三井化学(株)制的TPX MX001、MX002、MX004、MX0020、MX021、MX321、RT18、RT31或DX845(都是商标)等。此外，即使是其它制造商制，只要是满足上述要件的4-甲基-1-戊烯系聚合物，就能够优选使用。4-甲基-1-戊烯系聚合物(X)可以单独使用1种，也能够将2种以上组合使用。
在本发明的培养材料由包含4-甲基-1-戊烯聚合物(X)的组合物形成的情况下，上述组合物可以包含4-甲基-1-戊烯聚合物(X)以外的成分，例如，可以包含后述(添加剂)的项所记载的成分。另外，在培养材料由包含4-甲基-1-戊烯聚合物(X)的组合物形成的情况下，在培养材料100质量％中，4-甲基-1-戊烯聚合物(X)优选为90～100质量％，更优选为95～100质量％，特别优选为99～100质量％。如果大量包含4-甲基-1-戊烯聚合物(X)以外的成分，则不仅导致透氧性降低，而且导致透明性降低、强度降低。本范围所规定的、4-甲基-1-戊烯聚合物(X)的组合物比率为培养材料的培养面中的比率，培养容器的框部分、盖部分等细胞不直接接触的部分可以与上述范围不同。
4-甲基-1-戊烯聚合物(X)的、通过将标准聚苯乙烯作为基准物质的凝胶渗透色谱(GPC)测定得到的重均分子量(Mw)优选为10000～2000000，更优选为20000～1000000，进一步优选为30000～500000。这里，GPC测定时的试样浓度能够设为例如1.0～5.0mg/ml。此外，4-甲基-1-戊烯聚合物(X)的分子量分布(Mw/Mn)优选为1.0～30，更优选为1.1～25，进一步优选为1.1～20。GPC所使用的溶剂只要是溶解4-甲基-1-戊烯聚合物(X)的溶剂，就没有特别限定，优选使用邻二氯苯。此外，作为测定条件的一例，可举出后述实施例所示的条件，但并不限定于该测定条件。
通过使重均分子量(Mw)为上述上限以下，从而在后述的4-甲基-1-戊烯聚合物(X)的成型法中，由熔融成型制作得到的膜能够抑制凝胶等不良状况的发生，能够实现表面均匀的制膜。此外，利用溶液浇铸法制作时，在溶剂中的溶解性良好，能够抑制膜的凝胶等不良状况，能够实现表面均匀的制膜。
此外，通过使重均分子量(Mw)为上述下限以上，从而在本发明的容器制造和细胞培养中，作为培养材料的包含4-甲基-1-戊烯聚合物(X)的膜具有充分的强度。进一步，通过使分子量分布为上述范围内，从而能够抑制所制作的膜表面发粘，并且具有充分的韧性，能够抑制膜成型时的弯曲、裁切时的龟裂的发生等。
关于上述4-甲基-1-戊烯聚合物(X)的重均分子量(Mw)和分子量分布(Mw/Mn)，在使用了2种以上的聚合物作为4-甲基-1-戊烯聚合物(X)的情况下，只要各聚合物各自的Mw和Mw/Mn处于上述范围内即可。
<4-甲基-1-戊烯聚合物(X)的制造方法>
制造上述4-甲基-1-戊烯聚合物(X)的方法只要能够使4-甲基-1-戊烯、烯烃、其它构成单元进行聚合，则可以是任何方法。此外，为了控制分子量、分子量分布，也可以使链转移剂，例如氢共存。制造所使用的设备也不受限制。聚合法可以为公知的方法，可以为气相法、浆料法、溶液法、本体法。优选为浆料法、溶液法。进一步，聚合法可以为单步聚合法，或二步等多步聚合法，且将分子量不同的多个聚合物掺混于聚合体系中的方法。单步、多步聚合法的任一种中，在使用氢作为链转移剂的情况下，均可以一并投入，也可以分开投入，例如在聚合初期、中期、末期投入。制造可以在常温下进行，也可以根据需要进行加温，从聚合效率的观点考虑，优选在20℃～80℃进行，特别优选在40℃～60℃进行。制造所使用的催化剂也不受限制，从聚合效率的观点考虑，优选使用国际公开公报2006/054613所记载的固态钛催化剂成分(I)。
<添加剂>
在本发明的培养材料由包含4-甲基-1-戊烯聚合物(X)的组合物形成的情况下，也可以包含4-甲基-1-戊烯聚合物(X)以外的成分，作为4-甲基-1-戊烯聚合物(X)以外的成分，可举出耐热稳定剂、耐光稳定剂、加工助剂、增塑剂、抗氧化剂、润滑剂、消泡剂、抗粘连剂、着色剂、改性剂、抗菌剂、抗霉剂、防雾剂等添加剂。
4-甲基-1-戊烯聚合物(X)通常熔点为200℃～240℃，耐热性高。此外由于不发生水解，因此耐水性、耐沸水性、耐蒸汽性优异，因而包含4-甲基-1-戊烯聚合物(X)的培养容器等培养材料能够进行高压蒸气灭菌处理。4-甲基-1-戊烯聚合物(X)还具有可见光线透射率高(通常为90％以上)、不产生自身荧光的特征，因此包含4-甲基-1-戊烯聚合物(X)的培养容器易于进行培养细胞的观察。进一步，对于大部分的药品显示优异的耐药品性，由于不易吸收药剂，因此也适合用于药物开发筛选用途、诊断用途。4-甲基-1-戊烯聚合物(X)能够热封，不仅自材彼此的热熔合容易而且与其它原材料的热粘接也容易。此外，由于能够进行热成型，因此容易成型为任意形状的容器，例如使用了压印法、嵌件法的成型也容易。
4-甲基-1-戊烯聚合物(X)具有以上那样的优异的特性，因此包含本发明的培养材料的培养容器、由本发明的培养材料形成了培养面的细胞容器并不会对于培养带来不良影响，而且稳定性、光透过性、成型加工性良好，且能够进行灭菌处理，因此作为培养容器的材料是非常优异的。
<4-甲基-1-戊烯聚合物(X)的膜制造方法>
本发明的培养材料的制造方法没有特别限制，制造所使用的设备也不受限制。可以形成包含4-甲基-1-戊烯聚合物(X)和根据需要的4-甲基-1-戊烯聚合物(X)以外的成分的膜，将该膜进行成型以制成具有所期望的形状的培养材料。也可以通过注射成型、吹塑成型等方法，直接成型具有所期望的形状的培养材料。
作为形成膜的方法，具体而言，例如，采用通常的吹胀法、T-模头挤出法等。制造通常加温来进行。在采用T-模头挤出法的情况下，挤出温度优选为100℃～400℃，特别优选为200℃～300℃。此外，辊温度优选为45℃～75℃，特别优选为55℃～65℃。
此外，本发明的膜也可以通过将4-甲基-1-戊烯聚合物(X)溶解于溶剂，浇注到树脂、金属上，使其一边流平一边慢慢干燥而进行膜化的溶液浇铸法来制造。所使用的溶剂没有特别限制，可以使用环己烷、己烷、癸烷、甲苯等烃溶剂。此外，溶剂可以考虑到树脂的溶解性、干燥效率而将2种以上进行混合。利用台式涂布、旋转涂布、浸渍涂布、模涂、喷涂、棒涂、辊涂、帘流涂布等方法来涂布聚合物溶液，进行干燥、剥离，从而加工成膜。
在任何情况下，从量产性的观点考虑，优选形成包含4-甲基-1-戊烯聚合物(X)和根据需要的4-甲基-1-戊烯聚合物(X)以外的成分的膜，将该膜进行成型以制成具有所期望的形状的培养材料。
<细胞、组织或器官>
在本说明书中，细胞、组织或器官也简称为“细胞等”。
本发明中的细胞没有特别限定，在动物细胞的情况下，可以为悬浮性细胞，也可以为粘附性细胞，可例示例如，成纤维细胞、间充质系干细胞、造血干细胞、神经干细胞、神经细胞、角膜上皮细胞、口腔粘膜上皮细胞、视网膜色素上皮细胞、牙周膜干细胞、肌成纤维细胞、心肌细胞、肝细胞、脾内分泌细胞、皮肤角质形成细胞、皮肤成纤维细胞、皮下脂肪来源前体细胞、肾脏细胞、底部毛根鞘细胞、鼻粘膜上皮细胞、血管内皮前体细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、无限增殖化细胞、癌细胞、角质形成细胞、胚胎干细胞(ES细胞)、EBV转化B细胞、人工多能干细胞(iPS细胞)等。可以为原代培养细胞或株化传代了的细胞的任一者。皮肤、肾脏、肝脏、脑、神经组织、心肌组织、骨骼肌组织、癌干细胞等的氧要求性高，构成它们的细胞也是氧要求性高的细胞，因此本发明中的细胞优选为构成皮肤、肾脏、肝脏、脑、神经组织、心肌组织或骨骼肌组织的细胞、或者癌干细胞。作为细胞、组织或器官，优选为肝细胞、肾细胞、心肌细胞、神经细胞或癌干细胞，更优选为肝细胞。
本发明中的所谓组织，是指类似的细胞聚集而发挥同样的作用的物质。上述组织没有特别限定，可举出例如，上皮组织、结缔组织、肌肉组织、神经组织等。由于氧要求性高，因此上述组织优选为肝小叶、心肌组织、神经组织或骨骼肌组织，进一步优选为肝小叶。
本发明中的所谓器官，是指上述组织聚集而进行具有目的的共同工作的物质。上述器官没有特别限定，例如肺、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、胰腺、胆囊、食道、胃、皮肤、脑等。由于氧要求性高，因此上述器官优选为皮肤、肾脏、肝脏、脑，进一步优选为肝脏。
由于适合于培养器具内的培养，细胞等优选为细胞。在本发明中，细胞等优选为好氧性，更优选不含厌氧性细胞等。细胞等的来源没有特别限定，可以为动物、植物、真菌、原生生物、细菌等任何生物，优选为动物或植物，进一步优选为动物，特别优选为哺乳动物。本发明中的培养器具的透氧性合适，还保持有细胞粘附性，因此细胞等优选为附着性的细胞等，进一步优选为附着性细胞。
<肝细胞>
本发明中的肝细胞以肝实质细胞(Hepatocyte)为代表，只要是肝脏中的细胞，则可以是任何细胞，具体而言，包括血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、脂肪细胞、血球细胞、肝单核细胞、肝巨噬细胞(包含库普弗细胞)、肝星状细胞、肝内胆管上皮细胞、胆囊成纤维细胞等。上述肝细胞为含有例如20％以上、30％以上、40％以上或50％以上的肝实质细胞的细胞群。
上述肝细胞可以为原代培养细胞，也可以为株化传代细胞，作为肝细胞，优选使用原代培养细胞。株化传代细胞的种类没有特别限制，可举出例如，SSP-25、RBE、HepG2、TGBC50TKB、HuH-6、HuH-7、ETK-1、Het-1A、PLC/PRF/5、Hep3B、SK-HEP-1、C3A、THLE-2、THLE-3、HepG2/2.2.1、SNU-398、SNU-449、SNU-182、SNU-475、SNU-387、SNU-423、FL62891、DMS153等。
上述肝细胞的来源可以是任何哺乳动物，特别优选为人、牛、狗、猫、猪、迷你猪、兔、仓鼠、大鼠或小鼠的细胞，更优选为人、大鼠、小鼠或牛的细胞。
上述肝细胞可以为包含肝细胞以外的其它细胞种的细胞群，为包含例如20％以上、30％以上、40％以上或50％以上的肝细胞的细胞群。
<培养>
在本说明书中，所谓培养，不仅以使细胞等增殖、维持的含义，而且还以细胞等的接种、传代、分化诱导、自组织化诱导等工艺也包含在内的宽的含义来使用。培养所使用的培养基等不受限制，只要选择与细胞等的特性相应的培养基即可。
<细胞的培养>
细胞的培养可以为二维(包含细胞自发地重叠化的情况)培养，也可以为三维培养。本发明的培养材料的透氧度适于培养，因此不仅在二维培养中，而且在细胞立体地堆积的三维培养中，也能够向细胞充分地供给氧，细胞进行增殖、分化，进一步细胞的高度的自组织化现象也易于发生。
所谓三维培养，是指有意地将细胞立体地培养，可以是在支架材料中培养细胞的Scaffold型、以及作为块(球状体)以悬浮状态培养细胞的Scaffold-free型的任一者，优选为Scaffold型。在Scaffold型的情况下，由于能够效率良好地培养细胞，因此作为支架材料，优选为MatrigelTM、胶原蛋白凝胶、层粘连蛋白、藻酸水凝胶、玻璃质凝胶。
培养所使用的培养基等不受限制，但为了有效率地培养细胞，细胞优选在血清(例如，胎牛血清)的存在下进行培养。
作为将本发明的培养材料用于培养时，换句话说，使用后述本发明的培养器具来进行本发明的培养方法时的细胞培养密度优选为0.1×105细胞/cm2～10.0×105细胞/cm2，更优选为0.5×105细胞/cm2～5.0×105细胞/cm2，进一步优选为1.0×105细胞/cm2～4.0×105细胞/cm2，特别优选为1.5×105细胞/cm2～3.5×105细胞/cm2。
如果为上述范围，则与细胞培养密度为上述范围外的情况相比，药物代谢活性得以进一步增强，因此优选。
本发明的培养材料的透氧度高，因此即使在细胞培养密度高的情况下，也能够合适地培养。一般而言，据说生物体的细胞密度为2.5×105细胞/cm2左右，本发明的培养材料能够以与生物体相同程度的细胞培养密度进行培养，因此能够在体外，以更接近体内的状态进行培养，因此优选。
<培养材料>
本发明的培养材料为包含4-甲基-1-戊烯聚合物(X)的细胞、组织或器官的培养材料，培养面的水接触角为50°～100°，并且利用下述试验方法(A)得到的下垂距离为0～5mm，在温度23℃、湿度0％时的透氧度为4500～90000cm3/(m2×24h×atm)。
所谓培养材料，是指为了培养细胞而使用的材料，其为培养容器自身或构成培养容器的一部分。另外，在本发明的培养材料构成培养容器的一部分的情况下，至少培养面由本发明的培养材料构成。本发明的培养材料为例如，膜、片或培养容器。在上述培养材料为膜、片的情况下，能够将该膜、片作为包含培养面的培养容器的一部分来使用。作为培养容器，能够使用公知的各种培养容器，形状、大小没有特别限制，可举出例如，培养皿(也称为盘)、烧瓶、培养插件(insert)、培养板、培养瓶、袋等。上述培养容器通常在培养箱、大量培养装置或灌流培养装置等装置内使用。就上述培养容器而言，为了保持或储留培养基，优选为将底面作为培养面的容器。一般而言，底面具有孔那样的凹陷形状的培养容器为了使底面的复杂的形状稳定，需要使底面变厚，难以充分地进行向细胞等的氧供给。如果使用本发明的培养材料，则即使是具有1孔、6孔、12孔、24孔、48孔、96孔、384孔、1536孔等孔的板，形状也稳定，向细胞等的氧供给也充分。
本发明的培养材料是指在培养面上，没有涂布用于成为细胞等的支架的天然高分子材料、合成高分子材料或无机材料的物质。
另外，本发明中的所谓培养面，是指在培养细胞等时，形成培养基的面、接种细胞等的面、或者形成培养基且接种细胞等的面。即，所谓培养面，是包含培养基形成预定面和细胞等接种预定面的概念。
本发明的培养材料在温度23℃、湿度0％时的透氧度为4500～90000cm3/(m2×24h×atm)，优选为4500～67500cm3/(m2×24h×atm)，更优选为4500～47000cm3/(m2×24h×atm)，进一步优选为4500～45000cm3/(m2×24h×atm)。
如果培养材料的透氧度过低，则培养基中的氧浓度变低，细胞不会充分地增殖。另一方面，如果透氧度过高，则培养基中的氧浓度变得过高，由于氧应激而细胞功能降低。
在透氧度为上述上下限的范围内的情况下，细胞的密合性良好，保持良好的形态，能够根据培养期间而高效地增殖。
将本发明的培养材料配置于容器底面来制作培养皿、烧瓶、培养插件或培养板等培养容器时的培养材料的厚度没有特别限定，优选为20μm～400μm，更优选为20μm～300μm，进一步优选为20μm～200μm的厚度。根据培养容器的形态适时地选择，通过调整为上述上下限的范围，从而能够获得细胞增殖所需的适度的培养基中的氧浓度，能够使培养容器底面不弯曲(作为下垂距离进行规定)而制作合适的培养容器。
作为培养容器的一例，对于多孔板进行说明。通常，市售有孔(也称为well)的数目为1、6、12、24、48、96、128、384和1536个的细胞培养孔板。这些容器的容器整体(短边、长边的长度)的尺寸相等，通过孔的直径来规定孔数。即，多孔的容器的孔径小，孔数少的容器的孔径大。关于直径的大小，将培养材料直接配置于容器底面，由于在加入有培养基的状态下的因培养基的重量引起的应力而影响培养材料的弯曲度，通常，对于多孔(孔径小)的容器，使用厚度比较小的培养材料为好，对于孔数少的(孔径大)容器，需要使用厚度比较大的培养材料。
本发明的培养材料的厚度没有特别限制。此外，本发明的培养材料的培养面的厚度没有特别限制，优选为20～500μm，更优选为25～500μm，特别优选为50～200μm。
如果培养材料的厚度在上述范围内，则强度优异，因此优选。特别是如果培养面的厚度在上述范围内，则即使在用于孔数少而孔径大的容器时也不易产生弯曲。此外，对于培养材料实施电晕处理等时也不易破裂。此外，如果培养面的厚度在上述范围内，则透氧度成为特别适合于培养氧要求性的细胞等的范围。
本发明的培养材料为了制作球状体、提高细胞的支架功能，可以对于表面进行微细加工。4-甲基-1-戊烯聚合物(X)为热塑性树脂的1种，因此作为实施微细加工的方法，能够从切削加工、光刻法、电子射线直接描绘法、粒子束线束加工法、扫描探针加工法等、微粒的自组织化、或基于通过这些方法形成的母版(master)的纳米压印法、浇铸法、注射成型法所代表的成型加工法、镀覆法等中适当选择。微细加工的形状没有特别限定，从槽部分至山部分的高度优选为20nm～500μm。此外，为了保持充分的强度，与表面没有进行微细加工的情况相比，能够使最薄部的膜厚薄至20μm。
进行了微细加工的培养材料也可以作为微流路器件(也称为微流路芯片)来使用。微流路器件是对于培养材料表面实施微细加工而制作微小流路、反应容器，并应用于生物研究、化学工程的器件的总称。可举出例如，被称为microTAS(微型全分析系統)、芯片实验室(Lab on a Chip)等装置，正在进行作为下一代培养装置的应用。作为本发明的一个方式，可举出包含本发明的培养材料的微流路器件。
本发明的培养材料优选使细胞合适地密合于培养材料表面，此外，根据目的，优选将作为培养细胞时的支架材料的胶原蛋白等装载于培养材料表面，为了使其密合而对培养材料表面进行亲水化处理。培养材料表面的表面自由能能够利用后述的水接触角进行定义，培养材料的培养面的水接触角优选为50°～100°，更优选为55°～100°，进一步优选为60°～100°。此外，作为水接触角的优选的其它方式，可举出84°以下，更优选为50°～84°。
通过将本发明的培养材料的培养面(表面)的水接触角调整至上述范围内，从而例如，肝细胞与培养材料的密合性良好，能够在培养材料表面均匀地增殖。此外，能够以装载胶原蛋白时的胶原蛋白处理后的形态，将胶原蛋白均匀地装载于培养材料表面，在利用生理盐水进行的洗涤、细胞培养的环境下，胶原蛋白能够不剥离而保持稳定的初始状态来用于细胞培养。
本发明的培养材料表面的亲水化处理所使用的方法没有特别限定，可举出例如电晕处理、等离子体处理、臭氧处理、紫外线处理、化学蒸镀、蚀刻，或羟基、氨基、砜基、硫醇基、羧基等特定的官能团加成，硅烷偶联等利用特定的官能团的处理，利用氧化剂等的表面粗化等。其中，为了提高上述培养材料表面的润湿性，能够有效率地培养细胞，优选进行紫外线处理、电晕处理、等离子体处理或臭氧处理等表面亲水化处理。这些表面改性处理可以单独进行，也可以将2种以上组合进行。另外，在进行表面改性处理的情况下，优选至少对于培养面进行。在进行等离子体处理的情况下，作为伴随的气体，使用氮气、氢气、氦气、氧气、氩气等，优选选择选自氮气、氦气、氩气中的至少一种气体。
本发明的培养材料优选为细胞培养材料，更优选为肝细胞培养材料。
<利用试验方法(A)的下垂距离的测定>
本发明的培养材料利用试验方法(A)得到的下垂距离为0～5mm，优选为0～3mm。试验方法(A)如下。
试验方法(A)：制作与上述培养材料为相同材料，且与培养材料的培养面为相同厚度，纵×横为100mm×10mm的平板状的试验片。
将上述试验片以相对于试验片的纵尺寸从试验台的水平的上表面向水平方向伸出50mm的状态固定于试验台。
从固定时起3分钟后，测定从试验台伸出的上述试验片的前端从包含上述试验台的上表面的水平面向铅垂下方下垂的距离。其中，从上述固定到测定为止在室温下进行。另外，在本说明书中所谓室温是指20～25℃。
将该下垂的距离(mm)称为下垂距离(mm)，下垂距离成为弯曲刚性的指标。即，下垂距离越小，则本发明的培养材料的培养面的弯曲刚性越优异。
试验片的制作方法没有特别限制，例如可以对于与培养材料相同的材料，进行挤出成型等热成型，制作平板状的试验片，从该片切出上述尺寸的试验片，也可以直接成型试验片。此外，在培养材料为膜、片的情况下，可以从该膜、片切出试验片。此外，制作试验片时的热成型优选在与制造培养材料时相同温度条件(温度、时间)下进行成型。关于试验片，可以对于培养材料进行了微细加工、表面改性处理，也可以没有进行微细加工、表面改性处理，优选没有进行任何处理。
下垂距离如果大于5mm，则形状稳定性不充分。具体而言，培养材料产生弯曲，由于变形、随着变形而产生的冲击，不仅导致附着于培养容器内壁的细胞剥离，而且培养中的细胞会聚集于弯曲的部位，无法有效率地培养细胞。
<透氧度>
本发明的培养材料在温度23℃、湿度0％时的透氧度为4500～90000cm3/(m2×24h×atm)。对于使用培养材料或与培养材料相同的材料制作得到的测定样品，通过压差式气体透过率测定法，测定在温度23℃、湿度0％时的透氧度[cm3×mm/(m2×24h×atm)]，将透氧度除以培养材料的厚度(μm)而得的值设为透氧系数。测定所使用的设备只要使用了压差式气体透过率测定法，就没有特别限制，可举出例如东洋精机制作所制的压差式气体透过率测定装置MT-C3。测定样品例如从厚度50μm的膜切出90×90mm的试验片来制作，测定部直径优选为70mm(透过面积为38.46cm2)。由于透氧度大，因此更优选预先对于样品实施铝遮罩，使实际透过面积为5.0cm2。使用透氧度测定中所用的培养材料或与培养材料相同的材料制作得到的测定样品可以经过微细加工、表面改性处理，也可以没有经过微细加工、表面改性处理，优选没有经过任何处理。
<利用试验方法(B)的培养液中的溶解氧浓度>
本发明的培养材料在将培养液中的饱和氧浓度设为100％的情况下，以接种的大鼠原代培养肝细胞的细胞密度为1.0×105细胞/cm2～4.0×105细胞/cm2来进行下述试验方法(B)时，在上述细胞密度的范围的至少一点，1小时后的培养液中的溶解氧浓度优选为培养液中的饱和氧浓度的2～20％，更优选为5～18％，进一步优选为5～16％，最优选为9～16％。培养液中的饱和氧浓度的测定方法没有特别限制，可举出例如，使用荧光式的氧传感器(FireSting氧监测器，株式会社BAS公司制)的测定方法。试验方法(B)如下。
试验方法(B)：在培养面积为2cm2的经胶原蛋白涂覆的培养容器中，用大大鼠原代肝细胞用培养液0.5mL接种鼠原代培养肝细胞，在温度37℃、二氧化碳浓度5.0％、氧浓度20％下进行培养，在接种24小时后，除去培养容器内的培养液之后，重新添加培养液0.5mL，在距离培养容器底面80μm的高度测定氧浓度1小时，其中，所述培养容器包含由聚乙烯构成的圆筒部、以及与上述培养材料为相同材料且构成为与培养材料的培养面相同厚度的平板状的底面部。如果溶解氧浓度在上述范围内，则氧环境对于肝细胞而言为最佳的状态，因此优选。
另外，氧浓度的测定能够使用FireSting氧监测器(株式会社BAS公司制)等来进行，在使用FireSting氧监测器(株式会社BAS公司制)的情况下，在距离培养容器底面80μm的高度设置传感器来进行测定。
另外，进行试验方法(B)时，只要以接种的大鼠原代培养肝细胞的细胞密度为1.0×105细胞/cm2～4.0×105细胞/cm2来进行即可，只要至少在该范围的一点，溶解氧浓度成为上述范围即可。即，并不要求在细胞密度为1.0×105细胞/cm2～4.0×105细胞/cm2的整个范围内，溶解氧浓度处于上述范围内。
试验方法(B)所使用的大鼠原代肝细胞用培养液没有特别限定，例如，为包含10％胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS，富士胶片和光纯药)、30mg/mL L-脯氨酸(培养用，富士胶片和光纯药)、1×10-7M地塞米松(生物化学用，富士胶片和光纯药)、50μg/mL氢化可的松(培养用，富士胶片和光纯药)、20ng/mL上皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF，细胞生物学用，富士胶片和光纯药)、5.0×10-7M胰岛素(SIGMA)、5000单位/mL青霉素，5000μg/mL链霉素(培养用，富士胶片和光纯药)、D-MEM培养基(含有高葡萄糖、L-谷氨酰胺、酚红、丙酮酸钠、碳酸氢钠，培养用，富士胶片和光纯药)的溶液。
<氧消耗速度>
氧消耗速度能够使用Fick定律，将外部空气的氧浓度(20％)与培养液中的溶解氧浓度之差和膜的透氧度之积除以细胞密度，作为每单位细胞的消耗量来算出。这基于与细胞消耗的培养基中的氧的量相应地，从外部空气供给氧这样的考虑。
适当的氧消耗速度根据各脏器和构成该各脏器的细胞的不同而不同，例如在肺、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、胰腺、胆囊、食道、胃、皮肤、脑等之间有所不同。此外，根据动物种类的不同也不同，例如在人、牛、狗、猫、猪、迷你猪、兔、仓鼠、大鼠或小鼠之间也有所不同。进一步，在原代培养细胞和株化传代细胞之间也有所不同。
在大鼠原代肝细胞的情况下，向细胞培养容器以1.0×105细胞/cm2接种细胞时的氧消耗速度由非专利文献2和3可知，在细胞刚附着于培养容器之后为90pmol/s/105细胞，其后为40pmol/s/105细胞，该数值可能会根据细胞向容器上的附着、聚集的程度等而变动。
通过使用本发明的培养材料，从而能够在适于细胞等的氧环境下进行培养，细胞密度为例如1.0×105细胞/cm2的情况下的氧消耗速度优选为40pmol/s/105细胞以上，更优选为40～150pmol/s/105细胞。另外，评价氧消耗速度时的培养优选按照上述试验方法(B)进行。即，优选以接种的大鼠原代培养肝细胞的细胞密度为1.0×105细胞/cm2～4.0×105细胞/cm2来进行上述试验方法(B)时，在上述细胞密度的范围的至少一点，氧消耗速度为40～150pmol/s/105细胞。
<培养容器>
本发明第二方式的培养容器为至少培养面由上述培养材料形成的培养容器。
本发明的培养容器可以为上述培养材料自身，也可以为一部分由上述培养材料构成的培养容器。在一部分由上述培养材料构成的情况下，至少细胞、胶原蛋白等支架材料直接接触的面由上述培养材料构成。
本发明的培养容器的形状稳定性优异，向细胞等的氧供给也充分。作为培养容器，形状、大小没有特别限制，可举出例如，培养皿、烧瓶、培养插件、培养板、培养瓶、袋等。
培养容器优选具有至少一个孔。即，培养容器优选为具有孔的板，进一步优选为具有1孔、6孔、12孔、24孔、48孔、96孔、384孔、1536孔等孔的板。
本发明的培养容器是指在培养面上，没有涂布用于成为细胞等的支架的天然高分子材料、合成高分子材料或无机材料的物质。
在培养容器为培养皿、烧瓶、培养插件或培养板的情况下，由于底面为培养面，因此培养材料优选在它们的底面、侧面、上表面中，至少构成底面的一部分或全部。如果至少底面(培养面)由本发明的培养材料构成，则能够经由上述培养材料向培养基中有效率地供给氧，因此能够使处于培养基中的细胞等有效率地增殖。进一步，由于底面的形状稳定性优异，因此能够将细胞等均匀地培养。此外，由于透明性优异，因此细胞等的观察也容易。
底面的形状没有特别限制，可举出平底、圆底(U底)、平底(F底)、圆锥底(V底)、平底+曲边等。在加工成圆底(U底)、平底(F底)、圆锥底(V底)、平底+曲边等的情况下，可以利用一般的注射成型、压制成型进行一次加工，也可以先制作好膜或片，利用真空成型、加压成型等进行2次加工来制作。底面的形状根据培养的目的而选择，在将细胞等进行二维培养时，优选为平底，在进行三维培养时，优选为圆底(U底)或圆锥底(V底)。
培养容器的上述培养材料以外的部分可以由上述培养材料以外的原材料构成。上述培养材料以外的原材料没有特别限制，能够使用公知的原材料。可举出例如，聚乙烯(PE)、聚苯乙烯(PS)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、玻璃等。
本发明的培养容器为了防止污染，可以实施消毒、灭菌处理。作为消毒、灭菌处理的方法，没有特别限制，可举出流通蒸气法、煮沸法、间歇法、紫外线法等物理消毒法；使用臭氧等气体、乙醇等消毒剂的化学消毒法；高压蒸气法、干热法等加热灭菌法；γ射线法、高频法等照射灭菌法；氧化乙烯气体法、过氧化氢气体等离子体法等气体灭菌法等。其中，由于操作简便，且能够充分地进行灭菌，因此优选为乙醇消毒法、高压蒸气灭菌法、γ射线灭菌法或氧化乙烯气体灭菌法。这些消毒、灭菌处理可以单独进行1种，也可以组合进行2种以上。
本发明的培养容器的制造方法没有特别限制，在培养材料为培养容器自身的情况下，能够利用上述方法进行制造。在培养容器的一部分由上述培养材料形成的情况下，通过将培养材料与其它构件适当接合，从而能够获得培养容器。作为进行接合的方法，没有特别限制，可以将培养材料与其它构件一体形成，也可以经由粘接剂、粘着剂使它们密合。
本发明的培养容器优选为细胞培养容器，更优选为肝细胞培养容器。
<培养器具>
作为本发明第三方式的培养器具由作为第一方式的培养材料或作为第二方式的培养容器构成。本发明的培养器具可以为作为第一方式的培养材料或作为第二方式的培养容器自身，也可以为在作为第一方式的培养材料或作为第二方式的培养容器的培养面上，涂布有天然高分子材料、合成高分子材料或无机材料的培养器具。
上述经涂布的培养器具例如，能够在培养材料上将天然高分子材料、合成高分子材料或无机材料通过公知的方法进行涂布来获得。此外，上述培养器具例如，可以利用天然高分子材料、合成高分子材料或无机材料通过公知的方法涂布培养容器来获得，也可以通过将已涂布的上述培养材料至少用于培养容器的培养面来获得。
上述经涂布的培养器具的细胞等的粘附性、增殖性优异。认为这是因为，涂布于培养面的天然高分子材料、合成高分子材料或无机材料成为细胞等的支架。因此，在培养附着性的细胞等时，通常在培养材料或培养容器上涂布天然高分子材料、合成高分子材料或无机材料，并用作培养器具。
上述天然高分子材料、合成高分子材料或无机材料没有特别限制，作为天然高分子材料，可举出胶原蛋白、明胶、藻酸、透明质酸、硫酸软骨素等糖胺聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、血纤蛋白原、骨桥蛋白、肌腱蛋白、玻连蛋白、凝血栓蛋白、琼脂糖、弹性蛋白、角蛋白、壳聚糖、纤维蛋白、丝心蛋白、糖类；作为合成高分子材料，可举出聚乙醇酸、聚乳酸、聚乙二醇、聚己内酯、合成肽类、合成蛋白质类、聚羟基乙基甲基丙烯酸酯、聚乙烯亚胺；作为无机材料，可举出β-磷酸三钙、碳酸钙等。
此外，作为上述天然高分子材料、合成高分子材料或无机材料，也可举出将以往的细胞外基质成分等水凝胶进行玻璃化之后再水合而得的玻璃质凝胶等。例如，也可举出由作为细胞外基质成分之一的胶原蛋白制作的高密度胶原蛋白纤维网所构成的胶原蛋白玻璃质凝胶。
为了提高细胞的粘附性、细胞的增殖性，使细胞的功能更长期地维持，优选利用胶原蛋白、明胶、层粘连蛋白、聚赖氨酸等蛋白质或肽进行涂布，更优选利用胶原蛋白或聚赖氨酸进行涂布处理。这些涂布可以单独进行1种，也可以组合进行2种以上。
本发明的培养器具优选为细胞培养器具，更优选为肝细胞培养器具。
<培养方法>
作为本发明第四方式的细胞、组织或器官的培养方法为具有在作为第三方式的培养器具内培育细胞、组织或器官的工序的培养方法。
上述细胞等的培养方法只要具有在上述培养器具内培育细胞等的工序即可，其它培养条件只要根据细胞等的特性进行适当选择即可。上述细胞等的培养方法优选为细胞的培养方法，进一步优选为肝细胞的培养方法。
实施例
以下，基于实施例来进一步具体地说明本发明，但本发明不限定于这些实施例。
另外，以下记载了实施例中的聚合物分析值测定方法、下垂距离的测定方法、水接触角的测定方法、胶原蛋白涂覆溶液的调制方法、细胞种与培养液的调制方法、培养基中的溶解氧浓度的测定方法、氧消耗速度的算出方法、代谢活性值的测定方法、细胞粘附性的评价方法、所培养的细胞的自身荧光的观察方法以及药剂吸附性的评价。
[重均分子量(Mw)和分子量分布(Mw/Mn)]
通过凝胶渗透色谱(GPC)测定了作为本发明的培养材料使用的4-甲基-1-戊烯聚合物的重均分子量(Mw)以及分子量分布(Mw/Mn)。
具体而言，按照下述条件，利用聚苯乙烯标准品校正分子量并测定了溶解于邻二氯苯中的聚合物的重均分子量(Mw)和数均分子量(Mn)。
·装置：凝胶渗透色谱HLC-8321GPC/HT型(东曹公司制)
·数据解析软件：Empower3(Waters公司制)
·检测器：差示折射计
·串联连接柱：TSKgel GMH6-HT(2根)以及TSKgel GMH6-HTL(2根)
·柱温度：140℃
·流速：1.0ml/分钟
·试样浓度：1.5mg/ml
[下垂距离的测定]
以纵×横为100mm×10mm的尺寸切出试验片，将其以相对于该试验片的纵尺寸从试验台的水平的上表面向水平方向伸出50mm的状态固定于试验台，从固定时起3分钟后，测定从试验台伸出的试验片的前端从包含试验台的上表面的水平面向铅垂下方下垂的距离。从上述固定到测定为止为室温23℃。将结果示于表1中。
[水接触角的测定]
培养材料的表面亲水化处理后的水接触角的测定能够按照日本工业标准JIS-R3257(基板玻璃表面的润湿性试验方法)，在25±5℃、50±10％的恒温恒湿条件下，将水滴的形状可视为球形的4μL以下的容量的水滴滴加于基材表面，通过静滴法，利用测量从水滴刚接触基材表面之后1分钟以内的基材与水滴的接触界面的角度的方法来进行。在本实施方式中，将通过上述方法从水滴刚接触之后1分钟以内的数值作为物性值进行处理。
[胶原蛋白涂覆溶液的调制]
将0.1M的盐酸溶液(容量分析用，富士胶片和光纯药)用注射用水(日本药典，大塚制药)稀释100倍，调制0.001M的盐酸溶液并进行过滤灭菌。将3mg/mL的胶原蛋白溶液(Cellmatrix TypeI-P，猪腱来源，新田Gelatin)用0.001M的盐酸溶液稀释2倍，调制出1.5mg/mL的胶原蛋白涂覆溶液。
[细胞种和培养液的调制]
在加入有包含大鼠原代冷冻肝细胞的细胞悬浮液的离心管(50ml)中添加培养液。培养液通过使用胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS，富士胶片和光纯药)1.5mL、利用注射用水(扶桑药品工业)稀释至3.0g/mL的L-脯氨酸(培养用，富士胶片和光纯药)溶液0.15mL、利用乙醇(分子生物学用，富士胶片和光纯药)稀释至1×10-3M的地塞米松(生物化学用，富士胶片和光纯药)溶液1.5μL、利用乙醇稀释至36mM的氢化可的松(培养用，富士胶片和光纯药)溶液21μL、以及利用注射用水稀释至1.0mg/mL的BSA溶液，进一步添加稀释至20μg/mL的上皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF，细胞生物学用，富士胶片和光纯药)溶液15μL、胰岛素溶液(10mg/mL in HEPESS，SIGMA)8.7μL、青霉素-链霉素溶液(含有5000单位/mL青霉素，5000μg/mL链霉素，培养用，富士胶片和光纯药)0.3mL、D-MEM培养基(含有4500mg/mL D-葡萄糖，584mg/mL L-谷氨酰胺，15mg/mL酚红，110mg/mL丙酮酸钠，3700mg/mL碳酸氢钠，培养用，富士胶片和光纯药)13mL进行了调制。细胞密度的调整通过调整包含大鼠原代冷冻肝细胞的细胞悬浮液的细胞数的方法来实施，只要没有特别说明，以1.0×105细胞/cm2的细胞密度来实施，在实施例8和比较例6的高密度培养中，以4.0×105细胞/cm2的细胞密度来实施。
[透氧系数的测定和透氧度的算出]
使用东洋精机制作所制压差式气体透过率测定装置MT-C3，在温度23℃、湿度0％RH的环境下，测定透氧系数。测定部直径设为70mm(透过面积为38.46cm2)。预料到透氧系数会大，因此预先对于样品施加铝遮罩，使实际透过面积为5.0cm2。
将测定出的透氧系数[cm3×mm/(m2×24h×atm)]的值除以膜(培养材料)的厚度(μm)，算出透氧度[cm3/(m2×24h×atm)]。
[培养基中的溶解氧浓度的测定]
细胞接种1天后，除去培养容器的培养液，然后重新添加培养液0.5mL，使用FireSting氧监测器(株式会社BAS)，测定培养液中的溶解氧浓度。测定在加湿培养箱中实施。利用起重器(jack)将传感器设置于距离培养容器底面80μm的高度，测定1小时。将1小时后的溶解氧浓度除以培养液中的饱和氧浓度并乘以100得到的值(％)示于表1中。培养液中的饱和氧浓度使用荧光式氧传感器(FireSting氧监测器，株式会社BAS公司制)进行了测定。
[氧消耗速度的算出]
将外部空气(加湿培养箱中)的氧浓度(20％)与上述培养液中的溶解氧浓度之差和透氧度之积除以细胞密度，作为每单位细胞的消耗量算出。
[代谢活性值的测定]
除去细胞接种24小时后的培养容器中的培养液之后，添加利用培养液稀释了的荧光素-CEE，进一步培养3小时。将培养后的细胞与包含荧光素-CEE的培养液一起移至96孔板之后，添加荧光素检测试剂(Luciferin Detection Reagent)和重组缓冲液(Reconstitution Buffer)的混合液，在室温下遮光，反应1小时。1小时后，利用发光计测定发光量(相对光单位，RLU)。
关于蛋白量，在除去利用培养液稀释了的荧光素-CEE溶液之后，将200μLPBS(-)添加至培养基之后，使用细胞刮取器将细胞回收至离心管，进行了离心(4℃，22000×g，10分钟)。然后，除去上清液，添加0.1M氢氧化钠溶液100μL之后，使用PierceTMBCA ProteinAssay Kit(Thermo Fisher Scientific)测定蛋白量。利用酶标仪(SPECTRAmax PLUS384，Molecular Devices公司制)测定了波长450nm的吸光度。
使用P450-GloTM CYP1A1 Assay kit(Promega)测定用发光计获得的荧光素-CEE溶液的代谢活性量(pmol/L)，除以由吸光度获得的蛋白量和荧光素-CEE溶液的反应时间，从而算出代谢活性值(pmol/min/mg蛋白质)。将结果示于表1中。
[细胞粘附性的评价]
细胞粘附性评价为在容器中接种大鼠冷冻肝细胞的细胞悬浮液0.5mL，在37℃、5％CO2下进行培育，在培养1天和7天后进行显微镜观察。将肝细胞粘附、伸展的状态设为AA，将肝细胞粘附、略微伸展的状态设为BB，将肝细胞粘附但是变圆而没有伸展，或者剥离了的状态设为CC并示于表1中。
[培养容器的自身荧光的观察]
使用All in one荧光显微镜BZ-X700(Keyence制)，经由显微镜所附带的、蓝色呈色：BZ-X滤光片DAPI，绿色呈色：BZ-X滤光片GFP以及红色呈色：BZ-X滤光片TexasRed这样的名称的滤光片，观察培养容器底面的培养材料，观察是否产生蓝、绿和红的荧光色。
[药剂吸附性的评价]
对于24孔容器的任意的3个孔，将各种药剂溶液每1孔添加0.5mL，在23℃下静置2天后，回收药剂溶液。利用荧光分析法或LC/MS测定所回收的药剂溶液的浓度，算出相对于添加至容器之前的药剂溶液浓度的药剂残存率，求出3个孔内的药剂残存率的平均值。
评价用药剂
1.若丹明B的磷酸缓冲生理盐水(以下，称为PBS)溶液(浓度10μmol/L)
2.若丹明123的PBS溶液(浓度10μmol/L)
3.若丹明6G的PBS溶液(浓度10μmol/L)
4.环孢素A的二甲亚砜(以下，称为DMSO)溶液(浓度10μmol/L)
5.噻氯匹定盐酸盐的DMSO溶液(浓度10μmol/L)
6.来氟米特的DMSO溶液(浓度10μmol/L)
7.曲格列酮的DMSO溶液(浓度10μmol/L)
8.异丙肾上腺素盐酸盐的DMSO溶液(浓度10μmol/L)
对于上述评价用药剂1～3，利用荧光分析法实施了浓度分析，对于评价用药剂4～8，利用LC/MS实施了浓度分析。
＜荧光分析条件＞
·评价装置：FP-6600(日本分光制分光荧光光度计)
·使用单元：石英制微单元
·谱带宽度：激发侧：5nm，荧光侧：6nm
·灵敏度(PMT电压)：400V
·激发波长：若丹明B 555nm
若丹明123 505nm
若丹明6G 525nm
·荧光测定波长：若丹明B 580nm
若丹明123 530nm
若丹明6G 555nm
·扫描速度：2000nm/min
＜LC/MS条件＞
·装置：Acquity UPLC I-class system/TQ-S micro(水)
·离子化法：电喷雾离子化(ESI)，正负离子检测
·检测：选择反应监测(SRM)
1.极性：
正：环孢素A，噻氯匹定盐酸盐，异丙肾上腺素盐酸盐
负：来氟米特，曲格列酮
2.先躯离子：
环孢素A：m/z1203
噻氯匹定盐酸盐：m/z264
来氟米特：m/z269
曲格列酮：m/z440
异丙肾上腺素盐酸盐：m/z212
3.产物离子：
环孢素A：m/z156
噻氯匹定盐酸盐：m/z89
来氟米特：m/z82
曲格列酮：m/z42
异丙肾上腺素盐酸盐：m/z152
[制造例1]培养材料的制造方法
使用作为4-甲基-1-戊烯聚合物的TPX(注册商标)(三井化学株式会社制：分子量(Mw)＝428000，分子量分布(Mw/Mn)＝4.1)，投入至具备挤出基材层的全螺纹型的螺杆的带有T模头的挤出机中，将挤出温度设定为270℃，将辊温度设定为60℃，改变辊旋转速度的条件进行挤出成型，从而获得了厚度不同的5种膜。将厚度50μm、100μm、200μm、280μm、400μm的膜分别设为膜1、膜2、膜3、膜4、膜5。
[制造例2]培养材料的表面处理法和简易培养容器的制作法
膜1～5为使用台式电晕处理装置(春日电机制)，进行了电晕处理(处理速度3m/min，输出0.5kW，往复2次)。
将测定此时的培养材料表面得到的水接触角示于表1中。
然后，利用直径23mm的冲孔器进行切割，浸渍于消毒用乙醇(日本药典，富士胶片和光纯药)中1小时。1小时后，为了除去表面所附着的乙醇而浸渍于达尔伯克氏PBS(-)(培养用，富士胶片和光纯药)中1小时，然后，在室温下干燥1夜，进行灭菌，利用灭菌后的聚乙烯制框夹持膜的上下面，制作出培养面的内径为15mm的培养容器1～5。
[制造例3]培养材料的表面处理法和24孔培养板的制作法
对于膜1，使用常压等离子体表面处理装置(积水化学工业制)，将室内用氮气气流充满，进行了等离子体处理(处理速度2m/min，输出4.5kW，往复2次)。将测定此时的培养材料表面得到的水接触角示于表1中。
然后，使进行了等离子体处理的膜1经由医疗用粘着剂密合于聚苯乙烯(也称为PS)制24孔容器框的底面，制作24孔的培养板(培养容器6)，用耐γ射线袋进行捆包，照射10kGy的γ射线进行了灭菌。
[实施例1]
在由厚度50μm的膜1制作的培养容器1的培养面，添加1.5mg/mL的胶原蛋白涂覆溶液0.5mL之后，除去多余的胶原蛋白涂覆溶液。在室温下静置30～60分钟之后，利用达尔伯克氏PBS(-)进行洗涤，在室温下干燥一夜。利用相同方法，准备5个经胶原蛋白涂覆后的培养容器1。
接着，在5个培养容器1的培养面上分别利用微量加液器接种包含大鼠原代冷冻肝细胞的培养液(0.5mL)，盖上聚苯乙烯制的盖，放入培养箱中，在37℃、5％CO2下开始培养。1天后，从培养箱中取出4个培养容器1，从横向观看容器底面，观察在培养环境下有无膜的下垂，结果任何容器都与容器制作时没有变化，没有观察到下垂。接着，对4个培养容器1分别进行显微镜观察，观察细胞一边粘附一边伸展的样子。然后，利用4个中的1个测定培养基中的溶解氧浓度，算出氧消耗速度。利用剩下的3个测定代谢活性，将所得结果示于表1中。(关于代谢活性值，将3个容器的结果的平均值示于表1中。)进一步，利用剩下的1个容器培养7天后，从培养箱中取出，观察细胞一边粘附一边伸展的样子，将其结果示于表1中。图1示出利用相位差显微镜观察1天后、7天后的细胞而得到的结果。
[实施例2]
使用了由厚度100μm的膜2制作的培养容器2，除此以外，利用与实施例1同样的方法，培养大鼠原代冷冻肝细胞。1天后，从横向观看容器底面，观察在培养环境下有无膜的下垂，结果与容器制作时没有变化，没有观察到下垂。在表1中示出作为1天后的培养的结果的细胞的粘附性，由溶解氧浓度算出了氧消耗速度的结果，代谢活性的测定值、以及评价了7天后的细胞的粘附性的结果。
[实施例3]
使用了由厚度200μm的膜3制作的培养容器3，除此以外，利用与实施例1同样的方法，培养大鼠原代冷冻肝细胞。1天后，从横向观看容器底面，观察在培养环境下有无膜的下垂，结果与容器制作时没有变化，没有观察到下垂。在表1中示出作为1天后的培养的结果的细胞的粘附性，由溶解氧浓度算出了氧消耗速度的结果，代谢活性的测定值、以及评价了7天后的细胞的粘附性的结果。
[实施例4]
使用了由厚度280μm的膜4制作的培养容器4，除此以外，利用与实施例1同样的方法，培养大鼠原代冷冻肝细胞。1天后，从横向观看容器底面，观察在培养环境下有无膜的下垂，结果与容器制作时没有变化，没有观察到下垂。在表1中示出作为1天后的培养的结果的细胞的粘附性，由溶解氧浓度算出了氧消耗速度的结果，代谢活性的测定值、以及评价了7天后的细胞的粘附性的结果。
[实施例5]
使用了由厚度400μm的膜5制作的培养容器5，除此以外，利用与实施例1同样的方法，培养大鼠原代冷冻肝细胞。1天后，从横向观看容器底面，观察在培养环境下有无膜的下垂，结果与容器制作时没有变化，没有观察到下垂。在表1中示出作为1天后的培养的结果的细胞的粘附性，由溶解氧浓度算出了氧消耗速度的结果，代谢活性的测定值、以及评价了7天后的细胞的粘附性的结果。
[实施例6]
使用了由制造例3制作的24孔培养板即培养容器6，除此以外，利用与实施例1同样的方法，培养大鼠原代冷冻肝细胞。此时，使用了24个孔中的4个。1天后，从横向观看容器底面，观察在培养环境下有无膜的下垂，结果与容器制作时没有变化，没有观察到下垂。在表1中示出作为1天后的培养的结果的细胞的粘附性，由溶解氧浓度算出了氧消耗速度的结果，代谢活性的测定值、以及评价了7天后的细胞的粘附性的结果。
[实施例7]
使用由制造例3制作的24孔培养板即培养容器6，没有实施胶原蛋白涂覆，直接将包含大鼠原代冷冻肝细胞的培养液(0.5mL)分别接种于培养容器6的4个孔中，利用与实施例1同样的方法，培养大鼠原代冷冻肝细胞。1天后，从横向观看容器底面，观察在培养环境下有无膜的下垂，结果与容器制作时没有变化，没有观察到下垂。在表1中示出作为1天后的培养的结果的细胞的粘附性，由溶解氧浓度算出了氧消耗速度的结果，代谢活性的测定值、以及评价了7天后的细胞的粘附性的结果。
[实施例8]
将培养液中的细胞密度变更为4.0×105细胞/cm2，除此以外，利用与实施例1同样的方法，培养大鼠原代冷冻肝细胞。1天后，从横向观看容器底面，观察在培养环境下有无膜的下垂，结果与容器制作时没有变化，没有观察到下垂。在表1中示出作为1天后的培养的结果的细胞的粘附性，由溶解氧浓度算出了氧消耗速度的结果，代谢活性的测定值、以及评价了7天后的细胞的粘附性的结果。
[实施例9]
使用了作为重均分子量(Mw)为95000、分子量分布(Mw/Mn)为3.5的4-甲基-1-戊烯聚合物的TPX(注册商标)(三井化学株式会社制)，除此以外，利用与制造例1同样的方法，获得了厚度50μm的膜6。
将膜1变更为膜6，除此以外，利用与实施例1同样的方法，培养大鼠原代冷冻肝细胞。1天后，从横向观看容器底面，观察在培养环境下有无膜的下垂，结果与容器制作时没有变化，没有观察到下垂。在表1中示出作为1天后的培养的结果的细胞的粘附性，由溶解氧浓度算出了氧消耗速度的结果，代谢活性的测定值、以及评价了7天后的细胞的粘附性的结果。
[实施例10]
将培养材料为4-甲基-1-戊烯聚合物的实施例5的培养容器底面利用荧光显微镜进行观察，确认是否产生培养材料来源的自身荧光，结果利用BZ-X滤光片DAPI、BZ-X滤光片GFP和BZ-X滤光片TexasRed的任一波长滤光片进行观察，都没有观察到材料来源的荧光，可理解为能够直接在该容器的培养面观察细胞。图4表示利用荧光显微镜观察得到的培养面的照片。
[比较例1]
利用与制造例1同样的方法，制作厚度为600μm的膜，利用与制造例2同样的方法，实施膜的表面处理和灭菌，制作出培养容器c1。接着，利用与实施例1同样的方法，培养大鼠原代冷冻肝细胞。24小时后，从横向观看容器底面，观察在培养环境下有无膜的下垂，结果与容器制作时没有变化，没有观察到下垂。在表1中示出作为1天后的培养的结果的细胞的粘附性，由溶解氧浓度算出了氧消耗速度的结果，代谢活性的测定值、以及评价了7天后的细胞的粘附性的结果。
[比较例2]
使用厚度50μm的膜1，没有实施制造例2的表面处理而进行了灭菌，制作出培养容器c2。接着，按照实施例1实施了胶原蛋白涂覆，但是包含胶原蛋白的溶液在培养面被排斥，无法进行胶原蛋白涂覆，没有实现大鼠原代冷冻肝细胞的培养。
[比较例3]
使用由比较例2制作的培养容器c2，没有实施胶原蛋白涂覆而直接接种大鼠原代冷冻肝细胞的培养液(0.5mL)，盖上聚苯乙烯制的盖，放入培养箱中，在37℃、5％CO2下开始培养。1天后，从培养箱中取出，从横向观看容器底面，观察在培养环境下有无膜的下垂，结果与容器制作时没有变化，没有观察到下垂。接着，为了溶解氧浓度、代谢活性评价而除去了培养基，结果细胞没有固定于培养面，而与培养基一起从容器中被除去，培养面上仅残留有少量的细胞，没能够评价溶解氧浓度、代谢活性。中止了7天后的评价。
[比较例4]
使用培养面的厚度为1000μm的市售的24孔TCPS培养容器(康宁公司制)(聚苯乙烯(PS)制)，除此以外，利用与实施例1同样的方法，培养大鼠原代冷冻肝细胞。1天后，从横向观看容器底面，观察在培养环境下有无膜的下垂，结果与容器制作时没有变化，没有观察到下垂。在表1中示出作为1天后的培养的结果的细胞的粘附性，由溶解氧浓度算出了氧消耗速度的结果，代谢活性的测定值、以及评价了7天后的细胞的粘附性的结果。图2表示利用相位差显微镜观察1天后、7天后的细胞而得到的结果。
[比较例5]
作为高透氧容器，使用了培养材料的厚度为350μm的市售的24孔PDMS(聚二甲基硅氧烷)制培养容器(制品名G-plate，VECELLTM型号V24WGPB-10)，除此以外，利用与实施例1同样的方法，培养大鼠原代冷冻肝细胞。1天后，从培养箱中取出，从横向观看容器底面，观察在培养环境下有无膜的下垂，结果膜变化为向下方弯曲下垂的状态。为了评价溶解氧浓度、代谢活性，除去培养基，结果细胞以在培养面的中心群生的状态发生了增殖。在表1中示出作为1天后的培养的结果的细胞的粘附性，由溶解氧浓度算出了氧消耗速度的结果，代谢活性的测定值、以及评价了7天后的细胞的粘附性的结果。图3表示利用相位差显微镜观察1天后、7天后的细胞得到的结果。
[比较例6]
使用比较例4所记载的24孔TCPS培养容器(康宁公司制)(聚苯乙烯(PS)制)，将培养液中的细胞密度变更为4.0×105细胞/cm2，除此以外，利用与实施例1同样的方法，培养大鼠原代冷冻肝细胞。1天后，从横向观看容器底面，观察在培养环境下有无膜的下垂，结果与容器制作时没有变化，没有观察到下垂。在表1中示出作为1天后的培养的结果的细胞的粘附性，由溶解氧浓度算出了氧消耗速度的结果，代谢活性的测定值、以及评价了7天后的细胞的粘附性的结果。
[比较例7]
对于培养材料为聚苯乙烯的比较例4的培养容器底面，利用荧光显微镜进行了观察，结果利用BZ-X滤光片GFP和BZ-X滤光片TexasRed的波长滤光片进行观察时，没有观察到材料来源的荧光，但是利用BZ-X滤光片DAPI的波长滤光片进行观察时，观察到了材料来源的蓝色的发光。可理解为该培养容器不能直接对细胞进行荧光观察。图5表示由荧光显微镜观察得到的培养面的照片。
[表1-1]
[表1-2]
由表1可知，使用了将本发明的培养材料配置于培养容器底部的培养容器的大鼠原代冷冻肝细胞的培养时，能够进行最长7天的长期培养。没有容器底面的弯曲，细胞在培养面整体均匀地粘附、增殖，维持了形态。容器底面即使在将分子量(Mw)为95000、膜厚50μm的膜6用于培养材料的情况下，也没有弯曲，维持了充分的强度，本发明的包含4-甲基-1-戊烯聚合物(X)的培养材料具有优异的形状稳定性。
如果更详细地观察使用了本发明的培养材料的大鼠原代冷冻肝细胞的培养的效果，则测定培养1天后的培养基中氧浓度而算出的细胞的氧消耗速度为40pmol/s/105细胞以上，即使将细胞密度提高至4倍，结果也维持了充分的氧消耗速度，经由培养材料，高效地供给了氧。由此，评价作为肝细胞的功能的药剂代谢活性的代谢活性值高，细胞的功能得以维持正常。另一方面，比较例1、4的氧消耗量小于30pmol/s/105细胞，至少大鼠原代冷冻肝细胞发生了增殖，表达功能所需的氧没有得到供给。由此，特别是利用比较例4、6的PS容器培养得到的细胞的代谢活性值也低，即使细胞增殖，也没能够表达正常的功能。
进一步，在使用了将作为高透氧性的容器而广为人知的PDMS配置于容器底面的培养容器的结果中(比较例5)，即使1个孔的内径为16mm，即并不是特别大的情况下，就1天后的形态而言，容器底部的PDMS也发生了大幅弯曲。推测这是因为，PDMS膜的下垂距离为48mm，易于弯曲。此时，细胞以在容器底面的中心部群生的状态聚集，当确认代谢活性值时，非常低。预测到在群生的细胞间，产生细胞密度的疏密差，在密集的状态下发生了缺氧等不良状况。此外，也可考虑由PDMS的残留单体引起的中毒的影响等材料来源的不良状况。
进一步，对于本发明的培养材料的表面性状，在培养材料表面直接接种细胞进行培养的情况下或实施胶原蛋白涂覆进行培养的情况下，在任一情况下，细胞、胶原蛋白以良好的状态密合于培养材料表面。另一方面，根据比较例2、3所示的结果，示出了至少在使用本实施方式的胶原蛋白或细胞的培养时，培养材料表面为亲水性(为一定的水接触角)的必要性。目前已知多种多样的细胞，对于培养方法，也已知与细胞、其目的相应的各种培养方法，培养材料表面的亲水化处理应当看作作为使用本发明的透氧性容器时的一种手段而有用的方法。
[实施例11]
对于实施例6所使用的4-甲基-1-戊烯聚合物容器，进行药剂吸附试验。将结果示于表2中。
[比较例7、8]
对于比较例4所使用的24孔TCPS培养容器(康宁公司制)(聚苯乙烯(PS)制)和比较例5所使用的24孔PDMS制培养容器(制品名G-plate，VECELLTM型号V24WGPB-10)，进行药剂吸附试验，分别设为比较例7、8。将结果示于表2中。
[表2]
由表2可知，在使用了将本发明的培养材料配置于培养容器底部的培养容器的情况下(实施例11)，与PS制容器、PDMS容器相比，药剂不易吸附。即，本发明的包含4-甲基-1-戊烯聚合物(X)的培养材料具有优异的药剂低吸附性。
由以上结果可理解，本发明的培养材料除了优异的形状稳定性、氧供给性以外，细胞等的粘附性也优异，尽管是树脂容器但也不产生自身荧光，能够直接对培养的细胞进行荧光观察的便利性也优异。此外，由于药剂吸附性低，因此也适合用于药物开发筛选用途、诊断用途。
产业上的可利用性
如上述那样，本发明的培养材料能够培养多种多样的细胞，此外，也能够应对与细胞、其目的相应的各种培养方法，进一步，在实施了本发明的培养材料表面的亲水化处理的情况下，进一步能够应用于很多的用途，具有产业上的可利用性。
Claims (14)
1.一种培养材料，为包含4-甲基-1-戊烯聚合物(X)的细胞、组织或器官的培养材料，培养面的水接触角为50°～100°，并且
利用下述试验方法(A)得到的下垂距离为0～5mm，
在温度23℃、湿度0％时的透氧度为4500～90000cm3/(m2×24h×atm)，
将所述4-甲基-1-戊烯聚合物(X)的全部重复构成单元量设为100摩尔％时，由4-甲基-1-戊烯衍生的构成单元的含量为60～100摩尔％，
所述培养材料的厚度为20～500μm，
所述培养材料的表面经过亲水化处理，
试验方法(A)：制作与所述培养材料为相同材料，且与所述培养材料的培养面为相同厚度，纵×横为100mm×10mm的平板状的试验片，将所述试验片以相对于试验片的纵尺寸从试验台的水平的上表面向水平方向伸出50mm的状态固定于试验台，从固定时起3分钟后，测定从试验台伸出的所述试验片的前端从包含所述试验台的上表面的水平面向铅垂下方下垂的距离，其中，从所述固定到测定为止在室温下进行。
2.根据权利要求1所述的培养材料，
所述4-甲基-1-戊烯聚合物(X)为从4-甲基-1-戊烯均聚物(x1)、以及4-甲基-1-戊烯与选自乙烯和碳原子数3～20的α-烯烃中的至少1种烯烃的共聚物(x2)中选择的至少1种聚合物，其中，所述碳原子数3～20的α-烯烃中不包括4-甲基-1-戊烯。
3.根据权利要求1或2所述的培养材料，
以接种的大鼠原代培养肝细胞的细胞密度为1.0×105细胞/cm2～4.0×105细胞/cm2来进行下述试验方法(B)时，在所述细胞密度的范围的至少一点，1小时后的培养液中的溶解氧浓度为培养液中的饱和氧浓度的2～20％，
试验方法(B)：在培养面积为2cm2的经胶原蛋白涂覆的培养容器中，用大鼠原代肝细胞用培养液0.5mL接种大鼠原代培养肝细胞，在温度37℃、二氧化碳浓度5.0％、氧浓度20％下进行培养，在接种24小时后，除去培养容器内的培养液之后，重新添加培养液0.5mL，在距离培养容器底面80μm的高度测定氧浓度1小时，其中，所述培养容器包含由聚乙烯构成的圆筒部、以及与所述培养材料为相同材料且构成为与所述培养材料的培养面相同厚度的平板状的底面部。
4.根据权利要求3所述的培养材料，
以接种的大鼠原代培养肝细胞的细胞密度为1.0×105细胞/cm2～4.0×105细胞/cm2来进行所述试验方法(B)时，在所述细胞密度的范围的至少一点，氧消耗速度为40～150pmol/s/105细胞。
5.根据权利要求1或2所述的培养材料，其为膜、片或培养容器。
6.根据权利要求5所述的培养材料，培养容器为培养皿、烧瓶、培养插件、培养板、培养瓶或袋。
7.根据权利要求1或2所述的培养材料，对于培养面进行了微细加工。
8.一种微流路器件，其包含权利要求7所述的培养材料。
9.一种培养容器，其中，至少培养面由权利要求1～7中任一项所述的培养材料形成。
10.根据权利要求9所述的培养容器，其具有至少一个孔。
11.一种培养器具，其由权利要求1～7中任一项所述的培养材料、或者权利要求9或10所述的培养容器构成。
12.根据权利要求11所述的培养器具，在培养面涂布有天然高分子材料、合成高分子材料或无机材料。
13.一种细胞、组织或器官的培养方法，其具有在权利要求11或12所述的培养器具内培育细胞、组织或器官的工序。
14.根据权利要求13所述的细胞、组织或器官的培养方法，细胞、组织或器官为肝细胞。
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