WO2022138799A1 - 細胞培養部材及びその表面改質方法 - Google Patents

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直人 齋藤
健 植村
和俊 久野
良憲 佐藤
雅士 山本
啓一 二井
哲郎 西田
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国立大学法人信州大学
ステラケミファ株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a cell culture member and a surface modification method thereof, and more particularly to a cell culture member having excellent cell culture performance and long-term stability thereof and a surface modification method thereof.
  • Cell culture technology is used for research in various fields such as elucidation of biochemical phenomena, production of useful substances, regenerative medicine, and drug evaluation.
  • a polymer compound made of a thermoplastic resin as the material from the viewpoint of increasing awareness of infection / contamination, moldability and manufacturing cost. It is common.
  • the shape and physical properties of the cell culture vessel have a great influence on the efficiency of research and the like and the accuracy of analysis in various applications.
  • adherent cells all cells in mammals except some cells such as cancer cells and hematopoietic cells
  • the adhesion between the adherent cells and the cell culture vessel is high.
  • most of the cell culture vessels using the thermoplastic resin have a problem that the adhesiveness of the adhesive cells is poor and the cell activity of the adhesive cells is significantly impaired because the surface thereof is hydrophobic. be.
  • Patent Document 1 describes that the surface of a polypropylene substrate is surface-modified by plasma treatment in order to deposit or immobilize cells or biomolecules on the polypropylene substrate. .. According to Patent Document 1, it is described that the surface of a polypropylene substrate is modified by plasma treatment to optimize the interaction between the surface of the polypropylene substrate and cells or biomolecules.
  • the surface of the object to be treated is a smooth surface without unevenness. Therefore, there is a problem that it is difficult to apply it to a cell culture container having a complicated shape, such as that used in three-dimensional culture, whose demand has been increasing in recent years. Further, the surface subjected to the discharge treatment exhibits sufficient cell culture performance immediately after the discharge treatment, but there is a problem that the long-term stability is inferior because the cell culture performance deteriorates with the passage of time.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a cell culture member having excellent cell culture performance and long-term stability thereof, and a method for surface modification thereof.
  • the cell culture member according to the present invention is a cell culture member in which at least the holding region of adhesive cells is made of a polymer compound, and at least a part of the holding region is the polymer. It is a surface modification region in which a fluorine atom is directly chemically bonded to a part of a carbon atom and / or a silicon atom constituting the compound.
  • the peak value of the binding energy measured by the X-ray photoelectron spectroscopy of the fluorine atom is preferably in the range of 680 eV to 690 eV.
  • a surface modifying group is directly chemically bonded to a part of other carbon atoms and / or other silicon atoms constituting the polymer compound in the surface modification region.
  • the surface modifying group is -OR 1 group; -COOR 2 group; -COR 3 group; hydrocarbon group; silyl group; a hydrocarbon group having at least one of a hetero atom, a halogen atom and an unsaturated bond; hetero It consists of a silyl group having at least one of an atom, a halogen atom and an unsaturated bond; a cyano group; a nitro group; a nitroso group; a phosphate group; a sulfonyl group; a thiol group; a thionyl group; and a halogen atom excluding a fluorine atom.
  • At least one selected from the group, R 1 and R 2 are independently at least one of a hydrogen atom; a metal atom; a hydrocarbon group; a silyl group; a hetero atom, a halogen atom and an unsaturated bond.
  • a hydrocarbon group having one; or any of a silyl group having at least one of a hetero atom, a halogen atom and an unsaturated bond wherein R3 is a hydrocarbon group; a hetero atom and an unsaturated bond. It is preferably either a hydrocarbon group having at least one; or a silyl group having at least one of a hetero atom and an unsaturated bond.
  • the polymer compound is polyvinyl chloride, polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyvinyl acetate, polyurethane, cyclic polyolefin, polyether ether ketone, polyimide, polyamideimide, polycarbonate, polymethyl methacrylate, and the like. It is preferably at least one polymer selected from the group consisting of polyethylene terephthalate, acrylonitrile, butadiene, styrene, polyacrylonitrile, polyamide, polyvinyl alcohol, polyolefin, and a silicon-containing polymer compound.
  • the method for surface modification of a cell culture member of the present invention is a method for surface modification of a cell culture member in which the retention region of adhesive cells is made of a polymer compound in order to solve the above-mentioned problems.
  • a part of carbon atoms and / or silicon atoms constituting the polymer compound by contacting at least a part with a first treatment gas containing a gas containing a fluorine atom and an inert gas as an optional component. It is characterized by including a step of forming a surface modified region in which the fluorine atom is directly chemically bonded.
  • the peak value of the binding energy measured by X-ray photoelectron spectroscopy of the fluorine atom in the surface modification region is preferably in the range of 680 eV to 690 eV.
  • the above step by using a gas containing an oxygen atom as the first treatment gas, other carbon atoms and / or other silicon constituting the polymer compound are used.
  • a surface modifying group is directly chemically bonded to a part of the atom, and the surface modifying group is -OR 1 group; -COOR 2 group; -COR 3 group; hydrocarbon group; silyl group; hetero atom, halogen.
  • the polymer compound is formed by contacting at least a part of the holding region with which the first treatment gas has been brought into contact with a second treatment gas containing a gas containing another oxygen atom. Further includes a step of directly chemically bonding a surface modifying group to a part of other carbon atoms and / or other silicon atoms constituting the above, and the R 1 and the R 2 are independently hydrogen atoms; metal atoms.
  • the R3 is a hydrocarbon group; a hydrocarbon group having at least one of a hetero atom and an unsaturated bond; or a silyl having at least one of a hetero atom and an unsaturated bond. It may be any of the groups.
  • the fluorine atom directly chemically bonded to a part of the carbon atom and / or the silicon atom, and / or the chemical bond directly to a part of the other carbon atom and / or the other silicon atom.
  • the fluorine atom and / or the surface modifying group is replaced with the surface modifying group derived from the treated compound. It is preferable to further include a step of causing.
  • the polymer compound is polyvinyl chloride, polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyvinyl acetate, polyurethane, cyclic polyolefin, polyether ether ketone, polyimide, polyamideimide, polycarbonate, polymethyl methacrylate, and the like. It is preferably at least one polymer selected from the group consisting of polyethylene terephthalate, acrylonitrile, butadiene, styrene, polyacrylonitrile, polyamide, polyvinyl alcohol, polyolefin, and a silicon-containing polymer compound.
  • a fluorine atom is directly chemically bonded to a part of carbon atoms and / or silicon atoms constituting the polymer compound in the holding region of the adhesive cell made of the polymer compound.
  • the adhesiveness of the adhesive cell to the surface-modified region can be improved as compared with the region not subjected to such surface modification.
  • the cell culture member of the present invention is subjected to conventional surface modification such as plasma treatment, for example. Compared with those, it is possible to suppress the deterioration of the adhesiveness of the adhesive cells over time. This makes it possible to provide a cell culture member having excellent long-term stability in cell culture performance.
  • the holding region is simply contacted with at least a part of the holding region of the cell culture member by a first treatment gas containing at least a gas containing a fluorine atom.
  • a fluorine atom can be directly chemically bonded to a part of a carbon atom or the like in the polymer compound constituting the above, and a surface modification region can be formed.
  • FIG. 1 It is a conceptual diagram for demonstrating the surface modification region in the cell culture member which concerns on embodiment of this invention. It is a conceptual diagram for demonstrating the surface modification method of the cell culture member which concerns on the said Embodiment. It is a graph which shows the measurement result of XPS of the microplate which concerns on Example 1.
  • FIG. It is a figure which shows the bright-field observation image by an inverted microscope after culturing mouse astrocyte cells using the microplate of Example 1.
  • FIG. It is a figure which shows the bright-field observation image by an inverted microscope after culturing mouse astrocyte cells using the microplate of Comparative Example 1.
  • FIG. It is a figure which shows the bright-field observation image by an inverted microscope after culturing mouse astrocyte cells using the microplate of Comparative Example 2.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram for explaining a surface modification region in the cell culture member 10 according to the present embodiment.
  • the cell culture member 10 of the present embodiment includes at least a retention region (cell culture surface) capable of retaining adhesive cells.
  • the cell culture member 10 of the present embodiment adheres adhesive cells to this holding region, and enables the culture of the adhesive cells in the holding region.
  • the term "cell culture member” means a member having at least a solid surface that can serve as a scaffold for adhesive cells when the adhesive cells proliferate, differentiate, survive, and the like. Therefore, as the cell culture member 10, for example, a film (membrane), a sheet, a microplate, a flask, a dish, a tube, a hollow fiber membrane, a substantially spherical shape, or the like is used.
  • the embodiment in which the cell culture member 10 is a film or a sheet includes, for example, a part of a finished product such as a cell culture container.
  • the "adhesive cell” means a cell that requires a scaffold on the solid surface in proliferation, differentiation, survival, etc., and adheres to the solid surface.
  • the adhesive cells include epithelial cells such as human fetal kidney cells (HEK293T cells), Syrian hamster kidney cells (BHK-21 (C-13) cells) and mouse cerebral cortical nerve cells, tumor cells, endothelial cells, and fibers. Examples thereof include blast cells, muscle cells, nerve / endocrine gland cells, primary cells, glial cells (glial cells) such as mouse astrosite cells, and the like.
  • the adhesive cells are not limited to these exemplified cells.
  • the cell culture member 10 may have at least a holding region (cell culture surface) made of a polymer compound. Further, the holding region may be made of a polymer compound and may be a surface-modified surface whose surface has been modified by a known surface treatment such as plasma treatment.
  • Polymer compounds include polyvinyl chloride, polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyvinyl acetate, polyurethane, cyclic polyolefin, polyether ether ketone, polyimide, polyamideimide, polycarbonate, polymethyl methacrylate, polyethylene terephthalate, and acrylonitrile, butadiene, and styrene.
  • the polymer includes an elastomer as well as a thermoplastic resin.
  • polystyrene, polyethylene terephthalate, and polypropylene are preferable from the viewpoint of moldability, manufacturing cost, and the like.
  • At least a part of the holding region is a surface modification region in which a fluorine atom is directly chemically bonded to a part of a carbon atom and / or a silicon atom (hereinafter, referred to as “carbon atom or the like”) constituting the polymer compound (hereinafter referred to as “carbon atom or the like”). See Figure 1).
  • carbon atom or the like a surface modification region in which a fluorine atom is directly chemically bonded to a part of a carbon atom and / or a silicon atom constituting the polymer compound (hereinafter referred to as “carbon atom or the like”).
  • the surface modification region is subjected to other surface treatment such as plasma treatment. Compared with the region, it is possible to suppress the deterioration of the adhesiveness of the adhesive cells over time. As a result, the long-term stability of cell culture performance can also be improved.
  • the surface modification region may be formed in at least a part of the retention region. Therefore, in the present invention, the entire holding region may be a surface modification region.
  • the peak value of the bonding energy measured by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) of the fluorine atom in the surface modification region is preferably in the range of 680 eV to 690 eV, and is preferably 682 eV to 690 eV. The range is more preferable, and the range of 683 eV to 690 eV is particularly preferable.
  • XPS X-ray photoelectron spectroscopy
  • the peak value of the bonding energy of the fluorine atom is, for example, AlK ⁇ monochromaticized by a monochrome meter as X-rays to be irradiated using an X-ray photoelectron spectrometer (model number: PHI VersaProbe III, manufactured by ULVAC-PHI, Inc.).
  • X-ray photoelectron spectrometer model number: PHI VersaProbe III, manufactured by ULVAC-PHI, Inc.
  • the X-ray output can be measured at 50 W
  • the acceleration voltage can be measured at 15 kV
  • the measurement area at one time can be measured at a diameter of about 200 ⁇ m
  • the measurement interval of the coupling energy can be measured at 0.05 eV.
  • a surface modifying group is directly chemically bonded to a part of other carbon atoms and / or other silicon atoms (hereinafter referred to as "other carbon atoms, etc.") constituting the polymer compound in the surface modification region. May be.
  • the surface modifying group is -OR 1 group; -COOR 2 group; -COR 3 group; hydrocarbon group; silyl group; a hydrocarbon group having at least one of a hetero atom, a halogen atom and an unsaturated bond (hereinafter referred to as a hydrocarbon group).
  • Hydrocarbon group having a hetero atom or the like Cyril group having at least one of a hetero atom, a halogen atom and an unsaturated bond (hereinafter referred to as "silyl group having a hetero atom or the like”); It is at least one selected from the group consisting of a cyano group; a nitro group; a nitroso group; a phosphoric acid group; a sulfonyl group; a thiol group; a thionyl group; and a halogen atom excluding a fluorine atom.
  • the -OR 1 group R 1 and the -COOR 2 group R 2 in the surface modifying group are independently hydrogen atom; metal atom; hydrocarbon group; silyl group; hetero atom, halogen atom. And a hydrocarbon group having at least one of unsaturated bonds; or a silyl group having at least one of a hetero atom, a halogen atom and an unsaturated bond.
  • the metal atom in R 1 and R 2 is not particularly limited, and for example, an alkali metal such as lithium, sodium and potassium; an alkaline earth metal such as beryllium, magnesium and calcium; a period such as aluminum, gallium and indium. Table 13 elements; lanthanoids such as lanthanum and the like can be mentioned.
  • the hydrocarbon group in R 1 and R 2 is not particularly limited, and for example, a chain hydrocarbon group having 1 to 100 carbon atoms, preferably 1 to 50 carbon atoms, more preferably 1 to 20 carbon atoms; Examples thereof include 3 to 30, preferably 3 to 20, and more preferably 3 to 12 cyclic hydrocarbon groups. More specifically, the chain hydrocarbon group includes, for example, a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an n-butyl group, an n-pentyl group, an n-hexyl group, an n-heptyl group and an n-.
  • a linear hydrocarbon group such as an octyl group; a branched chain hydrocarbon group such as an isopropyl group, an isobutyl group, a tert-butyl group and an isopentyl group can be mentioned. More specifically, examples of the cyclic hydrocarbon group include a cyclopentyl group and a cyclohexyl group.
  • the range means that the carbon number of all the integers included in the range is included. Therefore, for example, the hydrocarbon group having "1 to 3 carbon atoms" means all the hydrocarbon groups having 1, 2 and 3 carbon atoms.
  • the silyl group in R 1 and R 2 is not particularly limited, and for example, a trimethylsilyl group, a triethylsilyl group, a tert-butyldimethylsilyl group, a triisopropylsilyl group, a tert-butyldiphenylsilyl (TBDPS) group and the like. Can be mentioned.
  • the hetero atom means an oxygen atom, a nitrogen atom, a sulfur atom or the like
  • the halogen atom means a fluorine atom, a chlorine atom, etc. It means a bromine atom or an iodine atom.
  • a hydrocarbon group having a heteroatom means that a part or all of hydrogen and carbon in the hydrocarbon group are substituted with any of these heteroatoms.
  • the hydrocarbon group having a halogen atom means that a part or all of hydrogen and carbon in the hydrocarbon group are substituted with any of these halogen atoms.
  • the hydrocarbon group having a hetero atom or the like in R 1 and R 2 has 1 to 100 carbon atoms, preferably 1 to 50 carbon atoms, and more preferably 1 to 20 carbon atoms. Further, the number of unsaturated bonds in the hydrocarbon group having a hetero atom or the like in R 1 and R 2 can be appropriately set as necessary.
  • examples of the hydrocarbon group having a hetero atom or the like in R 1 and R 2 include a 2-methoxyethyl group and the like.
  • the heteroatom and the halogen atom are the heteroatom and the heteroatom in the hydrocarbon group having the heteroatom and the like in R1 and R2 . Similar to a halogen atom. Therefore, the detailed description thereof will be omitted.
  • the silyl group having a hetero atom or the like in R 1 and R 2 is not particularly limited, and examples thereof include a 2-methoxysilyl group and the like.
  • the number of unsaturated bonds in the silyl group having a hetero atom or the like in R 1 and R 2 can be appropriately set as necessary.
  • the R3 of the -COR 3 group in the surface modifying group is a hydrocarbon group; a hydrocarbon group having at least one of a heteroatom and an unsaturated bond (hereinafter, “hydrocarbon group having a heteroatom or the like”). (); Or, it is one of a silyl group having at least one of a heteroatom and an unsaturated bond (hereinafter, referred to as "silyl group having a heteroatom or the like").
  • the hydrocarbon group in R3 is not particularly limited , and for example, a chain hydrocarbon group having 1 to 100 carbon atoms, preferably 1 to 50 carbon atoms, more preferably 1 to 20 carbon atoms; and 3 to 30 carbon atoms. , Preferably 3 to 20, more preferably 3 to 12 cyclic hydrocarbon groups and the like. More specifically, the chain hydrocarbon group includes, for example, a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an n-butyl group, an n-pentyl group, an n-hexyl group, an n-heptyl group and an n-.
  • a linear hydrocarbon group such as an octyl group
  • a branched chain hydrocarbon group such as an isopropyl group, an isobutyl group, a tert-butyl group and an isopentyl group
  • examples of the cyclic hydrocarbon group include a cyclopentyl group and a cyclohexyl group.
  • the heteroatom is a heteroatom or the like in R1 and R2 . It is the same as the heteroatom in the hydrocarbon group having. Therefore, the detailed description thereof will be omitted.
  • the hydrocarbon group having a hetero atom or the like in R3 is not particularly limited, and examples thereof include a 2 -methoxyethyl group and the like.
  • the number of unsaturated bonds in the hydrocarbon group having a hetero atom or the like in R3 can be appropriately set as necessary.
  • the silyl group having a hetero atom or the like in R3 is not particularly limited, and examples thereof include a 2 -methoxysilyl group and the like.
  • the number of unsaturated bonds in the silyl group having a hetero atom or the like in R3 can be appropriately set as necessary.
  • the hydrocarbon group in the surface modifying group is not particularly limited, and is, for example, a chain hydrocarbon group having 1 to 100 carbon atoms, preferably 1 to 50 carbon atoms, more preferably 1 to 20 carbon atoms; and 3 to 20 carbon atoms. Examples thereof include 30, preferably 3 to 20, more preferably 3 to 12, cyclic hydrocarbon groups and the like. More specifically, the chain hydrocarbon group includes, for example, a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an n-butyl group, an n-pentyl group, an n-hexyl group, an n-heptyl group and an n-.
  • a linear hydrocarbon group such as an octyl group
  • a branched chain hydrocarbon group such as an isopropyl group, an isobutyl group, a tert-butyl group and an isopentyl group
  • examples of the cyclic hydrocarbon group include a cyclopentyl group and a cyclohexyl group.
  • the silyl group in the surface modifying group is not particularly limited, and examples thereof include a trimethylsilyl group, a triethylsilyl group, a tert-butyldimethylsilyl group, a triisopropylsilyl group, and a tert-butyldiphenylsilyl (TBDPS) group. Be done.
  • the number of carbon atoms of the hydrocarbon group having a hetero atom or the like in the surface modifying group is 1 to 100, preferably 1 to 50, and more preferably 1 to 20. Further, the number of unsaturated bonds of the hydrocarbon group having a hetero atom or the like in the surface modifying group can be appropriately set as necessary.
  • examples of the hydrocarbon group having a hetero atom or the like in the surface modifying group include a 2-methoxyethyl group and the like.
  • the hetero atom and the halogen atom are the hetero atom and the halogen in the hydrocarbon group having the hetero atom and the like in R 1 and R 2 . Similar to an atom. Therefore, the detailed description thereof will be omitted.
  • the hetero atom and the halogen atom are the hetero atom and the halogen atom in the hydrocarbon group having the hetero atom and the like in R 1 and R 2 . Is similar to. Therefore, the detailed description thereof will be omitted.
  • the silyl group having a hetero atom or the like in the surface modifying group is not particularly limited, and examples thereof include a 2-methoxysilyl group and the like.
  • the number of unsaturated bonds in the silyl group having a hetero atom or the like in the surface modifying group can be appropriately set as necessary.
  • the sulfonyl group in the surface modifying group is not particularly limited, and examples thereof include a mesyl group, a tosyl group, a nosyl group, and a trifluoromethanesulfonyl group.
  • the thionyl group in the surface modifying group is not particularly limited, and examples thereof include a thionyl chloride group and a thionyl fluoride group.
  • the cell culture member 10 of the present embodiment has a structure in which a fluorine atom and a surface modifying group such as an —OH group and a —COOH group are directly chemically bonded in the holding region of the adhesive cell. .. Therefore, the cell culture member 10 of the present embodiment can sufficiently enhance the adhesiveness with the adhesive cells and is excellent in cell culture performance. In addition, the cell culture member 10 of the present embodiment is also excellent in long-term stability of its excellent culture performance.
  • the first treatment gas contains a gas containing a fluorine atom and an inert gas as an optional component.
  • the fluorine atom can be directly chemically bonded to a part of the carbon atom or the like constituting the polymer compound in the holding region to perform the fluorination treatment. can.
  • a fluorinated surface modification region can be formed in the region in the holding region where the first treatment gas comes into contact. Since the surface modification treatment of the present embodiment directly chemically bonds a fluorine atom to a part of carbon atoms and the like constituting the polymer compound, for example, plasma is used to activate the surface and impart hydrophilicity. Unlike plasma treatment, it enables surface treatment with excellent long-term stability.
  • the concentration of the gas containing a fluorine atom in the first treated gas is preferably in the range of 0.01 to 60 vol%, more preferably in the range of 0.05 to 30 vol%, based on the total volume of the first treated gas.
  • the range of 0.1 to 20 vol% is particularly preferable.
  • the gas containing a fluorine atom is not particularly limited as long as it is a gas containing a fluorine atom.
  • the gas containing such a fluorine atom include hydrogen fluoride (HF), fluorine (F 2 ), chlorine trifluoride (ClF 3 ), sulfur tetrafluoride (SF 4 ), and boron trifluoride (BF). 3 ), nitrogen trifluoride (NF 3 ), carbonyl fluoride (COF 2 ), phosphorus pentafluoride (PF 5 ) and the like. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the first treatment gas may contain an inert gas.
  • the inert gas is not particularly limited, but a gas that reacts with a gas containing a fluorine atom to adversely affect the surface modification treatment of the holding region, a gas that reacts with a polymer compound to have an adverse effect, and an impurity having such an adverse effect. Those containing the above are not preferable.
  • Specific examples of the inert gas include nitrogen, argon, helium, neon, krypton, xenon and the like. These can be used alone or in combination of two or more.
  • the purity of the inert gas is not particularly limited, but the impurities having an adverse effect are preferably 100 ppm or less, more preferably 10 ppm or less, and particularly preferably 1 ppm or less.
  • the first treatment gas may contain a gas containing an oxygen atom.
  • a surface modifying group in addition to the fluorination treatment. That is, by containing a gas containing an oxygen atom in the first treatment gas, the surface modifying group can be further directly chemically bonded to a part of other carbon atoms constituting the polymer compound in the holding region. ..
  • the gas containing an oxygen atom is not particularly limited, but a gas that reacts with a gas containing an oxygen atom and adversely affects the surface modification treatment (fluorination treatment) of the cell culture member 10, a material constituting the cell culture member 10, and the like. Those that react with and have an adverse effect, and those containing impurities that have such an adverse effect are not preferable.
  • Specific examples of the gas containing an oxygen atom include oxygen, ozone, water vapor, carbon monoxide, carbon dioxide, phosgen, sulfur dioxide and the like. These can be used alone or in combination of two or more.
  • the treatment temperature at the time of performing the surface modification treatment is not particularly limited as long as it is equal to or lower than the glass transition point of the polymer compound constituting the cell culture member 10, but is preferably ⁇ 20 ° C. to 150 ° C., more preferably ⁇ 10 ° C. It is about 120 ° C., more preferably 0 ° C. to 100 ° C.
  • the treatment temperature is set to ⁇ 20 ° C. or higher, the surface modification treatment, particularly the fluorination treatment, can be promoted.
  • the treatment temperature to 150 ° C.
  • the defects of the carbon skeleton and / or the silicon skeleton generated by the introduction of fluorine atoms (fluorine groups) on the surface of the cell culture member 10 are excessively increased. It can be suppressed to prevent excessive destruction of the carbon skeleton and / or silicon skeleton and reduction of the mechanical strength of the cell culture member 10. Further, it is possible to prevent the cell culture member 10 from being thermally deformed and to suppress a decrease in yield.
  • the treatment time (reaction time) of the surface modification treatment is preferably in the range of 1 second to 24 hours, more preferably in the range of 1 minute to 12 hours, and particularly preferably in the range of 3 minutes to 1 hour.
  • reaction time By setting the treatment time to 1 second or more, surface modification of the surface of the cell culture member 10, particularly fluorination, can be sufficiently sufficient.
  • processing time By setting the processing time to 24 hours or less, it is possible to prevent a decrease in processing efficiency due to a long processing time.
  • the pressure conditions for performing the surface modification treatment are not particularly limited, and can be performed under normal pressure, pressure, or depressurization. From the viewpoint of economy and safety, it is preferable to carry out under normal pressure.
  • normal pressure means standard atmospheric pressure (101.3 kPa), but in the present invention, it may include a pressure condition of ⁇ 10% with respect to standard atmospheric pressure.
  • the reaction vessel for performing the surface modification treatment is not particularly limited, and conventionally known ones such as fixed beds and fluidized beds can be adopted.
  • the method of contacting the first treatment gas with the cell culture member 10 is not particularly limited, and for example, the first treatment gas is brought into contact with the cell culture member 10 in a closed state under the flow of the first treatment gas or in an atmosphere containing at least the first treatment gas.
  • the method can be mentioned.
  • the surface modification treatment may be performed a plurality of times. As a result, fluorine atoms and surface modifying groups can be further introduced into the surface of the cell culture member 10, and the long-term stability of the surface of the cell culture member 10 can be further improved.
  • the surface modification treatment for the cell culture member 10 may be applied to at least any part of the retention region of the adhesive cell. Therefore, the surface modification treatment may be performed on the entire surface of the holding region. Further, the holding region may be subjected to another known surface treatment in advance before the surface modification treatment is applied. Known surface treatments include, for example, discharge treatments such as plasma treatments. The present invention may also include a case where a known surface treatment is applied to a region other than the holding region.
  • the masking material used for masking is not particularly limited except that it has heat resistance to the treatment temperature during the surface modification treatment.
  • Specific examples of the masking material include fluororesins such as polytetrafluoroethylene, polytetrafluorochloroethylene, polyvinyl fluoride, polyvinylidene fluoride, polydichlorodifluoroethylene, and polytrifluorochloroethylene, ceramics, and polyimides. Examples thereof include those made of polyether ether ketone (PEEK), metal and the like.
  • the post-treatment step may be performed immediately after the surface modification treatment.
  • the post-treatment step is a step of substituting the first treatment gas with an inert gas to create an inert atmosphere and cooling the cell culture member 10 to room temperature. Cooling to room temperature may be performed by allowing cooling. Further, after vacuum exhausting to replace with the inert gas, the pressure may be reduced to atmospheric pressure with the inert gas. This makes it possible to prevent the fluorine gas from being physically adsorbed and remaining on the surface of the cell culture member 10 that has been subjected to the surface modification treatment. As a result, hydrogen fluoride is prevented from being produced as a by-product due to the hydrolysis of fluorine gas, and problems such as destruction of cultured cells by hydrogen fluoride do not occur.
  • the inert gas is not particularly limited, and examples thereof include nitrogen gas.
  • the surface modification region may be brought into contact with a second treatment gas containing a gas containing other oxygen atoms to introduce the above-mentioned surface modification group (first surface modification). Basic introduction process).
  • gas containing other oxygen atoms include oxygen, ozone, water vapor, carbon monoxide, carbon dioxide, phosgen, sulfur dioxide and the like. These can be used alone or in combination of two or more.
  • the second treatment gas may contain an inert gas.
  • the inert gas is not particularly limited, but a gas that reacts with a gas containing an oxygen atom to adversely affect the surface modification treatment of the holding region, a gas that reacts with a polymer compound to have an adverse effect, and an impurity having such an adverse effect. Those containing the above are not preferable.
  • Specific examples of the inert gas include nitrogen, argon, helium, neon, krypton, xenon and the like. These can be used alone or in combination of two or more.
  • the purity of the inert gas is not particularly limited, but the impurities having an adverse effect are preferably 100 ppm or less, more preferably 10 ppm or less, and particularly preferably 1 ppm or less.
  • the treatment temperature at the time of performing the first surface modifying group introduction treatment is not particularly limited as long as it is equal to or lower than the glass transition point of the polymer compound constituting the cell culture member 10, but is preferably ⁇ 20 ° C. to 150 ° C., more preferably. It is ⁇ 10 ° C. to 120 ° C., more preferably 0 ° C. to 100 ° C.
  • the treatment temperature is set to 150 ° C. or lower, the defects in the carbon skeleton and / or the silicon skeleton generated by the treatment with the second treatment gas on the surface of the cell culture member 10 are excessively increased. It is possible to prevent excessive destruction of the carbon skeleton and / or the silicon skeleton and a decrease in the mechanical strength of the cell culture member 10. Further, it is possible to prevent the cell culture member 10 from being thermally deformed and to suppress a decrease in yield.
  • the treatment time (reaction time) for performing the first surface modifying group introduction treatment is preferably in the range of 1 second to 24 hours, more preferably in the range of 1 minute to 12 hours, and in the range of 3 minutes to 1 hour. Especially preferable. By setting the treatment time to 1 second or more, the introduction of the surface modifying group can be sufficiently sufficient. On the other hand, by setting the processing time to 24 hours or less, it is possible to prevent a decrease in processing efficiency due to a long processing time.
  • the pressure conditions for performing the first surface modifying group introduction treatment are not particularly limited, and can be performed under normal pressure, pressure, or reduced pressure. From the viewpoint of economy and safety, it is preferable to carry out under normal pressure.
  • the reaction vessel for performing the first surface modifying group introduction treatment is not particularly limited, and conventionally known ones such as a fixed bed and a fluidized bed can be adopted.
  • the method of contacting the second treatment gas with the cell culture member 10 is not particularly limited, and for example, the second treatment gas is brought into contact with the cell culture member 10 in a closed state under the flow of the second treatment gas or in an atmosphere containing at least the second treatment gas.
  • the method can be mentioned.
  • the first surface modifying group introduction treatment may be performed a plurality of times.
  • hydrophilic groups such as -OH group and -COOH group can be further introduced on the surface of the cell culture member 10, and the long-term stability of the surface of the cell culture member 10 can be further improved.
  • the first surface modifying group introduction treatment may be applied to at least any part of the retention region of the adhesive cell. Therefore, the first surface modifying group introduction treatment may be performed on the entire surface of the holding region.
  • the region other than the region where the first surface modifying group introduction treatment is desired is masked. Can be done.
  • the masking material used for masking is not particularly limited except that it has heat resistance to the treatment temperature at the time of the first surface modifying group introduction treatment. Specific examples of the masking material include the above-mentioned masking material used when performing a partial surface modification treatment.
  • another surface modification group may be introduced into the surface modification region (second surface modification group introduction treatment).
  • second surface modifying group introduction treatment a fluorine atom directly chemically bonded to a part of a carbon atom or the like and / or a treated compound reacting with a surface modifying group directly chemically bonded to a part of another carbon atom or the like is brought into contact with the contact. Do it.
  • the fluorine atom and / or the surface modifying group can be replaced with the surface modifying group derived from the compound.
  • the surface modifying group derived from the treated compound is the same as the surface modifying group in the first surface modifying group introduction treatment. Therefore, the detailed description thereof will be omitted.
  • a gaseous, liquid or solid compound can be used without particular limitation as long as it is a compound that reacts with a fluorine atom and / or a surface modifying group.
  • the gaseous treatment compound is not particularly limited, and examples thereof include steam. Further, the gaseous treated compound may contain an inert gas.
  • the inert gas is not particularly limited, but is one that reacts with the treated compound and adversely affects the surface modification treatment of the retention region, one that reacts with the polymer compound and has an adverse effect, and one containing impurities that have the adverse effect. Is not desirable. Specific examples of the inert gas include nitrogen, argon, helium, neon, krypton, xenon and the like. These can be used alone or in combination of two or more.
  • the purity of the inert gas is not particularly limited, but the impurities having an adverse effect are preferably 100 ppm or less, more preferably 10 ppm or less, and particularly preferably 1 ppm or less.
  • the liquid treatment compound is not particularly limited, and examples thereof include water and the like.
  • the treated compound is water, it can also be performed as a washing treatment for the cell culture member 10 described later. The details of the cleaning process will be described later.
  • the treatment temperature at the time of performing the second surface modifying group introduction treatment is not particularly limited as long as it is equal to or lower than the glass transition point of the polymer compound constituting the cell culture member 10, but is preferably ⁇ 20 ° C. to 150 ° C., more preferably. It is ⁇ 10 ° C. to 120 ° C., more preferably 0 ° C. to 100 ° C.
  • the treatment temperature By setting the treatment temperature to ⁇ 20 ° C. or higher, the introduction of surface modifying groups derived from the treated compound can be promoted.
  • the treatment temperature to 150 ° C. or lower it is possible to suppress excessive increase in defects in the carbon skeleton and / or the silicon skeleton generated by the treatment using the treatment compound on the surface of the cell culture member 10. However, it is possible to prevent excessive destruction of the carbon skeleton and / or the silicon skeleton and reduction of the mechanical strength of the cell culture member 10. Further, it is possible to prevent the cell culture member 10 from being thermally deformed and to suppress a decrease in yield.
  • the treatment time (reaction time) for performing the second surface modifying group introduction treatment is preferably in the range of 1 second to 24 hours, more preferably in the range of 1 minute to 12 hours, and in the range of 3 minutes to 1 hour. Especially preferable.
  • the treatment time By setting the treatment time to 1 second or more, the introduction of the surface modifying group derived from the treated compound can be sufficiently sufficient.
  • the processing time By setting the processing time to 24 hours or less, it is possible to prevent a decrease in processing efficiency due to a long processing time.
  • the pressure conditions for performing the second surface modifying group introduction treatment are not particularly limited, and can be performed under normal pressure, pressure, or reduced pressure. From the viewpoint of economy and safety, it is preferable to carry out under normal pressure.
  • the reaction vessel for performing the second surface modifying group introduction treatment is not particularly limited, and conventionally known ones such as a fixed bed and a fluidized bed can be adopted.
  • the method of contacting the treated compound with the cell culture member 10 is not particularly limited, and for example, in a closed state under the flow of the treated compound or in an atmosphere containing at least the treated compound.
  • the method of contacting is mentioned.
  • the second surface modifying group introduction treatment may be performed a plurality of times.
  • the second surface modifying group introduction treatment may be applied to at least any part of the retention region of the adhesive cell. Therefore, the second surface modifying group introduction treatment may be performed on the entire surface of the holding region.
  • the second surface modifying group introduction treatment is performed on an arbitrary part of the region (partial surface modifying group introduction treatment)
  • it is performed by masking the region other than the region where the second surface modifying group introduction treatment is desired. Can be done.
  • the masking material used for masking is not particularly limited except that it has heat resistance to the treatment temperature at the time of the second surface modifying group introduction treatment. Specific examples of the masking material include the above-mentioned masking material used when performing the first surface modifying group introduction treatment.
  • post-treatment may be performed immediately after the first surface modifying group introduction treatment and the second surface modifying group introduction treatment.
  • the post-treatment is a step of substituting the second treatment gas or the gaseous treatment compound with an inert gas to create an inert atmosphere, and cooling the cell culture member 10 to room temperature. Cooling to room temperature may be performed by allowing cooling. Further, after vacuum exhausting to replace with the inert gas, the pressure may be reduced to atmospheric pressure with the inert gas.
  • the treated compound is adsorbed and remains on the surface of the cell culture member 10 subjected to the second surface modifying group introduction treatment. Can be prevented. As a result, the generation of by-products due to the decomposition of the second treated gas or the gaseous treated compound is prevented, and problems such as destruction of cultured cells by the by-products do not occur.
  • the inert gas is not particularly limited, and examples thereof include nitrogen gas.
  • a cleaning treatment may be performed after the surface modification treatment, the first surface modification group introduction treatment, the second surface modification group introduction treatment and the post-treatment.
  • the cleaning agent is water
  • the cleaning causes a part of the directly chemically bonded fluorine atoms (fluorine groups) such as carbon atoms to react with water molecules, and replaces the fluorine groups with -OH groups, -COOH groups, etc. It can be directly chemically bonded.
  • the surface of the cell culture member 10 can be further hydrophilized.
  • the first treatment gas, the second treatment gas, the treatment compound, and the by-products that are not immobilized on the surface of the cell culture member 10 can be removed.
  • the cleaning agent to be used is not particularly limited, and examples thereof include ethanol, isopropyl alcohol, water (for example, ultrapure water), toluene, acetone and the like.
  • the cleaning conditions are not particularly limited, but are usually carried out within the range of the cleaning temperature (cleaning agent temperature) of 0 ° C. to 100 ° C. and the cleaning time of 1 second to 60 minutes.
  • the drying method is not particularly limited, and examples thereof include natural drying and drying by spraying nitrogen gas or the like.
  • the drying conditions are not particularly limited, but the drying temperature is usually within the range of 0 ° C. to 100 ° C. and a drying time of 1 second to 24 hours (in the case of spraying nitrogen gas or the like, the temperature of the nitrogen gas).
  • the holding region of the adhesive cell is simply brought into contact with the first treatment gas containing a gas containing a fluorine atom. It is possible to modify the surface to improve the adhesiveness with the adhesive cells in the above. As a result, it becomes possible to provide a cell culture member 10 having excellent cell culture performance and excellent long-term stability.
  • Example 1 First, a polystyrene microplate (manufactured by AGC Technoglass Co., Ltd., trade name: IWAKI suspension culture microplate 24WELL, hereinafter referred to as "microplate”) is prepared, and the microplate is placed in a SUS316L chamber (capacity 18L). A plate was installed.
  • a polystyrene microplate manufactured by AGC Technoglass Co., Ltd., trade name: IWAKI suspension culture microplate 24WELL, hereinafter referred to as "microplate”
  • SUS316L chamber capacity 18L
  • the inside of the chamber was vacuum-replaced with nitrogen gas, and the temperature was raised at 4 ° C./min under the flow of nitrogen gas (4 L / min) until the ambient temperature in the chamber reached 40 ° C. Then, the microplate was subjected to constant temperature treatment for 1 hour.
  • the first treatment gas was introduced into the chamber to perform surface modification treatment (fluorination treatment) on the microplate.
  • the introduction of the first treatment gas into the chamber was carried out until the pressure in the chamber reached atmospheric pressure by vacuum replacement.
  • As the first treated gas a mixed gas composed of a fluorine gas having a concentration of 0.25 vol% with respect to the total volume of the first treated gas and a nitrogen gas was used.
  • the chamber was sealed, the atmospheric temperature (treatment temperature) in the chamber was 40 ° C., and the treatment time of the surface modification treatment was 17 minutes. Then, the inside of the chamber was vacuum-replaced with nitrogen gas, and the mixture was allowed to cool to room temperature under an air flow of nitrogen gas (4 L / min).
  • the microplate after the surface modification treatment was sufficiently washed with ultrapure water to perform the washing treatment, and then the nitrogen gas at 25 ° C. was sprayed to perform the drying treatment.
  • a surface-modified microplate was produced as the cell culture member according to this example.
  • the temperature of the ultrapure water in the cleaning treatment was 25 ° C., and the cleaning time was 5 minutes.
  • the temperature of the nitrogen gas in the drying treatment was 25 ° C., and the drying time was 8 hours.
  • Comparative Example 1 In this comparative example, a microplate not subjected to the surface modification treatment of Example 1 (manufactured by AGC Technoglass Co., Ltd., trade name: IWAKI suspension culture microplate 24WELL) was used.
  • Comparative Example 2 Comparative Example 2
  • a discharge-treated microplate manufactured by AGC Technoglass Co., Ltd., trade name: IWAKI adherent culture microplate 24WELL
  • IWAKI adherent culture microplate 24WELL surface modification treatment
  • Elemental analysis was performed on each of the microplates according to Example 1, Comparative Example 1 and Comparative Example 2. Elemental analysis was performed by X-ray photoelectron spectroscopy using PHI5000 VersaProbe III (trade name, manufactured by Albac Phi Co., Ltd.). The results are shown in Table 1.
  • the surface of the microplate (surface subjected to fluorination treatment) according to Example 1 was analyzed by X-ray Photoelectron Spectroscopy (XPS), and the bonding energy of fluorine atoms was measured.
  • XPS X-ray Photoelectron Spectroscopy
  • the XPS measurement conditions were as follows. That is, an X-ray photoelectron spectroscope (model number: PHIVERSaProbeIII, manufactured by ULVAC-PHI, Inc.) was used, and AlK ⁇ rays monochromated by a monochromator were used as the X-rays to be irradiated.
  • the X-ray output was 50 W
  • the acceleration voltage was 15 kV
  • the diameter of one measurement region was about 200 ⁇ m
  • the measurement interval of the binding energy was 0.05 eV
  • the intensity was measured in the range of the bond energy of 679 to 699 eV.
  • the binding energy of the fluorine atom was detected as a waveform having a peak value at 686.5 eV.
  • FIG. 3 is a graph showing the measurement result of XPS of the microplate according to the first embodiment.
  • the culture solution was seeded on each of the microplates so that the number of cells was 1 ⁇ 10 4 cells / WELL.
  • Fetal bovine serum (FBS) in the culture medium was 10%.
  • fetal bovine serum (FBS) of 5% was used as the culture medium, and other than that, Syrian hamster kidney cells were cultured by the same method as the above-mentioned cell culture evaluation, and the number of viable cells was counted. ..
  • FBS fetal bovine serum
  • the culture medium was seeded on each of the microplates so that the number of cells was 1 ⁇ 10 4 cells / WELL.
  • Fetal bovine serum (FBS) in the culture medium was 10%.
  • this culture broth was stored in the air at 25 ° C. for 30 days.
  • human fetal kidney cells were cultured for 4 days in an environment of 37 ° C. and 5% CO 2 . After culturing, the medium was removed, the cells were peeled off, and the number of viable human fetal kidney cells was counted. The results are shown in Table 1.
  • the cerebral cortex was taken out from a mouse (ICR system) fetus, this was enzymatically decomposed, and then seeded on a microplate coated with laminin and polylysine. Then, after culturing for 15 days and confirming that the mouse astrocyte cells were cultured, they were detached.
  • FIGS. 4 to 6 are views showing bright-field observation images under an inverted microscope after culturing mouse astrocyte cells using the microplates in Example 1, Comparative Example 1 and Comparative Example 2, respectively. ..
  • the contact angle of the microplate of Example 1 was smaller than that of Comparative Example 1 using the untreated microplate. From this, it was clarified that the microplate of Example 1 had improved wettability to water.
  • the number of viable cells was 31.7 ⁇ 10 4 in the microplate of Example 1, and 1.6 ⁇ 10 4 in the untreated microplate of Comparative Example 1.
  • the microplate of Example 1 subjected to the surface modification treatment was superior in cell culture performance to the microplate of Comparative Example 1 which had not been treated.
  • the number of viable cells was 3.2 ⁇ 10 4 in the microplate of Example 1 subjected to the fluorination treatment, and the micros of Comparative Example 1 and Comparative Example 2 were obtained. It was confirmed that the cell culture performance was superior to that of the plate.
  • the number of living cells in the fluorinated microplate of Example 1 was 31.5 ⁇ 104, which was the same as that before storage in the air for 30 days. Was confirmed to be maintained.
  • the number of viable cells was 23.4 ⁇ 10 4 , which was significantly reduced from the number of viable cells 31.2 ⁇ 10 4 before storage in the atmosphere for 30 days. It was confirmed that the cell culture performance decreased with the passage of time.
  • Example 1 had better cell culture performance than the untreated microplate of Comparative Example 1. Further, the microplate after the surface modification treatment of Example 1 maintains excellent cell culture performance even after 30 days of atmospheric storage as compared with the microplate after the plasma treatment of Comparative Example 2. Became clear.

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Abstract

優れた細胞培養性能、及びその長期安定性を備えた細胞培養部材及びその表面改質方法を提供する。本発明に係る細胞培養部材は、少なくとも接着性細胞の保持領域が高分子化合物からなる細胞培養部材であって、前記保持領域の少なくとも一部は、前記高分子化合物を構成する炭素原子及び／又はケイ素原子の一部にフッ素原子が直接化学結合した表面改質領域であることを特徴とし、接着性細胞の表面改質領域に対する接着性を向上させ、接着性の経時劣化を抑制し、細胞培養性能とその長期安定性に優れた細胞培養部材を提供することができる。

Description

細胞培養部材及びその表面改質方法
　本発明は、細胞培養部材及びその表面改質方法に関し、より詳細には、優れた細胞培養性能、及びその長期安定性を有する細胞培養部材及びその表面改質方法に関する。
　細胞培養の技術は、生化学的現象の解明、有用物質の生産、再生医療、及び薬剤評価等、様々な分野での研究等に利用されている。細胞培養の技術のうち、細胞培養容器に於いては、感染・汚染等に対する認識の高まりと、成形性及び製造コストとの観点から、熱可塑性樹脂からなる高分子化合物をその材料に用いるのが一般的である。細胞培養容器の形状や物性は、各種用途での研究等の効率性や分析精度等に大きな影響を及ぼす。
　特に、接着性細胞（ガン細胞や造血細胞等の一部の細胞を除いた、哺乳動物に於ける全ての細胞）を用いた研究等では、当該接着性細胞と細胞培養容器との接着性が、細胞増殖効率や生理活性維持にとって重要になる。しかし、前記熱可塑性樹脂を使用した細胞培養容器のほとんどに於いて、その表面が疎水性であるため、接着性細胞の接着性が悪く、接着性細胞の細胞活性が著しく阻害されるという問題がある。
　この様な問題に対し、例えば、特許文献１では、細胞又は生体分子をポリプロピレン基板上に堆積又は固定化させるために、当該ポリプロピレン基板の表面をプラズマ処理により表面改質することが記載されている。特許文献１によれば、プラズマ処理を施すことにより、ポリプロピレン基板の表面改質を行い、ポリプロピレン基板の表面と、細胞又は生体分子との間の相互作用を最適化することが記載されている。
　しかしながら、プラズマ処理に代表される放電処理による表面改質を行う場合、被処理物の表面は凹凸のない平滑面であることが好ましい。そのため、近年需要が増加している三次元培養で使用される様な、複雑な形状を有する細胞培養容器への適用は困難であるという問題がある。また、放電処理が施された表面は、当該放電処理の直後では十分な細胞培養性能を発揮するが、時間の経過と共に細胞培養性能が低下するため、その長期安定性に劣るという問題がある。
特表２０１４－５１５６９２号公報
　本発明は、前記問題点に鑑みなされたものであり、優れた細胞培養性能、及びその長期安定性を備えた細胞培養部材及びその表面改質方法を提供することを目的とする。
　本発明に係る細胞培養部材は、前記の課題を解決するために、少なくとも接着性細胞の保持領域が高分子化合物からなる細胞培養部材であって、前記保持領域の少なくとも一部は、前記高分子化合物を構成する炭素原子及び／又はケイ素原子の一部にフッ素原子が直接化学結合した表面改質領域であることを特徴とする。
　前記の構成に於いては、前記フッ素原子のＸ線光電子分光法により測定された結合エネルギーのピーク値が、６８０ｅＶ～６９０ｅＶの範囲であることが好ましい。
　前記の構成に於いて、前記表面改質領域に於ける前記高分子化合物を構成する他の炭素原子及び／又は他のケイ素原子の一部には、表面修飾基が直接化学結合しており、前記表面修飾基は、－ＯＲ１基；－ＣＯＯＲ２基；－ＣＯＲ３基；炭化水素基；シリル基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基；シアノ基；ニトロ基；ニトロソ基；リン酸基；スルホニル基；チオール基；チオニル基；及びフッ素原子を除くハロゲン原子からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、前記Ｒ１及び前記Ｒ２はそれぞれ独立して、水素原子；金属原子；炭化水素基；シリル基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；又は、ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基の何れかであり、前記Ｒ３は、炭化水素基；ヘテロ原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；又は、ヘテロ原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基の何れかであることが好ましい。
　前記の構成に於いては、前記高分子化合物が、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ポリウレタン、環状ポリオレフィン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリイミド、ポリアミドイミド、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル、ポリエチレンテレフタラート、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリオレフィン、及びケイ素含有高分子化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の重合体であることが好ましい。
　本発明の細胞培養部材の表面改質方法は、前記の課題を解決するために、接着性細胞の保持領域が高分子化合物からなる細胞培養部材の表面改質方法であって、前記保持領域の少なくとも一部に、フッ素原子を含むガスと、任意成分としての不活性ガスとを含有する第１処理ガスを接触させることにより、前記高分子化合物を構成する炭素原子及び／又はケイ素原子の一部に前記フッ素原子を直接化学結合させた表面改質領域を形成する工程を含むことを特徴とする。
　前記の構成に於いては、前記表面改質領域に於ける前記フッ素原子のＸ線光電子分光法により測定された結合エネルギーのピーク値が、６８０ｅＶ～６９０ｅＶの範囲であることが好ましい。
　前記の構成に於いて、前記工程は、前記第１処理ガスとして、さらに酸素原子を含むガスを含有するものを用いることにより、前記高分子化合物を構成する他の炭素原子及び／又は他のケイ素原子の一部に、表面修飾基を直接化学結合させるものであり、前記表面修飾基は、－ＯＲ１基；－ＣＯＯＲ２基；－ＣＯＲ３基；炭化水素基；シリル基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基；ニトロ基；ニトロソ基；リン酸基；スルホニル基；チオニル基；及びフッ素原子を除くハロゲン原子からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、前記Ｒ１及び前記Ｒ２はそれぞれ独立して、水素原子；金属原子；炭化水素基；シリル基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；又は、ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基の何れかであり、前記Ｒ３は、炭化水素基；ヘテロ原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；又は、ヘテロ原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基の何れかであってもよい。
　前記の構成に於いては、前記第１処理ガスを接触させた前記保持領域の少なくとも一部に、他の酸素原子を含むガスを含有する第２処理ガスを接触させることにより、前記高分子化合物を構成する他の炭素原子及び／又は他のケイ素原子の一部に、表面修飾基を直接化学結合させる工程をさらに含み、前記Ｒ１及び前記Ｒ２はそれぞれ独立して、水素原子；金属原子；炭化水素基；シリル基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；又は、ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基の何れかであり、前記Ｒ３は、炭化水素基；ヘテロ原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；又は、ヘテロ原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基の何れかであってもよい。
　前記の構成に於いては、前記炭素原子及び／又はケイ素原子の一部に直接化学結合した前記フッ素原子、及び／又は前記他の炭素原子及び／又は他のケイ素原子の一部に直接化学結合した前記表面修飾基に、前記フッ素原子及び／又は表面修飾基と反応する処理化合物を接触させることにより、前記フッ素原子及び／又は表面修飾基を、前記処理化合物に由来する前記表面修飾基に置換させる工程をさらに含むことが好ましい。
　前記の構成に於いては、前記高分子化合物が、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ポリウレタン、環状ポリオレフィン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリイミド、ポリアミドイミド、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル、ポリエチレンテレフタラート、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリオレフィン、及びケイ素含有高分子化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の重合体であることが好ましい。
　本発明の細胞培養部材によれば、高分子化合物からなる接着性細胞の保持領域に於いて、高分子化合物を構成する炭素原子及び／又はケイ素原子の一部にフッ素原子を直接化学結合させて表面改質領域を設けることにより、その様な表面改質を行っていない領域と比較して、接着性細胞の表面改質領域に対する接着性を向上させることができる。その結果、細胞培養性能に優れた細胞培養部材を提供することができる。また、フッ素原子は高分子化合物を構成する炭素原子等の一部に直接化学結合し固定化されているので、本発明の細胞培養部材は、例えば、プラズマ処理等の従来の表面改質されたものと比べ、接着性細胞の接着性の経時劣化を抑制することができる。これにより、細胞培養性能の長期安定性に優れた細胞培養部材を提供することができる。
　また、本発明の細胞培養部材の表面改質方法によれば、細胞培養部材の保持領域の少なくとも一部に、フッ素原子を含むガスを少なくとも含有する第１処理ガスを接触させるだけで、保持領域を構成する高分子化合物に於ける炭素原子等の一部にフッ素原子を直接化学結合させることができ、表面改質領域を形成することができる。その結果、極めて簡便な方法で、細胞培養性能に優れ、かつ、その長期安定性に優れた細胞培養部材を製造することができる。
本発明の実施の形態に係る細胞培養部材に於ける表面改質領域を説明するための概念図である。 前記実施の形態に係る細胞培養部材の表面改質方法を説明するための概念図である。 実施例１に係るマイクロプレートのＸＰＳの測定結果を表すグラフである。 実施例１のマイクロプレートを用いて、マウスアストロサイト細胞を培養した後の倒立顕微鏡による明視野観察像を示す図である。 比較例１のマイクロプレートを用いて、マウスアストロサイト細胞を培養した後の倒立顕微鏡による明視野観察像を示す図である。 比較例２のマイクロプレートを用いて、マウスアストロサイト細胞を培養した後の倒立顕微鏡による明視野観察像を示す図である。
（細胞培養部材）
　先ず、本実施の形態の細胞培養部材について、図１に基づき説明する。図１は、本実施の形態に係る細胞培養部材１０に於ける表面改質領域を説明するための概念図である。
　本実施の形態の細胞培養部材１０は、接着性細胞を保持することが可能な保持領域（細胞培養面）を少なくとも備える。本実施の形態の細胞培養部材１０は、この保持領域に接着性細胞を接着させ、当該保持領域での接着性細胞の培養を可能にするものである。
　本明細書に於いて「細胞培養部材」とは、接着性細胞が増殖、分化及び生存等をするにあたって、接着性細胞の足場となり得る固体表面を少なくとも有するものを意味する。従って、細胞培養部材１０としては、例えば、フィルム（膜）、シート、マイクロプレート、フラスコ、ディッシュ、チューブ、中空糸膜、又は略球状等が用いられる。尚、細胞培養部材１０がフィルム（膜）やシートである場合の態様には、例えば、細胞培養容器等の完成品の部品である場合を含む。
　また、本明細書に於いて「接着性細胞」とは、増殖、分化及び生存等に於いて、固体表面に足場を必要とし、かつ、固体表面に接着する細胞を意味する。接着性細胞としては、例えば、ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）、シリアンハムスター腎細胞（ＢＨＫ－２１（Ｃ－１３）細胞）及びマウス大脳皮質神経細胞等の上皮細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、神経／内分泌腺細胞、初代細胞、マウスアストロサイト細胞等のグリア細胞（神経膠細胞）等が挙げられる。但し、接着性細胞は例示したこれらの細胞に限定されない。
　細胞培養部材１０は、少なくとも保持領域（細胞培養面）が高分子化合物からなるものであればよい。また、保持領域は、高分子化合物からなるものであって、さらにプラズマ処理等の公知の表面処理により表面が改質された表面改質面であってもよい。
　高分子化合物は、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ポリウレタン、環状ポリオレフィン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリイミド、ポリアミドイミド、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル、ポリエチレンテレフタラート、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリオレフィン、及びケイ素含有高分子化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の重合体である。重合体には、熱可塑性樹脂の他、エラストマーも含まれる。これらの高分子化合物のうち、成形性及び製造コスト等の観点からはポリスチレン、ポリエチレンテレフタラート、ポリプロピレンが好ましい。
　保持領域の少なくとも一部は、高分子化合物を構成する炭素原子及び／又はケイ素原子（以下、「炭素原子等」という。）の一部にフッ素原子が直接化学結合した表面改質領域である（図１参照）。これにより、フッ素原子が直接化学結合した表面改質領域では、当該フッ素原子が直接化学結合していない領域と比較して、接着性細胞の接着性を増大させ、細胞培養性能の向上が可能になる。また、フッ素原子は、保持領域を形成する高分子化合物の炭素原子等の一部に直接化学結合しているので、例えば、表面改質領域は、プラズマ処理等の他の表面処理が施された領域と比べ、接着性細胞の接着性の経時劣化を抑制することができる。その結果、細胞培養性能の長期安定性も向上させることができる。
　尚、本発明に於いて、表面改質領域は保持領域の少なくとも一部に形成されていればよい。従って、本発明は保持領域の全域が表面改質領域であってもよい。
　表面改質領域に於けるフッ素原子のＸ線光電子分光法（ＸＰＳ：X-ray Photoelectron Spectroscopy）により測定された結合エネルギーのピーク値は、６８０ｅＶ～６９０ｅＶの範囲であることが好ましく、６８２ｅＶ～６９０ｅＶの範囲であることがより好ましく、６８３ｅＶ～６９０ｅＶの範囲であることが特に好ましい。結合エネルギーのピーク値を６８０ｅＶ以上にすることにより、表面改質領域が親水化し、接着性能を増加させることができる。結合エネルギーのピーク値を６９０ｅＶ以下にすることにより、過度の表面改質による疎水化を防ぎ、表面改質領域と接着性細胞との適切な接着性を保つことができる。尚、フッ素原子の結合エネルギーのピーク値は、例えば、Ｘ線光電子分光装置（型番：ＰＨＩ ＶｅｒｓａＰｒｏｂｅIII、アルバック・ファイ（株）製）を用いて、照射するＸ線としてモノクロメーターにより単色化されたＡｌＫα線を使用し、Ｘ線の出力を５０Ｗ、加速電圧を１５ｋＶ、１回の測定領域を直径約２００μｍ、結合エネルギーの測定間隔を０．０５ｅＶとして測定することができる。
　表面改質領域の高分子化合物を構成する他の炭素原子及び／又は他のケイ素原子（以下、「他の炭素原子等」という。）の一部には、さらに表面修飾基が直接化学結合していてもよい。
　前記表面修飾基は、－ＯＲ１基；－ＣＯＯＲ２基；－ＣＯＲ３基；炭化水素基；シリル基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基（以下、「ヘテロ原子等を有する炭化水素基」という。）；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基（以下、「ヘテロ原子等を有するシリル基」という。）；シアノ基；ニトロ基；ニトロソ基；リン酸基；スルホニル基；チオール基；チオニル基；及びフッ素原子を除くハロゲン原子からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
　前記表面修飾基に於ける前記－ＯＲ１基のＲ１、及び前記－ＣＯＯＲ２基のＲ２は、それぞれ独立して、水素原子；金属原子；炭化水素基；シリル基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；又は、ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基の何れかである。
　前記Ｒ１及びＲ２に於ける金属原子としては特に限定されず、例えば、リチウム、ナトリウム及びカリウム等のアルカリ金属；ベリリウム、マグネシウム及びカルシウム等のアルカリ土類金属；アルミニウム、ガリウム及びインジウム等の周期表第１３族元素；ランタン等のランタノイド等が挙げられる。
　前記Ｒ１及びＲ２に於ける炭化水素基としては特に限定されず、例えば、炭素数が１～１００、好ましくは１～５０、より好ましくは１～２０の鎖状炭化水素基；炭素数が３～３０、好ましくは３～２０、より好ましくは３～１２の環状炭化水素基等が挙げられる。前記鎖状炭化水素基としては、より具体的には、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、ｎ－ヘプチル基及びｎ－オクチル基等の直鎖状炭化水素基；イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基及びイソペンチル基等の分岐鎖状炭化水素基等が挙げられる。また、前記環状炭化水素基としては、より具体的には、例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。尚、本明細書に於いて炭素数の範囲を表す場合、その範囲は当該範囲に含まれる全ての整数の炭素数を含むことを意味する。従って、例えば「炭素数１～３」の炭化水素基とは、炭素数が１、２及び３の全ての炭化水素基を意味する。
　前記Ｒ１及びＲ２に於けるシリル基としては特に限定されず、例えば、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、及びｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）基等が挙げられる。
　前記Ｒ１及びＲ２に於けるヘテロ原子等を有する炭化水素基に於いて、ヘテロ原子とは、酸素原子、窒素原子又は硫黄原子等を意味し、ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子を意味する。ヘテロ原子を有する炭化水素基とは、炭化水素基中の水素及び炭素の一部又は全部が、これらのヘテロ原子の何れかで置換されているものを意味する。また、ハロゲン原子を有する炭化水素基とは、炭化水素基中の水素及び炭素の一部又は全部がこれらのハロゲン原子の何れかで置換されているものを意味する。
　前記Ｒ１及びＲ２に於けるヘテロ原子等を有する炭化水素基の炭素数は、１～１００、好ましくは１～５０、より好ましくは１～２０である。また、前記Ｒ１及びＲ２に於けるヘテロ原子等を有する炭化水素基に於ける不飽和結合の数は、適宜必要に応じて設定することができる。
　前記Ｒ１及びＲ２に於けるヘテロ原子等を有する炭化水素基は、より具体的には、例えば、２－メトキシエチル基等が挙げられる。
　前記Ｒ１及びＲ２に於けるヘテロ原子等を有するシリル基に於いて、ヘテロ原子及びハロゲン原子は、前記Ｒ１及びＲ２に於けるヘテロ原子等を有する炭化水素基に於けるヘテロ原子及びハロゲン原子と同様である。従って、その詳細な説明は省略する。
　前記Ｒ１及びＲ２に於けるヘテロ原子等を有するシリル基としては特に限定されず、例えば、２－メトキシシリル基等が挙げられる。尚、前記Ｒ１及びＲ２に於けるヘテロ原子等を有するシリル基に於ける不飽和結合の数は、適宜必要に応じて設定することができる。
　前記表面修飾基に於ける前記－ＣＯＲ３基のＲ３は、炭化水素基；ヘテロ原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基（以下、「ヘテロ原子等を有する炭化水素基」という。）；又は、ヘテロ原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基（以下、「ヘテロ原子等を有するシリル基」という。）の何れかである。
　前記Ｒ３に於ける炭化水素基としては特に限定されず、例えば、炭素数が１～１００、好ましくは１～５０、より好ましくは１～２０の鎖状炭化水素基；炭素数が３～３０、好ましくは３～２０、より好ましくは３～１２の環状炭化水素基等が挙げられる。前記鎖状炭化水素基としては、より具体的には、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、ｎ－ヘプチル基及びｎ－オクチル基等の直鎖状炭化水素基；イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基及びイソペンチル基等の分岐鎖状炭化水素基等が挙げられる。また、前記環状炭化水素基としては、より具体的には、例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。
　前記Ｒ３に於けるヘテロ原子等を有する炭化水素基、及び前記Ｒ３に於けるヘテロ原子等を有するシリル基に於いて、ヘテロ原子は、前記Ｒ１及びＲ２に於けるヘテロ原子等を有する炭化水素基に於けるヘテロ原子と同様である。従って、その詳細な説明は省略する。
　前記Ｒ３に於けるヘテロ原子等を有する炭化水素基としては特に限定されず、例えば、２－メトキシエチル基等が挙げられる。尚、前記Ｒ３に於けるヘテロ原子等を有する炭化水素基に於ける不飽和結合の数は、適宜必要に応じて設定することができる。
　前記Ｒ３に於けるヘテロ原子等を有するシリル基としては特に限定されず、例えば２－メトキシシリル基等が挙げられる。尚、前記Ｒ３に於けるヘテロ原子等を有するシリル基に於ける不飽和結合の数は、適宜必要に応じて設定することができる。
　前記表面修飾基に於ける炭化水素基としては特に限定されず、例えば、炭素数が１～１００、好ましくは１～５０、より好ましくは１～２０の鎖状炭化水素基；炭素数が３～３０、好ましくは３～２０、より好ましくは３～１２の環状炭化水素基等が挙げられる。前記鎖状炭化水素基としては、より具体的には、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、ｎ－ヘプチル基及びｎ－オクチル基等の直鎖状炭化水素基；イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基及びイソペンチル基等の分岐鎖状炭化水素基等が挙げられる。また、前記環状炭化水素基としては、より具体的には、例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。
　前記表面修飾基に於けるシリル基としては特に限定されず、例えば、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、及びｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）基等が挙げられる。
　前記表面修飾基に於けるヘテロ原子等を有する炭化水素基の炭素数は、１～１００、好ましくは１～５０、より好ましくは１～２０である。また、前記表面修飾基に於けるヘテロ原子等を有する炭化水素基の不飽和結合の数は、適宜必要に応じて設定することができる。
　前記表面修飾基に於けるヘテロ原子等を有する炭化水素基は、より具体的には、例えば、２－メトキシエチル基等が挙げられる。
　前記表面修飾基に於けるヘテロ原子等を有する炭化水素基に於いて、ヘテロ原子及びハロゲン原子は、前記Ｒ１及びＲ２に於けるヘテロ原子等を有する炭化水素基に於けるヘテロ原子及びハロゲン原子と同様である。従って、その詳細な説明は省略する。
　前記表面修飾基に於けるヘテロ原子等を有するシリル基に於いて、ヘテロ原子及びハロゲン原子は、前記Ｒ１及びＲ２に於けるヘテロ原子等を有する炭化水素基に於けるヘテロ原子及びハロゲン原子と同様である。従って、その詳細な説明は省略する。
　前記表面修飾基に於けるヘテロ原子等を有するシリル基としては特に限定されず、例えば、２－メトキシシリル基等が挙げられる。尚、前記表面修飾基に於けるヘテロ原子等を有するシリル基に於ける不飽和結合の数は、適宜必要に応じて設定することができる。
　前記表面修飾基に於けるスルホニル基としては、特に限定されず、例えばメシル基、トシル基、ノシル基、トリフルオロメタンスルホニル基等が挙げられる。
　前記表面修飾基に於けるチオニル基としては、特に限定されず、例えば塩化チオニル基、フッ化チオニル基等が挙げられる。
　以上の通り、本実施の形態の細胞培養部材１０は、接着性細胞の保持領域において、フッ素原子や、－ＯＨ基及び－ＣＯＯＨ基等の表面修飾基が直接化学結合した構造を有している。そのため、本実施の形態の細胞培養部材１０は、接着性細胞との接着性を十分に高めることができ、細胞培養性能に優れている。また、本実施の形態の細胞培養部材１０はその優れた培養性能の長期安定性にも優れている。
（細胞培養部材の表面改質方法）
　次に、本実施の形態の細胞培養部材の表面改質方法について、図２に基づき説明する。
　本実施の形態の細胞培養部材の表面改質方法は、細胞培養部材１０の保持領域の少なくとも一部に、第１処理ガスを接触させて表面改質処理を施し、表面改質領域を形成する工程を少なくとも含む。
　第１処理ガスは、フッ素原子を含むガスと、任意成分としての不活性ガスとを含有する。第１処理ガスを保持領域の少なくとも一部に接触させることで、保持領域に於ける高分子化合物を構成する炭素原子等の一部にフッ素原子を直接化学結合させ、フッ素化処理を施すことができる。これにより、保持領域に於ける第１処理ガスが接触した領域では、フッ素化された表面改質領域を形成することができる。本実施の形態の表面改質処理は、高分子化合物を構成する炭素原子等の一部にフッ素原子を直接化学結合させるものであるので、例えば、プラズマを用いて表面を活性化し親水性を付与するプラズマ処理とは異なり、長期安定性に優れた表面処理を可能にする。
　第１処理ガスを保持領域に接触させる方法としては、例えば、気相中で行う方法が挙げられる。
　前記第１処理ガスに於けるフッ素原子を含むガスの濃度は、第１処理ガスの全体積に対し、０．０１～６０ｖｏｌ％の範囲が好ましく、０．０５～３０ｖｏｌ％の範囲がより好ましく、０．１～２０ｖｏｌ％の範囲が特に好ましい。フッ素原子を含むガスの濃度を０．０１ｖｏｌ％以上にすることにより、保持領域のフッ素化が不十分となるのを防止することができる。また、フッ素原子を含むガスの濃度を６０ｖｏｌ％以下にすることにより、処理時に保持領域の高分子化合物とフッ素原子とが激しく反応し、燃焼するのを防止することができる。
　フッ素原子を含む気体は、フッ素原子を含む気体であれば特に限定されない。その様なフッ素原子を含むガスとしては、例えば、フッ化水素（ＨＦ）、フッ素（Ｆ２）、三フッ化塩素（ＣｌＦ３）、四フッ化硫黄（ＳＦ４）、三フッ化ホウ素（ＢＦ３）、三フッ化窒素（ＮＦ３）、フッ化カルボニル（ＣＯＦ２）、五フッ化リン（ＰＦ５）等が挙げられる。これらは単独で、又は２種以上を混合して用いてもよい。
　前記第１処理ガスには、不活性ガスが含まれていてもよい。不活性ガスとしては特に限定されないが、フッ素原子を含むガスと反応して保持領域の表面改質処理に悪影響を与えるもの、高分子化合物と反応して悪影響を与えるもの、及び当該悪影響を与える不純物を含むものは好ましくない。不活性ガスとしては、具体的には、例えば、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン、クリプトン、キセノン等が挙げられる。これらは単独で、又は２種以上を混合して用いることができる。また、不活性ガスの純度としては特に限定されないが、当該悪影響を与える不純物については１００ｐｐｍ以下であることが好ましく、１０ｐｐｍ以下であることがより好ましく、１ｐｐｍ以下であることが特に好ましい。
　また、前記第１処理ガスには、酸素原子を含むガスが含まれていてもよい。これにより、本実施の形態の表面改質処理に於いては、フッ素化処理に加えて、表面修飾基の導入も可能となる。すなわち、第１処理ガスに酸素原子を含むガスを含有させることで、保持領域の高分子化合物を構成する他の炭素原子等の一部に、さらに前記表面修飾基を直接化学結合させることができる。
　酸素原子を含むガスとしては特に限定されないが、酸素原子を含むガスと反応して細胞培養部材１０の表面改質処理（フッ素化処理）に悪影響を与えるもの、細胞培養部材１０を構成する材料等と反応して悪影響を与えるもの、及び当該悪影響を与える不純物を含むものは好ましくない。酸素原子を含むガスとしては、具体的には、例えば、酸素、オゾン、水蒸気、一酸化炭素、二酸化炭素、ホスゲン、二酸化硫黄等が挙げられる。これらは単独で、又は２種以上を混合して用いることができる。
　表面改質処理を行う際の処理温度は、細胞培養部材１０を構成する高分子化合物のガラス転移点以下であれば特に限定されないが、好ましくは－２０℃～１５０℃、より好ましくは－１０℃～１２０℃、さらに好ましくは０℃～１００℃である。処理温度を－２０℃以上にすることにより、表面改質処理、特にフッ素化処理を促進させることができる。その一方、処理温度を１５０℃以下にすることにより、細胞培養部材１０表面へのフッ素原子（フッ素基）の導入に伴って発生する炭素骨格及び／又はケイ素骨格の欠陥が過度に増大するのを抑制し、炭素骨格及び／又はケイ素骨格の過度の破壊及び細胞培養部材１０の機械的強度が減少するのを防止することができる。さらに、細胞培養部材１０に熱変形が生じるのを防止し、歩留まりの低下を抑制することができる。
　表面改質処理の処理時間（反応時間）は１秒～２４時間の範囲内が好ましく、１分～１２時間の範囲内がより好ましく、３分～１時間の範囲内が特に好ましい。処理時間を１秒以上にすることにより、細胞培養部材１０表面の表面改質、特にフッ素化を十分なものにすることができる。その一方、処理時間を２４時間以下にすることにより、処理時間の長期化による処理効率の低下を防止することができる。
　表面改質処理を行う際の圧力条件としては特に限定されず、常圧下、加圧下又は減圧下で行うことができる。経済上・安全上の観点からは、常圧下で行うのが好ましい。尚、「常圧」とは、標準大気圧（１０１．３ｋＰａ）を意味するが、本発明に於いては標準大気圧に対し±１０％の圧力条件下である場合も含み得る。
　表面改質処理を行うための反応容器としては特に限定されず、固定床、流動床等の従来公知のものを採用することができる。
　細胞培養部材１０に対する第１処理ガスの接触方法としては特に限定されず、例えば、当該第１処理ガスのフロー下、又は当該第１処理ガスを少なくとも含む雰囲気下に於いて、密閉状態で接触させる方法が挙げられる。また、表面改質処理は複数回行ってもよい。これにより、細胞培養部材１０表面にさらにフッ素原子や表面修飾基を導入することができ、細胞培養部材１０表面の長期安定性を一層向上させることができる。
　細胞培養部材１０に対する表面改質処理は、接着性細胞の保持領域の少なくとも任意の一部の領域に施されればよい。従って、表面改質処理は保持領域の全面に行ってもよい。また、保持領域には、表面改質処理を施す前に予め他の公知の表面処理が施されていてもよい。公知の表面処理としては、例えば、プラズマ処理等の放電処理が挙げられる。尚、本発明は、保持領域以外の領域に公知の表面処理が施されている場合も含み得る。
　任意の一部の領域に対して表面改質処理を行う場合（部分表面改質処理）、当該表面改質処理を行いたい領域以外の領域をマスキングすることにより行うことができる。マスキングに使用するマスキング材としては、表面改質処理の際の処理温度に対し耐熱性を有していることを除き、特に限定されない。マスキング材としては、具体的には、例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ポリテトラフルオロクロルエチレン、ポリフッ化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリジクロルジフルオロエチレン、ポリトリフルオロクロルエチレン等のフッ素樹脂、セラミックス、ポリイミド、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、金属等からなるものが挙げられる。
　また、表面改質処理の直後に後処理工程を行ってもよい。後処理工程は、前記第１処理ガスを不活性ガスに置換して不活性雰囲気下にし、かつ、室温まで細胞培養部材１０を冷却させる工程である。室温までの冷却は放冷により行ってもよい。また、不活性ガスに置換するため真空排気した後、不活性ガスで大気圧にしてもよい。これにより、表面改質処理が施された細胞培養部材１０の表面にフッ素ガスが物理吸着して残存するのを防止することができる。その結果、フッ素ガスの加水分解によりフッ化水素が副生するのを防止し、フッ化水素による培養細胞の破壊等の不具合が生じることもない。尚、不活性ガスとしては特に限定されず、例えば、窒素ガス等が挙げられる。
　また、表面改質処理の後、表面改質領域に、他の酸素原子を含むガスを含む第２処理ガスを接触させて、前述の表面修飾基の導入を行ってもよい（第１表面修飾基導入処理）。
　他の酸素原子を含むガスとしては、具体的には、例えば、酸素、オゾン、水蒸気、一酸化炭素、二酸化炭素、ホスゲン、二酸化硫黄等が挙げられる。これらは単独で、又は２種以上を混合して用いることができる。
　前記第２処理ガスには、不活性ガスが含まれていてもよい。不活性ガスとしては特に限定されないが、酸素原子を含むガスと反応して保持領域の表面改質処理に悪影響を与えるもの、高分子化合物と反応して悪影響を与えるもの、及び当該悪影響を与える不純物を含むものは好ましくない。不活性ガスとしては、具体的には、例えば、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン、クリプトン、キセノン等が挙げられる。これらは単独で、又は２種以上を混合して用いることができる。また、不活性ガスの純度としては特に限定されないが、当該悪影響を与える不純物については１００ｐｐｍ以下であることが好ましく、１０ｐｐｍ以下であることがより好ましく、１ｐｐｍ以下であることが特に好ましい。
　第１表面修飾基導入処理を行う際の処理温度は、細胞培養部材１０を構成する高分子化合物のガラス転移点以下であれば特に限定されないが、好ましくは－２０℃～１５０℃、より好ましくは－１０℃～１２０℃、さらに好ましくは０℃～１００℃である。処理温度を－２０℃以上にすることにより、表面修飾基の導入を促進させることができる。その一方、処理温度を１５０℃以下にすることにより、細胞培養部材１０表面への第２処理ガスを用いた処理に伴って発生する炭素骨格及び／又はケイ素骨格への欠陥が過度に増大するのを抑制し、炭素骨格及び／又はケイ素骨格の過度の破壊及び細胞培養部材１０の機械的強度が減少するのを防止することができる。さらに、細胞培養部材１０に熱変形が生じるのを防止し、歩留まりの低下を抑制することができる。
　第１表面修飾基導入処理を行う際の処理時間（反応時間）は１秒～２４時間の範囲内が好ましく、１分～１２時間の範囲内がより好ましく、３分～１時間の範囲内が特に好ましい。処理時間を１秒以上にすることにより、表面修飾基の導入を十分なものにすることができる。その一方、処理時間を２４時間以下にすることにより、処理時間の長期化による処理効率の低下を防止することができる。
　第１表面修飾基導入処理を行う際の圧力条件としては特に限定されず、常圧下、加圧下又は減圧下で行うことができる。経済上・安全上の観点からは、常圧下で行うのが好ましい。
　第１表面修飾基導入処理を行うための反応容器としては特に限定されず、固定床、流動床等の従来公知のものを採用することができる。
　細胞培養部材１０に対する第２処理ガスの接触方法としては特に限定されず、例えば、当該第２処理ガスのフロー下、又は当該第２処理ガスを少なくとも含む雰囲気下に於いて、密閉状態で接触させる方法が挙げられる。また、第１表面修飾基導入処理は複数回行ってもよい。これにより、細胞培養部材１０表面にさらに－ＯＨ基や－ＣＯＯＨ基等の親水基を導入することができると共に、細胞培養部材１０表面の長期安定性を一層向上させることができる。
　第１表面修飾基導入処理は、接着性細胞の保持領域の少なくとも任意の一部の領域に施されればよい。従って、第１表面修飾基導入処理は保持領域の全面に行ってもよい。任意の一部の領域に対して第１表面修飾基導入処理を行う場合（部分表面修飾基導入処理）、当該第１表面修飾基導入処理を行いたい領域以外の領域をマスキングすることにより行うことができる。マスキングに使用するマスキング材としては、第１表面修飾基導入処理の際の処理温度に対し耐熱性を有していることを除き、特に限定されない。マスキング材としては、具体的には、例えば、部分表面改質処理を行う際に用いられる前述のマスキング材等が挙げられる。
　また、第１表面修飾基導入処理の直後に、表面改質領域に対し、他の表面修飾基の導入を行ってもよい（第２表面修飾基導入処理）。第２表面修飾基導入処理は、炭素原子等の一部に直接化学結合したフッ素原子、及び／又は他の炭素原子等の一部に直接化学結合した表面修飾基に反応する処理化合物を接触させて行う。これにより、第２表面修飾基導入処理では、フッ素原子及び／又は表面修飾基を、前記化合物に由来する表面修飾基に置換させることができる。
　前記処理化合物に由来する表面修飾基は、第１表面修飾基導入処理に於ける表面修飾基と同様である。従って、その詳細な説明は省略する。
　前記処理化合物としては、フッ素原子及び／又は表面修飾基に反応する化合物であれば、気体状、液体状又は固体状のものを特に制限なく使用することができる。
　気体状の処理化合物としては特に限定されず、例えば、水蒸気等が挙げられる。また、気体状の処理化合物には、不活性ガスが含まれていてもよい。不活性ガスとしては特に限定されないが、処理化合物と反応して保持領域の表面改質処理に悪影響を与えるもの、高分子化合物と反応して悪影響を与えるもの、及び当該悪影響を与える不純物を含むものは好ましくない。不活性ガスとしては、具体的には、例えば、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン、クリプトン、キセノン等が挙げられる。これらは単独で、又は２種以上を混合して用いることができる。また、不活性ガスの純度としては特に限定されないが、当該悪影響を与える不純物については１００ｐｐｍ以下であることが好ましく、１０ｐｐｍ以下であることがより好ましく、１ｐｐｍ以下であることが特に好ましい。
　液体状の処理化合物としては特に限定されず、例えば、水等が挙げられる。処理化合物が水である場合、後述の細胞培養部材１０の洗浄処理として行うことも可能である。尚、洗浄処理の詳細については、後段で述べる。
　第２表面修飾基導入処理を行う際の処理温度は、細胞培養部材１０を構成する高分子化合物のガラス転移点以下であれば特に限定されないが、好ましくは－２０℃～１５０℃、より好ましくは－１０℃～１２０℃、さらに好ましくは０℃～１００℃である。処理温度を－２０℃以上にすることにより、処理化合物に由来の表面修飾基の導入を促進させることができる。その一方、処理温度を１５０℃以下にすることにより、細胞培養部材１０表面への処理化合物を用いた処理に伴って発生する炭素骨格及び／又はケイ素骨格への欠陥が過度に増大するのを抑制し、炭素骨格及び／又はケイ素骨格の過度の破壊及び細胞培養部材１０の機械的強度が減少するのを防止することができる。さらに、細胞培養部材１０に熱変形が生じるのを防止し、歩留まりの低下を抑制することができる。
　第２表面修飾基導入処理を行う際の処理時間（反応時間）は１秒～２４時間の範囲内が好ましく、１分～１２時間の範囲内がより好ましく、３分～１時間の範囲内が特に好ましい。処理時間を１秒以上にすることにより、処理化合物に由来の表面修飾基の導入を十分なものにすることができる。その一方、処理時間を２４時間以下にすることにより、処理時間の長期化による処理効率の低下を防止することができる。
　第２表面修飾基導入処理を行う際の圧力条件としては特に限定されず、常圧下、加圧下又は減圧下で行うことができる。経済上・安全上の観点からは、常圧下で行うのが好ましい。
　第２表面修飾基導入処理を行うための反応容器としては特に限定されず、固定床、流動床等の従来公知のものを採用することができる。
　処理化合物が気体状である場合、細胞培養部材１０に対する処理化合物の接触方法としては特に限定されず、例えば、当該処理化合物のフロー下、又は処理化合物を少なくとも含む雰囲気下に於いて、密閉状態で接触させる方法が挙げられる。また、第２表面修飾基導入処理は複数回行ってもよい。
　第２表面修飾基導入処理は、接着性細胞の保持領域の少なくとも任意の一部の領域に施されればよい。従って、第２表面修飾基導入処理は保持領域の全面に行ってもよい。任意の一部の領域に対して第２表面修飾基導入処理を行う場合（部分表面修飾基導入処理）、当該第２表面修飾基導入処理を行いたい領域以外の領域をマスキングすることにより行うことができる。マスキングに使用するマスキング材としては、第２表面修飾基導入処理の際の処理温度に対し耐熱性を有していることを除き、特に限定されない。マスキング材としては、具体的には、第１表面修飾基導入処理を行う際に用いられる前述のマスキング材等が挙げられる。
　尚、本実施の形態に於いては、第１表面修飾基導入処理及び第２表面修飾基導入処理の直後に後処理を行ってもよい。後処理は、第２処理ガス又は気体状の処理化合物を不活性ガスに置換して不活性雰囲気下にし、かつ、室温まで細胞培養部材１０を冷却させる工程である。室温までの冷却は放冷により行ってもよい。また、不活性ガスに置換するため真空排気した後、不活性ガスで大気圧にしてもよい。これにより、第１表面修飾基導入処理の直後に後処理工程を行った場合には、第１表面修飾基導入処理が施された細胞培養部材１０の表面に第２処理ガスが吸着して残存するのを防止することができる。また、第２表面修飾基導入処理の直後に後処理工程を行った場合には、第２表面修飾基導入処理が施された細胞培養部材１０の表面に処理化合物が吸着して残存するのを防止することができる。これにより、第２処理ガス又は気体状の処理化合物の分解による副生物の発生を防止し、副生物による培養細胞の破壊等の不具合が生じることもない。前記不活性ガスとしては特に限定されず、窒素ガス等が挙げられる。
　また、本実施の形態に於いては、表面改質処理、第１表面修飾基導入処理、第２表面修飾基導入処理及び後処理の後に、洗浄処理を行ってもよい。例えば、洗浄剤が水の場合、洗浄により、炭素原子等の直接化学結合したフッ素原子（フッ素基）の一部を水分子と反応させ、フッ素基に換えて－ＯＨ基、－ＣＯＯＨ基等を直接化学結合させることができる。その結果、細胞培養部材１０表面をさらに親水化することができる。また、細胞培養部材１０の表面に固定化されなかった第１処理ガス、第２処理ガス、処理化合物、及び副生成物を除去することができる。使用する洗浄剤としては特に限定されず、例えば、エタノール、イソプロピルアルコール、水（例えば、超純水）、トルエン、アセトン等が挙げられる。また、洗浄条件は特に限定されないが、通常は洗浄温度（洗浄剤の温度）０℃～１００℃、洗浄時間１秒間～６０分間の範囲内で行われる。
　洗浄処理の後に於いては乾燥処理を行うのが好ましい。乾燥方法としては特に限定されず、例えば、自然乾燥や窒素ガス等の吹き付けによる乾燥等が挙げられる。また、乾燥条件は特に限定されないが、通常は乾燥温度（窒素ガス等を吹き付ける場合は、当該窒素ガスの温度）０℃～１００℃、乾燥時間１秒間～２４時間の範囲内で行われる。
　以上の通り、本実施の形態に係る細胞培養部材１０の表面改質方法は、接着性細胞の保持領域に、フッ素原子を含むガスを含有する第１処理ガスを接触させるだけで、当該保持領域に於ける接着性細胞との接着性を向上させる表面改質が可能となる。その結果、優れた細胞培養性能を有し、かつその長期安定性に優れた細胞培養部材１０の提供が可能になる。
　以下に、この発明の好適な実施例を例示的に詳しく説明する。但し、この実施例に記載されている材料や配合量等は、特に限定的な記載がない限り、この発明の範囲をそれらのみに限定するものではない。
　（実施例１）
　先ず、ポリスチレン製マイクロプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社製、商品名：ＩＷＡＫＩ浮遊培養用マイクロプレート　２４ＷＥＬＬ、以下、「マイクロプレート」という。）を用意し、ＳＵＳ３１６Ｌ製チャンバー（容量１８Ｌ）内に、当該マイクロプレートを設置した。
　次に、チャンバー内を窒素ガスに真空置換し、窒素ガスの気流（４Ｌ／ｍｉｎ）下、４℃／ｍｉｎでチャンバー内の雰囲気温度が４０℃になるまで昇温させた。その後、マイクロプレートに対し１時間の恒温処理を行った。
　続いて、チャンバー内に第１処理ガスを導入してマイクロプレートに対し表面改質処理（フッ素化処理）を行った。第１処理ガスのチャンバー内への導入は、真空置換によりチャンバー内の圧力が大気圧に達するまで行った。第１処理ガスとしては、第１処理ガスの全体積に対し濃度が０．２５ｖｏｌ％のフッ素ガスと、窒素ガスとからなる混合ガスを用いた。また、表面改質処理は、チャンバーを密閉状態にし、チャンバー内の雰囲気温度（処理温度）を４０℃、表面改質処理の処理時間は１７分間とした。その後、チャンバー内を窒素ガスに真空置換し、窒素ガスの気流（４Ｌ／ｍｉｎ）下、室温まで放冷した。
　次に、表面改質処理後のマイクロプレートを超純水で十分に洗浄して洗浄処理をした後、２５℃の窒素ガスを吹き付け、乾燥処理を行った。これにより、本実施例に係る細胞培養部材として、表面改質処理を施したマイクロプレートを作製した。尚、洗浄処理に於ける超純水の温度は２５℃とし、洗浄時間は５分間とした。また、乾燥処理に於ける窒素ガスの温度は２５℃とし、乾燥時間は８時間とした。
　（比較例１）
　本比較例に於いては、実施例１の表面改質処理が施されていないマイクロプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社製、商品名：ＩＷＡＫＩ浮遊培養用マイクロプレート　２４ＷＥＬＬ）を用いた。
　（比較例２）
　本比較例に於いては、実施例１の表面改質処理に代えて、放電処理を施したマイクロプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社製、商品名：ＩＷＡＫＩ付着性培養用マイクロプレート　２４ＷＥＬＬ）を用いた。
　（元素分析）
　実施例１、比較例１及び比較例２に係る各マイクロプレートについて、それぞれ元素分析を行った。元素分析は、ＰＨＩ５０００　ＶｅｒｓａＰｒｏｂｅ　ＩＩＩ（商品名、アルバック・ファイ株式会社製）を用いて、Ｘ線光電子分光法により行った。結果を表１に示す。
　（接触角）
　実施例１、比較例１及び比較例２に係る各マイクロプレートについて、それぞれ水の接触角を測定した。水の接触角の測定は、接触角計（協和界面科学株式会社製、型番：ＤＭ－３００）を用いて行った。結果を表１に示す。
　（フッ素原子の結合エネルギーの測定）
　実施例１に係るマイクロプレート表面（フッ素化処理が施された表面）をＸ線光電子分光法（ＸＰＳ：X-ray Photoelectron Spectroscopy）により分析し、フッ素原子の結合エネルギーを測定した。
　ＸＰＳの測定条件は、次の通りとした。すなわち、Ｘ線光電子分光装置（型番：ＰＨＩＶｅｒｓａＰｒｏｂｅIII、アルバック・ファイ（株）製）を用い、照射するＸ線としてモノクロメーターにより単色化されたＡｌＫα線を使用した。Ｘ線の出力を５０Ｗ、加速電圧を１５ｋＶ、１回の測定領域を直径約２００μｍ、結合エネルギーの測定間隔を０．０５ｅＶとし、結合エネルギー６７９～６９９ｅＶの範囲における強度を測定した。測定の結果、図３に示すように、フッ素原子の結合エネルギーが、６８６．５ｅＶにピーク値を有する波形として検出された。図３は、実施例１に係るマイクロプレートのＸＰＳの測定結果を表すグラフである。
　（細胞培養評価）
　実施例１、比較例１及び比較例２に係る各マイクロプレートについて、それぞれヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）、及びシリアンハムスター腎細胞（ＢＨＫ－２１（Ｃ－１３）細胞）を用いて細胞培養評価を実施した。
　細胞培養評価は、先ず、細胞数が１×１０４個／ＷＥＬＬとなる様に培養液をマイクロプレートのそれぞれに播種した。培養液中におけるウシ胎児血清（ＦＢＳ）は１０％とした。
　次に、この培養液を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で４日間、ヒト胎児腎細胞及びシリアンハムスター腎細胞の培養を行った。その後、培地を抜き取り、細胞を剥がし、各細胞の生細胞数をカウントした。結果を表１に示す。
（低栄養培地下に於ける細胞培養評価）
　実施例１、比較例１及び比較例２に係る各マイクロプレートについて、それぞれシリアンハムスター腎細胞（ＢＨＫ細胞）を用いて、低栄養培地下における細胞培養評価を実施した。
　すなわち、培養液としてウシ胎児血清（ＦＢＳ）が５％のものを用い、それ以外は、前述の細胞培養評価と同様の方法により、シリアンハムスター腎細胞の培養を行い、その生細胞数をカウントした。結果を表１に示す。
（細胞培養性能の長期安定性評価）
　次に、実施例１、比較例１及び２に係る各マイクロプレートについて、それぞれヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）を用いて細胞培養性能の長期安定性評価を実施した。
　長期安定性評価は、先ず、細胞数が１×１０４個／ＷＥＬＬとなる様に培養液をマイクロプレートのそれぞれに播種した。培養液中におけるウシ胎児血清（ＦＢＳ）は１０％とした。
　次に、この培養液を、大気下、２５℃で３０日間保管した。その後、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で４日間、ヒト胎児腎細胞の培養を行った。培養後、培地を抜き取り、細胞を剥がし、ヒト胎児腎細胞の生細胞数をカウントした。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（プライマリ細胞を用いた細胞培養評価）
　次に、実施例１、比較例１及び比較例２の各マイクロプレートについて、それぞれマウスアストロサイト細胞を用いて細胞培養評価を実施した。
　細胞培養評価は、先ず、マウス（ＩＣＲ系）の胎児から大脳皮質を取り出し、これを酵素で分解し、その後、ラミニン及びポリリジンでコーティングされたマイクロプレートに播種した。その後、１５日間培養しマウスアストロサイト細胞が培養されていることを確認後、これを剥離した。
　続いて、各マイクロプレートに細胞数が１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになる様に再播種した。３日後、各マイクロプレートのマウスアストロサイト細胞をカルセインで蛍光染色し、倒立顕微鏡を用いて当該マウスアストロサイト細胞の様子を確認した。結果を図４～図６に示す。図４～図６はそれぞれ、実施例１、比較例１及び比較例２に於けるマイクロプレートを用いてマウスアストロサイト細胞を培養した後の倒立顕微鏡に於ける明視野観察像を示す図である。
（結果）
　ＸＰＳによる元素分析の結果、実施例１のフッ素化処理後のマイクロプレートでは１４．０ａｔ％のフッ素原子が検出された。また、比較例１の未処理のマイクロプレートと比較して、酸素原子の量が増加していることも明らかとなった。また、ＸＰＳのピーク位置から、実施例１のマイクロプレートでは、表面修飾基としての－ＯＨ基及び－ＣＯＯＨ基が生成していることも確認できた。その一方、比較例１及び２のマイクロプレートについてはフッ素原子が検出されなかった。
　また、水接触角の測定の結果、実施例１のマイクロプレートについては、未処理のマイクロプレートを用いた比較例１と比較して、接触角が小さくなっていた。これにより、実施例１のマイクロプレートでは、水に対する濡れ性が向上していることが明らかとなった。
　また、細胞培養評価の結果、実施例１のマイクロプレートでは生細胞数が３１．７×１０４個であり、比較例１の未処理のマイクロプレートでは１．６×１０４個であった。これにより、表面改質処理を施した実施例１のマイクロプレートは、未処理の比較例１のマイクロプレートと比較して、細胞培養性能が優れていることが確認された。
　特に、低栄養培地下における細胞培養評価では、フッ素化処理を施した実施例１のマイクロプレートに於いて生細胞数が３．２×１０４個であり、比較例１及び比較例２のマイクロプレートに対し細胞培養性能が優れていることが確認された。
　さらに、細胞培養性能の長期安定性については、フッ素化処理を施した実施例１のマイクロプレートでは生細胞数が３１．５×１０４個であり、３０日間大気保管前と同等の細胞培養性能が維持されていることが確認された。その一方、プラズマ処理を施した実施例１のマイクロプレートでは生細胞数が２３．４×１０４個であり、３０日間大気保管前の生細胞数３１．２×１０４個から大幅減少しており、細胞培養性能が時間の経過と共に低減していることが確認された。
　またプライマリ細胞を用いた細胞培養評価では、図４に示す様に、フッ素化処理を施した実施例１のマイクロプレートに於いてマウスアストロサイト細胞がマイクロプレート表面に接着した状態で、その神経突起が伸長しているのが確認された。その一方、表面改質処理を施していない比較例１のマイクロプレートでは、図５に示す様に、マウスアストロサイト細胞がマイクロプレート表面に接着しておらず、またプラズマ処理を施した比較例２のマイクロプレートでは、図６に示す様に、マウスアストロサイト細胞がマイクロプレート表面に接着しているものの、その神経突起の伸張が実施例１と比較して十分ではなかった。これらの結果から、プライマリ細胞を用いた細胞培養評価でも、実施例１のマイクロプレートは比較例１及び２のマイクロプレートと比較して、細胞培養性能に優れていることが明らかとなった。
　以上の結果から、実施例１のフッ素化処理後のマイクロプレートについては、比較例１の未処理のマイクロプレートと比較して、良好な細胞培養性能を有することが明らかとなった。また、実施例１の表面改質処理後のマイクロプレートは、比較例２のプラズマ処理後のマイクロプレートと比較して、３０日間の大気保管後も、優れた細胞培養性能を維持していることが明らかとなった。
１０　細胞培養部材

 

Claims (10)

  1. 　少なくとも接着性細胞の保持領域が高分子化合物からなる細胞培養部材であって、
    　前記保持領域の少なくとも一部は、前記高分子化合物を構成する炭素原子及び／又はケイ素原子の一部にフッ素原子が直接化学結合した表面改質領域である細胞培養部材。
  2. 　前記フッ素原子のＸ線光電子分光法により測定された結合エネルギーのピーク値が、６８０ｅＶ～６９０ｅＶの範囲である請求項１に記載の細胞培養部材。
  3. 　前記表面改質領域に於ける前記高分子化合物を構成する他の炭素原子及び／又は他のケイ素原子の一部には、表面修飾基が直接化学結合しており、
    　前記表面修飾基は、－ＯＲ１基；－ＣＯＯＲ２基；－ＣＯＲ３基；炭化水素基；シリル基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基；シアノ基；ニトロ基；ニトロソ基；リン酸基；スルホニル基；チオール基；チオニル基；及びフッ素原子を除くハロゲン原子からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、
    　前記Ｒ１及び前記Ｒ２はそれぞれ独立して、水素原子；金属原子；炭化水素基；シリル基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；又は、ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基の何れかであり、
    　前記Ｒ３は、炭化水素基；ヘテロ原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；又は、ヘテロ原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基の何れかである請求項１又は２に記載の細胞培養部材。
  4. 　前記高分子化合物が、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ポリウレタン、環状ポリオレフィン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリイミド、ポリアミドイミド、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル、ポリエチレンテレフタラート、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリオレフィン、及びケイ素含有高分子化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の重合体である請求項１～３の何れか１項に記載の細胞培養部材。
  5. 　接着性細胞の保持領域が高分子化合物からなる細胞培養部材の表面改質方法であって、
    　前記保持領域の少なくとも一部に、フッ素原子を含むガスと、任意成分としての不活性ガスとを含有する第１処理ガスを接触させることにより、前記高分子化合物を構成する炭素原子及び／又はケイ素原子の一部に前記フッ素原子を直接化学結合させた表面改質領域を形成する工程を含む細胞培養部材の表面改質方法。
  6. 　前記表面改質領域に於ける前記フッ素原子のＸ線光電子分光法により測定された結合エネルギーのピーク値が、６８０ｅＶ～６９０ｅＶの範囲である請求項５に記載の細胞培養部材の表面改質方法。
  7. 　前記工程は、前記第１処理ガスとして、さらに酸素原子を含むガスを含有するものを用いることにより、前記高分子化合物を構成する他の炭素原子及び／又は他のケイ素原子の一部に、表面修飾基を直接化学結合させるものであり、
    　前記表面修飾基は、－ＯＲ１基；－ＣＯＯＲ２基；－ＣＯＲ３基；炭化水素基；シリル基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基；ニトロ基；ニトロソ基；リン酸基；スルホニル基；チオニル基；及びフッ素原子を除くハロゲン原子からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、
    　前記Ｒ１及び前記Ｒ２はそれぞれ独立して、水素原子；金属原子；炭化水素基；シリル基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；又は、ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基の何れかであり、
    　前記Ｒ３は、炭化水素基；ヘテロ原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；又は、ヘテロ原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基の何れかである請求項５又は６に記載の細胞培養部材の表面改質方法。
  8. 　前記第１処理ガスを接触させた前記保持領域の少なくとも一部に、他の酸素原子を含むガスを含有する第２処理ガスを接触させることにより、前記高分子化合物を構成する他の炭素原子及び／又は他のケイ素原子の一部に、表面修飾基を直接化学結合させる工程をさらに含み、
    　前記表面修飾基は、－ＯＲ１基；－ＣＯＯＲ２基；－ＣＯＲ３基；炭化水素基；シリル基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基；ニトロ基；ニトロソ基；リン酸基；スルホニル基；チオニル基；及びフッ素原子を除くハロゲン原子からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、
    　前記Ｒ１及び前記Ｒ２はそれぞれ独立して、水素原子；金属原子；炭化水素基；シリル基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；又は、ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基の何れかであり、
    　前記Ｒ３は、炭化水素基；ヘテロ原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；又は、ヘテロ原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基の何れかである請求項５又は６に記載の細胞培養部材の表面改質方法。
  9. 　前記炭素原子及び／又はケイ素原子の一部に直接化学結合した前記フッ素原子、及び／又は前記他の炭素原子及び／又は他のケイ素原子の一部に直接化学結合した前記表面修飾基に、前記フッ素原子及び／又は表面修飾基と反応する処理化合物を接触させることにより、
    　前記フッ素原子及び／又は表面修飾基を、前記処理化合物に由来する前記表面修飾基に置換させる工程をさらに含む請求項７又は８に記載の細胞培養部材の表面改質方法。
  10. 　前記高分子化合物が、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ポリウレタン、環状ポリオレフィン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリイミド、ポリアミドイミド、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル、ポリエチレンテレフタラート、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリオレフィン、及びケイ素含有高分子化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の重合体である請求項５～９の何れか１項に記載の細胞培養部材の表面改質方法。

     
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