JPS63198976A - 細胞培養用基材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 この発明は、細胞培養用基材に関する。さらに詳細には
、動物細胞を培養するために使用される細胞培養用基材
に関するものである。

〈従来技術及び発明が解決しようとする問題点〉近年、
生物の細胞を培養し、その細胞の代謝活動により有用な
生理活性物質、例えば、ワクチン、ホルモン、インター
フェロン等を生産する研究が活発に行われている。

このような方法において、従来、接着性動物細胞の培養
は、ガラス、プラスチック製のシャーレ、試験管、培養
ビンなどを用いて行なわれてきた。

また、最近、マイクロキャリアや中空糸を培養用基材と
して用い、より高密度の培養や、長期の培養を行なう試
みがなされつつある。接着性動物細胞を培養周基村上に
接着させ、増殖させるには、該基材表面と細胞の接着性
が良好であることと共に接着した細胞の形態、配列が、
細胞の伸展、増殖に有効な形態となっていることが必要
である。

しかしながら、従来から細胞培養用基材として用いられ
ている高分子材料は賦形性、耐久性に優れるものの、上
記接着性等の点に関して不適当であり、高密度かつ長期
間の細胞培養を行なうことができず、いずれも十分な成
果を上げるに至っていない。

この問題点を改善するため、高分子材料を表面処理して
親水化した細胞培養用基材、例えば、高分子材料がオゾ
ンで処理された組織培養用材料（特開昭５２−４１２９
１号公報参照）、低温プラズマで処理された組織培養用
担体粒子（特開昭５７−２２８９１号公報参照）が提案
されている。

しかしながら、上記のオゾンまたはプラズマ処理により
得られた細胞培養用基材は、高分子材料に特定の官能基
が導入された表面しか得られず、また、高分子材料は安
定な材料が多いので、官能基の導入量が極めて少なく、
これら従来の方法では、基材と細胞との接着に必要かつ
十分な化学的、物理的表面改質を行うことができない。

さらに、これらの方法による細胞培養用基材は、いずれ
も材料表面の全面が処理された基材しか得らず、接着し
た細胞の配列、形態を細胞の伸展、増殖にａ利な形態に
制御することができない。従って、上記の細胞培養用基
材は、細胞との接着性および細胞の伸展性と増殖性が不
十分であり、細胞培養を高密度かつ長期に亘って行なう
ことができないという問題がある。

く口　的〉 この発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、細
胞との接着性に優れ、細胞の増殖と機能維持を行うこと
のでき、高密度、長期間の細胞培養を可能ならしめる細
胞培養用基材を提供することを目的とする。

く問題点を解決するための手段および作用〉上記の問題
点を解決すべくなされた、この発明の細胞培養用基材は
、高分子基材の表面が、プラズマ、スパッタリング、γ
線、オゾンまたは化学処理のいずれかにより全面処理さ
れ、さらに紫外線、電子線またはイオンのいずれかによ
り部分的な照射処理がされていることを特徴とするもの
である。

なお、上記高分子基材は、多孔質材料であるのが好まし
い。また、上記基材が中空糸であるものが好ましい。

この発明の細胞培養用基材は、上記の構成より・なり、
高分子基材表面が、プラズマ、スパッタリング、γ線、
オゾンまたは化学処理により全面処理されており、基材
の表面が改質されると共に各種親水性官能基が導入され
る。さらに、これらの改質がされた基材の表面は、紫外
線、電子線またはイオンのいずれかにより部分的に照射
処理がされており、これらの照射処理により微細な模様
が基材表面に形成される。二のような微細模様が形成さ
れた基材は、細胞との接着性に優れ、細胞が安定した形
態、配置で接着することができる。すなわち、細胞表面
の細胞膜の構造は、脂質二重層の中に、膜内粒子と呼ば
れる各種の糖蛋白質、糖脂質等が分布をもって埋めこま
れており、これらが、上記脂質二重層の中を自由に移動
でき細胞の接着に関与している。上記官能基の微細模様
が形成された高分子基材は、膜内粒子とイオン結合、疎
水結合等により結合可能な部位を有するので、細胞との
接着性が高まると共に細胞を安定した形態、配置で保持
することができる。従って、本発明の細胞培養用基材は
、細胞の安定な接着を促すと共に接着した細胞の良好な
伸展および増殖を可能にすることができる。

また、上記高分子基材が、多孔質材料であるときは、多
孔質材料の孔を通じて物質代謝が容易となり長期に回り
細胞培養することができる。特に、前記高分子基材が中
空糸であるものは、中空部内や中空糸の外側に培養液等
を潅流することにより、中空糸上に細胞を高密度に育成
、増殖させることができる。

以下、この発明をより詳細に説明する。

この発明に使用される高分子基材としては、賦形性、機
械的強度を有するものであればいかなるものでも使用で
き、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩素化ポ
リエチレン、アイオノマー等のオレフィン系重合体、ポ
リテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン等の
フッ素系樹脂、ポリスチレン等のスチレン系樹脂、ポリ
メチルメタクリレート等のアクリル系樹脂、ポリビニル
アルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアセタール、
ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニ
リデン、ポリカーボネート、ボリアリレート、ポリフェ
ニレンオキサイド、ポリエチレンテレフタレート、ポリ
ブチレンテレフタレート等のポリエステル樹脂、エポキ
シ樹脂、ポリアミド、ポリイミド、ポリスルホン、セル
ロース系樹脂、シリコーン樹脂、ポリウレタンなどの種
々の重合体もしくは共重合体またはそれらのブレンド物
が例示できる。

上記高分子材料からなる基材は、種々の形態に形成でき
、例えば、シャーレ、フラスコ等の成形品の他、フィル
ム、チューブ、中空糸、繊維、微粒子等の形態が例示で
きる。これらの形態のうち、長期に亘り細胞培養を行な
うには、物質代謝を容易にする孔を有する多孔質高分子
基材が好ましく、また、高密度培養を行なうには、チュ
ーブ、中空糸の形状が好適である。特に、物質代謝が容
易で、高密度培養を長期に亘り行なえる多孔質高分子基
材からなる中空糸が好ましい。この中空糸を用いるとき
、培養液を、中空糸の中空部または外側に層流させ、必
要に応じて炭酸ガスや空気等を上記中空糸の中空部等に
送ることにより、細胞を中空糸上で育成し、増殖させる
ことができる。なお、中空糸としては、種々の大きさの
ものが使用でき、例えば、内径５０〜１００〇−程度の
ものが用いられる。

また、この発明の細胞培養用基材をマイクロキャリアー
法のビーズ担体として使用する場合には、高分子基材は
１００〜３００μ履程度の粒径のものが用いられる。

上記高分子基材の表面をプラズマ、スパッタリング、γ
線、オゾンまたは化学処理する方法は、いずれも慣用の
手段が用いられる。これらの表面処理により、高分子基
材表面に、カルボキシ基、カルボニル基、アルデヒド基
、ヒドロパーオキシド基、スルホ基、ニトロ基、アミノ
基、水酸基等の官能基が導入される。

上記処理において、プラズマ処理には慣用のプラズマ装
置が用いられ、例えば、ペルジャーにより構成される反
応容器内に対向する一対の電極を設け、その電極間に高
分子基材を保持した後、電極間に交流電源を接続して、
これにより電極間にプラズマを発生させ、このプラズマ
を高分子基材の表面に作用させる方法等が挙げられる。

スパッタリング処理には、慣用のスパッタリング装置が
用いられ、高分子基材は、真空槽内の陰極の近傍に配設
され、励起された正イオンは高分子基材に衝突し、その
運動エネルギーで基材表面が物理的に改質される。さら
に、雰囲気ガス中に、含酸素化合物（例えば、酸素ガス
、水等）、含窒素化合物（例えば、窒素ガス、アンモニ
ア等）のような反応しやすいガスを含む場合には、上記
スパッタリングにより活性化された表面と反応し、酸化
物、窒化物等が基材表面に導入され、基材表面の親水性
を一層高めることができる。

γ線照射処理に用いられる線源としては、一般にコバル
ト６０が利用される。照射線量は特に限定されず、基材
の種類、活性化させる程度等により適宜選択される。

オゾン処理する方法は、慣用の方法が用いられ、例えば
、高分子基材が配設された反応容器内に、オゾン発生装
置により発生させたオゾン（必要に応じて、アルゴン等
の不活性ガスとの混合ガスとして）を導入することによ
り行われる。所望に応じて、加圧条件下に行なってもよ
く、また有機溶媒等を用いてもよい。反応容器中のオゾ
ンの濃度は、通常０．２〜１０容量％、好ましくは０，
３〜３容量％とされ、反応は通常室温で行われる。

オゾン処理した後、通常の方法に従って、水洗、乾燥さ
れる。

化学処理は、上記基材に無機または有機試薬を作用させ
て行われ、作用させる試薬の種類により、またはその後
の処理により、種々の官能基、例えば、カルボニル基、
カルボキシ基、スルホ基、ニトロ基、アミノ基、チオー
ル基、水酸基等を基材表面に導入することができる。

上記化学処理は高分子基材の化学構造に応じて適宜選択
されるが、例えば、クロム酸、過酸、過酸化水素、過ヨ
ウ素酸、硝酸等の酸化剤で処理することにより、カルボ
ニル基、ヒドロパーオキシド基、アルデヒド基等が導入
される。さらに、これらの官能基は酸化または還元する
ことにより、カルボキシ基、水酸基等に変換することが
できる。

また、クロルスルホン酸、発煙硫酸等のスルホン化剤を
作用させることによりスルホ基を導入することができ、
発煙硝酸、濃硝酸、硝酸と硫酸混合酸等のニトロ化剤を
作用させることによりニトロ基を導入することができ、
該ニトロ基は還元することによりアミノ基に変換するこ
とができる。さらに、ハロゲン含有ポリマーにあっては
、ジチオカーバメートＸ導体と反応させた後、加水分解
してチオール基を導入することもできる。

なお、化学処理は、上記の例に限定されるものではなく
、いわゆる高分子反応として、高分子と無機または有機
の低分子化合物との反応として知られている全ての反応
が適用できる。

上記プラズマ、スパッタリング、γ線、オゾンまたは化
学処理がなされ、全面に親水性官能基が導入された基材
表面に、紫外線、電子線またはイオンのいずれかを部分
的に照射処理して、照射部分の官能基を変換したり、表
面の物理的形状を変化させることにより、この発明の細
胞培養用基材が製造される。紫外線、電子線またはイオ
ンの部分的照射は、例えば、マスクの使用や、ビームを
絞ることにより、μＩの単位で処理することができる。

この際、パターン化、特に、格子模様、縞模様、水玉模
様等の微細模様を形成するように処理するのが好ましい
。

上記紫外線処理に使用される紫外線としては、高分子材
料の表面で化学反応を生じさせる波長のものが使用され
、紫外線のうち、２００ｎｍ未満の遠紫外線は、光エネ
ルギーが大きいため、より効率的に処理することができ
る。

なお、上記紫外線を放射する光源としては、クセノンア
ーク、メタルハライドランプなども使用できるが、大面
積の処理が可能な水銀灯やコヒーレントで微細加工が可
能なレーザが好適に用いられる。上記水銀灯としては、
８８８ｎｍの波長が主である高圧水銀灯、２５３．７ｎ
鵬および１ｇ４．９ｎｍの波長の光を同時に放射する低
圧水銀灯が例示できる。

また、レーザとしては、Ａｒ、、Ｈｅ−Ｃｄ、Ｎ２等の
レーザの他に、短波長と高出力の光を放射するエキシマ
レーザが利用できる。エキシマレーザは、短時間に高い
エネルギーを基材に与え、基材を化学的および物理的に
大きく改質できるため、好適に用いられる。

電子線処理における電子線源としては、各種の電子線加
速機、コックロフトワルソン型、バンプグラフ型、共振
変圧器型等が使用でき、また照射線量としては、１〜５
０　Ｍ　ｒａｄ程度が用いられる。

イオン処理は、慣用のイオンビーム照射装置が用いられ
、マスクや集束イオンビームの採用により、部分的、微
細模様に照射される。イオンとしては各種のイオンを用
いることができ、特に限定されないが、Ｈｅ＋、Ａｒ＋
、Ｃ＋、Ｎ十等のイオンを例示することができる。また
、好適なイオンエネルギーの値としては０．０５ｋｅｖ
〜５００Ｋｅｙが挙げられ、この値未満では効果が小さ
く、またこの値を越えると基材の炭化が顕著に進み好ま
しくない。

この発明の細胞培養用基材は、種々の細胞の培養に使用
することができ、細胞の種類は特に限定されず生体由来
細胞、ハイブリドーマ−等が挙げられ、例えば、チャイ
ニーズハムスター肺由来細胞Ｖ−７９、ヒト子宮癌由来
細胞ＨｅＬａ、ヒト胎児肺由来細胞ＭＲＣ−５、ヒト肝
由来細胞Ｃｈａｎｇ　Ｌｉｖｅｒ　、ヒト肺由来正二倍
体線維芽細胞ＪＲＣ−９０、ヒトリンパ腫由来ナマルバ
細胞等が例示される。

また、この発明の細胞培養用基材を用いて動物細胞を培
養する場合、培養する細胞の種類に応じて種々の培養液
が用いられ、細胞の増殖に適した至適温度、ｐＨ等の条
件で培養が行なわれる。

本発明の細胞培養用基材は、従来公知の種々のモジュー
ルにて、動物細胞の増殖に適用できる。

本発明の細胞培養基材としてフィルム状基材を用いたモ
ジュールの一例を、添付図面に基づいて説明すると以下
の通りである。

添付図面に示す細胞培養器は、サポートスクリーン（２
上に載置されたフィルム状細胞培養用基材（１）の両端
が、ポリカーボネート等からなるハウジング（３）内の
両側に設けられたスペーサ（６）により保持されている
。また、上記ハウジング（３）には、増殖させる細胞懸
濁液をハウジング（３）内に満すための孔（４）が設け
られていると共に、培養液を潅流させるための管（５）
が取付られている。なお、上記孔（４）は、細菌等が侵
入するのを防止するため、フィルタ付きの蓋（７）で被
冠されている。

上記の細胞培養器を用いて細胞を増殖させるには、上記
孔（４）から細胞懸濁液を注入して細胞を前記基材（１
）上に接着させると共に、前記孔（４）をフィルタ付き
の上記蓋（７）で被冠し、所定の培養条件の下、上記培
養液を前記管（５）を通じて所定時間潅流させることに
より行なわれる。

〈実施例〉 以下、実施例に基づいてこの発明をより詳細に説明する
。

実施例１並びに比較例１および２ ポリエチレンテレフタレートフィルム（１）Ｉ厚１００
　／１ｆｆｉ、径４５ｍｍφの円形フィルム）を１３．
５８ＭＨｚの高周波電源を有するペルジャー型プラズマ
装置に設置し、アンモニアガスを１０ｃｃ／分で流しな
がら、放電出力６０Ｗ１圧力０゜８５Ｔｏｒｒ、処理時
間１０分の条件で処理した。次いで、このフィルムの処
理面にＤｅｅｐ　ＵＶ露光装置により石英板上に画かれ
たクロムマスクの画像を通じて、波長２５０〜３００ｎ
ｍの紫外線を照射し＆１１ｍ幅の間隔で紫外線処理部と
未処理部が交互に並ぶパターンが形成された処理フィル
ムを得た。これを４５ｍｍφのガラスシャーレにセット
し、高圧蒸気滅菌後、ヒト由来子宮頚部癌細胞（Ｈｅｌ
ａ　５−３）を培養した。

培養液は、１０％牛脂児血清を含むイーグルＭＥＭ培地
で、培養液１　ｍｌ当たり２Ｘ１０４個の培養細胞を播
種し、５％炭酸ガス、９５％空気雰囲気、３７℃の環境
下、３日間の培養を行なったところ培養液１　ｍｌ当た
り２゜９Ｘ１０５個の細胞数となり、良好な増殖が観察
された。

一方、ポリエチレンテレフタレートフィルムをそのまま
用いた他は、上記実施例１と同様にして試験を行なった
比較例１では、培養液１　ｍｌ当たり平均１．　　Ｉ　
Ｘ　１０Ｓ個の細胞数となった。

また、ポリエチレンテレフタレートフィルムを上記実施
例１と同様にしてプラズマ処理を行なっただけのフィル
ムを、実施例１と同様にして培養試験を行なった比較例
２では培養液１　ｍｌ当たり平均１．８Ｘ１０５個の細
胞数となった。

実施例２ ポリエーテルスルホン（ＩＣ１社製、５２００ｐ）をＮ
−メチル−２−ピロリドンに溶解し、２７重量％溶液を
調整した。この溶液をガラス板上にドクターナイフで厚
さ３００岬に流延し、一定時間放置後、ガラス板ごと温
度１５℃に保たれたＮ−メチル−２−ピロリドンの５９
６水溶液中に浸漬して凝固させ、多孔質フィルムを得た
。この多孔質フィルムを５０ｍｍφの円形に打ち抜き、
実施例１で、用いたのと同じペルジャー型プラズマ装置
に設置し、窒素ガスを１０ｃｃ／分で流しながら、放電
出力８０Ｗ１圧力０．３０Ｔｏｒｒｓ処理時間１０分の
条件で処理した。処理したフィルムを、次いで、電子線
描画装置にセットし、プラズマ処理面に加速電圧１５Ｋ
ｅＶで照射部２岬幅、未照射部２μ−幅が交互に並ぶ縞
模様の電子線のパターン処理を行なった。細胞培養用基
材としてのこのフィルムをプラズマ処理−電子線処理さ
れた面が上に向くようにして、添付図面に示される細胞
培養器（内径４７關φ）に装着し、全体を高圧蒸気滅菌
後、孔（４）がらハムスター仔腎由来細胞（ＢＨＫ−２
１）のイーグルＭＥＭ（１０％牛脂児血清添加）懸濁液
（細胞数２．　　Ｉ　Ｘ　１０４個／ｍ１）を満たした
。孔（４）には細菌をカットするフィルター付きの蓋■
をし、管（５）を通じて新鮮なイーグルＭＥＭ培地を潅
流し、３７℃で１週間培養を行なった。培養終了後、フ
ィルムに付着している細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液
で分離し、細胞数を計算したところ、２、ｌＸ１０５個
／　ｍｌであった。

〈発明の効果〉 以上のように、この発明の細胞培養用基材によれば、高
分子基材が、プラズマ、スパッタリング、γ線、オゾン
または化学処理のいずれかにより表面処理されて親水性
官能基が導入された表面が、紫外線、電子線またはイオ
ンにより部分的に照射処理され、微細模様が形成されて
いるで、細胞との親和性に優れ、細胞と基材との接着性
を高めることができ、高密度かつ長期間の細胞培養が可
能になるという特有の効果を奏する。従って、この発明
の細胞培養用基材は、動物細胞の培養によるホルモン等
の有用物の生産システムに利用できる他、例えばインス
リン産生細胞を基材表面に接着、培養することにより人
工膵臓が形成できるように人工臓器の構築に利用できる
。

【図面の簡単な説明】

図は、本発明の細胞培養用基材を用いた細胞培養器の一
例を示す断面図である。 （１）・・・細胞培養用基材、（２）・・・サポートス
クリーン、（３）・・・ハウジング、（４）・・・孔、
（５）・・・管。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、高分子基材の表面が、プラズマ、スパ ッタリング、γ線、オゾンまたは化学処 理のいずれかにより全面処理され、さら に紫外線、電子線またはイオンのいずれ かにより部分的な照射処理がされている ことを特徴とする細胞培養用基材。 ２、高分子基材が多孔性である上記特許請 求の範囲第１項記載の細胞培養用基材。 ３、高分子基材が中空糸である上記特許請 求の範囲第１項または第２項記載の細胞 培養用基材。 ４、紫外線、電子線またはイオンのいずれ かによる部分的な照射処理が、格子模様 に処理するものである上記特許請求の範 囲第１項記載の細胞培養用基材。 ５、紫外線、電子線またはイオンのいずれ かによる照射処理が、縞模様に処理する ものである上記特許請求の範囲第１項記 載の細胞培養用基材。 ６、紫外線、電子線またはイオンのいずれ かによる照射処理が、水玉模様に処理す るものである上記特許請求の範囲第１項 記載の細胞培養用基材。