JPH04237492A - 細胞培養用成形物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、細胞培養用成形物に関
するものである。詳しく述べると、本発明は、優れた細
胞親和性、親水性、強度（対脆弱性）を有する細胞培養
用成形物に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】動物細胞の培養技術は、インターフェロ
ン、リンフォカイン、各種の成長ホルモンや細胞増殖因
子などの生理活性物質、生体由来材料および治療用ワク
チンなどの生産手段としてあるいは細胞組込型人工臓器
の基本技術として欠かせぬものであり、近年これらの物
質を高効率かつ大量に生産する高密度培養法が注目され
ている。

【０００３】動物細胞の培養において、特に、生存、増
殖、目的物質の生産のために人工もしくは天然の基材に
接着することが必要な「接着依存性細胞」の高密度培養
では、細胞を培養する基材表面が細胞の接着性や増殖性
の優れた表面であることが必要となってくる。また、細
胞の生存や目的物質の生産能を維持するために、細胞に
とって良好な環境を維持することが重要となり、このた
め、栄養素や酵素の供給および老廃物の除去を連続的に
行うことが必要となってくる。

【０００４】前者の基材表面への細胞接着性に関しては
、組織培養用プラスチックシャーレとして通常使用され
ているポリスチレン系材料や適度の電荷密度を有する表
面が優れていることが知られている。スチレン系化合物
の細胞接着性を利用した例としては、特開平２−１６９
７２号にスチレン−ジビニルベンゼンの架橋重合体を表
面に保持させた多孔質膜が開示されており、また、適度
な電荷密度を有する表面については、ジャーナル　　オ
ブ　　セオロジカル　　バイオロジー（Ｊ．ｏｆ　　Ｔ
ｈｅｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、第４９巻、ページ４１７〜４
２４（１９７５）：アドヘッション　　アンド　　スプ
レッディング　　オブ　　セルズ　　オン　　チャージ
ド　　サーフェセス（Ａｄｈｅｓｉｏｎ　　ａｎｄ　　
Ｓｐｒｅａｄｉｎｇ　　ｏｆＣｅｌｌｓ　　ｏｎ　　Ｃ
ｈａｒｇｅｄ　　Ｓｕｒｆａｃｅｓ．）に記載されてい
る。また、各種の高分子材料表面に低温プラズマ処理、
スパッタリング処理、紫外線処理、電子線処理、単分子
累積膜の被覆処理などの表面処理を施した材料（特公昭
５８−３２５８９、特開昭６３−１９８９７６、特開昭
６３−１９８９７７、特開平１−１５１３３など）や、
コラーゲン、フィブロネクチン、ヒドロネクチン、ラミ
ニン等の細胞接着因子や細胞増殖因子などで処理した材
料（例えば、トランスアメリカン　　ソサエティ　　オ
ブ　　アーティフィシャル　　オルガンズ（Ｔｒａｎｓ
．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ（１９８７
）、第３３巻、ページ６６、スコラリー　　レビューズ
（Ｓｃｈｏｌａｒｌｙ　　Ｒｅｖｉｅｗｓ）“セルアド
ヘッション　　ツー　　バイオマテリアルズ（Ｃｅｌｌ
　　Ａｄｈｅｓｉｏｎｔｏ　　Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ
ｓ）”）も検討されている。

【０００５】しかし、高分子材料にポリスチレンを用い
て、上記表面処理を施した場合、ポリスチレンには良好
な細胞接着性が付与されるが、物性が脆弱なため、厚さ
の薄いフィルム状物や高密度培養に適した多孔質膜に成
形することは困難であるという欠点が生じる。また、細
胞培養用基材が膜厚１００μｍ程度の「孔質膜」という
特殊な形状であると、一般的に行われている表面処理で
は「膜物性の劣化」や「孔径の閉塞化」等の問題が生じ
るものが多かった。

【０００６】また、基材表面をコラーゲンや細胞間マト
リックス（ＥＣＭ）、細胞接着因子などで処理すること
により肝細胞等の細胞の接着性や伸展性が向上するが、
これらの方法では使用前に無菌的にコーティング処理を
施さなければならず、そのため操作が煩雑となるという
欠点がある。また、雑菌混入の可能性が増える点からも
上記方法は好ましいとはいえない。さらに、高密度培養
による有用物質の生産を考えると、大量の膜を使用する
ため、コラーゲンや細胞接着因子の必要量が増大し、経
済的観点からも問題点を有している。

【０００７】一方、高密度培養細胞の成育環境維持につ
いては、多孔質膜を用いる方法が優れていると考えられ
ている。すなわち、多孔質平膜を積層したり中空糸を束
ねることにより限られた容積内に多くの表面積を確保で
き、さらに、生命活動に必要な物質の供給や異物の除去
を多孔質膜の微小な孔を介して連続的に拡散もしくは膜
間の圧力差により強制的に行うことによって良好な成育
環境を維持することが可能となる。特に、上皮細胞や内
皮細胞のように極性を有する細胞の場合、栄養源の吸収
や代謝が生理的条件と同様に接着基質側から行われるこ
とは、細胞にとって好ましいことである。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明は
、接着依存性細胞を大量かつ高密度に培養する場合に非
常に有効である細胞培養用成形物を提供することを目的
とするものである。本発明はまた、上皮系細胞等の分化
した機能細胞の培養に好適であり、各種の細胞培養シス
テムに組み入れることに有効に使用可能な細胞培養用成
形物を提供することを目的とするものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記諸目的は、材料表面
の少なくとも一部に、アルコキシアルキルアクリレート
より選ばれる一種以上の重合性単量体を構成成分として
なる重合体層を形成してなる細胞培養用成形物によって
達成される。

【００１０】本発明はまた、基材となる材料が、バブル
ポイントが０．２〜５．０ｋｇ／ｃｍ２の多孔質膜であ
る細胞培養用成形物を示すものである。本発明はまた、
アルコキシアルキルアクリレートより選ばれる一種以上
の重合性単量体が、グラフト重合可能な重合開始点を表
面の少なくとも一部に有する材料にガス状で供給され、
該表面でグラフト重合されてなる細胞培養用成形物を示
すものである。本発明はまた、材料表面が、プラズマ放
電処理されている細胞培養用成形物を示すものである。 本発明はさらに、基材となる材料が、ポリオレフィンお
よび一部もしくはすべての水素がハロゲン化されたポリ
オレフィンよりなる群から選ばれた少なくとも一種のも
のを主成分とした多孔質膜である細胞培養用成形物を示
すものである。本発明はさらに、多孔質膜が、５分以内
の濡時間を有する親水性膜である細胞培養用成形物を示
すものである。

【００１１】

【作用】本発明に係わる組織培養成形物は、材料表面の
少なくとも一部に、アルコキシアルキルアクリレートよ
り選ばれる一種以上の重合性単量体を構成成分としてな
る重合体層を形成してなるものである。したがって、本
発明の細胞培養用成形物は、細胞増殖性、親水性、柔軟
性の優れたポリアルコキシアルキルアクリレートが表面
グラフト重合されているため、良好な細胞接着性、耐脆
弱性、親水性を示すこととなる。また、ポリアルコキシ
アルキルアクリレートは、カチオン性やアニオン性の極
性基を分子内に持たないで適度な親水性を有しているた
め、材料表面に吸着されるタンパク質も静電的相互作用
や疎水性相互作用に起因する著しい吸着変性を受けにく
いことや細胞表層への相互作用がマイルドとなることが
予測され、そのため細胞に対して良好な成育環境が維持
されやすいものと推定される。

【００１２】また、アルコキシアルキルアクリレートを
構成成分とする重合体が、グラフト鎖として基材表面に
共有結合により導入されていると、コーティングや架橋
剤を用いた不溶化による被覆と異なり、重合体層が溶出
したり剥離することがなくなる。

【００１３】また、本発明の細胞培養用成形物が、グラ
フト鎖が気相プラズマ表面グラフト法により材料表面に
導入されるものであると、グラフト鎖が強固に材料表面
に結合されることとなる。また、単量体がガス状で供給
され、真空下でグラフト重合されていると、凹凸を有す
る表面や不織布、微細孔を有する細胞培養用基材などに
対してグラフト鎖が良好に導入されていることとなる。

【００１４】さらに、本発明の細胞培養用成形物が、基
材となる材料がポリオレフィン及び一部もしくはすべて
の水素がハロゲン化されたポリオレフィンよりなる群か
ら選ばれた少なくとも一種のものを主成分としているも
のであると、耐酵素分解性（耐生体分解性）、耐薬品性
等に優れた細胞培養用成形物となり、代謝産物や酵素等
による物性の経時的劣化が少ない長持間使用可能な細胞
培養用成形物を作製することが可能となる。また、基材
となる材料が親水化処理された多孔質膜であると、事前
に親水化処理することなく使用することができ、さらに
、培養液が膜の孔に侵入、通過できるようになり、膜上
での高密度培養が可能になり、好ましい。

【００１５】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１６】本発明において使用されるアルコキシアル
キルアクリレートとしては、具体的には、メトキシエチ
ルアクリレート、メトキシブチルアクリレート、エトキ
シエチルアクリレート等が挙げられる。これらのうち、
特に、メトキシエチルアクリレートが好適に使用される
。

【００１７】また、本発明の細胞培養用成形物の形態は
、特に限定されず、例えば、シャーレ、ボトル、不織布
、織布、フィルム、フラスコ、微粒子、微多孔質膜など
が挙げられるが、好ましくは長期の細胞培養や生体に近
い状態での細胞培養に好適に使用できる形態、すなわち
、物質代謝を容易にする微小孔を有する平膜型、中空糸
型、チューブ型、不織布型などの多孔質基材が望ましい
。さらには、有用物質の回収、モジュール化、細胞成分
の保持、物質移動速度などを考慮すると、バブルポイン
トが、０．２〜５．０ｋｇ／ｃｍ２、さらに好ましくは
０．５〜３．０ｋｇ／ｃｍ２であり、膜厚が、１０〜１
０００μｍ、さらに好ましくは２０〜２００μｍであり
、空孔率が、２０〜９０％、さらに好ましくは４０〜８
０％である多孔質膜が好ましい。バブルポイントが０．
２ｋｇ／ｃｍ２未満であると、孔径が大きくなり、細胞
が孔内に入ってきてしまい好ましくない。これに対して
、バブルポイントが５．０ｋｇ／ｃｍ２を超えると、孔
径が小さくなりすぎて、膜を介しての代謝が不十分とな
ってしまう。

【００１８】また、本発明の細胞培養用成形物は、多孔
質膜の濡時間が、５分以内、好ましくは１分以内である
親水性膜であることが好ましい。

【００１９】本発明において、アルコキシアルキルアク
リレートを構成成分とした重合体層の基材表面への形成
方法は、コーティング法、架橋不溶化法、グラフト重合
法、プラズマ重合法等特に限定されないが、アルコキシ
アルキルアクリレートより選ばれる一種以上の重合性単
量体が、グラフト重合可能な重合開始点を表面の少なく
とも一部に有する基材にガス状で供給され、該表面でグ
ラフト重合されて形成される方法が好ましい。また、グ
ラフト鎖を基材表面に形成させる方法としては、材料表
面に放射線や紫外線などにより重合開始点となる高分子
ラジカルを生成させた後、材料表面に単量体を接触させ
る方法が例示できる。これらのうちで、気相プラズマグ
ラフト重合法が好ましい。気相プラズマグラフト重合法
とは、１００Ｔｏｒｒ以下、好ましくは１０−３〜１．
０Ｔｏｒｒのアルゴン、窒素、空気、種々のモノマーな
どよりなる低圧ガスに高周波電界、マイクロ波電界また
は直流電界を印加することによって低温プラズマを発生
させ、このプラズマを材料表面に１〜５００秒間、好ま
しくは２〜５０秒間接触させて、重合開始点となるラジ
カルを生成させた後、種々のモノマー等の雰囲気下で０
．１〜１００Ｔｏｒｒ、好ましくは０．２〜５０Ｔｏｒ
ｒの減圧下で重合性単量体ガスを供給してグラフト重合
を進行させる方法である。

【００２０】本発明において使用されるプラズマ放電処
理とは、１００Ｔｏｒｒ以下、好ましくは１０−３〜１
．０Ｔｏｒｒの低圧ガスに高周波電界、マイクロ波電界
または直流電界を印加することによって低温プラズマを
発生させ、このプラズマ雰囲気やプラズマにより生成す
るラジカルやイオンなどの活性種を材料表面に１〜５０
０秒間、好ましくは２〜５０秒間接触させて表面処理す
る方法である。プラズマ放電処理は、酸素、空気、アル
ゴン等の非重合性ガスやスチレン等の重合性ガスあるい
はそれらの混合物などを流しながら発生させることがで
きる。

【００２１】また、必要に応じて公知の他の単量体を共
重合したり、他の高分子と複合化しても差しつかえない
。

【００２２】本発明の細胞培養用成形物を構成する材料
としては、具体的には、ポリプロピレン、ポリエチレン
、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネイト、ポリ
ウレタン、ポリエステル、ポリアミド、ポリテトラフル
オロエチレン、ポリ塩化ビニリデン、エチレン−ビニル
アルコール共重合体、酢酸セルロース、ニトロセルロー
ス等種々の高分子や共重合体あるいはそれらの混合物を
挙げることができるが、耐酵素分解性、耐薬品性、寸法
安定性、製膜性、経済性等に優れているポリオレフィン
及び一部もしくはすべての水素がハロゲン化されたポリ
オレフィンよりなる群から選ばれた少なくとも一種のも
のを主成分としている基材が特に好ましい。

【００２３】本発明の細胞培養用成形物は、親水化処理
されていることが好ましい。親水化処理とは、ポリオレ
フィン等を主成分とする疎水性多孔質膜の表面及び細孔
表面に親水性化合物をコーティングや共有結合により保
持させ、親水性膜に改質するための処理のことであり、
方法は特に限定されないが、共有結合等により強固に基
材表面と親水性化合物とを結合させる方法が望ましい。 さらに、プラズマグラフト重合法により分子内に極性基
を有する重合性単量体よりなる親水性グラフト鎖を材料
表面に形成させる方法が好ましい。分子内に極性基を有
する重合性単量体よりなるグラフト鎖とは、メトキシエ
チルアクリレートやヒドロキシエチルメタクリレートな
どのアクリル酸エステルやメタクリル酸エステル、Ｎ，
Ｎ−ジメチルアクリルアミドやイソプロピルアクリルア
ミドなどのアクリルアミド系単量体などを構成成分とす
る親水性グラフト鎖を例示することができる。これらの
うち、アルコキシアルキルアクリレートで親水化された
膜が好ましい。

【００２４】さらに、本発明の細胞培養用成形物によっ
て培養される細胞としては、アフリカミドリザル腎細胞
（Ｖｅｒｏ細胞）、上皮細胞（９４０Ｃ３）、マウス肺
繊維芽細胞（３Ｔ３）、チャイニーズハムスター卵巣細
胞（ＣＨＯ）、チャイニーズハムスター肺繊維芽細胞（
Ｖ−７９）、ヒト子宮頸部癌細胞（ＨｅＬａ）、ヒト２
倍体繊維芽様細胞（ＷＩ−３８）などの接着依存性細胞
、リンパ球細胞、骨髄腫細胞、白血球細胞等及びこれら
の細胞と他の細胞との細胞融合によって得られたハイブ
リドーマなどの浮遊性細胞等が挙げられる。これらのう
ち、接着依存性細胞が好ましい。

【００２５】また、本発明で用いる培養においては、無
機塩類、アミノ酸類、糖類、脂肪酸類、ビタミン類、補
酵素類、核酸塩基類、ホルモン類、アルブミン、トラン
スフェリン、その他の種々の細胞の成長因子、血清中の
成分等の水溶液を培養液として用い、目的とする細胞を
通常の方法を用いて培養する。

【００２６】

【実施例】以下、実施例および比較例によって本発明を
さらに具体的に説明する。

【００２７】実施例１、２ ポリプロピレンフィルム（フィルム膜厚：６０μｍ、二
村化学株式会社製、ＦＯＰ＃６０）をチャンバーに設置
し、０．０１Ｔｏｒｒ以下に減圧した後、低温プラズマ
（アルゴン、０．１Ｔｏｒｒ）を１５秒間照射し、再び
０．０１Ｔｏｒｒ以下に減圧し、続いて、表１に示すメ
トキシエチルアクリレートなどのアルコキシアルキルア
クリレートの単量体をガス状で供給し、２８８Ｋの温度
で５分間表面グラフト重合を行った。グラフト重合後は
、未反応の単量体を減圧脱気して、０．０１Ｔｏｒｒ以
下にし、続いて、プラズマ放電処理を０．１Ｔｏｒｒ、
２０秒間（１００Ｗ）行った。このようにして得られた
膜をジクロロメタン／メタノール共沸溶媒で２日間洗浄
した後、乾燥させて、試料とした。

【００２８】各試料上でラット角化細胞を以下に示すよ
うに培養し、培養試験を行った。その培養結果を表１に
示す。

【００２９】［表皮系細胞（角化細胞）の培養試験］ラ
ット新生児皮膚から酵素処理により採取したラット角化
細胞を１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグ
ル培地（ＤＭＥ）に懸濁し、５×１０４細胞数／ｃｍ２
で各試料上に播種し、二酸化炭素雰囲気下でインキュベ
ーターにて３日間培養し、細胞数の計測および位相差顕
微鏡や走査型電子顕微鏡による観察により細胞増殖性お
よび細胞形態を（−、＋、＋＋）の３段階で評価した。

【００３０】実施例３、４ メルトフローインデックスが３０及び０．３のポリプロ
ピレン混合物（混合重量比１００：４０）１００重量部
当たり、４００重量部の流動パラフィン（数平均分子量
３２４）及び０．３重量部の結晶核形成剤としての１，
３、２，４−ビス（ｐ−エチルベンジリデン）ソルビト
ールを二軸型押出機により溶融混練し、ペレット化した
。このペレットを上記押出機を用いて１５０〜２００℃
で溶融し、スリット幅０．６ｍｍのＴダイより空気中に
押し出し、Ｔダイ直下に置かれた冷却液相のガイドロー
ラーの回転によって冷却固化液中に導き、冷却固化した
後、巻き取った。巻き取ったフィルム状物を一定長に切
断し、縦横両方向を固定し、１，１，２−トリクロロ−
１，２，２−トリフルオロエタン中に１０分間計４回浸
漬して流動パラフィンの抽出を行い、次いで１３５℃の
空気中で２分間熱処理を行って、孔径０．４５μｍ、膜
厚１２０μｍのポリプロピレン製多孔質膜を得た。この
ようにして得られた多孔質膜に低温プラズマ（アルゴン
、０．１Ｔｏｒｒ）を１５秒間照射した後、メトキシエ
チルアクリレートの単量体を実施例１、２と同様にして
ガス状で供給し、２８８Ｋの温度で所定時間表面グラフ
ト重合を行い、続いてプラズマ放電処理を行った。

【００３１】このようにして得られた多孔質膜は、ジク
ロロメタン／メタノール共沸溶媒で２日間洗浄した後、
乾燥させて試料とした。このようにして得られた試料に
ついて、実施例１、２と同様にしてラット角化細胞を用
いた培養試験を行った。その結果を表１に示す。

【００３２】実施例５ ポリフッ化ビニリデン粉末（三菱油化株式会社製、ｋｙ
ｎａｒ　　Ｋ３０１）１８重量部をアセトン７３．８重
量部及びジメチルホルムアミド８．２重量部に溶解して
なる溶液を、ポリエチレンテレフタレートフィルム上に
キャストした後、１，１，２−トリクロロトリフルオロ
エタン浴中に５分間浸漬し、乾燥して膜厚１２５μｍ、
平均孔径０．４５μｍのポリフッ化ビニリデン製多孔質
膜を得た。このようにして得られた多孔質膜に実施例１
と同様に表面グラフト重合およびプラズマ放電処理まで
の処理を行い、得られた試料について実施例１、２と同
様にしてラット角化細胞を用いた培養試験を行った。そ
の結果を表１に示す。

【００３３】比較例１〜３ 実施例１、２で使用したポリプロピレンフィルム、実施
例３、４で使用したポリプロピレン多孔質膜、実施例５
のポリフッ化ビニリデン多孔質膜について、そのまま何
等処理を加えずに、実施例１、２と同様にしてラット角
化細胞を用いた培養試験を行った。その結果を表１に示
す。

【００３４】比較例４ 実施例１、２で使用したポリプロピレンフィルムに空気
を流しながら、プラズマ放電処理を０．１Ｔｏｒｒ、２
０秒間（１００Ｗ）行った後、得られた試料について実
施例１、２と同様にしてラット角化細胞を用いた培養試
験を行った。その結果を表１に示す。

【００３５】比較例５ 実施例１、２で使用したポリプロピレン製多孔質膜を用
いて、単量体としてＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドを
用いた以外は、実施例１、２と同様に表面グラフト重合
を行い、得られた試料について実施例１、２と同様にし
てラット角化細胞を用いた培養試験を行った。その結果
を表１に示す。

【００３６】実施例６、７ グラフト重合後のプラズマ放電処理を行わなかった以外
は、実施例１、２と同様にしてプラズマグラフト重合し
たポリプロピレンフィルムを作製した。このようにして
試料について実施例１、２と同様にしてラット角化細胞
を用いた培養試験を行った。その結果を表１に示す。

【００３７】

【表１】

【００３８】

【発明の効果】以上述べたように、本発明は、材料表面
の少なくとも一部に、アルコキシアルキルアクリレート
より選ばれる一種以上の重合性単量体を構成成分として
なる重合体層を形成してなる細胞培養用成形物であるか
ら、重合体層の剥離等の悪影響を及ぼされることなく、
接着依存性細胞を大量かつ高密度に培養するのに非常に
適した細胞培養用成形物が得られる。特に、本発明の細
胞培養用成形物は、分化した機能細胞の培養に好適であ
り、人工臓器用や生物生産用等の各種の細胞培養システ
ムに組み入れるのに有効に使用することができるもので
ある。

【００３９】また、本発明の細胞培養用成形物は、耐酵
素分解性および耐薬品性に優れており、代謝産物や酵素
等による物性の経時的劣化が少なく、長期間使用可能で
ある。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　材料表面の少なくとも一部に、アルコ
   キシアルキルアクリレートより選ばれる一種以上の重合
   性単量体を構成成分としてなる重合体層を形成してなる
   細胞培養用成形物。
2. 【請求項２】　　基材となる材料が、バブルポイントが
   ０．２〜５．０ｋｇ／ｃｍ２の多孔質膜である請求項１
   に記載の細胞培養用成形物。
3. 【請求項３】　　アルコキシアルキルアクリレートより
   選ばれる一種以上の重合性単量体が、グラフト重合可能
   な重合開始点を表面の少なくとも一部に有する材料にガ
   ス状で供給され、該表面でグラフト重合されてなる請求
   項１または２に記載の細胞培養用成形物。
4. 【請求項４】　　材料表面が、プラズマ放電処理されて
   いることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載
   の細胞培養用成形物。
5. 【請求項５】　　基材となる材料が、ポリオレフィンお
   よび一部もしくはすべての水素がハロゲン化されたポリ
   オレフィンよりなる群から選ばれた少なくとも一種のも
   のを主成分とした多孔質膜であることを特徴とする請求
   項２から４のいずれかに記載の細胞培養用成形物。
6. 【請求項６】　　多孔質膜が、５分以内の濡時間を有す
   る親水性膜である請求項５に記載の細胞培養用成形物。