JPS63196285A - 細胞培養用基材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 この発明は、細胞培養用基材に関する。さらに詳細には
、動物細胞を培養するために使用される細胞培養用基材
に関するものである。

〈従来技術及び発明が解決しようとする問題点〉近年、
生物の細胞を培養し、その細胞の代謝活動により有用な
生理活性物質、例えば、ワクチン、ホルモン、インター
フェロン等を生産する研究が活発に行われている。

このような方法において、従来、接着性動物細胞の培養
は、ガラス、プラスチック製のシャーレ、試験管、培養
ビンなどを用いて行なわれてきた。

また、最近、マイクロキャリアや中空糸を培養用基材と
して用い、より高密度の培養や、長期の培養を行なう試
みがなされつつある。接着性動物細胞を培養用基材上に
接着させ、増殖させるには、基材表面と細胞の接着性が
良好であることと共に接着した細胞の形態、配列が、細
胞の伸展、増殖に有効な形態となっていることが必要で
ある。しかしながら゛、従来から細胞培養用基材として
用いられている高分子材料は賦形性、耐久性に優れるも
のの、上記接着性等の点に関して不適当であり、高密度
かつ長期間の細胞培養を行なうことができず、いずれも
十分な成果を上げるに至っていない。

この問題点を改善するため、上記高分子材料を表面処理
して親水化した細胞培養用基材、例えば、高分子材料が
オゾンで処理された組織培養用材料（特開昭５２−４１
２９１号公報参照）、低温プラズマで処理された組織培
養用担体粒子（特開昭５７−２２８９１号公報参照）や
、プラズマ重合により基体表面に薄膜を形成する細胞培
養床の製造方法（特開昭６１−５２２８１号公報参照）
が提案されている。

しかしながら、上記の従来技術により得られた細胞培養
用基材は、基材表面の活性度が低く、細胞の接着性およ
び接着した細胞の伸展性、増殖性が不十分であり、細胞
培養を高密度かつ長期に亘って行なうことができないと
いう問題点がある。

く目　的〉 この発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、細
胞の接着性、伸展および増殖に優れ、高密度かつ長期間
の細胞培養を可能ならしめる細胞培養用基材を提供する
ことを目的とする。

く問題点を解決するための手段および作用〉上記目的を
達成するためになされた、この発明の細胞培養用基材は
、高分子基材に該高分子基材と異なる高分子材料がスパ
ッタリングにより蒸着されていることを特徴とするもの
である。

なお、上記高分子基材と異なる高分子材料としては、高
分子基材が疎水性高分子の場合には親水性高分子が、高
分子基材が親水性高分子の場合には疎水性高分子を用い
るのが好ましい。また、高分子基材と異なる高分子材料
として、天然高分子材料、特に生体由来の高分子材料も
好適に用いられる。また高分子基材は、多孔性材料であ
るのが好ましい。さらに、該基材が中空糸状であるもの
が好ましい。

この発明は上記の構成よりなり、高分子基村上に、該高
分子基材と異なる高分子材料がスパッタリグ蒸着されて
いるので、高分子基材表面が親水性と高活性となり、細
胞との接着性が改良される。

特に、蒸着される高分子材料として、高分子基材が疎水
性の場合には親水性材料を、高分子基材が親水性の場合
には疎水性材料を用いたときには、蒸着量を調整するこ
とにより、親水−疎水の微細な構造を有する表面が形成
され、細胞との接着性がより高められる。すなわち、細
胞表面の細胞膜の構造は、脂質二重層の中に、膜内粒子
と呼ばれる各種の糖蛋白質、糖脂質等が分布をもって埋
めこまれており、これらが、上記脂質二重層の中を自由
に移動でき細胞の接着に関与している。上記糖蛋白質等
はその分子内に親水性基と疎水性基を有しており、微細
な親水−疎水構造が形成された表面において、上記のよ
うな糖蛋白質等の構造は、基材と細胞との結合を高める
と共に細胞が安定かつ増殖に適した配置、形態で接着す
ることができる。また、蒸着される高分子材料として、
天然高分子、特に生体由来の高分子を用いれば、生体由
来の高分子は上記膜内粒子とイオン結合、疎水結合等に
結合可能な部位を有するので細胞との親和性に優れ、細
胞との接着性を向上させることができる。

さらに、上記高分子基材が、多孔質材料であるときは、
多孔質材料の孔を通じて物質代謝が容易となり長期に亘
り細胞培養することができる。特に、前記高分子基材か
らなる基材が中空糸であるものは、中空部内や中空糸の
外側に培養液等を油流することにより、中空糸上に細胞
を高密度に育成、増殖させることができる。

以下、この発明の詳細な説明する。

この発明に用いられる高分子基材としては、賦形性、機
械的強度を有するものであればいかなるものでも使用で
き、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩素化ポ
リエチレン、アイオノマー等のオレフィン系重合体、ポ
リテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン等の
フッ素系樹脂、ポリスチレン等のスチレン系樹脂、ポリ
メチルメタクリレート等のアクリル系樹脂、ポリビニル
アルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアセクール、
ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニ
リデン、ポリカーボネート、ボリアリレート、ポリフェ
ニレンオキサイド、ポリエチレンテレフタレート、ポリ
ブチレンテレフタレート等のポリエステル樹脂、エポキ
シ樹脂、ポリアミド、ポリイミド、ポリスルホン、セル
ロース系樹脂、シリコーン樹脂、ポリウレタンなどの種
々の重合体もしくは共重合体またはそれらのブレンド物
が例示できる。

上記高分子基材は、種々の形態に形成でき、例えば、シ
ャーレ、フラスコ等の成形品の他、フィルム、チューブ
、中空糸、繊維、微粒子等の形態が例示できる。これら
の形態のうち、長期に亘り細胞培養を行なうには、物質
代謝を容易にする孔を存する多孔性高分子基材が好まし
く、また、高密度培養を行なうには、チューブ、中空糸
の形状が好適である。特に、物質代謝が容易で、高密度
培養を長期に亘り行なえる多孔質高分子基材からなる中
空糸が好ましい。この中空糸を用いるとき、培養液を、
中空糸の中空部または外側に泡流させ、必要に応じて炭
酸ガスや空気等を上記中空糸の中空部等に送ることによ
り、細胞を中空糸上で育成し、増殖することができる。

なお、前記中空糸としては、種々の大きさのものが使用
でき、例えば、内径５０〜１０００μｍ程度のものが用
いられる。

また、この発明の細胞培養用基材をマイクロキャリアー
法のビーズ担体として使用する場合には、前記高分子基
材は１００〜３００μｍ程度の粒径のものが用いられる
。

この発明の細胞培養用基材は、上記高分子基村上に、ス
パッタリングにより該高分子基材と異なる高分子材料を
蒸着することによ、り製造される。

上記において、高分子基材と異なる高分子材料、即ち高
分子基材上に蒸着される高分子材料としては、種々の合
成または天然高分子材料を用いることができる。蒸着さ
れる高分子材料として合成高分子材料を用いる場合、高
分子基材が疎水性のときには親水性材料を、高分子基材
が親水性のときには疎水性材料を用い、蒸着量を調整し
て、親水−疎水の微細な構造を有する表面を形成するの
が好ましい。上記親水性高分子材料としては、例えば、
ポリビニルアルコール、ポリアクリロニトリル、セルロ
ース繊維、ポリアミノ酸等が挙げられ、疎水性高分子材
料としては、例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ポ
リフッ化ビニリデン等が挙げられる。

また、高分子基材に蒸着させる高分子材料として、天然
高分子、特に生体由来の高分子材料を用いてもよく、こ
れらの天然高分子材料としては、例えば、コラーゲン、
ゼラチン等が挙げられる。

また、この発明におけるスパッタリング処理に使用され
る装置としては、慣用のスパッタリング装置を用いるこ
とができる。より具体的には、高分子基材を陽極、蒸着
される高分子材料（蒸着源）を陰極とし、真空槽内でグ
ロー放電を起こし、生起させた正イオンの衝撃により蒸
着源を高分子暴利に堆積させる。操作圧力としては１〜
１ｏ＝Ｔｏｒｒ程度とされ、使用されるガスとしてはア
ルゴン等の不活性ガスが用いられる。また、上記ガスに
は、窒素ガス、アンモニア等の含窒素化合物、酸素ガス
、水等の含酸素化合物などの反応性ガスを含有させても
よい。これらの反応性ガスを含有させることにより、窒
化物、酸化物等が基材表面に形成され、高分子基材と高
分子材料との接着が強固になると共に高分子基材表面の
親水性を調整することができる。なお、磁界を加えるこ
とにより、スパッタリング効率を高めてもよい。

この発明の細胞培養用基材は、種々の細胞の培養に使用
することができ、細胞の種類は特に限定されず生体由来
細胞、ハイブリドーマ−等が挙げられ、例えば、チャイ
ニーズハムスター肺由来細胞ｖ−７９、ヒト子宮癌由来
細胞ＨｅＬａ、ヒト胎児肺由来細胞ＭＲＣ−５、ヒト肝
由来細胞Ｃｈａｎｇ　Ｌｌｖｅｒ　、ヒト肺由来正二倍
体線維芽細胞ＩＲＣ−９０、ヒトリンパ腫由来ナマルバ
細胞等が例示される。

また、この発明の細胞培養用基材を用いて動物細胞を培
養する場合、培養する細胞の種類に応じて種々の培養液
が用いられ、細胞の増殖に適した至適温度、ｐＨ等の条
件で培養が行なわれる。

本発明の細胞培養用基材は、従来公知の種々のモジュー
ルにて、動物細胞の増殖に適用できる。

本発明の細胞培養基材としてフィルム状基材を用いたモ
ジュールの一例を、添付図面に基づいて説明すると以下
の通りである。

添付図面に示す細胞培養器は、サポートスクリーン（２
）上に載置されたフィルム状細胞培養用基材（１）の両
端が、ポリカーボネート等からなるハウジング（３）内
の両側に設けられたスペーサ（６）により保持されてい
る。また、上記ハウジング（３）には、増殖させる細胞
懸濁液をハウジング（３）内に満すための孔（４）が設
けられていると共に、培養液を潅流させるための管（５
）が取付られている。なお、上記孔（４）は、細菌等が
侵入するのを防止するため、フィルター付きの蓋（７）
で被冠されている。

上記の細胞培養器を用いて細胞を増殖させるには、上記
孔（４）から細胞懸濁液を注入して細胞を前記基材（１
）上に接着させると共に、前記孔（４）をフィルター付
きの上記蓋（７）で被冠し、所定の培養条件の下、上記
培養液を前記管（５）を通じて所定時間潅流させること
により行なわれる。

〈実施例〉 以下、実施例に基づいてこの発明をより詳細に説明する
。

実施例１および比較例 ポリプロピレンフィルム（厚さ１００／／ｆｆ１）を１
３．５８ＭＨｚの高周波電源を有するスパッタリング装
置の基板にセットし、酢酸セルロース（ダイセル化学■
製、アセチ）の１　ｍｍ厚さの成形品をターゲット材料
としてスパッタリング蒸着を行なった。

スパッタリングの条件はアルゴンガス５　ｃｃ／　ｍｉ
ｎ流量下、放電出力１００ｖ、処理時間５分で、基板は
水冷した。処理したフィプレムをガラスシャーレにセッ
トし、γ線滅菌後、ヒト由来子宮頚部癌細胞（Ｈｅｌａ
　　５−３）を培養した。培養液として１０重量％牛脂
児血清を含むイーグルＭＥＭ培地を用いた。培養液１１
１当たり２Ｘ１０４個の培養細胞を播種し、５％炭酸ガ
ス、９５％空気雰囲気中、温度３７℃の環境下、３日間
の培養を行なったところ、培養液１　ｘ１当たり平均２
．７Ｘ１０５個の細胞数となり、良好な増殖が観察され
た。

一方、ポリプロピレンフィルムをそのまま用いたほかは
、上記実施例と同様に試験を行なった比較例では培養液
１ν！当たり平均８．４Ｘ１０４の細胞数となった。

実施例２ 四弗化エチレン樹脂多孔質フィルム（住人電気工業■製
、フロロポアＦＰ−０２２）を実施例１で用いたのと同
じ装置にセットし、ゼラチンの１ｍｍ厚さのフィルムを
ターゲット材料としてスパッタリング蒸着を行なった。

スパッタリングの条件は、窒素ガス５　ｃｃ／　ｍｉｎ
流量下、放電出力５０Ｗ１処理時間１０分であった。処
理したフィルムを添付図面に示す細胞培養器（内径４７
ｍｍφ）に装着し、全体をエチレンオキサイドガス滅菌
し、十分に残留ガスを除いた後、孔（４）からヒト胎児
包皮由来細胞（Ｐ１ｏν　７０００）のイーグルＭＥＭ
（１０％牛脂児血清添加）懸濁液（細胞数２Ｘ１０４個
／１りを満した。孔（４）には、殺菌をカットするフィ
ルターの蓋（７）をし、管（５）を通して新鮮なイーグ
ルＭＥＭ培地を潅流し、３７℃で１週間培養を行なった
。培養終了後、フィルムに付着している細胞数を測定し
たところ、４．８Ｘ１０４個／１１！に増殖しているこ
とがわかった。

〈発明の効果〉 以上のように、この発明の細胞培養用基材によれば、高
分子基材上に該高分子基材と異なる高分子材料がスパッ
タリング蒸着されており、高分子基材表面の親水性およ
び活性が高められ、細胞培養に適した基材となる。特に
、高分子基材と蒸着される高分子材料との組み合わせを
親水性材料と疎水性材料とすることにより、高分子基材
表面に親水−疎水の微細構造を形成することができ、細
胞との接着性をより向上させることができ、さらに、蒸
着される高分子材料として、天然高分子、特に生体由来
の高分子材料を用いることにより、細胞を安定した形態
、配置で接着させることができる。上記の結果、細胞と
の接着性並びに細胞の伸展性および増殖性に優れ、高密
度かつ長期間の細胞培養が可能になるという特有の効果
を奏する。

従って、この発明の細胞培養用基材は、動物細胞の培養
によるホルモン等の有用物の生産システムに利用できる
他、例えばインスリン産生細胞を基材表面に接着、培養
することにより人工膵臓が形成できるように人工臓器の
構築に利用できる。

【図面の簡単な説明】

添付図面は本発明の細胞培養用基材を用いた細胞培養器
の一例を示す断面図である。 （１）・・・細胞培養用基材、（２）・・・サポートス
クリーン、（３）・・・ハウジング、（４）・・・孔、
（５）・・・管。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、高分子基材に、該高分子基材と異なる 高分子材料がスパッタリングにより蒸着 されていることを特徴とする細胞培養用 基材。 ２、高分子基材と異なる高分子材料が、高 分子基材が疎水性の場合には親水性高分 子であり、高分子基材が親水性の場合に は疎水性高分子である上記特許請求の範 囲第１項記載の細胞培養用基材。 ３、高分子基材と異なる高分子材料が、生 体由来の高分子材料である上記特許請求 の範囲第１項記載の細胞培養用基材。 ４、高分子基材が、多孔性材料である上記 特許請求の範囲第１項ないし第３項のい ずれかに記載の細胞培養用基材。 ５、高分子基材が、中空糸である上記特許 請求の範囲第１項ないし第４項のいずれ かに記載の細胞培養用基材。