JPH04252174A - 組織培養用成形物およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、組織培養用成形物およ
びその製造方法に関するものである。詳しく述べると、
本発明は、主に動物細胞を培養するために使用する基材
であり、良好な細胞接着性および細胞増殖性を有する組
織培養用成形物およびその製造方法に関するものである
。

【０００２】

【従来の技術】動物細胞の培養技術は、インターフェロ
ン、リンフォカイン、各種の成長ホルモンや細胞増殖因
子などの生理活性物質、および生体由来材料あるいは治
療用ワクチンなどの生産手段として欠かせぬものであり
、近年これらの物質を高効率かつ大量に生産する高密度
培養法が注目されている。

【０００３】動物細胞の培養において、特に、生存、増
殖、目的物質の生産のために人工もしくは天然の基材に
接着することが必要な「接着依存性細胞」の高密度培養
では、細胞を培養する基材表面が細胞の接着性や増殖性
の優れた表面であることが必要となってくる。また、細
胞の生存や目的物質の生産能を維持するために、細胞に
とって良好な環境を維持することが重要となり、このた
め、栄養素や酵素の供給および老廃物の除去を連続的に
行うことが必要となってくる。

【０００４】前者の基材表面への細胞接着性に関しては
、組織培養用プラスチックシャーレとして通常使用され
ているポリスチレン系材料や適度の電荷密度を有する表
面が優れていることが知られている。スチレン系化合物
の細胞接着性を利用した例としては、特開平２−１６９
７２号にスチレン−ジビニルベンゼンの架橋重合体を表
面に保持させた多孔質膜が開示されており、また、適度
な電荷密度を有する表面については、ジャーナル　　オ
ブ　　セオロジカル　　バイオロジー（Ｊ．ｏｆ　　Ｔ
ｈｅｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、第４９巻、ページ４１７〜４
２４（１９７５）：アドヘッション　　アンド　　スプ
レッディング　　オブ　　セルズ　　オン　　チャージ
ド　　サーフェセス（Ａｄｈｅｓｉｏｎ　　ａｎｄ　　
Ｓｐｒｅａｄｉｎｇ　　ｏｆＣｅｌｌｓ　　ｏｎ　　Ｃ
ｈａｒｇｅｄ　　Ｓｕｒｆａｃｅｓ．）に記載されてい
る。また、各種の高分子材料表面に低温プラズマ処理、
スパッタリング処理、紫外線処理、電子線処理、単分子
累積膜の被覆処理などの表面処理を施した材料（特公昭
５８−３２５８９、特開昭６３−１９８９７６、特開昭
６３−１９８９７７、特開平１−１５１３３など）や、
コラーゲン、フィブロネクチン、ヒドロネクチン、ラミ
ニン等の細胞接着因子や細胞増殖因子などで処理した材
料（例えば、トランスアメリカン　　ソサエティ　　オ
ブ　　アーティフィシャル　　オルガンズ（Ｔｒａｎｓ
．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ（１９８７
）、第３３巻、ページ６６、スコラリー　　レビューズ
（Ｓｃｈｏｌａｒｌｙ　　Ｒｅｖｉｅｗｓ）“セルアド
ヘッション　　ツー　　バイオマテリアルズ（Ｃｅｌｌ
　　Ａｄｈｅｓｉｏｎｔｏ　　Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ
ｓ）”）も検討されている。

【０００５】しかし、高分子材料にポリスチレンを用い
て、上記表面処理を施した場合、ポリスチレンには良好
な細胞接着性が付与されるが、物性が脆弱なため、厚さ
の薄いフィルム状物や高密度培養に適した多孔質膜に成
形することは困難であるという欠点が生じる。また、ス
チレンとジビニルベンゼンとからなる架橋重合体を表面
に保持させた膜は、スチレンに起因した良好な細胞接着
性を付与できるものの、基材表面と架橋重合体とが強固
な化学結合で結ばれていないことやスチレン架橋物の脆
弱な物性に起因した「架橋重合体層の剥離」という問題
点が生じる。

【０００６】また、基材表面をコラーゲンや細胞間マト
リックス（ＥＣＭ）、細胞接着因子などで処理すること
により肝細胞等の細胞の接着性や伸展性が向上するが、
これらの方法では使用前に無菌的にコーティング処理を
施さなければならず、そのため操作が煩雑となるという
欠点がある。また、雑菌混入の可能性が増える点からも
上記方法は好ましいとはいえない。さらに、高密度培養
による有用物質の生産を考えると、大量の膜を使用する
ため、コラーゲンや細胞接着因子の必要量が増大し、経
済的観点からも問題点を有している。

【０００７】一方、高密度培養細胞の成育環境維持につ
いては、多孔質膜を用いる方法が優れていると考えられ
ている。すなわち、多孔質平膜を積層したり中空糸を束
ねることにより限られた容積内に多くの表面積を確保で
き、さらに、生命活動に必要な物質の供給や異物の除去
を多孔質膜の微小な孔を介して連続的に拡散もしくは膜
間の圧力差により強制的に行うことによって良好な成育
環境を維持することが可能となる。特に、上皮細胞や内
皮細胞のように極性を有する細胞の場合、栄養源の吸収
や代謝が生理的条件と同様に接着基質側から行われるこ
とは、細胞にとって好ましいことである。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明は
、接着依存性細胞を大量かつ高密度に培養する場合に非
常に有効である組織培養用成形物およびその製造方法を
提供することを目的とするものである。本発明はまた、
上皮系の細胞等の分化した機能細胞の培養に好適であり
、各種の細胞培養システムに組み入れることに有効に使
用可能な組織培養用成形物およびその製造方法を提供す
ることを目的とするものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記諸目的は、材料表面
の少なくとも一部に、スチレンおよびスチレン誘導体よ
り選ばれる一種以上の重合性単量体を構成成分としてな
るグラフト鎖を有する組織培養成形物によって達成され
る。

【００１０】本発明はまた、グラフト鎖が、気相プラズ
マ表面グラフト重合法により材料表面に導入された組織
培養用成形物を示すものである。本発明はまた、材料表
面が、プラズマ放電処理されている組織培養用成形物を
示すものである。本発明のさらに、基材となる材料が、
ポリオレフィンおよび一部もしくはすべての水素がハロ
ゲン化されたポリオレフィンよりなる群から選ばれた少
なくとも一種のものを主成分とし、バブルポイントが０
．２〜５．０ｋｇ／ｃｍ２の多孔質膜である組織培養用
成形物を示すものである。本発明はさらに、多孔質膜が
、親水化処理されていることを特徴とする組織培養用成
形物を示すものである。

【００１１】本発明はまた、（１）材料表面をプラズマ
放電処理し、重合開始点を生成させる工程と、（２）重
合性単量体を含むガスに重合開始点を有する材料表面を
接触させて表面グラフト重合する工程と、（３）材料表
面に再びプラズマ放電処理を施す工程とを少なくとも一
連の真空プロセスで行うことを特徴とする組織培養用成
形物の製造方法によって達成される。

【００１２】本発明はさらに、（１）材料表面をプラズ
マ放電処理し、重合開始点を生成させる工程と、（２）
分子内に極性基を有する重合性単量体（Ｙ）を含むガス
に重合開始点を有する材料表面を接触させて表面グラフ
ト重合する工程と、（３）スチレン及びスチレン誘導体
から選ばれる一種以上の重合性単量体（Ｘ）を含むガス
中に材料表面を接触させて表面グラフト重合する工程と
、（４）材料表面に再びプラズマ放電処理を施す工程と
を少なくとも一連の真空プロセスで行うことを特徴とす
る組織培養用成形物の製造方法によって達成される。

【００１３】

【作用】本発明に係わる組織培養成形物は、材料表面の
少なくとも一部に、スチレンおよびスチレン誘導体より
選ばれる一種以上の重合性単量体を構成成分としてなる
グラフト鎖を有するものである。したがって、本発明の
組織培養成形物は、細胞接着性の優れたポリスチレンま
たはポリスチレン誘導体が表面にグラフト鎖として存在
するため、良好な細胞接着性を示すこととなる。また、
グラフト鎖として基材表面に共有結合により導入されて
いるため、コーティングや架橋剤を用いた不溶化による
被覆と異なり、ポリスチレン層が溶出したり剥離するこ
とはない。

【００１４】また、本発明の組織培養用成形物は、グラ
フト鎖が気相プラズマ表面グラフト法により材料表面に
導入されるものであると、グラフト鎖が強固に材料表面
に結合されることとなる。また、単量体がガスで供給さ
れ、真空下でグラフト重合されていると、凹凸を有する
表面や不織布、微細孔を有する組織培養用成形物などに
対してグラフト鎖が均一に導入されていることとなる。 さらに、本発明の組織培養用成形物は、スチレン（誘導
体）よりなるグラフト鎖を有する表面がプラズマ放電処
理されていると、良好な細胞接着性を発現することとな
る。

【００１５】本発明の組織培養用成形物が、基材となる
材料としてポリオレフィン及び一部もしくはすべての水
素がハロゲン化されたポリオレフィンよりなる群から選
ばれた少なくとも一種のものを主成分としているもので
あると、耐酵素分解性（耐生体分解性）、耐薬品性等に
優れた細胞培養用基材となり、代謝産物や酵素等による
物性の経時的劣化が少ない長持間使用可能な細胞培養用
基材を作製することが可能となる。また、成形物が親水
化処理されたものであると、事前に親水化処理すること
なく使用することができ、さらに、培養液が膜の孔に侵
入、通過できるようになり、膜上での高密度培養が可能
になり、好ましい。

【００１６】親水化処理が親水性グラフト鎖を膜表面に
導入したものであれば、重合体が培養液中に容易に溶出
したり剥離することがなくなり、細胞の培養環境に悪影
響を与えることがなくなる。また、親水性グラフト鎖と
して、カチオン性単量体を構成成分としたグラフト鎖を
導入することで、静電相互作用を利用して細胞を材料表
面に引き寄せたり、細胞間マトリックスの合成、分泌を
促進したりすることも可能となり、ポリスチレン（誘導
体）よりなるグラフト鎖との相乗効果により優れた細胞
接着性、細胞伸展性、細胞増殖性を発現することとなる
。電荷密度にも依存するが、一般的にカチオン性ポリマ
ーよりなる表面は細胞接着や細胞増殖を促進する傾向に
あり、特に繊維芽細胞のようにコラーゲンなどの細胞間
マトリックス（ＥＣＭ）の合成能力の高い細胞において
、ＥＣＭ合成及び増殖が促進される。しかしながら、カ
チオン性ポリマーのみをグラフト重合したポリオレフィ
ン表面では、表皮細胞などの分化した機能細胞の増殖に
おいて改良の余地が存在していた。このため、ポリスチ
レン（誘導体）よりなるグラフト鎖を材料表面に共存さ
せることにより、カチオン性ポリマー単独での問題も改
善でき、機能細胞の培養用成形物としても好適となる。 好ましいカチオン性ポリマーとしては、含窒素複素環を
分子内に有する単量体、具体的には、ビニルピリジン、
ビニルイミダゾール、ビニルカルバゾールなどが好適に
挙げられる。

【００１７】さらに、本発明の方法によると、表面処理
プロセスを一連の真空下でのドライプロセスで行うこと
が可能となり、液体を使用するプロセスと比べて工程の
維持及び管理が容易となる。さらに、単量体がガス状で
供給及びグラフト重合されるので、凹凸を有する多孔質
表面や多孔質膜内部の表面にまでグラフト鎖を導入させ
ることが可能となる。また、プラズマを有効に利用する
ことによって化学的改質が困難なポリオレフィン系成形
物の表面に安定して細胞培養用基材として好適な性質を
付与することができる。

【００１８】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１９】本発明において使用されるグラフト鎖は、
スチレン及びスチレン誘導体より選ばれる一種以上の重
合性単量体を構成成分として重合体が材料表面に化学結
合していれば良く、グラフト鎖の導入方法は特に限定さ
れないが、ジビニルベンゼン、グルタルアルデヒド、ジ
イソシアナート化合物、エポキシ化合物などの架橋剤を
用いた架橋不溶化法による表面被覆物や溶媒浸漬法によ
る被覆物は、表面グラフト鎖には含まれない。グラフト
鎖を基材表面に形成させる方法としては、材料表面に放
射線や紫外線などにより重合開始点となる高分子ラジカ
ルを生成させた後、材料表面に単量体を接触させる方法
が例示できる。これらのうちで、気相プラズマグラフト
重合法が好ましい。気相プラズマグラフト重合法とは、
１００Ｔｏｒｒ以下、好ましくは１０−２〜１０Ｔｏｒ
ｒで低圧ガスに高周波電界、マイクロ波電界または直流
電界を印加することによって低温プラズマを発生させ、
このプラズマを材料表面に１〜６００秒間、好ましくは
５〜６０秒間接触させて、重合開始点となるラジカルを
生成させた後、０．０１〜５００Ｔｏｒｒ、好ましくは
０．１〜１００Ｔｏｒｒの減圧下で重合性単量体ガスを
供給してグラフト重合を進行させる方法である。

【００２０】本発明において使用されるスチレン及びス
チレン誘導体とは、分子内にスチレン骨格を有する化合
物であり、具体的には、スチレン、α−メチルスチレン
、４−ベンゾイルスチレン、メチルスチレン、エチルス
チレン、メトキシスチレン、メトキシエチルスチレン等
が挙げられる。これらのうち、特にスチレン、メチルス
チレンが好適に使用される。

【００２１】本発明において使用されるプラズマ放電処
理とは、１００Ｔｏｒｒ以下、好ましくは１０−２〜１
０Ｔｏｒｒの低圧ガスに高周波電界、マイクロ波電界ま
たは直流電界を印加することによって低温プラズマを発
生させ、このプラズマ雰囲気やプラズマにより生成する
ラジカルやイオンなどの活性種を材料表面に１〜６００
秒間、好ましくは５〜６０秒間接触させて表面処理する
方法である。プラズマ放電処理は、酸素、空気、アルゴ
ン等の非重合性ガスやスチレン等の重合性ガスあるいは
それらの混合物などを流しながら発生させることができ
る。

【００２２】本発明の組織培養用成形物を構成する材料
は、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリメチルメタク
リレート、ポリカーボネイト、ポリウレタン、ポリエス
テル、ポリアミド、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ
塩化ビニリデン、エチレン−ビニルアルコール共重合体
等種々の高分子や共重合体あるいはそれらの混合物より
なる基材を用いることができるが、耐酵素分解性、耐薬
品性等に優れているポリオレフィン及び一部もしくはす
べての水素がハロゲン化されたポリオレフィンよりなる
群から選ばれた少なくとも一種のものを主成分としてい
る基材が特に好ましい。

【００２３】また、本発明の組織培養用成形物の形態は
、特に限定されず、例えば、シャーレ、ボトル、不織布
、織布、フィルム、フラスコ、微粒子、微多孔質膜など
が挙げられるが、好ましくは長期の細胞培養や生体に近
い状態での細胞培養に好適に使用できる形態、すなわち
、物質代謝を容易にする微小孔を有する平膜型、中空糸
型、チューブ型、不織布型などの多孔質基材が望ましい
。さらには、有用物質の回収、モジュール化、細胞成分
の保持、物質移動速度などを考慮すると、バブルポイン
トが、０．１〜５．０ｋｇ／ｃｍ２、さらに好ましくは
０．３〜２．０ｋｇ／ｃｍ２であり、膜厚が、１０〜１
０００μｍ、さらに好ましくは２０〜２００μｍであり
、空孔率が、２０〜９０％、さらに好ましくは３０〜８
０％である多孔質膜が好ましい。バブルポイントが０．
１ｋｇ／ｃｍ２未満であると、孔径が大きくなり、細胞
が孔内に入ってきてしまい好ましくない。これに対して
、バブルポイントが５．０ｋｇ／ｃｍ２を超えると、孔
径が小さくなりすぎて、膜を介しての代謝が不十分とな
ってしまう。

【００２４】本発明において、親水化処理とは、ポリオ
レフィン等を主成分とする疎水性多孔質膜の表面及び細
孔表面に親水性化合物をコーティングや共有結合により
保持させ、親水性膜に改質するための処理のことであり
、方法は特に限定されないが、共有結合等により強固に
基材表面と親水性化合物とを結合させる方法が望ましい
。さらに、プラズマグラフト重合法により分子内に極性
基を有する重合性単量体よりなる親水性グラフト鎖を材
料表面に形成させる方法が好ましい。分子内に極性基を
有する重合性単量体よりなるグラフト鎖とは、メトキシ
エチルアクリレートやヒドロキシエチルメタクリレート
などのアクリル酸エステルやメタクリル酸エステル、Ｎ
，Ｎ−ジメチルアクリルアミドやイソプロピルアクリル
アミドなどのアクリルアミド系単量体などを構成成分と
する親水性グラフト鎖を例示することができる。これら
のうち、室温で気相で供給でき、多孔質膜の物性を脆弱
化しない単量体であるメトキシエチルアクリレートなど
のアルコキシアルキルアクリレートが好ましい。

【００２５】本発明の組織培養用成形物の製造方法は、
（１）材料表面をプラズマ放電処理し、重合開始点を生
成させる工程と、（２）重合性単量体を含むガスに重合
開始点を有する材料表面を接触させて表面グラフト重合
する工程と、（３）材料表面に再びプラズマ放電処理を
施す工程とを少なくとも一連の真空プロセスで行うこと
を特徴とするものである。

【００２６】上記方法において、（１）のプラズマ放電
処理は、材料表面に重合開始点を生成させるための処理
であればよく、プラズマ雰囲気中に材料表面を直接暴露
してもよいし、プラズマにより生成したラジカルなどの
活性種を間接的に利用してもかまわない。また、（３）
のプラズマ放電処理は、表面に細胞親和性を向上させる
ために行われ、重合性ガス、非重合性ガスのどちらを使
用してもよい。

【００２７】また、本発明の組織培養用成形物の製造方
法における一連の真空プロセスとは、（１）〜（３）の
工程が減圧下で連続して行われ、途中で大気圧に戻す必
要のないプロセスである。真空度としては、好ましくは
１００Ｔｏｒｒ以下、さらに好ましくは２０Ｔｏｒｒ以
下である。また、本発明において使用される重合性単量
体は、細胞親和性を付与できかつグラフト重合可能な単
量体であれば特に限定されないが、好ましくは、スチレ
ン及びスチレン誘導体である。得られた組織培養用成形
物を洗浄したり、熱処理したりするなどの２次処理は、
真空プロセスで行う必要はない。また、（１）〜（３）
の真空プロセスは、複数回繰り返して行われてもよい。

【００２８】さらに、本発明の組織培養用成形物の製造
方法は、（１）材料表面をプラズマ放電処理し、重合開
始点を生成させる工程と、（２）分子内に極性基を有す
る重合性単量体（Ｙ）を含むガスに重合開始点を有する
材料表面を接触させて表面グラフト重合する工程と、（
３）スチレン及びスチレン誘導体から選ばれる一種以上
の重合性単量体（Ｘ）を含むガス中に材料表面を接触さ
せて表面グラフト重合する工程と、（４）材料表面に再
びプラズマ放電処理を施す工程とを少なくとも一連の真
空プロセスで行うことを特徴とするものである。

【００２９】上記方法において、（１）のプラズマ放電
処理は、材料表面に重合開始点を生成させるための処理
であり、（４）のプラズマ放電処理は、表面に細胞親和
性を向上させるために行われる。（２）の重合性単量体
（Ｙ）は、重合性単量体（Ｘ）よりなるグラフト鎖−（
Ｘ）ｎ−の有する細胞接着性を増強させる目的や別の機
能を付与する目的で使用される。具体的には、グラフト
鎖−（Ｘ）ｎ−との相乗効果により細胞接着性を向上さ
せるためには、ビニルピリジン等の上記したようなカチ
オン性を有する重合性単量体が好適に挙げられる。また
、基材が疎水性多孔質膜である際には、親水性を付与す
る目的で、メトキシエチルアクリレートなどの親水性グ
ラフト鎖を形成する上記したような分子内に極性基を有
する重合性単量体が好適に使用される。

【００３０】また、本発明の組織培養用成形物の製造方
法における一連の真空プロセスとは、（１）〜（４）の
工程が減圧下で連続して行われ、途中で大気圧に戻す必
要のないプロセスである。真空度としては、好ましくは
１００Ｔｏｒｒ以下、さらに好ましくは２０Ｔｏｒｒ以
下である。また、各プロセスは、必要に応じて複数回繰
り返されてもよいし、順序を入れ替えても構わない。ま
た、得られた組織培養用成形物を洗浄したり、熱処理す
るなどの２次処理は上記真空プロセスでは行う必要がな
い。

【００３１】また、本発明の組織培養用成形物の製造方
法において、成形物を構成する材料、形態および性状は
、上記本発明の組織培養用成形物と同様である。

【００３２】さらに、本発明の組織培養用成形物によっ
て培養される細胞としては、アフリカミドリザル腎細胞
（Ｖｅｒｏ細胞）、上皮細胞（９４０Ｃ３）、マウス肺
繊維芽細胞（３Ｔ３）、チャイニーズハムスター卵巣細
胞（ＣＨＯ）、チャイニーズハムスター肺繊維芽細胞（
Ｖ−７９）、ヒト子宮頸部癌細胞（ＨｅＬａ）、ヒト２
倍体繊維芽様細胞（ＷＩ−３８）などの接着依存性細胞
、リンパ球細胞、骨髄腫細胞、白血球細胞等及びこれら
の細胞と他の細胞との細胞融合によって得られたハイブ
リドーマなどの浮遊性細胞等が挙げられる。これらのう
ち、接着依存性細胞が好ましい。

【００３３】また、本発明で用いる培養においては、無
機塩類、アミノ酸類、糖類、脂肪酸類、ビタミン類、補
酵素類、核酸塩基類、ホルモン類、アルブミン、トラン
スフェリン、その他の種々の細胞の成長因子、血清中の
成分等の水溶液を培養液として用い、目的とする細胞を
公知の方法を用いて培養する。

【００３４】

【実施例】以下、実施例および比較例によって本発明を
さらに具体的に説明する。

【００３５】実施例１〜４ ポリプロピレンフィルム（フィルム膜厚：６０μｍ、二
村化学株式会社製、ＦＯＰ＃６０）をチャンバーに設置
し、０．０１Ｔｏｒｒ以下に減圧した後、低温プラズマ
（アルゴン、０．１Ｔｏｒｒ）を１５秒間照射し、再び
０．０１Ｔｏｒｒ以下に減圧し、続いて、表１に示すス
チレンなどの単量体をガス状で供給し、２８８Ｋの温度
で５分間表面グラフト重合を行った。実施例２〜４は、
表１に示す複数の単量体を使用して各５分間別々にグラ
フト重合を行い、共重合体よりなる合成高分子を膜表面
に保持させた。すなわち、最初の単量体をグラフト重合
した後、未反応の単量体を減圧除去し、続いて第２の単
量体をガス状で供給して、第２のグラフト鎖を成長させ
た。グラフト重合後は、未反応の単量体を減圧脱気して
、０．０１Ｔｏｒｒ以下にし、続いて、プラズマ放電処
理を０．１Ｔｏｒｒ、２０秒間（１００Ｗ）行った。 このようにして得られた膜をジクロロメタン／メタノー
ル共沸溶媒で２日間洗浄した後、乾燥させて、試料とし
た。

【００３６】各試料上でラット角化細胞を以下に示すよ
うに培養し、培養試験を行った。その培養結果を表１に
示す。

【００３７】また、ラット繊維芽細胞を用いて以下に示
すような培養実験を行った。その結果、実施例１〜４の
試料は、良好な細胞増殖性を示した。特に、ポリビニル
ピリジン塩酸塩を表面に有する試料（実施例３）は、細
胞増殖性の優れた表面であることがわかった。

【００３８】［表皮系細胞（角化細胞）の培養試験］ラ
ット新生児皮膚から酵素処理により採取したラット角化
細胞を１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグ
ル培地（ＤＭＥ）に懸濁し、５×１０４細胞数／ｃｍ２
で各試料上に播種し、二酸化炭素雰囲気下でインキュベ
ーターにて３日間培養し、細胞数の計測および位相差顕
微鏡や走査型電子顕微鏡による観察により細胞増殖性お
よび細胞形態を（−、＋、＋＋）の３段階で評価した。

【００３９】［繊維芽細胞の培養実験］ラット新生児皮
膚から酵素処理により採取したラット繊維芽細胞を１０
％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ
ＭＥ）に懸濁し、１×１０４細胞数／ｃｍ２で各試料上
に播種し、二酸化炭素雰囲気下でインキュベーターにて
３日間培養し、細胞数の計測および位相差顕微鏡や走査
型電子顕微鏡による観察により細胞増殖性を評価した。

【００４０】実施例５、６ メルトフローインデックスが３０及び０．３のポリプロ
ピレン混合物（混合重量比１００：４０）１００重量部
当たり、４００重量部の流動パラフィン（数平均分子量
３２４）及び０．３重量部の結晶核形成剤としての１，
３、２，４−ビス（ｐ−エチルベンジリデン）ソルビト
ールを二軸型押出機により溶融混練し、ペレット化した
。このペレットを上記押出機を用いて１５０〜２００℃
で溶融し、スリット幅０．６ｍｍのＴダイより空気中に
押し出し、Ｔダイ直下に置かれた冷却液相のガイドロー
ラーの回転によって冷却固化液中に導き、冷却固化した
後、巻き取った。巻き取ったフィルム状物を一定長に切
断し、縦横両方向を固定し、１，１，２−トリクロロ−
１，２，２−トリフルオロエタン中に１０分間計４回浸
漬して流動パラフィンの抽出を行い、次いで１３５℃の
空気中で２分間熱処理を行って、孔径０．４５μｍ、膜
厚１２０μｍのポリプロピレン製多孔質膜を得た。この
ようにして得られた多孔質膜に低温プラズマ（アルゴン
、０．１Ｔｏｒｒ）を１５秒間照射した後、表１に示す
スチレンなどの単量体を実施例１〜３と同様にしてガス
状で供給し、２８８Ｋの温度で所定時間表面グラフト重
合を行い、続いてプラズマ放電処理を行った。

【００４１】このようにして得られた多孔質膜は、ジク
ロロメタン／メタノール共沸溶媒で２日間洗浄した後、
乾燥させて試料とした。

【００４２】このようにして得られた試料について、実
施例１〜４と同様にしてラット角化細胞を用いた培養試
験を行った。

【００４３】その結果を表１に示す。

【００４４】実施例７ ポリフッ化ビニリデン粉末（三菱油化株式会社製、ｋｙ
ｎａｒ　　Ｋ３０１）１８重量部をアセトン７３．８重
量部及びジメチルホルムアミド８．２重量部に溶解して
なる溶液を、ポリエチレンテレフタレートフィルム上に
キャストした後、１，１，２−トリクロロトリフルオロ
エタン浴中に５分間浸漬し、乾燥して膜厚１２５μｍ、
平均孔径０．４５μｍのポリフッ化ビニリデン製多孔質
膜を得た。このようにして得られた多孔質膜に実施例２
と同様に表面グラフト重合およびプラズマ放電処理まで
の処理を行い、このようにして得られた試料について実
施例１〜４と同様にしてラット角化細胞を用いた培養試
験を行った。

【００４５】その結果を表１に示す。

【００４６】比較例１、２ 実施例１〜４で使用したポリプロピレンフィルム、実施
例５、６で使用したポリプロピレン多孔質膜について、
そのまま何等処理を加えずに、実施例１〜４と同様にし
てラット角化細胞を用いた培養試験を行った。

【００４７】その結果を表１に示す。

【００４８】比較例３ 実施例１〜４で使用したポリプロピレンフィルムに空気
を流しながら、プラズマ放電処理を０．１Ｔｏｒｒ、２
０秒間（１００Ｗ）行った後、このようにして得られた
試料について実施例１〜４と同様にしてラット角化細胞
を用いた培養試験を行った。

【００４９】その結果を表１に示す。

【００５０】実施例８、９ グラフト重合後のプラズマ放電処理を行わなかったほか
は、実施例１、２と同様にポリスチレン及びポリメトキ
シエチルアクリレートとポリスチレンをプラズマグラフ
ト重合したポリプロピレンフィルムを作製し、このよう
にして得られた試料について実施例１〜４と同様にして
ラット角化細胞を用いた培養試験を行った。

【００５１】その結果を表１に示す。

【００５２】比較例４ 実施例１〜４で使用したポリプロピレン製多孔質膜を用
いて、単量体としてＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドを
用いた以外は、実施例１〜４と同様に表面グラフト重合
を行い、このようにして得られた試料について実施例１
〜４と同様にしてラット角化細胞を用いた培養試験を行
った。

【００５３】その結果を表１に示す。

【００５４】

【表１】

【００５５】

【発明の効果】以上述べたように、本発明は、材料表面
の少なくとも一部に、スチレンおよびスチレン誘導体よ
り選ばれる一種以上の重合性単量体を構成成分としてな
るグラフト鎖を有する組織培養成形物であるから、重合
体の剥離等の悪影響を及ぼされることなく、接着依存性
細胞を大量かつ高密度に培養するのに非常に適した細胞
培養用成形物が得られる。特に、本発明の細胞培養用成
形物は、分化した機能細胞の培養に好適であり、各種の
細胞培養システムに組み入れるのに有効に使用すること
ができるものである。

【００５６】また、本発明の細胞培養用成形物は、耐酵
素分解性および耐薬品性に優れており、代謝産物や酵素
等による物性の経時的劣化が少なく、長期間使用可能で
ある。

【００５７】さらに、本発明は、（１）材料表面をプラ
ズマ放電処理し、重合開始点を生成させる工程と、（２
）重合性単量体を含むガスに重合開始点を有する材料表
面を接触させて表面グラフト重合する工程と、（３）材
料表面に再びプラズマ放電処理を施す工程とを少なくと
も一連の真空プロセスで行うことを特徴とする組織培養
用成形の製造方法であるから、表面処理プロセスを一連
の真空下でドライプロセスとして行なうことが可能とな
り、工程の維持及び管理を容易とすることができる。ま
た、本発明の組織培養用成形物の製造方法は、凹凸を有
する多孔質表面や多孔質膜内部の表面にまでグラフト鎖
を導入することが可能である。さらに、本発明の組織培
養用成形物の製造方法は、プラズマを有効に利用するこ
とによって、化学的改質が困難なポリオレフィン系成形
物の表面に安定して細胞培養基材として好適な性質を付
与することができるものである。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　材料表面の少なくとも一部に、スチレ
   ンおよびスチレン誘導体より選ばれる一種以上の重合性
   単量体を構成成分としてなるグラフト鎖を有する組織培
   養成形物。
2. 【請求項２】　　グラフト鎖が、気相プラズマ表面グラ
   フト重合法により材料表面に導入されたものである請求
   項１に記載の組織培養用成形物。
3. 【請求項３】　　材料表面が、プラズマ放電処理されて
   いることを特徴とする請求項１または２に記載の組織培
   養用成形物。
4. 【請求項４】　　基材となる材料が、ポリオレフィンお
   よび一部もしくはすべての水素がハロゲン化されたポリ
   オレフィンよりなる群から選ばれた少なくとも一種のも
   のを主成分とし、バブルポイントが０．２〜５．０ｋｇ
   ／ｃｍ２の多孔質膜であることを特徴とする請求項１〜
   ３のいずれかに記載の組織培養用成形物。
5. 【請求項５】　　多孔質膜が、親水化処理されているこ
   とを特徴とする請求項４に記載の組織培養用成形物。
6. 【請求項６】　　（１）材料表面をプラズマ放電処理し
   、重合開始点を生成させる工程と、（２）重合性単量体
   を含むガスに重合開始点を有する材料表面を接触させて
   表面グラフト重合する工程と、（３）材料表面に再びプ
   ラズマ放電処理を施す工程とを少なくとも一連の真空プ
   ロセスで行うことを特徴とする組織培養用成形物の製造
   方法。
7. 【請求項７】　　（１）材料表面をプラズマ放電処理し
   、重合開始点を生成させる工程と、（２）分子内に極性
   基を有する重合性単量体（Ｙ）を含むガスに重合開始点
   を有する材料表面を接触させて表面グラフト重合する工
   程と、（３）スチレン及びスチレン誘導体から選ばれる
   一種以上の重合性単量体（Ｘ）を含むガス中に材料表面
   を接触させて表面グラフト重合する工程と、（４）材料
   表面に再びプラズマ放電処理を施す工程とを少なくとも
   一連の真空プロセスで行うことを特徴とする組織培養用
   成形物の製造方法。