JPS63198981A - 細胞培養用基材 - Google Patents
細胞培養用基材Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
この発明は、細胞培養用基材に関する。さらに詳細には
、動物細胞を培養するために使用される細胞培養用基材
に関するものである。
、動物細胞を培養するために使用される細胞培養用基材
に関するものである。
〈従来技術及び発明が解決しようとする問題点〉近年、
生物の細胞を培養し、その細胞の代謝活動により有用な
生理活性物質、例えば、ワクチン、ホルモン、インター
フェロン等を生産する研究が活発に行われている。
生物の細胞を培養し、その細胞の代謝活動により有用な
生理活性物質、例えば、ワクチン、ホルモン、インター
フェロン等を生産する研究が活発に行われている。
このような方法において、従来、接着性動物細胞の培養
は、ガラス、プラスチック製のシャーレ、試験管、培養
−ビンなどを用いて行なわれてきた。
は、ガラス、プラスチック製のシャーレ、試験管、培養
−ビンなどを用いて行なわれてきた。
また、最近、マイクロキャリアや中空糸を培養用基材と
して用い、より高密度の培養や、長期の培養を行なう試
みがなされつつある。接着性動物細胞を培養用基材上に
接着させ、増殖させるには、該基材表面と細胞の接着性
が良好であることと共に接着した細胞の形態、配列が、
細胞の伸展、増殖に有効な形態になっていることが必要
である。
して用い、より高密度の培養や、長期の培養を行なう試
みがなされつつある。接着性動物細胞を培養用基材上に
接着させ、増殖させるには、該基材表面と細胞の接着性
が良好であることと共に接着した細胞の形態、配列が、
細胞の伸展、増殖に有効な形態になっていることが必要
である。
しかしながら、従来から細胞培養用基材として用いられ
ている高分子材料は賦形性、耐久性に優れるものの、上
記接着性等の点に関して不適当であり、高密度かつ長期
間の細胞培養を行なうことができず、いずれも十分な成
果を上げるに至っていない。
ている高分子材料は賦形性、耐久性に優れるものの、上
記接着性等の点に関して不適当であり、高密度かつ長期
間の細胞培養を行なうことができず、いずれも十分な成
果を上げるに至っていない。
この点を改善するため、生体高分子であるコラーゲンや
その変性物であるゼラチンを高分子材料上に塗布したも
の(特開昭58−71884号公報参照)や、高分子材
料上に可溶性フィブロインの架橋体が積層された細胞培
養床(特開昭81−52280号公報参照)が提案され
ている。
その変性物であるゼラチンを高分子材料上に塗布したも
の(特開昭58−71884号公報参照)や、高分子材
料上に可溶性フィブロインの架橋体が積層された細胞培
養床(特開昭81−52280号公報参照)が提案され
ている。
しかしながら、上記の従来技術は、高分子基材への糖や
蛋白質などの固定化が十分でなく容易に脱離してしまう
だけでなく、糖蛋白質として1種類しか用いていないの
で、細胞の接着性並びに接着した細胞の伸展性、増殖性
および活性維持が未だ十分でない。また、上記従来の細
胞培養用基材は、いずれも基材全面に糖蛋白質がコーテ
ィングされているので、物質代謝も円滑に行なえない。
蛋白質などの固定化が十分でなく容易に脱離してしまう
だけでなく、糖蛋白質として1種類しか用いていないの
で、細胞の接着性並びに接着した細胞の伸展性、増殖性
および活性維持が未だ十分でない。また、上記従来の細
胞培養用基材は、いずれも基材全面に糖蛋白質がコーテ
ィングされているので、物質代謝も円滑に行なえない。
従って、上記従来の技術では、高密度、長期間の細胞培
養ができないという問題点がある。
養ができないという問題点がある。
く目 的〉
この発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、細
胞との接着性に優れ、細胞の増殖と機能維持を行うこと
のでき、高密度、長期間の細胞培養を可能ならしめる細
胞培養用基材を提供することを目的とする。
胞との接着性に優れ、細胞の増殖と機能維持を行うこと
のでき、高密度、長期間の細胞培養を可能ならしめる細
胞培養用基材を提供することを目的とする。
く問題点を解決するための手段および作用〉上記の問題
点を解決すべくなされた、この発明の細胞培養用基材は
、高分子基材の表面上に、糖、蛋白質、脂質およびそれ
らの複合化合物(以下、これらを糖蛋白質等と称する)
から選ばれた少なくとも2種類の化合物が一定の配列を
もって担持されていることを特徴とするものである。
点を解決すべくなされた、この発明の細胞培養用基材は
、高分子基材の表面上に、糖、蛋白質、脂質およびそれ
らの複合化合物(以下、これらを糖蛋白質等と称する)
から選ばれた少なくとも2種類の化合物が一定の配列を
もって担持されていることを特徴とするものである。
なお、高分子基材は、物理的または化学的に表面処理さ
れているものが好ましい。さらには、高分子基材は多孔
性のものや、中空糸であるものが好ましい。さらには、
少なくとも2種の糖蛋白質等が、平面的または立体的に
一定の配列をもって積層されているものが好ましい。
れているものが好ましい。さらには、高分子基材は多孔
性のものや、中空糸であるものが好ましい。さらには、
少なくとも2種の糖蛋白質等が、平面的または立体的に
一定の配列をもって積層されているものが好ましい。
この発明は上記の構成よりなり、高分子基材の表面上に
、糖蛋白質等から選ばれた少なくとも2種類の・糖蛋白
質等が担持されているので、糖蛋白質等の配列状態に対
応して、細胞が安定した形態、配置で接着することがで
き、接着した細胞の伸展、増殖を増大させることができ
る。すなわち、細胞表面の細胞膜の構造は、脂質二重層
の中に、膜内粒子と呼ばれる各種の糖蛋白質、糖脂質等
が分布をもって埋めこまれており、これらが、上記脂質
二重層の中を自由に移動でき細胞の接着に関与している
が、上記少なくとも2種類の糖蛋白質等が高分子基材に
一定の配列をもって担持されているので、配列された糖
蛋白質等の区画に対応して、膜内粒子は、糖蛋白質等の
結合可能な部位にイオン結合、疎水結合等により結合し
、細胞との接着性が高まると共に細胞を安定した形態、
配置で保持することができる。従って、本発明の細胞培
養用基材は、細胞の安定な接着を促すと共に接着した細
胞の良好な伸展および増殖を可能にすることができる。
、糖蛋白質等から選ばれた少なくとも2種類の・糖蛋白
質等が担持されているので、糖蛋白質等の配列状態に対
応して、細胞が安定した形態、配置で接着することがで
き、接着した細胞の伸展、増殖を増大させることができ
る。すなわち、細胞表面の細胞膜の構造は、脂質二重層
の中に、膜内粒子と呼ばれる各種の糖蛋白質、糖脂質等
が分布をもって埋めこまれており、これらが、上記脂質
二重層の中を自由に移動でき細胞の接着に関与している
が、上記少なくとも2種類の糖蛋白質等が高分子基材に
一定の配列をもって担持されているので、配列された糖
蛋白質等の区画に対応して、膜内粒子は、糖蛋白質等の
結合可能な部位にイオン結合、疎水結合等により結合し
、細胞との接着性が高まると共に細胞を安定した形態、
配置で保持することができる。従って、本発明の細胞培
養用基材は、細胞の安定な接着を促すと共に接着した細
胞の良好な伸展および増殖を可能にすることができる。
また、少なくとも2種の糖蛋白質等が平面的に一定の配
列をもって積層されているものは、積層された糖蛋白質
等の区画に対応した位置に、細胞を接着させることがで
き、細胞の接告位置を制御した状態で、より一層安定か
つ円滑に細胞の伸展、増殖を行なうことができる。また
、上記少なくとも2種の糖蛋白質等が立体的に一定の配
列をもって、すなわち、一定の間隔をもって凹凸状に積
層されたものは、細胞の接着をさらに安定化させた状態
で細胞の伸展、増殖を行なうことができるだけでなく、
物質代謝をも円滑に行なうことができる。すなわち、2
種以上の糖蛋白質を平面的および/または立体的に積層
することにより、接着する細胞の位置を、細胞の伸展、
増殖に有利な状態に調整でき、細胞が所定の間隔をもっ
て接着するので、細胞との接着がさらに安定化し、細胞
の伸展、増殖をより一層増大させることができる。
列をもって積層されているものは、積層された糖蛋白質
等の区画に対応した位置に、細胞を接着させることがで
き、細胞の接告位置を制御した状態で、より一層安定か
つ円滑に細胞の伸展、増殖を行なうことができる。また
、上記少なくとも2種の糖蛋白質等が立体的に一定の配
列をもって、すなわち、一定の間隔をもって凹凸状に積
層されたものは、細胞の接着をさらに安定化させた状態
で細胞の伸展、増殖を行なうことができるだけでなく、
物質代謝をも円滑に行なうことができる。すなわち、2
種以上の糖蛋白質を平面的および/または立体的に積層
することにより、接着する細胞の位置を、細胞の伸展、
増殖に有利な状態に調整でき、細胞が所定の間隔をもっ
て接着するので、細胞との接着がさらに安定化し、細胞
の伸展、増殖をより一層増大させることができる。
また、高分子基材が、物理的または化学的に表面処理さ
れているものにあっては、基材と糖蛋白質等との接着性
を強固なものにすることができ、基材からの糖蛋白質等
の脱落を防止できると共に、接着した細胞の伸展、増殖
を安定化して行なうことができる。
れているものにあっては、基材と糖蛋白質等との接着性
を強固なものにすることができ、基材からの糖蛋白質等
の脱落を防止できると共に、接着した細胞の伸展、増殖
を安定化して行なうことができる。
また、上記高分子基材が、多孔性であるときは、孔を通
じて物質代謝が容易となり長期に亘り細胞培養すること
ができる。特に、前記高分子基材が中空糸であるものは
、中空部内や中空糸の外側に培養液等を潅流することに
より、中空糸上に細胞を高密度に育成、増殖させること
ができる。
じて物質代謝が容易となり長期に亘り細胞培養すること
ができる。特に、前記高分子基材が中空糸であるものは
、中空部内や中空糸の外側に培養液等を潅流することに
より、中空糸上に細胞を高密度に育成、増殖させること
ができる。
以下、この発明をより詳細に説明する。
この発明の細胞培養用基材は、高分子基材の表面上に、
糖蛋白質等の少なくとも2種類の化合物が担持された構
造を有する。
糖蛋白質等の少なくとも2種類の化合物が担持された構
造を有する。
上記高分子基材の材料としては、賦形性、機械的強度を
有するものであればいかなるものでも使用でき、例えば
、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩素化ポリエチレン
、アイオノマー等のオレフィン系重合体、ポリテトラフ
ルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン等のフッ素系樹
脂、ポリスチレン等のスチレン系樹、脂、ポリメチルメ
タクリレート等のアクリル系樹脂、ポリビニルアルコー
ル、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアセタール、ポリアク
リロニトリル、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、
ポリカーボネート、ボリアリレート、ポリフェニレンオ
キサイド、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレン
テレフタレート等のポリエステル樹脂、エポキシ樹脂、
ポリアミド、ポリイミド、ポリスルホン、セルロース系
樹脂、シリコーン樹脂、ポリウレタンなどの種々の重合
体もしくは共重合体またはそれらのブレンド物が例示で
きる。
有するものであればいかなるものでも使用でき、例えば
、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩素化ポリエチレン
、アイオノマー等のオレフィン系重合体、ポリテトラフ
ルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン等のフッ素系樹
脂、ポリスチレン等のスチレン系樹、脂、ポリメチルメ
タクリレート等のアクリル系樹脂、ポリビニルアルコー
ル、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアセタール、ポリアク
リロニトリル、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、
ポリカーボネート、ボリアリレート、ポリフェニレンオ
キサイド、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレン
テレフタレート等のポリエステル樹脂、エポキシ樹脂、
ポリアミド、ポリイミド、ポリスルホン、セルロース系
樹脂、シリコーン樹脂、ポリウレタンなどの種々の重合
体もしくは共重合体またはそれらのブレンド物が例示で
きる。
上記高分子材料からなる基材は、種々の形態に形成でき
、例えば、シャーレ、フラスコ等の成形品の他、フィル
ム、チューブ、中空糸、繊維、微粒子等の形態が例示で
きる。これらの形態のうち、長期に亘り細胞培養を行な
うには、物質代謝を容易にする孔を有する多孔質高分子
基材が好ましく、また、高密度培養を行なうには、チュ
ーブ、中空糸の形状が好適である。特に、物質代謝が容
易で、高密度培養を長期に亘り行なえる多孔質高分子基
材からなる中空糸が好ましい。この中空糸を用いるとき
、培養液を、中空糸の中空部または外側に潅流させ、必
要に応じて炭酸ガスや空気等を上記中空糸の中空部等に
送ることにより、細胞を中空糸上で育成し、増殖させる
ことができる。なお、前記中空糸としては、種々の大き
さのものが使用でき、例えば、内径50〜100077
1程度のものが用いられる。
、例えば、シャーレ、フラスコ等の成形品の他、フィル
ム、チューブ、中空糸、繊維、微粒子等の形態が例示で
きる。これらの形態のうち、長期に亘り細胞培養を行な
うには、物質代謝を容易にする孔を有する多孔質高分子
基材が好ましく、また、高密度培養を行なうには、チュ
ーブ、中空糸の形状が好適である。特に、物質代謝が容
易で、高密度培養を長期に亘り行なえる多孔質高分子基
材からなる中空糸が好ましい。この中空糸を用いるとき
、培養液を、中空糸の中空部または外側に潅流させ、必
要に応じて炭酸ガスや空気等を上記中空糸の中空部等に
送ることにより、細胞を中空糸上で育成し、増殖させる
ことができる。なお、前記中空糸としては、種々の大き
さのものが使用でき、例えば、内径50〜100077
1程度のものが用いられる。
また、この発明の細胞培養用基材をマイクロキャリアー
法のビーズ担体として使用する場合には、前記高分子基
材は100〜300μ麿程度の粒径のものが用いられる
。
法のビーズ担体として使用する場合には、前記高分子基
材は100〜300μ麿程度の粒径のものが用いられる
。
また、上記高分子基材は、糖蛋白質等との接着性を高め
るため、物理的または化学的に表面処理されているもの
が好ましい。
るため、物理的または化学的に表面処理されているもの
が好ましい。
上記基材の表面処理は、糖蛋白質等との接着性を高める
ものであればいかなる処理であってもよいが、プラズマ
、スパッタリング、紫外線、電子線、γ線、イオン、オ
ゾン処理または化学処理が好ましい。上記高分子基材の
表面をプラズマ、スパッタリング、紫外線、電子線、γ
線、イオン、オゾン処理または化学処理する方法は、い
ずれも慣用の手段が用いられる。これらの表面処理によ
り、高分子基材表面にカルボキシ基、カルボニル基、ヒ
ドロパーオキシド基等の官能基が導入されると共に多数
のラジカルサイトが残り、活性の高い表面が形成され、
試薬との反応性が高まり化学処理により多くの官能基を
導入することができる。
ものであればいかなる処理であってもよいが、プラズマ
、スパッタリング、紫外線、電子線、γ線、イオン、オ
ゾン処理または化学処理が好ましい。上記高分子基材の
表面をプラズマ、スパッタリング、紫外線、電子線、γ
線、イオン、オゾン処理または化学処理する方法は、い
ずれも慣用の手段が用いられる。これらの表面処理によ
り、高分子基材表面にカルボキシ基、カルボニル基、ヒ
ドロパーオキシド基等の官能基が導入されると共に多数
のラジカルサイトが残り、活性の高い表面が形成され、
試薬との反応性が高まり化学処理により多くの官能基を
導入することができる。
上記処理において、プラズマ処理には慣用のプラズマ装
置が用いられ、例えば、ペルジャーにより構成される反
応容器内に対向する一対の電極を設け、その電極間に高
分子基材を保持した後、電極間に交流電源を接続して、
これにより電極間にプラズマを発生させ、このプラズマ
を高分子基材の表面に作用させる方法等が挙げられる。
置が用いられ、例えば、ペルジャーにより構成される反
応容器内に対向する一対の電極を設け、その電極間に高
分子基材を保持した後、電極間に交流電源を接続して、
これにより電極間にプラズマを発生させ、このプラズマ
を高分子基材の表面に作用させる方法等が挙げられる。
スパッタリング処理には、慣用のスパッタリング装置が
用いられ、高分子基材は、真空槽内の陰極の近傍に配設
され、グロー放電により励起された正イオンは高分子基
材に衝突し、その運動エネルギーで基材表面が物理的に
改質される。さらに、雰囲気ガス中に、含酸素化合物(
例えば、酸素ガス、水等)、含窒素化合物(例えば、窒
素ガス、アンモニア等)のような反応しやすいガスを含
む場合には、上記スパッタリングにより活性化された表
面と反応し、酸化物、窒化物等が基材表面に導入され、
基材表面の親水性を一層高めることができる。
用いられ、高分子基材は、真空槽内の陰極の近傍に配設
され、グロー放電により励起された正イオンは高分子基
材に衝突し、その運動エネルギーで基材表面が物理的に
改質される。さらに、雰囲気ガス中に、含酸素化合物(
例えば、酸素ガス、水等)、含窒素化合物(例えば、窒
素ガス、アンモニア等)のような反応しやすいガスを含
む場合には、上記スパッタリングにより活性化された表
面と反応し、酸化物、窒化物等が基材表面に導入され、
基材表面の親水性を一層高めることができる。
紫外線処理に使用される紫外線としては、高分子材料の
表面で化学反応を生じさせる波長のものが使用され、紫
外線のうち、200n1未満の遠紫外線は、光エネルギ
ーが大きいため、より効率的に処理することができる。
表面で化学反応を生じさせる波長のものが使用され、紫
外線のうち、200n1未満の遠紫外線は、光エネルギ
ーが大きいため、より効率的に処理することができる。
なお、上記紫外線を放射する光源としては、クセノンア
ーク、メタルハライドランプなども使用できるが、大面
積の処理が可能な水銀灯やコヒーレントで微細加工が可
能なレーザが好適に用いられる。上記水銀灯としては、
380naの波長が主である高圧水銀灯、253.7n
mおよび184.9no+の波長の光を同時に放射する
低圧水銀灯が例示できる。
ーク、メタルハライドランプなども使用できるが、大面
積の処理が可能な水銀灯やコヒーレントで微細加工が可
能なレーザが好適に用いられる。上記水銀灯としては、
380naの波長が主である高圧水銀灯、253.7n
mおよび184.9no+の波長の光を同時に放射する
低圧水銀灯が例示できる。
また、レーザとしては、Ars He−Cd、、N2等
のレーザの他に、短波長と高出力の光を放射するエキシ
マレーザが利用できる。エキシマレーザは、短時間に高
いエネルギーを基材に与え、基材を化学的および物理的
に大きく改質できるため、好適に用いられる。上記紫外
線による処理は、紫外線を種々の雰囲気中で所望の高分
子基材の表面に照射することにより行なわれる。例えば
、空気中で紫外線を照射すると、高分子基材の表面にカ
ルボニル基が生成する他、ヒドロペルオキシド基や過酸
基も生じる。
のレーザの他に、短波長と高出力の光を放射するエキシ
マレーザが利用できる。エキシマレーザは、短時間に高
いエネルギーを基材に与え、基材を化学的および物理的
に大きく改質できるため、好適に用いられる。上記紫外
線による処理は、紫外線を種々の雰囲気中で所望の高分
子基材の表面に照射することにより行なわれる。例えば
、空気中で紫外線を照射すると、高分子基材の表面にカ
ルボニル基が生成する他、ヒドロペルオキシド基や過酸
基も生じる。
電子線処理における電子線源としては、各種の電子線加
速機、コックロフトワルソン型、バンプグラフ型、共振
変圧器型等が使用でき、また照射線量としては、所望す
る表面処理、改質の程度に応じて、例えば、1〜50
M rad程度のものが用いられる。
速機、コックロフトワルソン型、バンプグラフ型、共振
変圧器型等が使用でき、また照射線量としては、所望す
る表面処理、改質の程度に応じて、例えば、1〜50
M rad程度のものが用いられる。
γ線照射処理に用いられる線源としては、一般にコバル
ト60が利用される。照射線量は特に限定されず、基材
の種類、活性化させる程度等により適宜選択される。
ト60が利用される。照射線量は特に限定されず、基材
の種類、活性化させる程度等により適宜選択される。
イオン処理は、慣用のイオンビーム照射装置が用いられ
、イオンシャワーにより試料全体に照射される他、マス
クや集束イオンビームの採用により、部分的、微細模様
に照射される。イオンとしては、各種のイオンを用いる
ことができ、特に限定されないが、He ” 、A r
十% C” 、N十等のイオンを例示することができ
る。また、好適なイオンエネルギニの値としては0.0
5kev〜500Keyが挙げられ、この値未満では効
果が小さく、またこの値を越えると基材の炭化が顕著に
進み好ましくない。
、イオンシャワーにより試料全体に照射される他、マス
クや集束イオンビームの採用により、部分的、微細模様
に照射される。イオンとしては、各種のイオンを用いる
ことができ、特に限定されないが、He ” 、A r
十% C” 、N十等のイオンを例示することができ
る。また、好適なイオンエネルギニの値としては0.0
5kev〜500Keyが挙げられ、この値未満では効
果が小さく、またこの値を越えると基材の炭化が顕著に
進み好ましくない。
オゾン処理する方法は、慣用の方法が用いられ、例えば
、高分子基材が配設された反応容器内に、オゾン発生装
置により発生させたオゾン(、必要に応じて、アルゴン
等の不活性ガスとの混合ガスとして)を導入することに
より行われる。所望に応じて、加圧条件下に行なっても
よく、また有機溶媒等を用いてもよい。反応容器中のオ
ゾンの濃度は、通常0.2〜10容量%、好ましくは0
.3〜3容量%とされ、反応は通常室温で行われる。
、高分子基材が配設された反応容器内に、オゾン発生装
置により発生させたオゾン(、必要に応じて、アルゴン
等の不活性ガスとの混合ガスとして)を導入することに
より行われる。所望に応じて、加圧条件下に行なっても
よく、また有機溶媒等を用いてもよい。反応容器中のオ
ゾンの濃度は、通常0.2〜10容量%、好ましくは0
.3〜3容量%とされ、反応は通常室温で行われる。
オゾン処理した後、通常の方法に従って、水洗、乾燥さ
れる。
れる。
化学処理は、上記基材に無機またはを機試薬を作用させ
て行われ、作用させる試薬の種類により、またはその後
の処理により、種々の官能基、例えば、カルボニル基、
カルボキシ基、スルホ基、ニトロ基、アミノ基、チオー
ル基、水酸基等を基材表面に導入することができる。
て行われ、作用させる試薬の種類により、またはその後
の処理により、種々の官能基、例えば、カルボニル基、
カルボキシ基、スルホ基、ニトロ基、アミノ基、チオー
ル基、水酸基等を基材表面に導入することができる。
上記化学処理は高分子基材の化学構造に応じて適宜選択
されるが、例えば、クロム酸、過酸、過酸化水素、過ヨ
ウ素酸、硝酸等の酸化剤で処理することにより、カルボ
ニル基、ヒドロパーオキシド基、アルデヒド基等が導入
される。さらに、これらの官能基は酸化または還元する
ことにより、カルボキシ基、水酸基等に変換することが
できる。
されるが、例えば、クロム酸、過酸、過酸化水素、過ヨ
ウ素酸、硝酸等の酸化剤で処理することにより、カルボ
ニル基、ヒドロパーオキシド基、アルデヒド基等が導入
される。さらに、これらの官能基は酸化または還元する
ことにより、カルボキシ基、水酸基等に変換することが
できる。
また、クロルスルホン酸、発煙硫酸等のスルホン化剤を
作用させることによりスルホ基を導入することができ、
発煙硝酸、濃硝酸、硝酸と硫酸混合酸等のニトロ化剤を
作用させることによりニトロ基を導入することができ、
該ニトロ基は還元することによりアミノ基に変換するこ
とができる。さらに、ハロゲン含有ポリマーにあっては
、ジチオカーバメート誘導体と反応させた後、加水分解
してチオール基を導入することもできる。
作用させることによりスルホ基を導入することができ、
発煙硝酸、濃硝酸、硝酸と硫酸混合酸等のニトロ化剤を
作用させることによりニトロ基を導入することができ、
該ニトロ基は還元することによりアミノ基に変換するこ
とができる。さらに、ハロゲン含有ポリマーにあっては
、ジチオカーバメート誘導体と反応させた後、加水分解
してチオール基を導入することもできる。
なお、化学処理は、上記の例に限定されるものではなく
、いわゆる高分子反応として、高分子と無機または有機
の低分子化合物との反応として知られている全ての反応
が適用できる。
、いわゆる高分子反応として、高分子と無機または有機
の低分子化合物との反応として知られている全ての反応
が適用できる。
また、上記種々の表面処理は、2以上組合せて行なって
もよい。
もよい。
上記処理の内、紫外線、電子線およびイオン処理の場合
には、高分子基材表面の全面に均一な処理のみならず、
部分的に微細模様に処理することも可能で、このように
微細模様に処理された表面に化学処理を行うことで、微
細模様に沿って多くの官能基が導入された表面を形成す
ることができ、糖蛋白質等ひいては細胞の接着性をより
高めることができる。
には、高分子基材表面の全面に均一な処理のみならず、
部分的に微細模様に処理することも可能で、このように
微細模様に処理された表面に化学処理を行うことで、微
細模様に沿って多くの官能基が導入された表面を形成す
ることができ、糖蛋白質等ひいては細胞の接着性をより
高めることができる。
上記の高分子基材の表面には、細胞の接着位置を制御し
、接着した細胞の伸展、増殖を高めるため、少なくとも
2種の糖蛋白質等が担持されている。ここで用いる糖蛋
白質等は、細胞と親和性があり、基材と細胞の接着を促
進するものであればいずれも用いることができ、例えば
、ラクトース、ガラクトース等のオリゴ糖、アルブミン
、インスリン等の蛋白質、リン脂質等の脂質、グロボシ
ド、ガングリオシド等の糖と脂質との複合体である糖脂
質、細胞質や血清中に含まれる脂質と蛋白質との複合体
であるリポ蛋白質、糖と蛋白質との複合体である糖蛋白
質等が挙げられる。特に、オリゴ糖、コラーゲン、ゼラ
チン、フィブロネクチン、ラミニン、コンドロネクチン
、ビトロネクチン、フィブリン等の糖蛋白質は、高分子
基材と細胞との接着を促進するので好ましい。また、ア
ルブミンやインスリン等の蛋白質は、細胞の増殖促進に
有用である。上記糖蛋白質等は、所望する細胞の接着性
等に応じて、適宜組合せて選択することができるが、上
記オリゴ糖等の糖蛋白質と、アルブミン等の蛋白質とを
組合せたものが好ましく、この場合には、細胞の接着性
、伸展、増殖を促進し、長期に亘り高密度で細胞培養す
ることができる。
、接着した細胞の伸展、増殖を高めるため、少なくとも
2種の糖蛋白質等が担持されている。ここで用いる糖蛋
白質等は、細胞と親和性があり、基材と細胞の接着を促
進するものであればいずれも用いることができ、例えば
、ラクトース、ガラクトース等のオリゴ糖、アルブミン
、インスリン等の蛋白質、リン脂質等の脂質、グロボシ
ド、ガングリオシド等の糖と脂質との複合体である糖脂
質、細胞質や血清中に含まれる脂質と蛋白質との複合体
であるリポ蛋白質、糖と蛋白質との複合体である糖蛋白
質等が挙げられる。特に、オリゴ糖、コラーゲン、ゼラ
チン、フィブロネクチン、ラミニン、コンドロネクチン
、ビトロネクチン、フィブリン等の糖蛋白質は、高分子
基材と細胞との接着を促進するので好ましい。また、ア
ルブミンやインスリン等の蛋白質は、細胞の増殖促進に
有用である。上記糖蛋白質等は、所望する細胞の接着性
等に応じて、適宜組合せて選択することができるが、上
記オリゴ糖等の糖蛋白質と、アルブミン等の蛋白質とを
組合せたものが好ましく、この場合には、細胞の接着性
、伸展、増殖を促進し、長期に亘り高密度で細胞培養す
ることができる。
これらの糖蛋白質等は、細胞の接着位置を制御するだけ
でなく、細胞の接着を安定化させるため、一定の配列を
もって担持されている。特に、上記糖蛋白質等の配列、
担持状態は、細胞の接着をより一層安定化させ、細胞の
伸展、増殖に有利な形態で細胞培養を行なうため、平面
的および/または立体的に一定の配列をもって糖蛋白質
等が前記基材に積層、担持されているのが好ましい。上
記少なくとも2種の糖蛋白質等が平面的に一定の配列を
もって積層、担持されているものは、異なる区画に糖蛋
白質等を積層、担持することにより、上記区画に、細胞
が安定に接着し、細胞の伸展、増殖に有利な状態で細胞
培養することができる。
でなく、細胞の接着を安定化させるため、一定の配列を
もって担持されている。特に、上記糖蛋白質等の配列、
担持状態は、細胞の接着をより一層安定化させ、細胞の
伸展、増殖に有利な形態で細胞培養を行なうため、平面
的および/または立体的に一定の配列をもって糖蛋白質
等が前記基材に積層、担持されているのが好ましい。上
記少なくとも2種の糖蛋白質等が平面的に一定の配列を
もって積層、担持されているものは、異なる区画に糖蛋
白質等を積層、担持することにより、上記区画に、細胞
が安定に接着し、細胞の伸展、増殖に有利な状態で細胞
培養することができる。
また、立体的に一定の配列をもって積層、担持されてい
るものは、より一層細胞を安定に接着させることができ
、物質代謝も円滑に行なえる。さらには、上記平面的な
積層、担持と立体的な積層、担持とを複合的に組合せる
こともできる。従って、上記のように2種以上の糖蛋白
質等を一定の配列をもって積層、担持することにより、
細胞の接着をより一層安定化させ、かつ細胞の伸展、増
殖に有利な形態で物質代謝を高めつつ細胞培養を行なう
ことができるので、長期に亘り高密度の細胞培養が可能
となる。
るものは、より一層細胞を安定に接着させることができ
、物質代謝も円滑に行なえる。さらには、上記平面的な
積層、担持と立体的な積層、担持とを複合的に組合せる
こともできる。従って、上記のように2種以上の糖蛋白
質等を一定の配列をもって積層、担持することにより、
細胞の接着をより一層安定化させ、かつ細胞の伸展、増
殖に有利な形態で物質代謝を高めつつ細胞培養を行なう
ことができるので、長期に亘り高密度の細胞培養が可能
となる。
基材上に糖蛋白質等を担持する方法は、従来の技術がい
ずれも応用できる。例えば、2種類以上の糖蛋白質等を
平面的に一定の配列をもって積層するには、スクリーン
印刷等の技術を応用して、基材に糖蛋白質等を積層した
後、積層箇所をずらして他の糖蛋白質等を順次積層すれ
ばよく、また、2FIi類以上の糖蛋白質等を立体的に
一定の配列をもって積層するには、前記基材に糖蛋白質
等の溶液を塗布した後、上記スクリーン印刷等の技術を
利用して他の糖蛋白質等を積層すればよい。なお、上記
糖蛋白質等の溶液を乾燥させる際、糖蛋白質等が変性し
にくい条件で乾燥するのが好ましい。
ずれも応用できる。例えば、2種類以上の糖蛋白質等を
平面的に一定の配列をもって積層するには、スクリーン
印刷等の技術を応用して、基材に糖蛋白質等を積層した
後、積層箇所をずらして他の糖蛋白質等を順次積層すれ
ばよく、また、2FIi類以上の糖蛋白質等を立体的に
一定の配列をもって積層するには、前記基材に糖蛋白質
等の溶液を塗布した後、上記スクリーン印刷等の技術を
利用して他の糖蛋白質等を積層すればよい。なお、上記
糖蛋白質等の溶液を乾燥させる際、糖蛋白質等が変性し
にくい条件で乾燥するのが好ましい。
この発明の細胞培養用基材は、種々の細胞の培養に使用
することができ、細胞の種類は特に限定されず生体由来
細胞、ハイブリドーマ−等が挙げられ、例えば、チャイ
ニーズハムスター肺由来細胞v−79、ヒト子宮癌由来
細胞HeLa、ヒト胎児肺由来細胞MRC−5、ヒト肝
由来細胞Chang Liver sヒト肺由来正二倍
体線維芽細胞I RC−90、ヒトリンパ腫由来ナマル
バ細胞等が例示される。
することができ、細胞の種類は特に限定されず生体由来
細胞、ハイブリドーマ−等が挙げられ、例えば、チャイ
ニーズハムスター肺由来細胞v−79、ヒト子宮癌由来
細胞HeLa、ヒト胎児肺由来細胞MRC−5、ヒト肝
由来細胞Chang Liver sヒト肺由来正二倍
体線維芽細胞I RC−90、ヒトリンパ腫由来ナマル
バ細胞等が例示される。
また、この発明の細胞培養用基材を用いて動物細胞を培
養する場合、培養する細胞の種類に応じて種々の培養液
が用いられ、細胞の増殖に適した至適温度、pH等の条
件で培養が行なわれる。
養する場合、培養する細胞の種類に応じて種々の培養液
が用いられ、細胞の増殖に適した至適温度、pH等の条
件で培養が行なわれる。
本発明の細胞培養用基材は、従来公知の種々のモジュー
ルにて、動物細胞の増殖に適用できる。
ルにて、動物細胞の増殖に適用できる。
本発明の細胞培養基材としてフィルム状基材を用いたモ
ジュールの一例を、添付図面に基づいて説明すると以下
の通りである。
ジュールの一例を、添付図面に基づいて説明すると以下
の通りである。
添付図面に示す細胞培養器は、サポートスクリーン(2
)上に載置されたフィルム状細胞培養用基材(1)の両
端が、ポリカーボネート等からなるハウジングG)内の
両側に設けられたスペーサ(6)により保持されている
。また、上記ハウジング口)には、増殖させる細胞懸濁
液をハウジング(3)内に満すための孔(4)が設けら
れていると共に、培養液を潅流させるための管(5)が
取付られている。なお、上記孔(4)は、細菌等が侵入
するのを防止するため、フィルタ付きの蓋(7)で被冠
されている。
)上に載置されたフィルム状細胞培養用基材(1)の両
端が、ポリカーボネート等からなるハウジングG)内の
両側に設けられたスペーサ(6)により保持されている
。また、上記ハウジング口)には、増殖させる細胞懸濁
液をハウジング(3)内に満すための孔(4)が設けら
れていると共に、培養液を潅流させるための管(5)が
取付られている。なお、上記孔(4)は、細菌等が侵入
するのを防止するため、フィルタ付きの蓋(7)で被冠
されている。
上記の細胞培養器を用いて細胞を増殖させるには、上記
孔(4)から細胞懸濁液を注入して細胞を前記基材(1
)上に接着させると共に、前記孔(4)をフィルタ付き
の上記蓋(7)で被冠し、所定の培養条件の下、上記培
養液を前記管(5)を通じて所定時間潅流させることに
より行なわれる。
孔(4)から細胞懸濁液を注入して細胞を前記基材(1
)上に接着させると共に、前記孔(4)をフィルタ付き
の上記蓋(7)で被冠し、所定の培養条件の下、上記培
養液を前記管(5)を通じて所定時間潅流させることに
より行なわれる。
〈実施例〉
以下、実施例に基づいてこの発明をより詳細に説明する
。
。
実施例1および比較例
ポリスルホン(UCC社製、U d e I P17
00)の厚さ50μ膳のフィルムを45m+aφの円形
に打抜き、高圧蒸気滅菌後、無菌のコラーゲン溶液(タ
イプl、濃度0.3%)に1分間浸し、ひき上げて、室
温で乾燥した。このフィルムにメタルスクリーンを用い
て、無菌のフィブロネクチン溶液(シグマ社製、牛血清
より採血)のトリス緩衝溶液(濃度0.2’に/11)
テ塗布幅4077m、未塗布幅40μ層の縞模様を形
成し、乾燥させた。これらの操作は、全て無菌的に行な
った。これを滅菌済みの45mmφガラスシャーレにセ
ットし、ヒト由来子宮頚部癌細胞(HelaS−3)を
培養した。
00)の厚さ50μ膳のフィルムを45m+aφの円形
に打抜き、高圧蒸気滅菌後、無菌のコラーゲン溶液(タ
イプl、濃度0.3%)に1分間浸し、ひき上げて、室
温で乾燥した。このフィルムにメタルスクリーンを用い
て、無菌のフィブロネクチン溶液(シグマ社製、牛血清
より採血)のトリス緩衝溶液(濃度0.2’に/11)
テ塗布幅4077m、未塗布幅40μ層の縞模様を形
成し、乾燥させた。これらの操作は、全て無菌的に行な
った。これを滅菌済みの45mmφガラスシャーレにセ
ットし、ヒト由来子宮頚部癌細胞(HelaS−3)を
培養した。
培養液は、10%牛脂児血清を含むイーグルMEM培地
で、培養液1 wl当たり平均2X104個の培養細胞
を播種し、5%炭酸ガス、95%空気雰囲気、温度37
℃の環境下、3日間の培養を行なったところ、培養液1
111当たり平均4X105個の細胞数となり、良好な
増殖が観察された。
で、培養液1 wl当たり平均2X104個の培養細胞
を播種し、5%炭酸ガス、95%空気雰囲気、温度37
℃の環境下、3日間の培養を行なったところ、培養液1
111当たり平均4X105個の細胞数となり、良好な
増殖が観察された。
一方、ポリスルホンフィルムをそのまま用いた他は、本
実施例と同様に試験を行なった比較例では、培養液11
1!当たり平均1.2X105個の細胞数となった。
実施例と同様に試験を行なった比較例では、培養液11
1!当たり平均1.2X105個の細胞数となった。
実施例2
四弗化エチレン樹脂多孔質フィルム(住友電気工業■製
、フロロポアFP−022)を13.58 MHzの高
周波電源を有するペルジャー型プラズマ装置にセットし
、アンモニアガスを10cc/分で流しながら、放電出
力too w、圧力0.25Torrs処理時間15分
の条件でプラズマ処理した。処理したフィルムに高圧蒸
気滅菌後、メタルスクリーンを用いて無菌のコラーゲン
溶液(タイプ■、濃度0.3%)で塗布幅40μm、未
塗布幅40μ思の縞模様を形成し、乾燥させた。ついで
、メタルスクリーンの位置をずらし、コラーゲンの未塗
布部分に、無菌のラミニン(ベセスダ・リサーチ社製)
50μg/厭のトリス緩衝液を塗布し、乾燥させ、コラ
ーゲンとラミニンが40−の間隔で並ぶパターンの形成
された複合膜を得た。これらの操作は全て無菌的に行な
った。この複合膜を添付図面に示す滅菌済みの細胞培養
器に装着し、0.05%コラ−ゲナーゼ液流法により、
調整したラット分離肝細胞4X105個を培養液に懸濁
し、孔(4)より注入した。このときの培養液は、ウィ
リアムス培地Eに5%の仔牛血清とインスリン10μg
/ν!、Glucagonl Ou g / xl、D
examethasqne 100μg/l!を加えた
ものである。孔(4)には、細菌をカットするフィルタ
ー付きの蓋のをし、管(5)を通して、新鮮な培養液を
潅流し、37℃で10日間の培養を行なった。培養後の
状態を位相差顕微鏡で観察すると、細胞のクラスターが
形成されており、良好な接着と伸展が確認できた。
、フロロポアFP−022)を13.58 MHzの高
周波電源を有するペルジャー型プラズマ装置にセットし
、アンモニアガスを10cc/分で流しながら、放電出
力too w、圧力0.25Torrs処理時間15分
の条件でプラズマ処理した。処理したフィルムに高圧蒸
気滅菌後、メタルスクリーンを用いて無菌のコラーゲン
溶液(タイプ■、濃度0.3%)で塗布幅40μm、未
塗布幅40μ思の縞模様を形成し、乾燥させた。ついで
、メタルスクリーンの位置をずらし、コラーゲンの未塗
布部分に、無菌のラミニン(ベセスダ・リサーチ社製)
50μg/厭のトリス緩衝液を塗布し、乾燥させ、コラ
ーゲンとラミニンが40−の間隔で並ぶパターンの形成
された複合膜を得た。これらの操作は全て無菌的に行な
った。この複合膜を添付図面に示す滅菌済みの細胞培養
器に装着し、0.05%コラ−ゲナーゼ液流法により、
調整したラット分離肝細胞4X105個を培養液に懸濁
し、孔(4)より注入した。このときの培養液は、ウィ
リアムス培地Eに5%の仔牛血清とインスリン10μg
/ν!、Glucagonl Ou g / xl、D
examethasqne 100μg/l!を加えた
ものである。孔(4)には、細菌をカットするフィルタ
ー付きの蓋のをし、管(5)を通して、新鮮な培養液を
潅流し、37℃で10日間の培養を行なった。培養後の
状態を位相差顕微鏡で観察すると、細胞のクラスターが
形成されており、良好な接着と伸展が確認できた。
〈発明の効果〉
以上のように、この発明の細胞培養用基材によれば、高
分子基材の表面上に、少なくとも2種の糖蛋白質等が担
持されているので、細胞の接着位置を制御し、細胞の伸
展、増殖にを利な形態で細胞培養を行なうことができる
。また、糖蛋白質等は、細胞との親和性に優れ、細胞と
の接着性を高めることかできると共に細胞を伸展、増殖
に適した形態、配列で接着させることができるので、高
密度かつ長期間の細胞培養が可能になるという特をの効
果を奏する。従って、この発明の細胞培養用基材は、動
物細胞の培養によるホルモン等の有用物の生産システム
に利用できる他、例えばインスリン産生細胞を基材表面
に接着、培養することにより人工膵臓が形成できるよう
に人工臓器の構築に利用できる。
分子基材の表面上に、少なくとも2種の糖蛋白質等が担
持されているので、細胞の接着位置を制御し、細胞の伸
展、増殖にを利な形態で細胞培養を行なうことができる
。また、糖蛋白質等は、細胞との親和性に優れ、細胞と
の接着性を高めることかできると共に細胞を伸展、増殖
に適した形態、配列で接着させることができるので、高
密度かつ長期間の細胞培養が可能になるという特をの効
果を奏する。従って、この発明の細胞培養用基材は、動
物細胞の培養によるホルモン等の有用物の生産システム
に利用できる他、例えばインスリン産生細胞を基材表面
に接着、培養することにより人工膵臓が形成できるよう
に人工臓器の構築に利用できる。
図は本発明の細胞培養用基材を用いた細胞培養器の一例
を示す断面図である。 (1)・・・細胞培養用基材、(2)・・・サポートス
クリーン、(3)・・・ハウジング、(4)・・・孔、
(5)・・・管。 特許出願人 住友電気工業株式会社 (ばか3名)
を示す断面図である。 (1)・・・細胞培養用基材、(2)・・・サポートス
クリーン、(3)・・・ハウジング、(4)・・・孔、
(5)・・・管。 特許出願人 住友電気工業株式会社 (ばか3名)
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、高分子基材の表面上に、糖、蛋白質、 脂質およびそれらの複合化合物から選ば れた少なくとも2種類の化合物が一定の 配列をもって担持されていることを特徴 とする細胞培養用基材。 2、高分子基材が、物理的または化学的に 表面処理されている上記特許請求の範囲 第1項記載の細胞培養用基材。 3、高分子基材が多孔性である上記特許請 求の範囲第1項または第2項記載の細胞 培養用基材。 4、高分子基材が中空糸である上記特許請 求の範囲第1項ないし第3項のいずれか に記載の細胞培養用基材。 5、糖、蛋白質、脂質およびそれらの複合 化合物が、平面的に一定の配列をもって 積層されている上記特許請求の範囲第1 項記載の細胞培養用基材。 6、糖、蛋白質、脂質およびそれらの複合 化合物が、立体的に一定の配列をもって 積層されている上記特許請求の範囲第1 項記載の細胞培養用基材。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3223387A JPS63198981A (ja) | 1987-02-13 | 1987-02-13 | 細胞培養用基材 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3223387A JPS63198981A (ja) | 1987-02-13 | 1987-02-13 | 細胞培養用基材 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63198981A true JPS63198981A (ja) | 1988-08-17 |
Family
ID=12353259
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3223387A Pending JPS63198981A (ja) | 1987-02-13 | 1987-02-13 | 細胞培養用基材 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS63198981A (ja) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH02308790A (ja) * | 1989-05-25 | 1990-12-21 | Bio Material Kenkyusho:Kk | 細胞培養方法 |
US5162225A (en) * | 1989-03-17 | 1992-11-10 | The Dow Chemical Company | Growth of cells in hollow fibers in an agitated vessel |
JPH11243948A (ja) * | 1998-03-02 | 1999-09-14 | Natl Inst Of Sericultural & Entomological Science | 動物細胞増殖用の細胞培養床基材及びその調製方法 |
JP2001120255A (ja) * | 1999-10-25 | 2001-05-08 | Able Corp | 三次元動物細胞培養装置及び培養方法 |
JP2005036106A (ja) * | 2003-07-15 | 2005-02-10 | New Industry Research Organization | 細胞接着材料 |
-
1987
- 1987-02-13 JP JP3223387A patent/JPS63198981A/ja active Pending
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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