JPH02308790A - 細胞培養方法 - Google Patents
細胞培養方法Info
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- JPH02308790A JPH02308790A JP1130212A JP13021289A JPH02308790A JP H02308790 A JPH02308790 A JP H02308790A JP 1130212 A JP1130212 A JP 1130212A JP 13021289 A JP13021289 A JP 13021289A JP H02308790 A JPH02308790 A JP H02308790A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は、細胞培養方法に関する。さらに詳細には、細
胞の機能を高レベルで安定に維持しながら高密度に培養
する方法に関する。
胞の機能を高レベルで安定に維持しながら高密度に培養
する方法に関する。
(従来技術および発明が解決しようとする問題点)近年
、動物の細胞を生体外で培養しその機能を利用して人工
臓器として使用する研究や、サイトカイン、モノクロー
ナル抗体、インターフェロン等のような有用物質を生産
する研究が活発に行われている。
、動物の細胞を生体外で培養しその機能を利用して人工
臓器として使用する研究や、サイトカイン、モノクロー
ナル抗体、インターフェロン等のような有用物質を生産
する研究が活発に行われている。
このような研究においては細胞の機能を高レベルで安定
に保持して培養することが重要であり、従来より生体蛋
白質であるコラーゲンやゼラチンを培養床にコートした
り(特開昭58−71884号公報参照)、物理的化学
的手法を用いて培養床を処理する試み(特開昭52−4
1291号公報参照)等がなされてきた。
に保持して培養することが重要であり、従来より生体蛋
白質であるコラーゲンやゼラチンを培養床にコートした
り(特開昭58−71884号公報参照)、物理的化学
的手法を用いて培養床を処理する試み(特開昭52−4
1291号公報参照)等がなされてきた。
また、最近になって細胞を高密度に培養するために合成
および生体高分子をマイクロキャリアや中空系の形状に
加工しこれを培養床とした培養も行われている(特公昭
54−6434号公報、特開昭61−25476号公報
参照)。
および生体高分子をマイクロキャリアや中空系の形状に
加工しこれを培養床とした培養も行われている(特公昭
54−6434号公報、特開昭61−25476号公報
参照)。
このように、細胞を生体外で培養するための培養技術に
関しては、数多くの研究、開発例が報告されているが、
従来、これらの培養に供する細胞を単離する場合、−m
に、生体をトリプシンやコラゲナーゼ等の酵素を用いて
処理するため、播種時における細胞表面の損傷が大きく
、また培養中に細胞間相互作用が円滑に行えないため、
特に初代培養系の細胞を培養する場合には、前記培養技
術を用いても基材に接着した後、即座に細胞機能が失わ
れるという問題点があった。
関しては、数多くの研究、開発例が報告されているが、
従来、これらの培養に供する細胞を単離する場合、−m
に、生体をトリプシンやコラゲナーゼ等の酵素を用いて
処理するため、播種時における細胞表面の損傷が大きく
、また培養中に細胞間相互作用が円滑に行えないため、
特に初代培養系の細胞を培養する場合には、前記培養技
術を用いても基材に接着した後、即座に細胞機能が失わ
れるという問題点があった。
本発明は、このような技術的費景に鑑みてなされたもの
であり、生体細胞の機能を高レベルで安定に保持させた
形で細胞を高密度に培養する新規培養方法を提供するこ
とを目的とするものである。
であり、生体細胞の機能を高レベルで安定に保持させた
形で細胞を高密度に培養する新規培養方法を提供するこ
とを目的とするものである。
(問題点を解決するための手段)
上院の問題点を解決すべくなされた本発明の細胞培養方
法は、単離した細胞を予め細胞保護作用を有する単独又
は複数種の水溶性高分子物質と接触させた後、3次元的
集合体として培養することを特徴とするものである。
法は、単離した細胞を予め細胞保護作用を有する単独又
は複数種の水溶性高分子物質と接触させた後、3次元的
集合体として培養することを特徴とするものである。
尚、水溶性高分子としては、好適には、少な(ともコラ
ーゲンやラミニン等を含有するものが使用される。また
細胞は如何なる種類のものでよいが、例えば肝実質細胞
などのような初代培養系のものを利用することも可能で
ある。3次元的集合体の作成方法としては、遠心操作や
圧力を利用して適宜実施される。
ーゲンやラミニン等を含有するものが使用される。また
細胞は如何なる種類のものでよいが、例えば肝実質細胞
などのような初代培養系のものを利用することも可能で
ある。3次元的集合体の作成方法としては、遠心操作や
圧力を利用して適宜実施される。
本発明の細胞培養方法によれば、単離時に受けた細胞の
損傷を回復した状態で播種が行なえる上、培養中に細胞
相互作用が円滑に行われるため細胞機能を高いレベルで
、長期にわたり維持することができる。特に生体内で高
密度に存在している初代培養系の細胞は、単離する時に
大きな損傷を受けるため本発明の細胞培養法は培養後の
高機能発現に極めて有効である。
損傷を回復した状態で播種が行なえる上、培養中に細胞
相互作用が円滑に行われるため細胞機能を高いレベルで
、長期にわたり維持することができる。特に生体内で高
密度に存在している初代培養系の細胞は、単離する時に
大きな損傷を受けるため本発明の細胞培養法は培養後の
高機能発現に極めて有効である。
本発明で用いる水溶性高分子としてはコラーゲンの他に
ラミニンなどのような細胞物質を一部に用いる事により
一層大きな効果を奏する。そして、細胞を処理後遠心操
作や圧力を利用した手法を用いて人為的に集合体を形成
させ、多孔性基材等の適宜の基材上で培養することによ
り、細胞間相互作用が円滑に行えるようになり生体外で
の高機能発現が可能となる。
ラミニンなどのような細胞物質を一部に用いる事により
一層大きな効果を奏する。そして、細胞を処理後遠心操
作や圧力を利用した手法を用いて人為的に集合体を形成
させ、多孔性基材等の適宜の基材上で培養することによ
り、細胞間相互作用が円滑に行えるようになり生体外で
の高機能発現が可能となる。
例えば、極めて多くの機能を有する肝細胞は、単離後コ
ラーゲンとラミニンを含む溶液と接触させ細胞集合体と
して培養することにより初めて生体内と同様のレベルで
の機能発現が可能となることが判明した。
ラーゲンとラミニンを含む溶液と接触させ細胞集合体と
して培養することにより初めて生体内と同様のレベルで
の機能発現が可能となることが判明した。
以下に、本発明の構成をさらに詳細に説明する。
本発明の細胞培養方法は酵素処理等により単離した細胞
を細胞保護作用を有する単独又は複数種の水溶性高分子
と接触させた後、3次元的集合体として培養することを
特徴とするものである。
を細胞保護作用を有する単独又は複数種の水溶性高分子
と接触させた後、3次元的集合体として培養することを
特徴とするものである。
本発明で用いる水溶性高分子物質としては、好適には細
胞の保護作用を有するメチルセルロース、ポリビニルと
ロリドン、カルボキシメチルセルロース等の人工材料、
各種増殖因子やホルモン、ゼラチン、アルブミンやフィ
ブリノーゲンをはじめとする血清蒼白質、フィブロネク
チン、コラーゲン、ラミニン等の細胞間勧賞、ヘパリン
、コンドロイチン硫酸等の多糖類のような生体由来高分
子物質等が利用される。これらは単独で利用しても複数
種組合せて利用することもできるが特に、コラーゲンや
ラミニン等のような細胞間勧賞を少なくとも一部に利用
すると一層大きな効果が得られる。
胞の保護作用を有するメチルセルロース、ポリビニルと
ロリドン、カルボキシメチルセルロース等の人工材料、
各種増殖因子やホルモン、ゼラチン、アルブミンやフィ
ブリノーゲンをはじめとする血清蒼白質、フィブロネク
チン、コラーゲン、ラミニン等の細胞間勧賞、ヘパリン
、コンドロイチン硫酸等の多糖類のような生体由来高分
子物質等が利用される。これらは単独で利用しても複数
種組合せて利用することもできるが特に、コラーゲンや
ラミニン等のような細胞間勧賞を少なくとも一部に利用
すると一層大きな効果が得られる。
細胞をこれらの水溶性高分子物質と接触させるには、水
溶性高分子物質を培養液や生理的緩衝液に適当な濃度で
溶解させたものに細胞を懸濁させて一定時間インキユベ
ートする事などにより容易に達成されるが、例えば水溶
性高分子としてコラーゲンを選択した場合は、培養中に
細胞周辺でゲルが形成されるように0.1%以上の濃度
に調整するのが望ましい。
溶性高分子物質を培養液や生理的緩衝液に適当な濃度で
溶解させたものに細胞を懸濁させて一定時間インキユベ
ートする事などにより容易に達成されるが、例えば水溶
性高分子としてコラーゲンを選択した場合は、培養中に
細胞周辺でゲルが形成されるように0.1%以上の濃度
に調整するのが望ましい。
細胞を上記水溶性高分子溶液とインキュベートする条件
は特に限定されないが、コラーゲンを0.1%以上の濃
度で利用する場合には細胞の接触処理中に溶液がゲル化
しないよう0−4℃で接触させる配慮が必要である。
は特に限定されないが、コラーゲンを0.1%以上の濃
度で利用する場合には細胞の接触処理中に溶液がゲル化
しないよう0−4℃で接触させる配慮が必要である。
また、本発明で用いる細胞集合体は、細胞の自己集合能
を利用してそれをそのまま使用してもよいが細胞懸濁液
を遠心操作もしくは圧力をかけることにより人為的に容
易に作成することができる。
を利用してそれをそのまま使用してもよいが細胞懸濁液
を遠心操作もしくは圧力をかけることにより人為的に容
易に作成することができる。
遠心操作を利用する場合の回転数および時間は細胞の大
きさ等により適宜選択されるが好ましくは300rpm
ないし2000rpmで1分ないし10分、さらに好ま
しくは600rpmないし1500rpmで2分ないし
6分である。また、圧力を利用する場合は、細胞懸濁液
を透過性基材上に播種した後、該基材上から加圧もしく
は該基材下から吸引することにより実施される。
きさ等により適宜選択されるが好ましくは300rpm
ないし2000rpmで1分ないし10分、さらに好ま
しくは600rpmないし1500rpmで2分ないし
6分である。また、圧力を利用する場合は、細胞懸濁液
を透過性基材上に播種した後、該基材上から加圧もしく
は該基材下から吸引することにより実施される。
細胞集合体を構成する細胞は、如何なるものであっても
よく必要に応じて自由に選択できるが、特に肝実質細胞
をはじめとする初代培養系のものが好適に利用される。
よく必要に応じて自由に選択できるが、特に肝実質細胞
をはじめとする初代培養系のものが好適に利用される。
さらに、この細胞集合体は1種類の細胞で構成してもよ
いが2種類以上の細胞を用いて構成してもよい。
いが2種類以上の細胞を用いて構成してもよい。
本発明により動物細胞を培養する場合、培養する細胞の
種類に応じて種々の培養液が用いられ細胞の機能維持に
適した温度、酸素分圧等の条件で培養が行われることは
いうまでもない。
種類に応じて種々の培養液が用いられ細胞の機能維持に
適した温度、酸素分圧等の条件で培養が行われることは
いうまでもない。
以下、実施例にもとづき本発明を説明する。
(実施例)
実施例1および比較例1
コラゲナーゼ潅流法および遠心分離によって単離したマ
ウス肝実質細胞を0.1%のコラーゲン溶液中(P H
7,0イ一グルMEM培地に溶かしたもの)および、0
.1%コラーゲン、20/jg/fluラミニンを含む
溶液中で4℃で10分間懸濁させた後101000rp
分の遠心操作を行い、細胞の集合体を得た。上清を瘤棄
してこの集合体中に含まれる生細胞数をカウントすると
1μβ当り3.8X10’個であった。この細胞集合体
をコラーゲンコートした多孔性ポリカーボネーl−MC
孔径8μm)の上にのせ(細胞数0.625xlO’個
)血清、各種増殖因子を含まないウィリアムスE培地に
膜ごと浮かべて培養したところアルブミンの分泌は図1
で示すように2週間生体内に近いレベルで安定して維持
された。また、圧力を利用して細胞集合体を形成させた
時も同様であった。
ウス肝実質細胞を0.1%のコラーゲン溶液中(P H
7,0イ一グルMEM培地に溶かしたもの)および、0
.1%コラーゲン、20/jg/fluラミニンを含む
溶液中で4℃で10分間懸濁させた後101000rp
分の遠心操作を行い、細胞の集合体を得た。上清を瘤棄
してこの集合体中に含まれる生細胞数をカウントすると
1μβ当り3.8X10’個であった。この細胞集合体
をコラーゲンコートした多孔性ポリカーボネーl−MC
孔径8μm)の上にのせ(細胞数0.625xlO’個
)血清、各種増殖因子を含まないウィリアムスE培地に
膜ごと浮かべて培養したところアルブミンの分泌は図1
で示すように2週間生体内に近いレベルで安定して維持
された。また、圧力を利用して細胞集合体を形成させた
時も同様であった。
一方、同数の細胞をコラーゲン溶液で前処理せずに集合
体を形成させて培養したところ、安定に機能の維持が見
られたが生体内の場合と比べるとかなり近い値であった
。また、同数の細胞を前処理せずにコラーゲンコートし
た培養皿で培養した従来の培養法では数日で機能が低下
した。
体を形成させて培養したところ、安定に機能の維持が見
られたが生体内の場合と比べるとかなり近い値であった
。また、同数の細胞を前処理せずにコラーゲンコートし
た培養皿で培養した従来の培養法では数日で機能が低下
した。
(実施例2)
単離したマウス肝実′MIlI胞を、種々の濃度のコラ
ーゲン溶液(P)f7.0イ一グルMEM培地に溶かし
たもの)中で4℃、10分間懸濁させた後実施例1と同
様の培養を行い一1日あたりに分泌されるアルブミン量
を壇養後1日目と78目に調査した。細胞と接触させる
溶液中のコラーゲンの濃度を0.1%以上にすると図2
に示されるように培養肝細胞の機能が高いレベルで維持
されることが判明した。
ーゲン溶液(P)f7.0イ一グルMEM培地に溶かし
たもの)中で4℃、10分間懸濁させた後実施例1と同
様の培養を行い一1日あたりに分泌されるアルブミン量
を壇養後1日目と78目に調査した。細胞と接触させる
溶液中のコラーゲンの濃度を0.1%以上にすると図2
に示されるように培養肝細胞の機能が高いレベルで維持
されることが判明した。
(発明の効果)
以上のように、本発明の細胞培養方法によれば細胞の単
離時に受けた細胞のダメージを速やかに回復させる事が
可能となるので高レベルで細胞機能を安定させたまま細
胞を培養できる効果がある。
離時に受けた細胞のダメージを速やかに回復させる事が
可能となるので高レベルで細胞機能を安定させたまま細
胞を培養できる効果がある。
さらに、この方法を用いて特に高い機能を有する初代培
養系の細胞を培養することにより、有用物質の高能率生
産システムとして利用できるだけでなく、例えば人工肝
臓のような人工臓器としても応用できるという特有の効
果が得られる利点がある。
養系の細胞を培養することにより、有用物質の高能率生
産システムとして利用できるだけでなく、例えば人工肝
臓のような人工臓器としても応用できるという特有の効
果が得られる利点がある。
第1図は、実施例および比較例における培養肝細胞10
’個の1日あたりのアルブミン分泌量を示すグラフであ
る。 第2図は、実施例2における培養肝細胞10’個の1日
あたりのアルブミン分泌量を培養1日後と7日後にコラ
ーゲン濃度を変化させて調査した場合のグラフである。
’個の1日あたりのアルブミン分泌量を示すグラフであ
る。 第2図は、実施例2における培養肝細胞10’個の1日
あたりのアルブミン分泌量を培養1日後と7日後にコラ
ーゲン濃度を変化させて調査した場合のグラフである。
Claims (9)
- (1)単離した細胞を予め細胞保護作用を有する単独又
は複数種の水溶性高分子物質と接触させた後3次元的集
合体を形成させて培養することを特徴とする細胞培養方
法。 - (2)水溶性高分子物質の少なくとも一部がコラーゲン
を含むことを特徴とする特許請求の範囲第一項記載の細
胞培養方法。 - (3)コラーゲンが0.1%以上の濃度で含まれること
を特徴とする特許請求の範囲第二項記載の細胞培養方法
。 - (4)水溶性高分子物質の少なくとも一部がラミニンを
含むことを特徴とする特許請求の範囲第一項ないし三項
記載の細胞培養方法。 - (5)細胞の少なくとも一部が初代培養系のものである
ことを特徴とする特許請求の範囲第一項ないし四項記載
の細胞培養方法。 - (6)細胞の少なくとも一部が肝実質細胞を含むことを
特徴とする特許請求の範囲第一項ないし五項記載の細胞
培養方法。 - (7)細胞の3次元的な集合体が、細胞懸濁液を遠心操
作することにより形成させたものであることを特徴とす
る特許請求の範囲第一項ないし第六項記載の細胞培養方
法。 - (8)細胞の3次元的な集合体が、細胞懸濁液を透過性
基材上に播種した後該基材上から加圧もしくは該基材下
から吸引することにより形成させたものであることを特
徴とする特許請求の範囲第一項ないし第六項記載の細胞
培養方法。 - (9)水溶性高分子物質が、メチルセルロース、ポリビ
ニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、ゼラチ
ン、血精蛋白質、コラーゲン、ラミニンから選択される
一種又は複数種であることを特徴とする特許請求の範囲
一項ないし第八項記載の細胞培養方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1130212A JP2824081B2 (ja) | 1989-05-25 | 1989-05-25 | 細胞培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1130212A JP2824081B2 (ja) | 1989-05-25 | 1989-05-25 | 細胞培養方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02308790A true JPH02308790A (ja) | 1990-12-21 |
JP2824081B2 JP2824081B2 (ja) | 1998-11-11 |
Family
ID=15028772
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1130212A Expired - Lifetime JP2824081B2 (ja) | 1989-05-25 | 1989-05-25 | 細胞培養方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2824081B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP4349972A2 (en) | 2016-02-22 | 2024-04-10 | Osaka University | Method for producing three-dimensional cell tissue |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63198981A (ja) * | 1987-02-13 | 1988-08-17 | Sumitomo Electric Ind Ltd | 細胞培養用基材 |
JPH01120278A (ja) * | 1987-11-02 | 1989-05-12 | Terumo Corp | 細胞培養方法およびその装置 |
-
1989
- 1989-05-25 JP JP1130212A patent/JP2824081B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63198981A (ja) * | 1987-02-13 | 1988-08-17 | Sumitomo Electric Ind Ltd | 細胞培養用基材 |
JPH01120278A (ja) * | 1987-11-02 | 1989-05-12 | Terumo Corp | 細胞培養方法およびその装置 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2824081B2 (ja) | 1998-11-11 |
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