DE69633189T2

DE69633189T2 - Fester Träger zur Verwendung in der Zellkultivierung, insbesondere für die Kultivierung von Leberzellen, Bioreaktor, welcher den festen Träger enthält, und die Verwendung davon in einem biologisch-künstlichen Lebersystem

Info

Publication number: DE69633189T2
Application number: DE69633189T
Authority: DE
Inventors: Marcus Leonardus FLENDRIG
Original assignee: Seed Capital Investments (SCI) BV; Academisch Ziekenhuis bij de Universiteit Van Amsterdam
Current assignee: Academisch Medisch Centrum
Priority date: 1995-10-06
Filing date: 1996-10-04
Publication date: 2005-08-11
Anticipated expiration: 2016-10-05
Also published as: WO1997012960A2; US6372495B1; AU7148296A; AU714517B2; EP0866849A1; JPH11514229A; EP0866849B1; ES2227607T3; JP4112616B2; WO1997012960A3; CA2244659C; CA2244659A1; DE69633189D1; ATE274052T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Kultivierung von Zellen, insbesondere adhärenten Gewebezellen, wie Leberzellen. Spezieller bezieht sich die Erfindung auf das Gebiet biologischer Verfahren und Reaktoren zur Kultivierung und/oder Versorgung von Zellen, insbesondere Leberzellen, und auf die Verwendung dieser Verfahren in einem bioartifiziellen Lebersystem (BAL).
Kurze Beschreibung des Standes der Technik
Es ist im allgemeinen bekannt, daß die meisten Gewebezellen einen festen Träger benötigen, auf dem sie wachsen und sich teilen.
Obwohl es möglich ist, adhärente Gewebezellen in normalen Gefäßen, wie Glasflaschen oder Petrischalen, während die Zellen an der Wand des Gefäßes haften, zu kultivieren, werden normalerweise spezielle Reaktionsgefäße oder -flaschen mit einer hohen Oberfläche verwendet, um so eine erhöhte Kapazität für die Zellanlagerung bereitzustellen. Ein Weg, diese Oberfläche zu verbessern, ist, einen festen Träger für die Zellhaftung zu verwenden. Diese festen Träger sind im Stand der Technik bekannt; Beispiele umfassen Glasperlen, Mikroträger und Cellulosefasern.
Ein spezielles Problem bei der Kultivierung von adhärenten Zellen – im Vergleich zur Kultivierung von Zellen in Suspension oder in zusammenfließenden Schichten – ist, den Zellen ausreichend Nährstoffe und/oder Sauerstoff zuzuführen und/oder die aus reichende Entfernung von Abfallprodukten und/oder Kohlendioxid bereitzustellen. Dies ist insbesondere ein Problem mit Zellen, die strenge Anforderungen sowohl an die Oxygenierung als auch die Entfernung von Abfallprodukten stellen, wie Leberzellen.
Die Nichtverfügbarkeit von geeigneten festen Trägern und Verfahren zur in vitro-Kultivierung von Leberzellen hat über die letzten 40 Jahre hinweg stark die Entwicklung der sogenannten bioartifiziellen Leber-(BAL-)-systeme behindert; Systeme, die bei Patienten mit Leberdefekten zur Unterstützung und/oder für den Ersatz der natürlichen Leberfunktion verwendet werden könnten. Da das akute Leberversagen eine sehr schlechte Prognose darstellt und normalerweise für den Patienten innerhalb von Tagen oder sogar Stunden tödlich ist [siehe beispielsweise Devlin et al., Hepatology Bd. 21, Nr. 4 (1995), Seiten 1018–1024, und Lake and Suzman, Hepatology, Bd. 21, Nr. 3 (1995), Seiten 879–882, die die allgemeinen Probleme in der Technik der Behandlung von Leberversagen beschreiben], da eine Leber zur Transplantation nicht ohne weiteres verfügbar ist, würde ein BAL-System, das die Leberfunktion unterstützen und/oder ersetzen könnte, beispielsweise während der Zeit, die der Patient auf eine Leber wartet, um zur Transplantation zur Verfügung zu stehen und/oder den Zeitraum zu überbrücken, bis sich die Leber des Patienten ausreichend erholt und/oder sich selbst und/oder als Folge der Behandlung regeneriert, sehr wünschenswert sein.
Aufgrund des zuvor genannten Mangels an geeigneten Verfahren und/oder Materialien zur Kultivierung und/oder Versorgung von Leberzellen in vitro sind jedoch die bioartifiziellen Lebersysteme vom Stand der Technik bisher unzureichend nachgewiesen worden, da sie nicht alle Funktionen, die von der Leber des Patienten in vivo durchgeführt werden, vollständig ersetzen, weil sie unzureichende Kapazität aufweisen und/oder weil die Zeit, während der sie therapeutisch wirksam sind, zur praktischen Verwendung zu begrenzt ist.
Die Geschichte der bioartifiziellen Lebersysteme ist in einer Vielzahl von neuen Artikeln beschrieben worden, besonders Nyberg et al., the American Journal of Surgery, Bd. 166, November 1993, S. 512–521, und Suzman and Kelly, Scientific American, Mai–Juni 1995, S. 59–77.
Wie in diesen Artikeln beschrieben, basierten die ersten Lebererhaltungssysteme auf Hämodialyse, Aktivkohle-Hämoperfusion oder Crosshämodialyse entweder zwischen Menschen oder zwischen Menschen und Tieren. Ebenso ist die extrakorporale Leberperfusion versucht worden.
All diese Systeme sind als unzureichend befunden worden. Wie von Nyberg et al. angegeben:
„basierend auf den begrenzten Erfolg, der durch frühere Lebererhaltungstechniken erreicht wurde, entwickelte sich die Auffassung, daß die zum Überleben wichtigen Leberfunktionen bestens durch Säugetierleberpräparate bereitgestellt würden, die anhaltende oder wiederholende Anwendung ermöglichen. Diese Leberpräparate, die allgemein als Hybrid- oder bioartifizielle Systeme bezeichnet werden, enthalten biologische Komponenten innerhalb eines synthetischen Gerüsts. Biologische Komponenten können isolierte Leberenzyme, zelluläre Komponenten, Objektträger von Leber oder kultivierte Hepatozyten umfassen. Hepatozyten können in den Patienten implantiert oder extrakorporal perfundiert werden. Hepatozytensysteme berechtigten zu den größten Hoffnungen für den bioartifiziellen Leberträger. Wenn man sie mit einer zellulärer Komponente und isolierten Enzymsystemen vergleicht, sollten Hepatozytsysteme eine größere Anzahl von Leberfunktionen liefern, da sie intakte, stoffwechselaktive Leberzellen nutzen (...). Ein Hauptvorteil der bioartifiziellen Leber aus Hepatozyten gegenüber traditioneller Hepatozyttransplantation und früheren Trägertechniken, wie Crosszirkulation und extrakorporale Leberperfusion, ist, daß die bioartifizielle Leber aus semipermeablen Materialien aufgebaut werden kann, die eine Barriere zwischen den Hepatozyten und dem Wirtsimmunsystem bereitstellen. Infolgedessen kann die Therapie per bioartifizielle Leber ohne Unterdrückung des Immunsystems durchgeführt werden, und Hepatozyten von unterschiedlicher Spezies (Xenozyten) können in der bioartifiziellen Leber verwendet werden. Die Nachteile der bioartifiziellen Lebersysteme umfassen (...) die Probleme der Aufrechterhaltung der normalen Hepatozytenlebensfähigkeit und Funktion bei der hohen Zelldichte, die zur klinischen Anwendung notwendig ist. Wenn beispielsweise Hepatozyten auf einer Kunststoffoberfläche mit einem Standardzellkulturmedium wuchsen, verlieren sie ihre Lückenverbindungen in etwa 12 bis 24 Stunden: sie fallen ebenso zusammen und werden körnig: gewebespezifische Funktionen gehen in 3 bis 5 Tagen verloren, gefolgt vom Hepatozyttod innerhalb 1 bis 2 Wochen. Infolgedessen sind verbesserte Techniken der Zellkultur für die Anwendung von bioartifiziellen Lebererhaltungssystemen notwendig geworden."
Eine Vielzahl von unterschiedlichen Ansätzen für die Kultivierung von Hepatozyten und verwandten Zellen zur Verwendung in oder als BAL-Systeme ist beschrieben worden. Jedoch leiden die Hepatozytsysteme vom Stand der Technik unter Problemen in bezug auf die Kapazität und effektiver Arbeitszeit, siehe Sussman and Kelly:
„In bezug auf die Bereitstellung ausreichender Stoffwechselkapazität ist es nicht genau deutlich, wieviel Lebernekrose tödlich ist. Tierexperimente lassen darauf schließen, daß zumindest 30% der ursprünglichen Funktionen der Leber erhalten werden müssen, um zu überleben. Die Leber eines Erwachsenen enthält ungefähr 1000 g Hepatozyten, die die stoffwechselaktiven Zellen sind. Daher haben wir vorgeschlagen, daß die effektive Leberunterstützung das Äquivalent von 300 bis 400 g der Zellen benötigen wird.
Zwei Quellen an Hepatozyten sind verfügbar: frisch isolierte Zellen (primäre Kulturen) und Zellen, die in kontinuierlicher Kultur gewachsen sind (klonierte oder immortalisierte Zellen). Zellen, die aus einer normalen Menschen- oder Tierleber isoliert worden sind, behalten viele ihrer Funktionen (...) die Technologie weist strenge Einschränkungen auf. Artifizielle Lebern, die frisch isolierte Zellen verwenden, haben bisher nur eine Fraktion der notwendigen Stoffwechselkapazität bereitgestellt. Hepatozyten teilen sich nicht, nachdem sie isoliert worden sind, daher wird eine stabile Zufuhr von neuen Zellen benötigt. Verbunden mit der arbeitsaufwendigen Weise der Zellpräparation macht es dies beinahe unmöglich, die Produktion zu erhöhen, um den gegenwärtigen Erfordernissen in einer kosteneffektiven Weise zu entsprechen. Außerdem scheint es, daß die frisch isolierten Zellen nicht sehr lange während der Behandlung überleben. Eine leberunterstützende Vorrichtung, die nur 6 bis 7 Stunden überlebt, wie einige es berichteten, fällt zur Leberregenerierung daher aus. Schließlich bringt die Herstellung einer solchen Vorrichtung unter Verwendung von Tierzellen eine Vielzahl von Problemen mit sich, insbesondere in Bereichen der Sterilität und Chargen-zu-Chargen-Variabilität."
Uchino et al, ASIAO Transactions 1988; 23; 972–977 beschreiben eine bioartifizielle Hybridleber, die aus Mehrplattenhepatozyteinzelschichten besteht. Insgesamt 80 g kultivierte Hepatozyten von ausgewachsenen Hunden wurden in einem Reaktor, der eine Menge an 200 kollagenbeschichteten Borsilikatglasplatten umfaßt, kultiviert. Diese Hepatozyten waren lebensfähig und funktionierten während 4 Wochen in Perfusionskultur gut. Diese bioartifizielle Leber wurde in anhepatischen Hunden getestet. Die erhaltene längste Überlebenszeit betrug 65 Stunden.
Jedoch ist ein ernsthafter Nachteil dieses Systems, außer der Komplexität des Aufbaus und der Verwendung eines 200-Glasplattenreaktors, der, daß die Einzelschichtkultur von Hepatozyten auf diesen Platten die vorteilhafte Bildung von Hepatozytaggregaten ausschließt. Es ist in der Technik allgemein bekannt, daß Hepatozyten, die in oder als Aggregate kultiviert werden, sowohl länger als auch besser als Hepatozyten, die in Einzelschichten kultiviert werden, fungieren, was höhere Aktivität und bessere Differenzierung zeigt.
Ein anderer Ansatz bei der Entwicklung von bioartifiziellen Lebersystemen ist die Verwendung von Hohlfaserbioreaktoren gewesen, in denen die Leberzellen in dem extra-Faserraum (extraluminar) vorliegen, während ein flüssiges Medium durch den Faserhohlraum (intraluminarer Raum) normalerweise durch Perfusion mit Vollblut oder Plasma gepumpt wird.
Rozga, Demetriou et al. Biotechnology and Bioengineering, Bd. 43 (1994) gibt einen Überblick über die gegenwärtigen Hohlfasersysteme. Ihr eigenes System besteht aus einem starken Plasmastromperfusionskreis, der eine Aktivkohlesäule und ein poröses Hohlfasermodul mit 5 bis 6 × 10⁹ Mikroträger-angelagerte Schweinehepatozyten, gesät in die Extrafaserkompartimente, umfaßt. Aufgrund der Verwendung des festen Trägers (kollagenbeschichtete Dextranmikroträger) wird die für die Hepatozytanlagerung verfügbare Oberfläche erhöht.
Jedoch erfordert diese Konstruktion einen separaten Membranoxygenator für die Oxygenierung des Plasmas, das in den Perfusionskreis aufgenommen werden soll, um so den Hepatozyten in dem Hohlfasermodul ausreichend Sauerstoff zuzuführen. Deshalb hängen diese Oxygenierung sowie die Entfernung von Kohlendioxid von einschränkenden Faktoren, wie die Löslichkeit von Sauerstoff und Kohlendioxid in dem Plasma und dem Transport des oxygenierten Plasmas durch den Reaktor, ab. Aufgrund dieser Einschränkungen kann dieser Hohlfaserreaktor nicht so leicht auf eine Kapazität, die zur praktischen therapeutischen Anwendung erforderlich ist, erhöht werden.
Außerdem wird dieser Reaktor mit einer Säule mit sehr „geschlossenem Weg" mit einer hohen Dichte der Mikroträger verwendet, was zu der Bildung von Mikroträgerpellets und zu Stoffübertragungsproblemen in bezug auf die Zellen in der Mitte eines solchen Pellets führt.
Ein anderer Nachteil dieses Systems ist, daß die Hepatozyten zunächst auf dem Mikroträger immobilisiert werden müssen, bevor die Hepatozyten in den Hohlfaserreaktor eingeführt werden können. Dies umfaßt weitere komplizierte Verfahrensschritte, die zum Verlust der Zellebensfähigkeit führen können.
Sussmann and Kelly, die hierin zuvor genannt wurden, beschreiben ein Hohlfaser-basierendes bioartifizielles Lebersystem, in dem die Leberzellen an Kapillaren, durch die Vollblut aus dem Patienten gepumpt wird, angelagert sind.
Gemäß diesem System werden die Leberzellen durch das Blut des Patienten oxygeniert, da – wie zuvor durch die Autoren angegeben – „Plasma nicht die Sauerstofftransportkapazität von Vollblut bereitstellt."
Außerdem kann die Perfusion mit Vollblut zu Fasern und/oder Poren davon in dem Bioreaktor, der verstopft, führen, wobei das Problem nur durch das gesamte Erset zen des Hohlfasermoduls gelöst werden könnte, was eine frische Isolierung/Immobilisierung der Hepatozyten erforderlich macht.
Andere Nachteile dieser und anderer Hohlfasersysteme unter Verwendung von Vollblut als das flüssige Medium sind, daß „die Hohlfasermembran zunächst als ein Plasmaseparator fungieren muß, bevor irgendein signifikanter Transport von Nährstoffen und Stoffwechselprodukten durch die Faserwand stattfinden kann", und daß es „die systemische Antikoagulation mit Heparin erforderlich macht, um die Gerinnung in dem Modul zu verhindern".
Um ebenso die Probleme der Isolierung von Zellen zu überwinden, wird in diesem BAL-System eine spezielle Zellinie, C3A genannt, die aus einem Lebertumor eines Kindes stammt, verwendet. Jedoch wird in bezug auf die Aktivität und Funktion, ebenso aus Sicherheitsgründen, die Verwendung solcher Tumor-abgeleiteten Zellinien im Stand der Technik im allgemeinen weniger bevorzugt als die Verwendung von isolierten primären Hepatozyten.
Außerdem mangelt es der C3A-Zellinie, die von Suzmann verwendet wird, an einigen sehr wichtigen Funktionen von primären Hepatozyten. Die C3A-Zellen sind ebenso weniger differenziert und daher weniger aktiv als primäre Leberzellen.
Ein etwas unterschiedliches Hohlfasersystem wird von Nyberg et al beschrieben, das hierin zuvor genannt wurde: Hepatozyten werden in einem Kollagengel suspendiert, das in den Hohlraum von Hohlfasern injiziert wird. Danach wird der Extrafaserraum des Bioreaktors mit einem Medium 24 Stunden perfundiert, wonach sich das Gel in den Fasern zusammenzieht, wodurch ein dritter Raum erzeugt wird, der mit dem Medium perfundiert wird.
Die Idee hinter dieser Drei-Kompartiment-Konstruktion ist, daß Blut durch das Extrafaserkompartiment gedrückt werden kann, während die in Gel eingeschlossenen Zellen ernährt und möglicherweise durch die Faktoren stimuliert werden, die in dem Medium vorliegen, welches durch einen Weg neben dem zusammengezogenen Kollagen fließt.
Jedoch macht dieses System ebenso eine komplizierte und zeitaufwendige Vorimmobilisierung der Hepatozyten erforderlich.
Ein anderes BAL-System, das auf Kapillaren basiert, zur Hepatozytimmobilisierung wird von Gerlach et al., Transplantation, Bd. 58, Nr. 9 (1994) beschrieben. Ihr Bioreaktor besteht aus einem dreidimensionalen Gerüst zur dezentralisierten Zellperfusion mit geringen Stoffwechselproduktgradienten und dezentralisierten Oxygenierung und CO₂-Entfernung, bestehend aus einem Gewebenetzwerk aus vier diskreten Kapillarmembransystemen, wobei jedes unterschiedlichen Zwecken dient, d. h. I. Plasmazulauf (Polyamidfasern); II. Oxygenierung und Kohlendioxidentfernung (hydrophobe Polypropylenfasern oder Siliziumfasern); III. Plasmaablauf (Polysulfonfasern); und IV. Sinusoidendothel-Co-Kultur (hydrophile Polypropylenfasern). Diese Kapillaren müssen in einer derartigen Weise gewebt werden, daß die Mehrheit von Hepatozyten alle vier Typen an Membranen in ihrer Umgebung findet.
Dieser Reaktor wurde mit 2,5 × 10⁹ Schweinehepatozyten mit einer Lebensfähigkeit zwischen 88 und 96% verwendet, die mit autologen Sinusoidendothelzellen, die in dem co-kultivierten Kompartiment des Reaktors vorliegen, co-kultiviert wurden.
In diesem Typ des Hohlfaserbioreaktors müssen die Leberzellen direkt an die Hohlfasern angelagert werden, da kein weiteres Matrixmaterial zur Zellanlagerung in dem Reaktor vorhanden ist. Um die ausreichende Anlagerung der Zellen zu erhalten, müssen die Oberflächen der Fasern zunächst mit einem proteinhaltigen Basalmembranprodukt, wie Matrigel^® oder anderen kollagenbasierenden Materialien, beschichtet werden, was einen separaten und teuren Vorbehandlungsschritt erfordert. Dennoch wird, da Hohlfasern nicht speziell konstruiert und/oder zur Verwendung als ein fester Träger bei der Zellkultivierung geeignet sind, die Anlagerung und deren Geschwindigkeit, ermöglicht durch und/oder erhältlich mit den Reaktoren, eingeschränkt, und schwere Impfchargen sind erforderlich, wenn der Reaktor geimpft wird.
Außerdem beträgt der durchschnittliche Faserabstand in dem dreidimensionalen Fasergerüst etwa 500 μm, was zur Bildung von großen Zellaggregaten von vergleich barer Größe führt. Außerdem können diese großen Aggregate zu Stoffübertragungsproblemen in bezug auf die Zellen in der Mitte dieses Aggregats führen.
Es ist ebenso allgemein bekannt, daß Hohlfasern schwierig herzustellen sind, und in dieser Hinsicht leidet die Herstellung des sehr komplizierten, dreidimensionalen Fasernetzwerkes, das von Gerlach et al. beschrieben wurde, umfassend vier separate, diskrete Kapillarsysteme, aus einem wirtschaftlichen Gesichtspunkt unter einem Nachteil. Ebenso ist dieser Reaktor schwierig zu betreiben, wobei mehrere separate Zulauf/Ablauf-Kontrollsysteme erforderlich sind.
Ein allgemeines Problem der gesamten, zuvor genannten Hohlfaserbioreaktoren des Standes der Technik ist, daß das flüssige Medium (Blut, Plasma), das behandelt werden soll, aus den Hepatozyten durch die Hohlfasermembran abgetrennt wird; mit anderen Worten, daß es keinen direkten Kontakt zwischen dem flüssigen Medium und den Hepatozyten in dem Reaktor gibt. Nährstoffe und Substanzen, die aus dem flüssigen Medium entfernt und/oder in das flüssige Medium abgesondert werden sollen, müssen durch diese Membranbarriere strömen, um die Hepatozyten bzw. das flüssige Medium zu erreichen. Der Durchfluß durch die Membran kann zu dem Transportphänomen führen, das die erreichbare Stoffübertragung und deshalb die Wirksamkeit der BAL-Systeme einschränken kann.
Ebenso können die Membranen verstopfen, insbesondere wenn die Perfusion mit Vollblut verwendet wird. In diesem Falle, muß das BAL-System oder Teile davon ersetzt werden, was bedeutet, daß die Therapie unterbrochen oder sogar abgebrochen werden muß.
Ein anderer wichtiger einschränkender Faktor bei dem Membrantransport ist der Molekulargewichtsschnitt der Membran, siehe Nyberg et al:
„Durchlässigkeit und Membranmolekulargewichtschnitt beeinflussen die Abfallentfernung, Produktlieferung und Immunaktivierung. Die Durchführung von Biotransformationsfunktionen und die Entfernung von stickstoffhaltigen Abfällen sind wichtige Funktionen der bioartifiziellen Leber, zusammen mit der Entfernung von Abbauprodukten roter Blutzellen, wie Bilirubin. Die Herstellung von Koagulationsproteinen und anderen Serumproteinen durch Hepatozyten in der bioartifiziellen Leber kann ebenso für Patienten mit Leberversagen vorteilhaft sein. Jedoch besitzen diese Proteine mit Antikörpern vergleichbare Größen, die eine nachteilige Wirkung aufweisen könnten, wenn sie gegen nicht-autologe Hepatozyten in dem Bioreaktor gerichtet sind. Alternativ können kleine Peptidprodukte der Hepatozyten den Bioreaktor verlassen und in dem Patienten als Antigenstimulans dienen. Ob diese fremden Moleküle zur schädlichen Zytokinherstellung, Immunkomplexbildung oder Serumkrankheit bei Patienten mit Leberversagen führen, bleibt zu bestimmen. Potentielle Nebenwirkungen müssen experimentell angesprochen werden, um den besten Molekulargewichtsschnitt zur Verwendung in der bioartifiziellen Leber zu bestimmen."
Die klinische Behandlung von Leberversagen erfordert Massenkultivierung von Hepatozyt mit einer hohen Dichte. In vielen Bioreaktoren verursacht dies die Bildung von nicht-physiologischen Hepatozytpellets. Hepatozyten in der Mitte dieser großen Aggregate zeigen schlechte Stoffwechselaktivität und sogar mögliche Nekrose aufgrund hoher Gradienten infolge des gehinderten Transports von Nährstoffen und Sauerstoff zu und Kohlendioxid, Giften und Zellprodukten aus diesen Zellen. Dies steht im Gegensatz zu der in vivo Leber, wo jedes Hepatozyt in engem Kontakt mit dem Blut steht. Außerdem hängt in den meisten Systemen der Substrataustausch von der Diffusion ab, die den Massetransport im Vergleich zu der in vivo Situation, wo Hepatozyten unter Perfusionsbedingungen mit geringen Gradienten fungieren, weiter einschränkt.
Ebenso werden die Bioreaktoren des Standes der Technik in bezug auf die Menge an flüssigem Medium, das von dem Hohlfaserraum abgezogen werden kann, eingeschränkt, da der Fusionstransport im allgemeinen zu langsam sein wird. Deshalb wird ein aktiver Abzug des flüssigen Mediums aus den Hohlfasern erforderlich sein, dennoch wird der Gesamtfluß durch die Hohlfasermembran sehr langsam sein und/oder zu der unerwünschten Bildung von Gradienten führen, sogar mit einer hohen Strömung an flüssigem Medium durch die Hohlfasern selbst.
Ein anderes allgemeines Problem mit den bioartifiziellen Lebersystemen des Standes der Technik ist, daß sie die Verwendung von Leberzellpräparaten mit einer hohen Lebensfähigkeit (> 80%) und einer hohen Anlagerung erforderlich machen. Wie bereits durch Sussman and Kelly hierin zuvor bestätigt, ist die Herstellung solcher Zellen ein sehr kostspieliges, komplexes und zeitaufwendiges Verfahren, das die Isolierung und anschließende Kultivierung von geeigneten Leberzellen in ausreichender Lebensfähigkeit und Menge erforderlich macht, was komplizierte Verfahrensweisen umfaßt, die die erforderlichen Ergebnisse nicht zuverlässig gewährleisten, selbst wenn sie von qualifizierten Experten durchgeführt werden.
Außerdem können bekannte Hepatozyt-enthaltende BAL-Systeme nicht vor der Verwendung für einen längeren Zeitraum gelagert werden, da die Lebensfähigkeit und Funktion der Leberzellen in dem Reaktor nicht bei einem therapeutisch akzeptablen Niveau aufrechterhalten werden können.
Ebenso gewährleistet die einzige Technik, die zur Konservierung von isolierten Leberzellen über einen längeren Zeitraum verfügbar ist, d. h. Gefrierkonservierung, keine Zellen, die zur Verwendung mit bekannten BAL-Systemen geeignet sind, siehe Rozga et al, hierin zuvor genannt:
„Verfügbarkeit von Zellen nach Anforderung wird zu einer sehr wichtigen Betrachtung in der klinischen Umgebung, wo die Behandlung von Patienten mit FHF nach kurzer Diagnose und zu jeder Zeit schnellstens durchgeführt wird. Jedoch kann die [Gefrierkonservierung] zu einem signifikanten Verlust der Zelllebensfähigkeit [...] und der Anlagerung (so viel wie 50%) führen. [...] Deshalb bevorzugen wir in klinischen Umgebungen die Verwendung von frisch isolierten, gut angelagerten Hepatozyten."
Aufgrund dieser Probleme können die bekannten BAL-Systeme nicht als „Standardeinheiten", die in den Krankenhäusern aufbewahrt und/oder behalten werden können, bis ihre Verwendung benötigt wird, verwendet werden, wie es der Fall mit anderen artifiziellen Systemen zur Organerhaltung ist, wie beispielsweise Dialysemaschinen oder artifizielle Herz- oder Lungensysteme. Ebenso ist der Austausch während der Therapie eines verbrauchten BAL-Systems auf Basis primärer Leberzellen vom Stand der Technik mit unzureichender Funktion mit einem frischen BAL-System normalerweise über einen verlängerten Zeitraum wirtschaftlich nicht machbar.
Beispielsweise berichtete Demetriou, daß nach 6 Stunden der Verwendung 50% der primären Leberzellen in seinem Reaktor abstarben, während in 24 Stunden alle Zellen abstarben. Bessere Ergebnisse sind durch die Verwendung immortalisierter Zellen oder der C3A-Zellinie erhalten worden, berichtet von Sussman et al., jedoch weist die Verwendung dieser Hepatoblasten-abstammenden Zellinie andere Nachteile auf, wie bereits hierin oben erwähnt.
Im Hinblick auf das obige besteht ein fortlaufender Bedarf an bioartifiziellen Lebersystemen, die nicht die obengenannten Nachteile der Systeme des Standes der Technik aufweisen.
Die britische Patentanmeldung 2,178,447 beschreibt eine Matrix zur Zellkultivierung in vitro, die eine erhöhte, verfügbare, wirksame Oberfläche zur Zellanlagerung bereitstellt, die durch ein Fasernetzwerk oder offenporigen Schaum mit einer geeigneten Porengröße von 10 μm bis 100 μm bereitgestellt wird. Dieses Matrixmaterial kann in Form einer Schicht oder Matte oder in Form von Teilchen oder Flocken bereitgestellt werden, wobei die letztere Form von Bibby Sterilin unter dem Namen Fibra-Cel^® vermarktet wird. Als eine Schicht oder Matte weist dieses Matrixmaterial ein Aussehen wie Filterpapier oder Seidenpapier oder dünnen, porösen Filz auf.
Dieses Matrixmaterial weist einige spezielle Vorteile gegenüber Mikrokapseln auf, die teuer und empfindlich herzustellen sind, und verursacht Probleme beim Wachstum von Zellen mit hoher Dichte, da die Zellen in der Mitte der Kapsel häufig absterben. Ebenso können die Mikrokapseln frühzeitig zerbrechen, wobei sie ihre Inhalte verlieren, und jede neue Impfung erfordert ein frisches Einkapselungsverfahren. Im Vergleich zu Mikroträgern weist das Matrixmaterial gemäß GB-A-2,178,447 den Vorteil auf, daß die Zellen in der Matrixstruktur immobilisiert werden. Mit Mikroträgern werden diese Zellen auf der Außenseite der Trägerteilchen immobilisiert, was sie für die Scherspannung und Teilchenkollisionen anfällig macht, beispielsweise während der Herstellung oder Packen des Reaktors.
Außerdem können sich in dem Matrixmaterial gemäß GB-A-2,178,447 die Zellen entlang der Fasern der Schicht in drei Dimensionen (3D) vermehren, besser als in zwei Dimensionen wie in konventionellen Gewebekulturflaschen, -kolben oder Petrischalen oder auf Mikroträgerperlen oder Hohlfasern. Zellen können sich selbst an mehr als eine Faser anlagern und das Zeltwachstum findet im inneren Volumen der Fasermatrix statt. Aus diesen Gründen sind diese und ähnliche Matrixmaterialien in der Technik als „3D-Trägermatrizes" bekannt.
Ein anderer Vorteil dieses 3D-Matrixmaterials ist, daß es nicht die schweren Impfchargen der zweidimensionalen Systeme benötigt (20 bis 30% der Endmenge an Zellen bei Sättigung), aber bei Mengen von weniger als 10% und so wenig wie 5% geimpft werden kann. Das dreidimensionale Netzwerk sorgt für ein höheres – und schnelleres – „Einfangen" der Zellen, wodurch es ebenso möglich gemacht wird, Zellen mit suboptimaler Anlagerung zu verwenden.
GB-A-2,178,447 beschreibt außerdem eine Anzahl von potentiellen Bioreaktorgeometrien, die das darin beschriebene Matrixmaterial einsetzen. Eine von diesen umfaßt eine Schicht des Matrixmaterials, aufgerollt zu einer Spirale zwischen zwei abgeflachten Rohren, wobei jedes abgeflachte Rohr abwechselnd als Röhre dient, eine für das flüssige Nährstoffmedium und die andere für Gase, wie Sauerstoff, Luft, CO₂ und Wasserdampf.
Jedoch ist GB-A-2,178,447 nicht auf die Konstruktion von bioartifiziellen Lebersystemen noch auf die speziellen Probleme, die sich auf die Kultivierung und/oder Versorgung von Hepatozyten darin beziehen, gerichtet. Insbesondere bezieht sich GB-A-2,178,447 nicht auf das spezielle Problem der Zufuhr von ausreichend Sauerstoff zu stark sauerstoffabhängigen Hepatozyten.
Tatsächlich würde die Verwendung des „spiralförmig gewickelten" Reaktors gemäß GB-A-2,178,447 zur Kultivierung und/oder Versorgung von Hepatozyten in der Praxis zur unzureichenden Oxygenierung führen, da der Sauerstoff mittels nur einer Röhre, die die gesamte Länge der Matrixmatte abdeckt, zugeführt wird. Die Verwen dung solch einer Einzelröhre würde zur Erzeugung eines unerwünschten Sauerstoffgradienten entlang ihrer Länge oder sogar zur lokalen Sauerstoffverarmung führen, insbesondere wenn der Reaktor durch Erhöhen der Anzahl von Matrixwindungen vergrößert wird.
Ebenso zieht die Bioreaktorkonstruktion gemäß GB-A-2,178,447 eine separate Röhre für die Zufuhr und/oder Entfernung des flüssigen Mediums in Betracht, so daß während der Verwendung als ein BAL Nährstoffe, Toxine und andere Substanzen, die absorbiert oder abgesondert werden sollen, durch die Membran, die diese Röhre umgibt, strömen würden, um die Hepatozyten zu erreichen, was die Probleme in Bezug auf den Membrantransport und die Stoffübertragung, wie hierin oben beschrieben, verursacht.
Außerdem kann die Verwendung einer einzelnen spiralförmig gewickelten Röhre für den Flüssigtransport zu einer inhomogenen Zufuhr von flüssigem Medium zu allen Teilen des Bioreaktors beispielsweise durch die Erzeugung von unerwünschten Gradienten führen.
Andere Bioreaktoren, die im Stand der Technik, beispielsweise DE A 42 18 917 und GB A 2 178 447, beschrieben werden, verwenden nur eine Einzelröhre für die kombinierte Zufuhr von sowohl Medium als auch Sauerstoff.
All diese Faktoren machen das Matrixmaterial als solches und den Bioreaktor gemäß GB-A-2,178,447 ungeeignet zur Verwendung bei der Kultivierung von Leberzellen und/oder zur Verwendung als ein BAL.
Gegenstände der Erfindung
Es ist daher ein erster Gegenstand der Erfindung, einen verbesserten festen Träger und Bioreaktor zur Kultivierung und/oder Versorgung der adhärenten Zellen, insbesondere Leberzellen, mit verbesserten Zellhaftungseigenschaften und verbesserter Zufuhr und/oder Entfernung von gasförmigen Komponenten, wie Sauerstoff und Kohlendioxid, bereitzustellen, selbst wenn sie in oder als ein Großmaßstabsbioreaktor verwendet werden.
Es ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung, einen verbesserten festen Träger und Bioreaktor bereitzustellen, was direkten Flüssigkontakt zwischen den Zellen und dem flüssigen Medium, das behandelt werden soll, ermöglicht, während zur gleichen Zeit eine homogene Strömung an flüssigem Medium zu allen Teilen des Trägers aufrechterhalten wird.
Es ist ein anderer Gegenstand der Erfindung, ein Verfahren zur Kultivierung von Leberzellen bereitzustellen, mit dem die Leberzellen in einer Menge und während einer Zeit, die zur Verwendung in einer bioartifiziellen Leber praktisch sind, lebensfähig gehalten werden können.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist, eine bioartifizielle Leber mit verbesserten therapeutischen Merkmalen bereitzustellen, die verwendet werden kann, um die Leberfunktion eines Patienten zu ersetzen und/oder zu ergänzen.
Noch ein anderer Gegenstand der Erfindung ist, ein Verfahren zur Behandlung des Leberversagens, insbesondere akuten Leberversagens, unter Verwendung einer bioartifiziellen Leber bereitzustellen.
Weitere Gegenstände der Erfindung werden aus der nachstehenden Beschreibung hierin deutlich.
Kurze Beschreibung der Erfindung und der Figuren
Es ist nun herausgefunden worden, daß ein verbesserter fester Träger zur Kultivierung von Zellen durch die Bereitstellung eines 3D-Matrixmaterials, wie hierin oben beschrieben, und insbesondere dem Matrixmaterial gemäß GB-A-2,178,447 mit Hohlfasern zur Zufuhr und/oder Entfernung von gasförmigen Komponenten, wie Sauerstoff und/oder Kohlendioxid, erhalten werden kann, wobei der feste Träger ins besondere zur Kultivierung von adhärenten Gewebezellen, wie menschliche oder tierische Leberzellen, geeignet ist.
Es ist ebenso herausgefunden worden, daß ein verbessertes bioartifizielles Lebersystem unter Verwendung des erfindungsgemäßen festen Trägers bereitgestellt werden kann.
Im allgemeinen bezieht sich die Erfindung daher auf

– einen festen Träger, umfassend ein 3D-Matrixmaterial und Hohlfasern für den Gastransport;
– ein Verfahren zur Herstellung des festen Trägers, umfassend Anlagerung von Hohlfasern an ein 3D-Matrixmaterial;
– einen Bioreaktor, umfassend den erfindungsgemäßen festen Träger;
– ein Verfahren zur Kultivierung und/oder Versorgung von Zellen, insbesondere adhärente Gewebezellen, und insbesondere Leberzellen, unter Verwendung des festen Trägers und/oder des Bioreaktors der Erfindung;
– ein bioartifizielles Lebersystem, umfassend den festen Träger und/oder den Bioreaktor der Erfindung;
– ein Verfahren zum Ersetzen und/oder Erhalten der Leberfunktionen bei einem Patienten und/oder ein Verfahren zur Behandlung von Leberstörungen, umfassend die Verwendung des erfindungsgemäßen bioartifiziellen Lebersystems.

Weitere Aspekte, Ausführungsformen und Vorteile der Erfindung werden durch die hierin nachstehende Beschreibung und die Figuren deutlich, in denen:
1 eine Vorderansicht des bevorzugten, erfindungsgemäßen festen Trägers zeigt;
2 eine Querschnittsdarstellung des bevorzugten, erfindungsgemäßen festen Trägers in „Sandwich"-Konfiguration zeigt;
3 und 4 zwei mögliche Geometrien der erfindungsgemäßen Bioreaktoren zeigen;
5 bis 9 vier mögliche Konfigurationen des erfindungsgemäßen bioartifiziellen Lebersystems zeigen;
10 eine alternative Ausführungsform des erfindungsgemäßen festen Trägers zeigen, umfassend separate Matrixschichten und Hohlfaserschichten;
11 eine Vorrichtung zur Immobilisierung von Zellen in dem erfindungsgemäßen Bioreaktor schematisch darstellt;
12 eine mögliche Konstruktion eines erfindungsgemäßen Bioreaktors schematisch darstellt;
13 eine Lichtmikroskopmikroaufnahme eines Querschnitts der 3D-Matrix aus einem Hepatozytbioreaktor, kultiviert bei 20·10⁶ lebensfähigen Zellen/ml für fünf Tage, zeigt;
14 eine Rasterelektronenmikroaufnahme von isolierten Schweinehepatozyten, kultiviert für fünf Tage in der 3D-Matrix der Bioreaktorvorrichtung bei 20·10⁶ lebensfähigen Zellen/ml, zeigt;
15A und 15B Transaktionsströmungs-empfindliche MRI's mit einem kleinen (A) Innendurchmesser (1,32 cm) und einem Innendurchmesser (2,2 cm) eines vergrößerten Bioreaktors (B) zeigen.
Der feste Träger
Der erfindungsgemäße feste Träger umfaßt im allgemeinen ein 3D-Matrixmaterial und Hohlfasern.
Eine 3D-Matrix wird hierin als ein Material definiert, das für eine dreidimensionale Struktur für das Wachstum von darin kultivierten Zellen sorgt. Derartige 3D-Matrizes sind dem Fachmann bekannt; Beispiele sind:

1. Gelfoam (Gelatine, Größe: 20 mm*7 mm, Upjohn Ltd., Tokyo, Japan).
2. PVF (kollagenbeschichtetes, netzförmiges Polyvinylformalharz, Größe: 2 mm dickes, industrielles Filtermaterial mit einer Porosität von 80%, Kanebo Kasei Co., Osaka, Japan).
3. PVLA-RPU (Poly-N-para-vinylbenzyl-lactonamid-beschichtetes, netzförmiges Polyurethan, Größe: 34 mm Durchmesser*1 mm Dicke, Sanyo Chemical Industries, Ltd., Kyoto, Japan).
4. PGA (Polyglykolsäure), Albany International Research Co., Mansfield, Mass.
5. PVA (Polyvinylalkohol), Unipoint Industries, Highpoint, NC.
6. PGA/PLA (Polyglykolsäure/Polyessigsäure, Verhältnis 90 : 10), Ethisorb.
7. 3D-Polyurethanschaum oder nicht-gewebte Matrix.
8. Poröser Silikongummischaum (Ashby Scientific Ltd, Leicestershire, UK).

Vorzugsweise ist diese 3D-Matrix ein Material, das ein Substrat mit hoher Oberfläche bereitstellt, wobei die effektive Oberfläche davon das 10- bis etwa 100fache der Fläche derselben, projiziert auf eine ebene Oberfläche, beträgt, umfassend ein physiologisch akzeptables Netzwerk an Fasern mit einer Porosität von 40 bis etwa 95% und einer Porengröße in der Größenordnung von 10 μm bis 100 μm oder eine offenporige Schaumstruktur mit einer Porengröße von etwa 10 μm bis 100 μm, wobei die Gesamthöhe der Matrix in der Größenordnung von 50 mm bis etwa 2000 μm, vorzugsweise 100 bis 1000 μm liegt, wobei diese Matrix in Form einer stark porösen, nicht-gewebten Schicht oder Matte vorliegt.
Dieses Material sowie seine Herstellung, seine Vorteile und seine bevorzugten Ausführungsformen werden in der britischen Patentanmeldung 2,178,447, die hierin zuvor genannt wurde, beschrieben.
Die Matrix weist vorzugsweise eine offenporige Schaumpolymerstruktur mit Poren von etwa 10 μm bis 100 μm und einer Porosität von 60 bis 95% auf.
Die Matrix kann aus irgendeinem geeigneten Material, das in der britischen Patentanmeldung 2 178 447 erwähnt wurde, hergestellt werden, aber wird vorzugsweise aus einem Polyester hergestellt.
Das Matrixmaterial kann ebenso in irgendeiner Form, die in der britischen Patentanmeldung 2 178 447 beschrieben wurde, verwendet werden, aber wird vorzugsweise in Form einer nicht-gewebten, dreidimensionalen Gewebestruktur, wie Schichten oder Matten, verwendet; wobei diese flachen, stark porösen, nicht-gewebten Schichten oder Matten und ihre Herstellung ebenso in dieser Referenz beschrieben werden, und von Bibby Sterilin Stone, Staffordshire, UK, kommerziell erhältlich sein können.
Es ist ebenso möglich, eine Kombination aus mehreren unterschiedlichen 3D-Matrixschichten, beispielsweise eine nicht-gewebte Polyesterschicht und eine nicht-gewebte Polyurethanschicht, oder eine Kombination aus einer nicht-gewebten und einer gewebten Struktur zu verwenden. Es ist ebenso möglich, eine 3D-Schicht mit einer variierenden Dichte zu verwenden, d. h. eine offenere Struktur auf der Außenseite und eine kompaktere Struktur auf der Innenseite, was besseres Einfangen von Zellen während der Beschickung des Bioreaktors bereitstellen kann.
Wenn es in der bevorzugten Form einer Schicht oder Matte verwendet wird, weist diese Schicht oder Matte vorzugsweise eine Dicke von 10 bis 1000 μm, stärker bevorzugt 250 bis 750 μm, und normalerweise 400 bis 500 μm auf, und umfaßt runde, flache nicht-runde oder hohle Fasern oder eine Kombination aus diesen Fasern in der Größenordnung von 0,5 μm bis 20 μm im Durchmesser oder Breite, vorzugsweise 10 μm bis 15 μm und/oder bevorzugte Denier zwischen 0,05 und 5 dpf, wie in dieser Referenz beschrieben.
Die Fasern werden vorzugsweise in der Schicht oder Matte als eine stark ungeordnete, zufällige, verfilzte Weise angeordnet, wobei die Achsen der Fasern eine offene mehrdimensionale Anordnung bilden.
Zur Verwendung bei der Kultivierung von Leberzellen und/oder in dem BAL-System der Erfindung beträgt die Dicke der Schicht vorzugsweise etwa gleich 0,2 bis 0,8 mm, vorzugsweise rund 0,5 mm.
Obwohl nicht kritisch, wird die Schicht im allgemeinen eine Breite von 10 cm bis 100 cm, normalerweise rund 20 cm aufweisen.
Die oxygenierenden Hohlfasern, die in dem festen Träger verwendet werden, sollten für zumindest gasförmigen Sauerstoff und/oder gasförmiges Kohlendioxid durchlässig sein, und als solches können sowohl poröse als auch nicht-poröse („geschlossene") Fasern verwendet werden, wobei poröse Fasern bevorzugt werden. In anderer Hinsicht ist der Molekulargewichtsschnitt der Fasern nicht besonders eingeschränkt.
Die Fasern können aus irgendeinem geeigneten Material, vorzugsweise ein hydrophobes Material, wie Silikon, Polyethylen, Polypropylen, hydrophobes Polysulfon, oder irgendeinem anderen geeigneten hydrophoben Material, aus dem Hohlfasern hergestellt werden können, oder irgendeiner Kombination davon hergestellt werden.
Solche Fasern und ihre Herstellung sind in der Technik bekannt; geeignete kommerziell erhältliche Materialien sind Silastic von Dow Corning (Silikonfasern), Oxyphan und Plasmaphan von Akzo-Nobel (hydrophobe Polypropylenfasern), hydrophobe Polysulfonfasern von Fresenius A. G., Bad Homburg, Deutschland, oder Polypropylenfasern, beschichtet auf der Innenseite und/oder der Außenseite mit Silikongummi (Applied Membrane Technology, Minnetonka, Minnesota und Neomecs, St. Louis Park, Minnesota).
Die Hohlfasern können mit Gasplasma vor der Einführung in das Matrixmaterial behandelt werden, um so ihre hydrophoben Eigenschaften zu verbessern.
Der äußere Durchmesser der Fasern beträgt vorzugsweise weniger als 10 mm, stärker bevorzugt 0,05 bis 5 mm, stärker bevorzugt 0,1 bis 1,0 mm.
Die Fasern werden vorzugsweise gleichmäßig durch das Matrixmaterial verteilt. Stärker bevorzugt werden sie in paralleler Weise angeordnet, wobei sie von einem Ende des Matrixmaterials zum anderen Ende verlaufen, wodurch die Leichtigkeit der Konstruktion des festen Trägers ohne den Bedarf an der Bildung eines komplexen Netzwerkes von verschlungenen Hohlfasern bereitgestellt wird.
Die Anzahl von Hohlfasern und der Abstand zwischen den einzelnen Fasern in dem festen Träger werden so sein, daß alle Zellen, die an dem Matrixmaterial haften, ausreichend mit Sauerstoff und mit der ausreichenden Entfernung von Kohlendioxid versorgt werden.
Um dies zu erreichen, wird der Abstand zwischen den einzelnen Fasern, gemessen von der Mitte einer Faser zu der Mitte der nächsten, normalerweise weniger als 10 mm, stärker bevorzugt 0,1 bis 5 mm, noch stärker bevorzugt 1 bis 3 mm und am stärksten bevorzugt rund 2 mm, betragen, wobei sich die Gesamtzahl an Fasern auf die Gesamtlänge der Faserschicht bezieht. Vorzugsweise umfaßt der feste Träger zumindest drei, stärker bevorzugt zumindest zehn Hohlfasern.
Normalerweise wird der Reaktor 50 bis 50.000, vorzugsweise 500 bis 5000 Hohlfasern enthalten.
Vorzugsweise werden die Hohlfasern an das 3D-Matrixmaterial angelagert und/oder physikalisch gebunden, obwohl die Erfindung nicht darauf beschränkt ist, und alternative Ausführungsformen werden hierin nachstehend beschrieben.
Die Fasern können an das Matrixmaterial durch irgendein geeignetes Verfahren angelagert werden, das den Sauerstoff/Kohlendioxid-Transport durch die Faserwand nicht behindert. An sich können die Fasern zu dem Matrixmaterial gewebt, auf das Matrixmaterial geklebt, auf das Matrixmaterial genäht, darauf durch Ultraschall gebunden werden.
Beispiele von Matrixmaterialien, die in der Praxis der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassend Hohlfasern, die an eine nicht-gewebte Polyesterschicht angelagert sind, umfassen die kommerziellen Hohlfasermatten, erhältlich von AKZO-Nobel (Wuppertal, Deutschland) und Microgon (Laguna Hils, CA, USA).
Um das Binden zu verbessern und/oder das Matrixmaterial nicht zu beschädigen, kann das Matrixmaterial zunächst mit einer geeigneten Polyamid- oder Silikonschicht oder einem groben Polypropylensieb laminiert werden, wie in GB-A-2,178,447 beschrieben, nachdem die Fasern an die Schicht oder den Sieb durch die hierin oben beschriebenen Verfahren gebunden werden.
Wenn das Matrixmaterial in Form einer Schicht oder Matte vorliegt, können die Hohlfasern an beide Seiten des Matrixmaterials angelagert werden, aber werden vorzugsweise nur an eine Seite der Matrixmatte angelagert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform, wobei die allgemeine Geometrie in 1 gezeigt wird, besteht das erfindungsgemäße Matrixmaterial aus einer 3D-Polyestermatrix 1 gemäß GB-A-2 178 447, die mit parallelen, hydrophoben, porösen Hohlfasern 2 mit einem Durchmesser von etwa 0,7 mm bereitgestellt wird, die bei einem Abstand von etwa 2 mm angeordnet, zu dem Matrixmaterial gewebt oder an eine Seite davon gebunden sind.
Solch ein festes Trägermaterial stellt die Leichtigkeit der Herstellung bereit, und kann bei der „Sandwich"-Konfiguration, die in 2 gezeigt wird, vorteilhaft verwendet werden, umfassend eine Vielzahl an Schichten 1, wobei jede Schicht auf beiden Seiten von den Hohlfasern 2 umgeben ist, und umgekehrt, wobei 3 der intraluminare Raum (Faserhohlraum) und 4 der extraluminare Raum ist.
Bei dieser Sandwichkonfiguration fungieren, neben der Bereitstellung von verbesserter Zufuhr und Entfernung von Gasen, die Fasern ebenso vorteilhaft als ein Spacer zwischen den einzelnen Faserschichten und dienen als Prallfläche und/oder ein Kanalisierungsmittel, um so eine einheitliche Strömung und Verteilung des flüssigen Mediums durch den extraluminaren Raum 4 zu allen Teilen des festen Trägers bereitzustellen.
Außerdem sorgen die Fasern 2 für physikalische Unterstützung der Matrixschichten 3, die besonders wichtig ist, wenn der feste Träger hoher Scherung, wie einer Flüssigkeitsströmung, unterzogen werden soll.
Wenn die Sandwichkonfiguration verwendet wird, ist es möglich, daß die Fasern von einer Schicht zur anderen Schicht bei einem leichten Winkel zueinander oder sogar senkrecht von Schicht zu Schicht vorliegen.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform, die in 10 gezeigt wird, umfaßt der feste Träger eine separate 3D-Matrixschicht 26 und eine separate Fasern-enthaltende Schicht 27, beispielsweise erhalten durch Weben von Fasern zu einer Schicht oder Binden einzelner Fasern, und diese Schichten und ihre Herstellung sind in dem Gebiet der Hohlfaserherstellung allgemein bekannt.
In solch einer separaten Faserschicht können die Fasern in eine Richtung parallel sein, oder die Schicht kann zwei, drei oder mehrere Einheiten von parallelen Fasern umfassen, wobei die Einheiten von parallelen Fasern senkrecht oder bei einem Winkel zueinander vorliegen. Solch eine Schicht kann beispielsweise durch Weben der Hohlfasern in einer derartigen Weise erhalten werden, daß die gewünschte Anzahl an Hohlfasereinheiten sowie der gewünschte Winkel zwischen diesen Einheiten erhalten wird.
In solche einer Schicht, die unterschiedliche Einheiten an Hohlfasern umfaßt, können die Fasern ebenso aus unterschiedlichen geeigneten Materialien, wie hierin obengenannt, in Abhängigkeit der Endverwendung dieser Einheit an Fasern hergestellt werden. Sie können ebenso unterschiedliche Durchmesser aufweisen, so lange sie verschlungen sein können, um die gewünschte Hohlfaserschicht zu bilden.
Die Faser-enthaltende Schicht kann auf der Schicht des Matrixmaterials laminiert werden. Es ist ebenso möglich, das Matrixmaterial beispielsweise in Form von Flocken an solch eine Hohlfaserschicht anzulagern. All diese Ausführungsformen werden ebenso vorzugsweise in einer Sandwichkonfiguration, wie in 10 gezeigt, verwendet.
In allen anderen Hinsichten umfaßt diese Ausführungsform dieselben bevorzugten Aspekte und Vorteile, wie hierin zuvor erwähnt.
Schließlich ist es, obwohl der erfindungsgemäße feste Träger im allgemeinen keinen Vorbehandlungsschritt vor der Verwendung benötigt, im Umfang der Erfindung eingeschlossen, den gesamten festen Träger oder nur die Hohlfasern oder die Hohlfaser-enthaltende Matte mit extrazellulären Matrixmaterialien, wie Matrigel, Poly-N-para-vinylbenzyl-lactonamid oder kollagenbasierenden Materialien, in einer an sich bekannten Weise zu behandeln, um die Zelladhäsion weiter zu verbessern. Ebenso kann der feste Träger mit einer Schicht eines undurchlässigen Materials, wie Polyamid, Polyfluorethylen oder Silikon, beispielsweise durch dessen Laminieren auf die Matrixschicht oder dessen Aufrollen oder Aufstapeln mit dem erfindungsgemäßen festen Träger bereitgestellt werden, wodurch in gewissem Maße kleine Kompartimente in dem festen Träger zur Aufrechterhaltung einer homogenen Zellverteilung gebildet werden.
Weitere vorteilhafte Ausführungsformen werden einem Fachmann offensichtlich und sind in dem Umfang der Erfindung enthalten.
Geometrie und Konstruktion des Bioreaktors
Im allgemeinen umfaßt der erfindungsgemäße Bioreaktor einen geeigneten Behälter, der aus einer Wand besteht, die einen Raum umgibt, der mit dem erfindungsgemäßen festen Träger vorsorgt ist.
Der feste Träger liegt vorzugsweise in Form einer Matte oder Schicht, stärker bevorzugt in der „Sandwich"-Konfiguration, die in 2 gezeigt wird, vor. Es gibt zwei bevorzugte Wege zur Erhaltung der Reaktorgeometrie.
Gemäß der Ausführungsform, die in 3 gezeigt wird, liegt der feste Träger 5 in dem Reaktor 6 in Form einer spiralförmig aufgerollten Matte oder Schicht des Matrixmaterials vor, wobei 7 die Wand des Reaktorbehälters ist. Gemäß dieser Ausführungsform wird der Reaktor normalerweise ein Zylinder sein.
Gemäß der Ausführungsform, die in 4 gezeigt wird, liegt der feste Träger 8 in dem Reaktor 9 als aufgestapelte Schichten vor, wobei 10 die Wand des Reaktorbe hälters ist. Gemäß dieser Ausführungsform wird der Reaktor normalerweise eine kastenförmige Form aufweisen. Ebenso können die einzelnen festen Trägerschichten bei einem Winkel, beispielsweise bei einem rechten Winkel, gestapelt werden, was die obengenannte senkrechte Hohlfaserkonfiguration ergibt.
Der feste Träger/Bioreaktor der Erfindung kann ebenso eine alternierende Schicht der Matrixmaterialschichten und Hohlfaser-enthaltenden Schichten, wie in 10 gezeigt, oder Hohlfaserschichten mit dem Matrixmaterial zwischen den Schichten oder an die Schichten gebunden umfassen oder ein Laminat einer Matrixmaterialschicht und einer Hohlfaserschicht umfassen, wie hierin oben beschrieben.
In all diesen Reaktorgeometrien ist es möglich, daß dort zwei, drei oder mehrere separate Einheiten von (vorzugsweise) parallelen Hohlfasern in den Träger/Reaktor eingeführt werden, wobei jede Einheit an Fasern bei einem Winkel oder senkrecht zu einer oder mehreren der in dem Reaktor vorliegenden anderen Einheiten an Fasern vorliegt.
Diese unterschiedlichen Einheiten von Fasern können durch irgendeines der hierin oben beschriebenen Verfahren erhalten werden, beispielsweise durch Stapeln einzelner Schichten des Matrixmaterials mit Hohlfasern, die bei einem Winkel zueinander daran physikalisch angelagert sind; durch Verwenden separater Hohlfaserschichten, umfassend zwei, drei oder mehrere einzelne Einheiten an Fasern bei (einem) Winkel(n) zueinander, wie hierin oben beschrieben; durch Verwenden separater Schichten des Matrixmaterials und Hohlfasermaterials und Plazieren der Hohlfaserschichten bei (einem) Winkel(n) zueinander, oder irgendeine Kombination davon, wie die Verwendung einer Schicht des Matrixmaterials mit Hohlfasern, die daran physikalisch angelagert sind, gestapelt bei einem Winkel mit einer separaten Hohlfaserschicht.
Wenn es mehrere Einheiten von Hohlfasern gibt, können diese Einheiten aus denselben oder unterschiedlichen, geeigneten Hohlfasermaterialien hergestellt werden und können unterschiedliche Durchmesser usw. in Abhängigkeit der Endverwendung dieser Fasereinheit aufweisen.
Weitere geeignete Reaktorgeometrien werden einem Fachmann offensichtlich sein, und werden in dem Umfang der Erfindung enthalten sein. Jedenfalls wird die Geometrie so sein, daß während der Verwendung alle Zellen in dem Bioreaktor in geeigneter Nähe zu den Oxygenierungsfasern liegen, so daß sie ausreichend mit Sauerstoff versorgt werden können.
Ebenso ist für die meisten Anwendungen und insbesondere zur Verwendung in oder als ein BAL die Reaktorgeometrie vorzugsweise so, daß das meiste oder vorzugsweise alles des flüssigen Mediums, das durch den Reaktorbehälter perfundiert wird, mit den Zellen, die auf dem festen Träger immobilisiert wurden, in Kontakt kommt.
Alle der obengenannten Reaktorgeometrien, umfassend zwei oder mehrere Einheiten an Hohlfasern, sollten sich jedoch von der Reaktorgeometrie unterschieden, die von Gerlach et al beschrieben wird, umfassend ein dreidimensionales Netzwerk an Hohlfasern: In dem Gerlach-Reaktor gibt es kein separates 3D-Matrixmaterial zur Zelladhäsion, so daß sich die Zellen selbst an die Hohlfasern anlagern müssen. Damit dies möglich ist, müssen die Hohlfasern, die in dem Gerlach-Reaktor verwendet werden, verschlungen sein, um so das erforderliche dreidimensionale Netzwerk zu bilden. Ebenso muß in diesem Netzwerk der Abstand zwischen den einzelnen verschlungenen Hohlfasern so klein sein, um die dreidimensionale Adhäsion der Leberzellen an diese Fasern möglich zu machen. Es wird deutlich sein, daß dies das 3D-Hohlfasernetzwerk gemäß Gerlach et al sehr schwierig macht und teuer herzustellen ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Zelladhäsion im wesentlichen durch das 3D-Matrixmaterial und nicht durch die Hohlfasern bereitgestellt, so daß ein dreidimensionales Hohlfasernetzwerk zur Bereitstellung der 3D-Zellanlagerung nicht erforderlich ist. (Beispielsweise gibt es in allen obigen Reaktorgeometrien ein wesentliches zweidimensionales Hohlfasernetzwerk mit den Einheiten an Fasern, die in derselben – im Fall von verschlungenen Fasereinheiten – oder in parallelen – im Fall von gestapelten Fasereinheiten – Ebene(n) in dem festen Träger liegen).
Es wird deutlich sein, daß aufgrund dessen der Abstand zwischen den einzelnen Hohlfasern in dem festen Träger der Erfindung weniger kritisch ist und größer als in dem Gerlach-Reaktor sein kann, so lange wie ausreichende Oxygenierung aller Zellen, die in der Matrix vorliegen, erhalten werden kann.
Ebenso ist der feste Träger der Erfindung mit unterschiedlichen Einheiten an Fasern leichter einfach durch Stapeln oder durch Verwendung einer zweidimensionalen Faserschicht, umfassend zwei oder mehrere Einheiten von parallelen Fasern, herzustellen.
Der erfindungsgemäße Reaktor wird normalerweise eine(n) Gaszuleitung/-abgang, die betriebsbereit an die Hohlfasern angeschlossen sind, umfassen, so daß Gas eingespeist und aus dem Hohlfaserraum entfernt werden kann.
Der Reaktor wird normalerweise ebenso zumindest eine(n) Flüssigzuleitung und -abgang, die betriebsbereit mit dem Extrafaserraum verbunden sind, umfassen, wodurch ein flüssiges Medium eingespeist oder aus dem Extrafaserraum oder den darin vorliegenden Zellen entfernt werden kann. Der Reaktor kann zusätzliche Zuleitungen und Abgänge für sowohl Gase, Flüssigkeiten als auch Feststoffe, wenn erforderlich, umfassen.
Der Reaktor kann außerdem alle bekannten Elemente von Bioreaktoren, wie Gas- und/oder Flüssigkeitspumpen, die betriebsbereit mit den unterschiedlichen Zuleitungen oder Abgängen verbunden sind; Mittel zur Messung und/oder Kontrolle der Temperatur in dem Reaktorbehälter; Zugangsmittel, wie ein Luke, zum Zugang der Innenseite des Reaktors; Untersuchungsmittel, Sonden und Mittel zu deren Einführen, wie Sonden zur Messung der Lebensfähigkeit, wie hierin nachstehend weiter beschrieben, usw. umfassen.
Der Reaktor kann außerdem mit Mitteln zur automatischen Kontrolle der unterschiedlichen Reaktorfunktionen ausgestattet sein, wie einem Computer, der betriebsbereit mit den Pumpen verbunden ist, Temperaturkontrollmittel usw.
Der Reaktor kann ebenso mit Mitteln zum Bewegen des Reaktors, wie einen elektrischen Motor, beispielsweise zum Drehen des Reaktors entlang einer seiner Achsen, oder mit Mitteln zum Rühren im Inneren des Reaktors ausgestattet sein, obwohl das letztere normalerweise nicht bevorzugt wird.
Die Wand des Reaktorbehälters kann aus irgendeinem geeigneten inerten Material, wie Glas, Kunststoffen, wie Plexiglas, oder Metallen, und Polycarbonat oder Polysulfon sein, wobei die letzteren Materialien für die bevorzugte Dampfsterilisation geeignet sind. Das Innere des Reaktorbehälters kann mit einer speziellen Beschichtung ausgestattet sein, die für die Zellen, die kultiviert werden sollen, verträglich ist.
Die Größe des Reaktors ist nicht eingeschränkt und wird normalerweise von der erforderlichen Kapazität abhängen. Das Volumen des Reaktors kann daher von 1 ml bis 1000 Liter variieren.
Es wird deutlich sein, daß für die obigen Reaktorgeometrien der erfindungsgemäße feste Träger, insbesondere wenn er in Form einer Schicht oder Matte mit daran angelagerten Hohlfasern verwendet wird, für leichte Konstruktion sorgt, insbesondere im Vergleich zu dem Kapillarnetzwerk-enthaltenden Bioreaktor von Gerlach et al, wie hierin oben beschrieben. Der feste Träger kann ebenso zur Bearbeitung eines existierenden Reaktors zur Verwendung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft verwendet werden.
Beispielsweise kann die Reaktorgeometrie von 3 durch Aufrollen einer Schicht des erfindungsgemäßen festen Trägers und Einbringen der aufgerollten Trägerschicht in den Reaktorbehälter einfach erhalten werden. Es wird deutlich sein, daß die Größe des festen Trägers so sein wird, daß, wenn er einmal aufgerollt ist, er passen und vorzugsweise eine Größe aufweisen wird, die im wesentlichen der Größe des Reaktorbehälters entspricht. Wenn notwendig, kann der feste Träger auf die gewünschte Größe, entweder bevor oder nachdem er aufgerollt worden ist, geschnitten werden. Ebenso kann die Reaktorgeometrie von 3 durch Stapeln einer oder mehrerer Schichten des festen Trägers einer geeigneten Größe oder Falten einer oder mehrerer Schichten in den Reaktorbehälter erhalten werden.
Wie hierin oben erwähnt, ist es ebenso möglich, eine separate Schicht des Matrixmaterials und eine Faser-enthaltende Schicht aufzurollen oder separate alternierende Schichten des Matrixmaterials und Faser-enthaltenden Materials zu stapeln.
In all diesen Konfigurationen werden die Hohlfasern für physikalische Unterstützung des aufgerollten oder gestapelten festen Träger sowie für die verbesserte Flüssigkeitsströmung durch den Extrafaserraum sorgen.
Es wird deutlich sein, daß im allgemeinen die Menge an festen Träger, der im Inneren des Reaktorbehälters vorliegt, sowie die Dimensionen davon normalerweise von dem Volumen und den Dimensionen des Reaktorbehälters abhängen und/oder daran angepaßt werden.
Der Reaktorbehälter kann ebenso Mittel zum Tragen und/oder Halten des aufgerollten oder gestapelten festen Trägers enthalten, wie es einem Fachmann offensichtlich sein wird.
Nachdem der feste Träger in den Reaktorbehälter plaziert worden ist, können sowohl die Hohlfasern als auch der Extrafaserraum betriebsbereit mit verschiedenen Gaszuleitungen und -abgängen bzw. Flüssigzuleitungen und -abgängen verbunden werden, die normalerweise einen Teil des Reaktorbehälters bilden, gegebenenfalls durch oder mittels Verteilungsmitteln, die für eine gleichmäßige Verteilung des Gasflusses und/oder Flüssigkeitsflusses durch den Reaktor sorgen können.
Gemäß der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, worin die Fasern unidirektional sind, werden die Fasern auf einer Seite des Matrixmaterials gemeinsam mit einer Gaszuleitungszufuhr verbunden und auf der gegenüberliegenden Seite mit einem Gasabgang gemeinsam verbunden. Jedoch ist es ebenso möglich, ein System zu haben, das im Gegenstrom arbeitet, d. h. wo die Richtung des Gasflusses entgegengesetzt von Faser (Schicht) zu Faser (Schicht) ist, oder bei rechten Winkeln mit der senkrechten Konfiguration, wie hierin oben erwähnt.
Es wird aus dem obigen deutlich sein, daß der Reaktor gemäß der vorliegenden Erfindung ebenso wesentlich leichter zu betreiben ist als der Reaktor von Gerlach et al, der ein gewebtes Netzwerk von vier einzelnen Kapillarmembransystemen umfaßt, der deshalb mehrere Zuleitungs- und Abgangssysteme erforderlich macht. Ebenso stellt im Vergleich zu dem Reaktor von Gerlach et al der feste Träger der Erfindung, umfassend ein 3D-Matrixmaterial, sowohl verbesserte Zellanlagerung als auch verbesserte Zellkapazität pro Volumeneinheit bereit.
Gemäß der Erfindung kann der extrazelluläre Faserraum direkt mit einem Flüssigzuleitungs-/abgangssystem verbunden werden, was es möglich macht, diesen Extrafaserraum mit dem flüssigen Medium zu perfundieren, was den direkten Kontakt zwischen den Zellen, die in dem Extrafaserraum vorliegen, und dem flüssigen Medium ergibt.
Obwohl die Erfindung in ihrer einfachsten Ausführungsform nur eine Einheit an Hohlfasern für die Zufuhr und/oder Entfernung von gasförmigen Komponenten umfaßt, wird es verstanden, daß weitere separate Hohlfasersysteme für die Zufuhr und/oder Entfernung von speziellen Gasen und/oder flüssigen Medien bereitgestellt werden können. Diese weiteren Systeme können ebenso für das separate, kontrollierte Einbringen von gasförmigen, flüssigen und/oder gelösten Komponenten unabhängig von der gasförmigen oder flüssigen Haupteinspeisung, wie hierin zuvor beschrieben, verwendet werden. Es ist ebenso möglich, einzelne Fasern, Einheiten von Fasern oder Faserschichten des festen Trägers für diesen Zweck zu verwenden, so lange die ausreichende Oxygenierung aufrechterhalten werden kann.
Für derartige Anwendungen wird der feste Träger/Bioreaktor der Erfindung normalerweise zwei oder mehrere unterschiedliche Einheiten von Hohlfasern parallel oder bei (einem) Winkel(n) zueinander umfassen, wie hierin zuvor beschrieben, wobei jede Einheit an Fasern für einen speziellen Zweck verwendet wird, wobei zumindest eine Einheit zur ausreichenden Oxygenierung des erfindungsgemäßen Reaktors verwendet wird.
Es ist ebenso gemäß der Erfindung möglich, daß unterschiedliche Einheiten von Hohlfasern für den Zufluß und Ausfluß verwendet werden. In dieser Ausführungsform wird die Faser normalerweise an einem Ende geschlossen sein und am anderen Ende mit der Zuleitung bzw. dem Abgang verbunden sein, wobei die Zuleitung und/oder der Abgang gegebenenfalls mit Pumpmitteln versorgt werden.
Das gasförmige oder flüssige Medium wird durch die Zuleitung zu dem Faserhohlraum der Zulauffaser geleitet, strömt durch die Faserwand zu dem Extrafaserraum und wird dann durch die Abgangsfaser aufgenommen und entfernt.
Obwohl es Probleme in bezug auf die erreichbare Strömung geben wird und/oder diese Fasern verstopfen können, wird der Hauptvorteil dieser Ausführungsform der sein, daß das gesamte zugeführte Medium notwendigerweise mit den Zellen in dem Extrafaserraum in Kontakt kommen wird.
Weitere vorteilhafte Ausführungsformen werden dem Fachmann offensichtlich sein und sind in dem Umfang der Erfindung enthalten.
Kultivierung von Zellen in dem Bioreaktor
Der erfindungsgemäße Bioreaktor kann verwendet werden, um alle Arten von Zellen zu kultivieren und/oder zu versorgen, und die Erfindung bezieht sich außerdem auf diese Verwendungen und Verfahren der Zellkultivierung und/oder Versorgung.
Vorzugsweise sind die Zellen von Pflanzen, Menschen oder Tieren abstammende adhärente Zellen, wie Gewebezellen, obwohl Pilzzellen sowie alle Arten von Einzellorganismen, wie Bakterien, ebenso mit Vorteil kultiviert werden können.
Die Erfindung kann ebenso zur Kultivierung von modifizierten Zellen, wie Zellinien, fusionierten Zellen, Hybridomzellen, Transformanten usw., verwendet werden. Weitere Beispiele von geeigneten Zellen werden dem Fachmann offensichtlich sein.
Der feste Träger und Reaktor der Erfindung kann ebenso zur Kultivierung von zwei oder mehreren unterschiedlichen Typen an Zellen gleichzeitig verwendet werden.
Im allgemeinen ist die Erfindung besonders zur Kultivierung von Zellen geeignet, die strenge Anforderungen an den festen Träger, der für die Zellanlagerung verfügbar ist, die Zufuhr und/oder Entfernung von gasförmigen Komponenten, wie Sauerstoff, oder beides stellen. Die vorteilhaften Eigenschaften des festen Trägers der Erfindung machen es außerdem möglich, Zellen bei sehr hohen Zelldichten und mit ausgezeichneter „dreidimensionaler" Zellanlagerung und Zellvermehrung zu kultivieren und/oder zu versorgen, wie hierin oben erwähnt.
Die gesamt Zellkapazität des Reaktors wird normalerweise von Faktoren wie der Größe des Reaktors, der Menge des darin enthaltenden festen Trägers und des verwendeten Typs an Zellen abhängen.
Im allgemeinen wird der Reaktor aufgrund der sehr großen Oberfläche, die für die Zellanlagerung verfügbar ist, der verbesserten Oxygenierung und der erreichbaren hohen Zelldichten normalerweise eine hohe Zellkapazität pro Volumeneinheit zeigen. Ebenso kann der Reaktor aufgrund der verbesserten Oxygenierung und des homogenen Flüssigkeitsflusses auf die erforderliche Kapazität vergrößert werden – beispielsweise durch Erhöhen des Volumens und/oder der Menge des festen Trägers, der in dem Reaktor vorliegt, in einer an sich bekannten Weise – ohne die Probleme des Maßstabs, die normalerweise mit großen Bioreaktoren in Verbindung gebracht werden, wie unzureichende Oxygenierung und/oder inhomogene Flüssigkeitsströmung.
Der erfindungsgemäße Reaktor ist besonders zur Kultivierung von menschlichen Leberzellen oder tierischen Leberzellen, wie Hunde- oder Schweineleberzellen, sowohl als primäre Zellen oder als immortalisierte Zellen geeignet.
Der Reaktor kann außerdem zur Kultivierung und Versorgung von Leberzell-abstammenden Zellinien, Leberzelltransformanten; und Lebertumorzellen und Hepatoblasten, sowie daraus abstammenden Zellinien, wie die transformierte C3A-Leber tumor-abstammende Zellinie, verwendet werden, wie von Sussman et al. beschrieben.
Der Ausdruck Leberzellen und/oder der äquivalente Ausdruck Hepatozyten, wie in der vorliegenden Anmeldung verwendet, umfassen daher all diese unterschiedlichen Typen an Zellen und Zellinien.
Verfahren zur Erhaltung dieser Zellen, wie Isolierung, Kultivierung, Transformation usw., sind allgemein bekannt und werden beispielsweise in dem obengenannten Stand der Technik beschrieben.
Obwohl zur Verwendung in einem BAL vorzugsweise Leberzellen mit einer Lebensfähigkeit von mehr als 80% verwendet werden, macht es das erfindungsgemäße BAL-System aus den hierin nachstehend erwähnten Gründen ebenso möglich, Leberzellen mit einer Lebensfähigkeit von nicht mehr als 70% oder sogar weniger als 40 bis 50% zu verwenden.
Dies bedeutet, daß die vorliegende Erfindung weniger strenge Anforderungen an die Zellebensfähigkeit als die BAL-Systeme des Standes der Technik, die eine Lebensfähigkeit von mehr als 80% erfordern, stellen. Dies ist ein wichtiger praktischer Vorteil im Hinblick auf die Probleme, die normalerweise mit der Realisierung dieser hohen Zellebensfähigkeiten, insbesondere mit primären Leberzellen, in Verbindung gebracht werden, wie hierin oben beschrieben.
Außerdem macht es die Erfindung möglich, Leberzellen zu verwenden, die mittels Gefrierkonservierung gelagert worden sind, was normalerweise Leberzellen mit einer Lebensfähigkeit von weniger als 60 bis 80% gewährleistet, so daß die Isolierung von frischen Leberzellen mit ausreichender Lebensfähigkeit für jedes neue BAL nicht länger erforderlich ist. Außerdem war dies mit den BAL-Systemen des Standes der Technik nicht möglich.
Wenn gewünscht, kann die Kultivierung und Versorgung der Leberzellen in der Gegenwart von zugegebenen Ergänzungsstoffen, wie Wachstumsfaktoren, Antibiotika und Hormonen, sowie zugegebenen Anlagerungsfaktoren und extrazellulären Matrixkomponenten durchgeführt werden. Diese können zu dem Perfusionsstrom selbst, bevor er in den Reaktor eindringt, durch separate Mittel, die in dem Reaktor bereitgestellt sind, wie eine separate Einheit von Hohlfasern, die für diesen speziellen Zweck bereitgestellt wird, zugegeben werden.
Ebenso kann die Erfindung zur Co-Kultivierung von Leberzellen beispielsweise mit Nicht-Parenchymleberzellen verwendet werden. Gegebenenfalls kann dies in separaten Hohlfasern, die in dem Reaktor vorliegen, durchgeführt werden.
Obwohl diese Techniken im Stand der Technik, siehe beispielsweise den obengenannten Referenzen, bekannt sind, ist ihre Verwendung aufgrund der vorteilhaften Eigenschaften des festen Trägers der Erfindung nicht immer notwendig und sicher nicht erforderlich.
Der Bioreaktor kann ebenso zum Kultivieren von Hybridomzellen – d. h. zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern – die normalerweise schlechte Anlagerung und/oder Haftung an die festen Träger zeigen, verwendet werden.
Zur Kultivierung von Zellen, werden die Zellen im allgemeinen in das bioartifizielle Reaktorsystem eingebracht, nachdem sie sich an den festen Träger während einer geeigneten Zeit anlagern und/oder anhaften können. Während dieser Anlagerungsphase wird ein Sauerstoff enthaltendes Gas oder Gasgemisch durch die Hohlfasern, wie reiner Sauerstoff, Luft oder ein Gasgemisch, enthaltend Sauerstoff, vorzugsweise 50 bis 99% Sauerstoff, stärker bevorzugt 90 bis 99% Sauerstoff, in Beimischung mit einem anderen inerten und/oder physiologisch akzeptablen Gas, wie Stickstoff oder Kohlendioxid, durch die oxygenierenden Hohlfasern geleitet und verbrauchtes Gas wird durch den Gasabgang entfernt.
Der Transport dieser Gase zu den Zellen wird im wesentlichen durch die Diffusion stattfinden, wobei ein ausreichender Gasaustausch sowohl durch die hohe verfügbare Oberfläche der Hohlfasern als auch den geringen Abstand zwischen den Zellen und der nächsten oxygenierenden Faser gewährleistet wird. Diese Diffusion-Oxy genierung vermeidet die Einschränkungen, die mit der Oxygenierung durch das flüssige Medium in Verbindung gebracht werden, sowie die Verwendung eines separaten Oxygenators, weil der Oxygenator direkt in den Reaktor selbst aufgenommen wird.
Ebenso können Nährstoffe in die angelagerten Zellen eingespeist werden, und Abfallprodukte können im allgemeinen durch einen Extraluminalflüssigkeitsstrom entfernt werden. An sich können alle bekannten und geeigneten Nährstoffe und Nährstoff enthaltenden Lösungen und Medien verwendet werden, oder die Lösung kann besonders an die Bedürfnisse der Zellen, die kultiviert werden sollen, angepaßt werden.
Dieses Nährstoffmedium wird vorzugsweise von einer Seite des Matrixmaterials eingespeist und von der anderen Seite entfernt – d. h. durch eine unidirektionale Strömung – zusammen mit gebildeten Nebenprodukten und Abfallprodukten.
Es ist ebenso möglich, separate Fasern zur kontrollierten Einspeisung einiger spezieller Nährstoffe bereitzustellen, obwohl dies im allgemeinen eine kompliziertere Konstruktion und Betrieb des Reaktors bedeutet, was aus diesem Grund nicht bevorzugt ist.
Während der Kultivierung können die Zellen bei einer gewünschten, biologisch oder physiologisch akzeptablen Temperatur gehalten werden, d. h. durch Halten des Reaktors in einem Thermostat oder durch Kontrollieren der Temperatur des Extraluminalflüssigkeitsflusses und/oder des Gasflusses in den Fasern, was einem Fachmann offensichtlich sein wird.
Beim Kultivieren der Zellen kann der Reaktor mit einer kleinen Menge an Zellen beschickt werden, nachdem sich die Zellen teilen konnten, um so den Reaktor vollständig zu besetzen. Gemäß dieser Ausführungsform wird der feste Träger der Erfindung weniger schwere Impfchargen als die Träger des Standes der Technik benötigen, wobei die Impfungen mit Mengen von 10% oder weniger oder sogar weniger als 5% der gesamten Zellkapazität ausreichend sind, um so den Reaktor durch vorteilhaftes „dreidimensionales" Wachstum vollständig zu besetzen.
Es ist ebenso möglich, mehr Zellen in den Reaktor einzuspeisen, um so das Matrixmaterial mit adhärenten Zellen vollständig zu sättigen, oder sogar eine überschüssige Menge an Zellen zu verwenden, nachdem überflüssige Zellen entfernt werden.
Ob nun mit einer geringen Menge an Impfmaterial oder einem großen Überschuß beschickt, wird der 3D-Matrixträger der Erfindung für erhöhtes „Einfangen" der Zellen sorgen, so daß die Zellen mit suboptimaler Anlagerung verwendet werden können und/oder die Zeit, die für die Anlagerungsphase benötigt wird, beträchtlich verkürzt wird. Das letztere ist von speziellem Vorteil, wenn der Reaktor als ein BAL verwendet werden soll, da die Zeit, die benötigt wird, bis ein BAL zur Verwendung fertig ist, in einer klinischen Umgebung kritisch ist.
Ebenso werden aufgrund der Extraluminalkanäle, die in dem festen Träger durch die Hohlfasern, die als Spacer, Kanalisierungsmittel oder Prallfläche agieren, nach der Einführung in den Reaktor beispielsweise durch Injizieren einer Zellsuspension gebildet werden, die Zellen schneller und gleichmäßiger über den gesamten Träger verteilt, was die Zeit, die für die Anlagerungsphase benötigt wird, noch weiter verringert und zu einer homogeneren Zellverteilung führt.
Im allgemeinen wird die Anlagerungsphase 30 Minuten bis 5 Stunden in Abhängigkeit der speziellen verwendeten Zellen dauern.
Gemäß einem speziellen Aspekt der Erfindung macht es, wenn die Zellprobe, die in den Reaktor eingeführt werden soll, sowohl lebensfähige als auch nicht-lebensfähige Zellen enthält, die einzigartige Gestalt des Reaktors möglich, die lebensfähigen von den nicht-lebensfähigen Zellen zu trennen, wie es hierin nachstehend in bezug auf die Kultivierung von Leberzellen beschrieben wird.
Weitere Vorteile des erfindungsgemäßen Bioreaktors sind, daß während der Anlagerungsphase die Sedimentation der Zellen als ein großes Pellet auf dem Boden des Bioreaktors ausgeschlossen werden kann. Dies wird ebenso hierin nachstehend beschrieben.
Nach der Anlagerungsphase und gegebenenfalls einer Zellwachstumsphase und/oder der Erreichung eines stabilen Zustands wird der geimpfte Reaktor im allgemeinen für seine beabsichtigte Verwendung fertig sein. Während dieser Verwendung werden die Zellen normalerweise in/bei ausreichender Menge, Lebensfähigkeit und Aktivität aufrechterhalten, d. h. durch Aufrechterhalten biologisch und/oder physiologisch akzeptabler Bedingungen, während das flüssige Medium, das behandelt werden soll, in die Zellen normalerweise durch den Extrafaserraum eingespeist wird. Für die meisten Verwendungen und mit den meisten Zellen wird es der Bioreaktor möglich machen, die Lebensfähigkeit und Aktivität bei höheren Niveaus während eines längeren Zeitraums aufrechtzuerhalten als die Verfahren des Standes der Technik.
Obwohl die Erfindung hierin nachstehend in bezug auf die Kultivierung von Leberzellen und die Verwendung als eine bioartifizielle Leber weiter beschrieben wird, wird es erwartet, daß der erfindungsgemäße Bioreaktor ebenso für andere bioartifizielle Systeme vorteilhaft verwendet werden kann.
An sich kann der feste Träger und/oder der Bioreaktor der Erfindung beispielsweise in einer bioartifiziellen Bauchspeicheldrüse, einer bioartifiziellen Niere und/oder einer bioartifiziellen Nebenschilddrüse, artifiziellem Knochenmark, Systemen, die derzeit auf Hohlfaserreaktoren, wie hierin oben beschrieben, basieren, verwendet werden. Die Verwendung der Erfindung in diesen Systemen wird ebenso zu den Vorteilen der Erfindung, wie verbesserte Zellanlagerung und -kapazität, direkten Kontakt der Zellen mit dem flüssigen Medium und/oder verbesserte Oxygenierung sowie längere effektive Arbeitszeit, führen.
Der erfindungsgemäße Bioreaktor kann ebenso zur Herstellung, Biokonversion und/oder Entfernung von Substanzen in oder aus einem flüssigen oder gasförmigen Medium unter Verwendung von Zellen, die zu den gewünschten biologischen Reaktionen fähig sind, verwendet werden. Für diese und andere Anwendungen stellt die Erfindung vorteilhaft eine hohe Oberfläche, die zum Gasaustausch zwischen dem Faserhohlraum und dem Extraluminalraum durch die Hohlfaserwand verfügbar ist, sowie den direkten Flüssigkontakt zwischen den Zellen in dem extrazellulären Raum und dem flüssigen Medium bereit, wobei das letztere von besonderer Wichtigkeit bei der Degradation, Biokonversion oder Herstellung von biologischen Substanzen mit einem hohen Molekulargewicht, wie Polypeptide, ist. Die hergestellten Substanzen können dann aus dem flüssigen Medium, das aus dem Bioreaktor stammt, in einer an sich bekannten Weise isoliert werden.
Andere vorteilhafte Verwendungen des erfindungsgemäßen Bioreaktors werden dem Fachmann offensichtlich sein.
Verwendung des festen Trägers und des Bioreaktors der Erfindung als eine bioartifizielle Leber
Wie hierin zuvor angegeben, machen die vorteilhaften Eigenschaften des festen Trägers und des Bioreaktors der Erfindung sie zur Verwendung in oder als bioartifizielles Lebersystem besonders geeignet.
In solch einem System werden geeignete Leberzellen unter Verwendung des festen Trägers und/oder des Bioreaktors der Erfindung kultiviert und/oder versorgt, wie hierin oben beschrieben.
Deshalb umfaßt im allgemeinen das erfindungsgemäße bioartifizielle Lebersystem einen erfindungsgemäßen Bioreaktor und wird in der Regel ebenso Leberzellen umfassen, wie hierin oben definiert, die normalerweise in dem extraluminaren Raum vorliegen, stärker bevorzugt an das Matrixmaterial des festen Trägers angelagert sind.
Während der Verwendung wird der Bioreaktor betriebsbereit mit dem Blutkreislauf eines Patienten durch einen Flüssigkeitskreislauf verbunden, so daß ein flüssiges Medium direkt oder indirekt, das aus dem Patienten stammt, in die Leberzellen in dem extraluminaren Raum eingespeist wird, nachdem die Zellen die meisten oder alle der Funktionen durchführen konnten, die normalerweise durch die Leber in vivo durchgeführt werden. Nach der Behandlung durch die Leberzellen wird das flüssige Medium zu dem Patienten rückgeführt.
Das erfindungsgemäße BAL-System wird daher außerdem einen Flüssigkeitskreislauf zur Zirkulation des flüssigen Mediums umfassen sowie an sich bekannte Pumpmittel zur Kontrolle des Flüssigkeitsstroms durch diesen Kreislauf. An sich kann der erfindungsgemäße Bioreaktor in irgendeinen, an sich bekannten Kreislauf eingeführt werden, wie beispielsweise in dem obengenannten Stand der Technik beschrieben, bei dem der erfindungsgemäße Bioreaktor beispielsweise das Hohlfaser-BAL-System ersetzen wird.
Der Kreislauf kann ebenso weitere Mittel zur Behandlung des flüssigen Mediums, wie eine Aktivkohlesäule zur Absorption von hydrophilen Toxinen und/oder eine Harzsäule zur Adsorption von hydrophoben Substanzen (beispielsweise Bilirubin), enthalten.
Der Flüssigkeitskreislauf kann ebenso Zellfilter zur Entfernung von Zellen aus dem Flüssigkeitsstrom umfassen. Wenn sie verwendet werden, um tote Leberzellen aus der Zirkulation des Patienten fernzuhalten, wird dieser Zellfilter normalerweise nach dem Bioreaktor plaziert.
Der Flüssigkeitskreislauf kann ebenso Mittel zur Zugabe von Nährstoffen und anderen gewünschten Substanzen zu dem flüssigen Medium umfassen, obwohl in dieser Hinsicht das flüssige Medium, das aus dem Patienten stammt, selbst ausreichend sein kann, um die Leberzellen in dem Reaktor lebensfähig zu halten. Ebenso können separate Fasersysteme zur Zugabe von Nährstoffen in dem Reaktor bereitgestellt werden, wie hierin oben beschrieben.
Während der Verwendung kann das erfindungsgemäße BAL-System mit Vollblut – entweder arteriell oder venerisch – das aus dem Patienten stammt, in einer an sich bekannte Weise perfundiert werden. In diesem Fall müssen die Leberzellen in dem Reaktor für das Blut des Patienten immunologisch verträglich sein, so daß norma lerweise menschliche Leberzellen oder daraus abstammende Zellen und Zellinien verwendet werden. Die weniger bevorzugte Verwendung von Xenozyten könnte die Unterdrückung des Immunsystems erforderlich machen.
Jedoch wird das erfindungsgemäße BAL vorzugsweise mit Plasma, das aus einem Patienten stammt, perfundiert. In dieser bevorzugten Weise der Plasmaperfusion wird der Kreislauf normalerweise einen Plasmaseparator oder Plasmaphereseeinheit zum Trennen des Plasmas von dem Vollblut, das aus dem Patienten stammt, umfassen. Die Verwendung der BAL-Systeme auf Basis der Plasmapherese sowie geeigneter Plasmaphereseeinheiten sind in dem Gebiet allgemein bekannt und werden beispielsweise in dem obigen Stand der Technik beschrieben.
In seiner Plasmaphereseweise kann der Kreislauf ebenso immunologische Barrieren umfassen, um die Blutzirkulation des Patienten von der Plasmazirkulation durch den Reaktor immunologisch getrennt zu halten, was es möglich macht, Xenozyten, wie Schweinehepatozyten, ohne die Notwendigkeit der Unterdrückung des Immunsystems zu verwenden. Normalerweise wird der/die Plasmaseparator/Plasmaphereseeinheit selbst in gewissem Maße die immunologische Trennung bereitstellen. Der Kreislauf kann jedoch ebenso (weitere) Trennmittel, wie Membranen, Säulen oder Hohlfasermodule mit einem geeigneten Molekulargewichtsschnitt, wie hierin oben beschrieben, entweder vor oder nach dem Reaktor plaziert, und/oder spezielle Säulen zur Adsorption von Antigenen und/oder Antikörpern usw., enthalten, wie sie für einen Fachmann bekannt sind.
Wie hierin oben erwähnt, muß eine separate Oxygenierungseinheit nicht in den Kreislauf des flüssigen Mediums eingeführt werden, selbst wenn die Plasmaperfusion verwendet wird.
Eine Anzahl von möglichen Konfigurationen des erfindungsgemäßen BALs in dem bevorzugten Plasmapheresemodus wird in den 5 bis 9 gezeigt.
5 zeigt eine Konfiguration, bei der arterielles Blut von dem Patienten durch den Infusionsschlauch 11 gegebenenfalls mittels der Pumpe 12 in die Plasmapherese einheit 13 eingespeist wird, wo das Plasma von dem Vollblut getrennt wird, das durch den Infusionsschlauch 14 zu dem Patienten rückgeführt wird.
Das Plasma wird dann direkt durch den Infusionsschlauch 15 gegebenenfalls mittels der Pumpe 16 in den Leberzellen-enthaltenden Bioreaktor 17 eingespeist und von dort direkt zu dem Venenblut im Infusionsschlauch 14 mittels des Infusionsschlauches 18 rückgeführt.
Ein Sauerstoff-enthaltendes Gas wird in die Hohlfasern mittels der Einspeisung 19 eingespeist und das Kohlendioxid-angereicherte Gas wird durch den Infusionsschlauch 20 abgelassen.
6 zeigt eine Konfiguration namens „Schleife für hohen Fluß", die zur Rezirkulation des Plasmas über den Reaktor mittels des zusätzlichen Infusionsschlauchs 21, ausgestattet mit der Pumpe 22, konstruiert ist.
In 7 ist der Kreislauf mit einem Zellfilter 23 ausgestattet, um die toten Zellen, die aus dem Reaktor ausgespült werden, aus der Zirkulation des Patienten herauszuhalten.
In 8 ist der Kreislauf mit einer Hohlfasermembranpatrone 24 zur immunologischen Trennung ausgestattet, die in der Schleife für den hohen Fluß nach dem Reaktor plaziert ist.
In den 9a und 9b ist der Kreislauf mit einer immunologischen Vorbehandlungssäule und/oder Säulen zur hydrophilen und/oder hydrophoben Toxinentfernung ausgestattet, wie hierin oben beschrieben, wobei Schritt 25 entweder in (9a) oder außerhalb (9b) der Schleife für den hohen Fluß eingebracht ist.
Es wird dem Fachmann offensichtlich sein, daß die gesamte unterschiedliche Vorrichtung, die oben erwähnt und in den Figuren gezeigt werden, in einem Kreislauf kombiniert werden kann.
Die unterschiedlichen Elemente des BAL-Kreislaufes können als ein integriertes System in einem Einzelgehäuse bereitgestellt werden, oder das BAL-System kann aus separat verbundenen Elementen bestehen.
Obwohl abhängig von der Geometrie und Kapazität, der Menge und Aktivität der Zellen, die in dem Reaktor vorliegen, der gewünschten therapeutischen Anwendung und anderen Faktoren, kann das erfindungsgemäße BAL verwendet werden, um 1 bis 300 ml des flüssigen Mediums, das von einem Patienten stammt, pro Minute zu behandeln.
Um dies zu erreichen, kann das flüssige Medium direkt in den Reaktor 17 bei einer entsprechenden Geschwindigkeit, wie in 5 gezeigt, eingespeist werden.
Jedoch wird vorzugsweise der erfindungsgemäße Bioreaktor in eine „Schleife für hohen Fluß" eingeführt, wie an sich aus dem obengenannten Stand der Technik bekannt ist und in 6 gezeigt wird.
In solch einer Schleife, die durch den Reaktor 17, Infusionsschlauch 21 und Pumpe 22, und Teile der Infusionsschläuche 15 und 18 gebildet wird, wie in 6 gezeigt, kann der Fluß des flüssigen Mediums über den Reaktor 17 bei einer höheren Geschwindigkeit als der Fuß des flüssigen Mediums aus dem Patienten durch die Infusionsschläuche 11 und 14 gehalten werden, wodurch die Rezirkulation des flüssigen Mediums über den Reaktor 17 bereitgestellt wird. Normalerweise wird dies durch die geeignete Kontrolle der Pumpen 16, 22 bzw. 18a durch deren Halten bei einem geeigneten Fließverhältnis, normalerweise 1 : 2 : 1 bis 1 : 100 : 1, durchgeführt.
Das erfindungsgemäße BAL kann ebenso zwei oder mehrere erfindungsgemäße Bioreaktoren, die hintereinander und/oder parallel verbunden sind, umfassen; die beispielsweise denselben Typ und/oder unterschiedliche Typen von Leber- oder anderen Zellen enthalten.
Das erfindungsgemäße bioartifizielle Lebersystem kann verwendet werden, um die Leberfunktion bei Patienten mit vergleichbarer Leberfunktion zu unterstützen und/oder zu ersetzen, und/oder in Fällen, bei denen der artifizielle Leberträger gewünscht und/oder erforderlich ist. Das BAL-System kann beispielsweise bei Patienten verwendet werden, die unter fulminanter Hepatitis (FHF), beispielsweise aufgrund von Virushepatitisinfektionen oder akuter Lebervergiftung (beispielsweise mit Acetaminophen, CCl₄, Alkohol oder Drogen), sowie transitorischer Leberischämie und Lebertrauma aufgrund von Verletzung leiden. Die artifizielle Leber kann ebenso verwendet werden, um den Zustand des Patienten vor der Lebertransplantation zu verbessern, die Zeit vor der Lebertransplantation zu überbrücken, die Abstoßungszeit nach der akuten Abstoßung einer transplantierten Leber zu überbrücken, während der anhepatischen Phase, während eine Lebertransplantation durchgeführt wird und/oder während der Rückgewinnung eines Lebertransplantats, oder um die Regenerierungszeit der eigenen Leber des Patienten zu ermöglichen.
Außerdem kann das erfindungsgemäße BAL-System bei der Behandlung von chronischen Lebererkrankungen verwendet werden, um die Lebensqualität des Patienten zu verbessern und/oder die Zeiten der Verschlimmerung zu überbrücken.
Das erfindungsgemäße BAL-System kann ebenso verwendet werden, um die relativ kurze Krise der Patienten zu überbrücken, was es ihrer Leber ermöglicht, sich zu regenerieren, wodurch das Trauma und die Kosten des Transplantats eingespart werden.
An sich wird das erfindungsgemäße BAL vorzugsweise kontinuierlich verwendet, obwohl die in Abständen auftretende Verwendung ebenso in Betracht gezogen wird.
Um den Bioreaktor zu erhalten, können die Leberzellen in den Bioreaktor in einer an sich bekannten Weise und/oder wie oben beschrieben eingeführt werden.
Gemäß einer Ausführungsform wird nur eine geringe Menge an Zellen in den Reaktor geimpft, nachdem die Zellen wachsen und sich teilen konnten, bis der Bioreaktor seine maximale Kapazität erreichte, und/oder ein stabiler Zustand erreicht wird, wonach der Reaktor als ein BAL verwendet werden kann.
In dieser Ausführungsform werden daher der Träger und der Bioreaktor zur Kultivierung von Leberzellen sowie dem bioartifiziellem Lebersystem selbst verwendet. Es wird deutlich sein, daß gemäß diesem Aspekt der Erfindung der feste 3D-Träger der Erfindung das Zeltwachstum und die Zellteilung unterstützen wird, insbesondere im Vergleich zu den Hohlfasersystemen des Standes der Technik, in denen das Zellwachstum und die Teilung normalerweise eingeschränkt oder sogar ausgeschlossen sind.
Diese Ausführungsform wird normalerweise nicht für Leberzellen geeignet sein, die nicht in der Lage sind, sich zu teilen und zu wachsen, nachdem sie isoliert worden sind, wie primäre Leberzellen. Es wird jedoch erwartet, daß sogar mit primären Leberzellen der feste Träger der Erfindung das Auftreten von etwas Wachstum und Teilung unterstützen wird, insbesondere im Vergleich zum Stand der Technik. Die Kultivierung von primären Leberzellen unter Verwendung des festen Trägers und/oder des Bioreaktors der Erfindung gegebenenfalls mit der Verwendung von Wachstumsfaktoren usw. wird daher ausdrücklich in den Umfang der vorliegenden Erfindung einbezogen.
Gemäß einer anderen Ausführungsform wird die Menge an Zellen weitgehend der Kapazität des Bioreaktors entsprechen und/oder diese überschreiten. In diesem Fall werden die Zellen zu dem Reaktor zugegeben und können an dem festen Träger haften, nachdem die überschüssigen nicht-angelagerten Zellen beispielsweise durch Waschen entfernt werden. Danach kann der Bioreaktor als oder in einem BAL gegebenenfalls nach Erreichen eines stabilen Zustandes verwendet werden.
Diese Ausführungsform wird im allgemeinen den Vorteil aufweisen, daß das BAL-System nach kürzester Zeit im Vergleich zu den Systemen des Standes der Technik betriebsbereit ist, gemäß der Erfindung normalerweise zwischen 0,5 bis 6 Stunden, in den meisten Fällen rund 2 Stunden. Ebenso ist diese Ausführungsform besonders für die Verwendung von primären Leberzellen geeignet.
Im allgemeinen wird das BAL mit 1·10⁵ bis 1·10⁸ Zellen/ml, normalerweise rund 1 bis 50·10⁶ Zellen/ml (Volumeneinheit) und auf eine Gesamtkapazität von 10⁸ bis 10¹¹ Zellen, d. h. rund 1 bis 1000 g Zellen, vorzugsweise 100 bis 500 g Zellen, geimpft.
Der Reaktor wird normalerweise durch Injizieren einer Suspension der Leberzellen in den Reaktor geimpft, erhalten beispielsweise durch Kultivieren von Zellen durch Suspendieren von Leberzellen in einem geeigneten flüssigen Medium oder nach Isolierung, wonach sich die Zellen selbst in dem Reaktor verteilen und selbst an den festen Träger während eines geeigneten Zeitraumes, normalerweise 1 Minute bis 5 Stunden oder mehr, vorzugsweise etwa 30 Minuten bis 3 Stunden, und stärker bevorzugt rund 2 Stunden haften können. Im Vergleich zu dem Reaktor von Gerlach et al kann die Anlagerungsphase bis zu 8 Stunden oder mehr dauern.
Um die Verteilung der Zellsuspension noch weiter zu erleichtern, kann der Reaktor, nachdem die Zellsuspension injiziert worden ist, bewegt werden.
Gemäß einer stark bevorzugten Ausführungsform wird der Reaktor nach der Injektion der Zellsuspension in Abständen, aber vorzugsweise kontinuierlich um seine Längsachse, d. h. die Richtung der Hohlfasern in dem festen Träger, während des obengenannten Zeitraums bei einer Geschwindigkeit von 0,01 bis 100 U/min, vorzugsweise 0,1 bis 10 U/min, stärker bevorzugt rund 1 U/min, gedreht. In der bevorzugten Ausführungsform, die in 11 gezeigt wird, wird der Bioreaktor 28, der in den 3/4 gezeigt wird, um eine Mittelachse 29 gedreht, wobei der Reaktor durch Befestigungsmittel 30, wie eine Klemmvorrichtung von geeigneter Größe (nicht gezeigt), an der Achse befestigt ist.
Dieses Verfahren der Verteilung der Zellen in dem Reaktor verhindert die Bildung eines Zellpellets am Boden des Bioreaktors, was zu Stoffübertragungsproblemen während der Verwendung führen würde, insbesondere in bezug auf die Zellen in der Mitte des Pellets, was zum Verlust der funktionellen Aktivität und/oder Lebensfähigkeit führen kann. Durch Drehen des Reaktors und vorzugsweise das periodische Umkehren der Rotationsrichtung verändert sich die Richtung der Sedimentation kontinuierlich, und es kann in Betracht gezogen werden, daß die Zellen in der Suspension einem beinahe kreisförmigen Weg durch den Reaktor folgen, so daß die Zellen wiederholt mit dem Matrixmaterial in Kontakt kommen, wodurch die Chancen des Einschlusses durch die Polyesterfasern in das Matrixmaterial stark verbessert werden, so daß eine homogene Immobilisierung bei einer hohen Rate und Anlagerungsgeschwindigkeit erhalten wird.
Nachdem die Immobilisierung der Zellen beendet ist, wird die verbleibende Suspension, die nicht-angelagerte und/oder überschüssige Zellen enthält, aus dem Reaktor entfernt, wonach der Reaktor gegebenenfalls ausgewaschen und/oder mit einem geeigneten flüssigen Medium gespült werden kann.
Ebenso können durch Bewegen und vorzugsweise Rotieren des Reaktors lebende Zellen zumindest in gewissem Maße von toten Zellen, die in der injizierten Zellsuspension vorliegen, getrennt werden, insbesondere wenn eine kultivierte Suspension von primären Leberzellen verwendet wird. Die lebenden Zellen werden durch den festen Träger eingeschlossen und/oder haften an ihm, während die nicht-haftenden toten Zellen mit der verbleibenden Suspension oder durch Waschen des Reaktors entfernt werden.
Ebenso können durch Perfundieren des Reaktors mit einem geeigneten flüssigen Medium tote Zellen aus dem Reaktor ausgewaschen werden. Dieses „Auswaschen" von toten Zellen kann sogar während der Verwendung stattfinden, d. h. während der Reaktor mit dem Perfusionskreislauf verbunden ist. In diesem Fall wird die Einführung eines Zellfilters 23 in den Flüssigkeitskreislauf nach dem Reaktor, wie in 7 gezeigt, stark vorteilhaft sein.
Diese günstige Entfernung von toten Zellen kann nicht mit den Hohlfaserbioreaktoren des Standes der Technik erreicht werden, da in diesen Reaktoren die Leberzellen im wesentlichen in einem eingeschlossenen „Kompartiment" zwischen den Hohlfasern ohne der Notwendigkeit des Perfundierens dieses Raums oder eingefangen in dem (Hydro)gel vorliegen.
Während der Verwendung werden die Leberzellen in dem Reaktor in einer an sich bekannten Weise gehalten. Das erfindungsgemäße BAL wird vorzugsweise bei einer physiologisch akzeptablen Temperatur, vorzugsweise rund 37°C, gehalten. Ebenso können zusätzliche Nährstoffe und andere geeignete Substanzen zu dem Reaktor zugegeben werden, wie und wenn es erforderlich ist.
Die Leberzellen werden durch Einspeisen von Sauerstoff oder eines Sauerstoff-angereicherten Gases, wie „Carbogen" (ein 95 : 5 O₂/CO₂-Gemisch) oder einem CO₂-angereicherten Sauerstoff-enthaltenden Gas, wie „Kulturgas" (95% Luft, 5% CO₂) oxygeniert. Dieses Gas kann durch irgendein geeignetes Mittel, wie einen Gaszylinder oder eine Gaspumpe, oder durch Verbinden mit einer äußeren Gaszufuhr eingespeist werden. Wie hierin zuvor angegeben, bedeutet dieses Verfahren der direkten Oxygenierung durch eng gepackte Hohlfasern, daß die Erzeugung von schädlichen Sauerstoff- und/oder Kohlendioxidgradienten vermieden wird. Ebenso kann während der Perfusion das verwendete flüssige Medium eine weitere „Mischwirkung" auf die Gaszufuhr aufweisen, was diese Gradienten noch weiter verringert.
Vor oder während der Verwendung können die funktionelle Wirkung und die Stoffwechselleistung des Bioreaktors und der darin enthaltenden Zellen in einer an sich bekannten Weise mit irgendeinem der zahlreichen Tests, die für diese Zwecke verfügbar sind, wie Messung der Proteinsynthese, Harnstoffbildung, Sauerstoffaufnahme (wofür vorteilhaft die direkte Messung bei der Gaszuleitung und dem Gasabgang verwendet werden kann), Zytochrom-P450-Aktivität, Medikamentenstoffwechselassays, Clearance-Techniken usw., siehe beispielsweise Rozga et al, hierin zuvor erwähnt, überwacht werden. Ebenso kann ein Biomasse-Meßgerät (Aber) verwendet werden, das Leitfähigkeitsmessungen, basierend auf den Unterschieden im Membranpotential zwischen toten Zellen und lebenden Zellen, verwendet. Ein solches Meßgerät ist dem Fachmann bekannt.
Die Verwendung der bioartifiziellen Leber der Erfindung wird natürlich alle Vorteile, die mit der Verwendung des festen Trägers und des Bioreaktors der Erfindung in Verbindung stehen, sowie eine Vielzahl von weiteren Vorteilen gewährleisten, wie:

– Verbesserte Anlagerung der Leberzellen und verbesserte Zellkapazität pro Volumeneinheit aufgrund der Gegenwart eines geeigneten Matrixmaterials. Der feste Träger bietet ebenso eine verbesserte Umgebung für das Zellwachstum und die Zellteilung.
– Verbesserte Oxygenierung der Leberzellen aufgrund der Gegenwart der Oxygenierungsfasern ohne die Notwendigkeit eines separaten Oxygenators und ohne das Auftreten von schädlichen Gradienten.
– Direkter Flüssigkontakt zwischen den Leberzellen und dem Blut oder Plasma, das behandelt werden soll, ohne die Notwendigkeit Toxine und/oder Lebersekrete durch eine Membran mit den verbundenen Stoffübertragungs- und Molekularschnittproblemen zu führen.
– Der Reaktor kann leicht auf die für die therapeutische Verwendung erforderliche Kapazität „vergrößert" werden.
– Eine einfache Konstruktion, die einfach hergestellt und betrieben werden kann, in ihrer einfachsten Form, die nur eine(n) Flüssigkeitszuleitung/-abgang und eine(n) Gaszuleitung/-abgang benötigt. Ebenso ist keine teure Vorbehandlung des festen Trägers erforderlich.
– Im Vergleich zu den Systemen des Standes der Technik stellt der erfindungsgemäße Bioreaktor weniger strenge Anforderungen an die verwendeten (primären) Leberzellpräparate, insbesondere in bezug auf die Lebensfähigkeit und Anlagerung.
– Die Geschwindigkeit und Rate der Zellanlagerung nach der Impfung wird verringert, so daß die Zeit, bis das BAL betriebsbereit ist, verkürzt wird und weniger Leberzellen erforderlich sind.

Schließlich ist ein Hauptvorteil der Verwendung des festen 3D-Trägers und des Bioreaktors der Erfindung als ein BAL und/oder bei der Kultivierung und/oder Versorgung von Leberzellen sowie dem obengenannten Rotationsverfahren zur Impfung des Reaktors der, daß die Zellen in dem Reaktor als kleine Zellaggregate vorliegen und/oder gehalten werden, wobei zumindest ein Durchmesser nicht größer als 10 Zellen, vorzugsweise nicht größer als 6 bis 8 Zellen (100 μm) ist. Es ist in der Technik allgemein bekannt, daß diese Hepatozytaggregate, die während eines längeren Zeitraums funktionieren und lebensfähig bleiben, aktiver und besser differenziert als Hepatozyten sind, die in Einzelschichten oder auf 2D-Trägern oder Hohlfasern wachsen. Ebenso ist die Morphologie der Zellen, kultiviert in solchen kleinen Aggre gaten, ähnlich der Morphologie von Leberzellen in der Leber in vivo. Ebenso gibt es, da diese Aggregate von relativ geringer Größe sind (nur 6 bis 8 Zellen im Durchmesser), keine Probleme in bezug auf die Stoffübertragung zu den Zellen in der Mitte der Aggregate, wie mit den Leberzellen, die in großen (> als 200 μm) Aggregaten, wie die 500 μm Aggregate, in dem Reaktor von Gerlach et al. kultiviert oder in Mikrokapseln immobilisiert werden.
Die Erfindung macht es daher möglich, Leberzellen in einem Reaktor mit hoher Kapazität bei sehr hohen Zelldichten zu kultivieren, d. h. 20 bis 40 × 10⁶ Zellen/ml oder mehr. Es kann ebenso gesagt werden, daß im allgemeinen und im Vergleich zu BAL-Systemen des Standes der Technik der feste Träger der Erfindung eine Umgebung bereitstellt, die den/der biologischen Bedingungen/Umgebung der Zellen in der Leber genauer entspricht.
Natürlich bedeuten diese Merkmale ebenso, daß das BAL der Erfindung große Vorteile aus einer therapeutischen Sicht, insbesondere im Vergleich zu den Systemen des Standes der Technik, aufweist. Das BAL wird im allgemeinen für einen längeren Zeitraum therapeutisch wirksam sein, zeigt verbesserte Wirksamkeit und kann mit ausreichender Kapazität für den Leberersatz leicht bereitgestellt werden.
Ein weiterer praktischer Vorteil des BAL der Erfindung ist, daß es in einem Autoklav sterilisiert werden kann (20 Minuten bei 120°C). Die Systeme des Standes der Technik benötigen die Gassterilisation mit toxischen Gasen, wie Ethylenoxid, das noch in dem Reaktor vorliegt und durch die Reaktorfasern abgegeben wird, Wochen nachdem der Reaktor sterilisiert worden ist.
Schließlich macht es das erfindungsgemäße BAL für die erste Zeit möglich, gefrierkonservierte primäre Hepatozyten in einem bioartifiziellem Lebersystem erfolgreich einzusetzen, was die Möglichkeit der zentralisierten Isolierung und Konservierung eröffnet, nachdem die Zellen in den Krankenhäusern verteilt werden, wo sie gelagert werden können, bis sie benötigt werden. Zusammen mit der verkürzten Anlagerungsphase des erfindungsgemäßen BAL bedeutet dies, daß in einer klinischen Um gebung das erfindungsgemäße BAL einem Arzt eher und zu geringeren Kosten zur Verfügung gestellt werden kann.
Die Erfindung wird nun mittels der folgenden nicht-einschränkenden Beispiele dargestellt.
Beispiel 1: in vitro-Tests
Die Entwicklung eines Lebererhaltungssystems zur Behandlung von Patienten mit fulminanter Hepatitis und als eine Überbrückung der Lebertransplantation ist eine signifikante Herausforderung. Viele frühe Versuche konzentrierten sich auf die Blutentgiftung, sich auf die Annahme stützend, daß das Leberversagen umgekehrt werden kann, wenn die damit verbundenen Toxine aus dem Kreislauf des Patienten entfernt wurden. Obwohl die Verbesserung des neurologischen Status bei Patienten berichtet worden ist, erreichte keiner langfristiges Überleben. Es wurde daher beschlossen, daß ein effektives Lebererhaltungssystems in der Lage sein sollte, die mehreren Synthese- und Stoffwechselfunktionen der Leber, einschließlich Entgiftung und Ausscheidung, auszuführen. Der logischste Ansatz für dieses Problem, ist die Einführung von aktiv funktionierenden Hepatozyten. Die Ausführungsform des Standes der Technik dieser Theorie wird in der bioartifiziellen Leber (BAL) dargestellt, wobei eine extrakorporale Vorrichtung gut ernährte und oxygenierte lebensfähige Hepatozyten umfaßt, die auf einem mechanischen Träger immobilisiert und aus dem Blutkreislauf durch semipermeable Membranen getrennt wurden.
Ziele wie Biokompatibilität, Aufrechterhaltung der funktionellen Kapazität und Durchführbarkeit, wichtige Aspekte bei der Entwicklung des BAL, sind im Stand der Technik diskutiert worden. Jedoch erfüllen die gegenwärtigen Bioreaktorkonstruktionen nicht die wesentlichen Bedingungen zur optimalen Stoffübertragung zu und aus den Hepatozyten, wie sie in der intakten Leber vorliegen. In dieser Hinsicht ist der Einfluß der Bioreaktorkonstruktion auf die Hepatozytfunktion unterbewertet worden.
Das Ziel unserer Studie war, eine Bioreaktorkonfiguration zu entwickeln, die eine Hepatozytkultur hoher Dichte ermöglicht und gleichzeitig sicherstellt, daß jeder He patozyt unter in vivo ähnlichen Perfusionsbedingungen und direktem Mediumkontakt wirksam arbeitet, wodurch die physiologische Stoffübertragung genauer nachgeahmt wurde. Außerdem wollten wir Hepatozyten als kleine Aggregate kultivieren, die dahingehend bekannt sind, daß sie viel der in vivo gefunden Cyto-Architekturmerkmale aufrechterhalten und höhere und verlängerte funktionelle Aktivität im Vergleich zu Hepatozyten, die als Einzelschichten kultiviert wurden, aufweisen.
Ein anderes Ziel war, einen Bioreaktor zu entwickeln, der vergrößert werden kann, um eine ausreichende Zellmasse zur therapeutischen Lebererhaltung einzubringen. Dies führte zu einer neuen Bioreaktorkonstruktion, umfassend eine spiralförmig gewickelte, nicht-gewebte 3D-Polyestermatrix und einen integrierten Oxygenator, in dem sich Hepatozyten reorganisieren und als kleine Aggregate immobilisieren.
Hierin werden nachstehend die Merkmale und die in vitro-Ergebnisse der neuen Bioreaktorkonstruktion einer Ausführungsform der Erfindung dargestellt.
1. Materialien und Verfahren
1.a. Hepatozytisolierung
Schweinelebern wurden freundlicherweise von der Abteilung der klinischen und experimentellen Kardiologie des AMC, Amsterdam, der Abteilung der Dermatologie des AMC, Amsterdam und einem örtlichen Schlachthaus bereitgestellt. Die Hepatozyten wurden aus den Schweinen mit einer Körpermasse von 20 bis 25 kg unter Verwendung einer einfachen Zweischritt-Kollagenase-Perfusionstechnik isoliert, wie zuvor beschrieben (te Velde AA, Ladiges NCJJ, Flendrig LM, Chamuleau RAFM, J Hepatology 1995; 23: 184–192). Die Lebensfähigkeit der isolierten Zellen, basierend auf Trypanblauausschluß, variierte von 71 bis 96% (n = 8, Mittelwert 89 ± 7%). Die Ausbeute variierte von 8·10⁶ bis 30·10⁶ Hepatozyten pro g Naßlebergewicht für unterschiedliche Isolierungen.
1.b. Bioreaktor
Der Bioreaktor basiert auf einem nicht-gewebten 3D-Polyestergewebe, insbesondere konstruiert zur Kultivierung festsitzender Zellen (Bibby Sterilin Ltd., Stone, Staffordshire, GB), und hydrophoben Polypropylen-Hohlfasern, gespendet von Dr. J. Vienken von AKZO-NOBEL (Plasmaphan, AKZO-NOBEL, Wuppertal, Deutschland), zur Oxygenierung und Kohlendioxidentfernung. Das 3D-Gewebe (Dimensionen: Länge 140 mm, Breite 90 mm, Dicke 0,5 mm, Faserdurchmesser 13 μm) stellt ein Gerüst zur Hepatozytimmobilisierung und Selbstaggregation bereit. Ihre Oberfläche zur Anlagerung beträgt etwa das 15fache seiner projizierten Oberfläche, was eine Hepatozytkultur hoher Dichte ermöglicht. Die Oxygenierungshohlfasern (äußere Durchmesser 630 μm, innere Durchmesser 300 μm) werden an den 3D-Träger in einer parallelen Weise durch Weben gebunden, in Abständen bei einem durchschnittlichen Abstand von 2 mm angeordnet. Im allgemeinen wird dies durchgeführt durch das drei- oder mehrfache Falten des Matrixmaterials, das Herstellen einer Vielzahl von Löchern in dem gefalteten Matrixmaterial mit einem Abstand von 2 mm mittels einer Nadel, das Stecken der Hohlfasern von geeigneter Länge durch die so erhaltenen Löcher und dann erneut das Strecken des gefalteten Matrixmaterials in die Richtung der Fasern, um so die Falten zu entfernen, was ein Matrixmaterial ergab, wobei die Hohlfasern in eine unidirektionale, parallele Weise gerichtet sind.
Dieser Polyester-Polypropylen-Verbundstoff wird wie eine Biskuitrolle mit der Hilfe eines Acrylkerns (3) spiralförmig aufgewickelt und in einem Polysulfondialysegehäuse plaziert (Minifilter, Amicon Ltd, Irland, ID 1,4 cm, AD 1,7 cm, Gesamtlänge 15,5 cm). Die Oxygenierungshohlfasern werden in Polyurethanharz (PUR-System 725A und 725 BF, Morton International, Bremen, Deutschland) unter Verwendung von Dialysegerät-Verkapselungstechniken eingebettet und mit Gaszuleitungs- und -abgangsdeckeln ausgestattet.
Der resultierende Bioreaktor wird in 12 gezeigt, wobei 31 das Gehäuse ist, 32 die Polyurethanverkapselung ist, 33 die/der Extrafaserhohlraumzuleitung und -abgang ist, bzw. 34 der Extrafaserhohlraum ist und 35 die Hohlfasern sind.
Der Bioreaktor wird durch Autoklavenbehandlung (20 min bei 121°C) sterilisiert. Die Hepatozytimpfung in den Extrafaserraum (Volumen 11 ml, geeignet für zukünftige in vivo-Experimente an der Ratte) wird durch Injizieren der Zellsuspension durch die Ablauf- und Zulauföffnungen, die normalerweise für den Dialysatstrom verwendet werden, realisiert. Dieselben Öffnungen werden zur Mediumperfusion nach der Zellimmobilisierung verwendet.
1.c. Hepatozytkultur
Hepatozyten, suspendiert in eiskaltem Williams'E-Medium (Gibco BRL Life Technologies, European Division), angereichert mit hitzeinaktiviertem FCS (10%, Boehringer Mannheim), Glutamin (2 mM, BDH Laboratory Supplies Ltd.), Insulin (20 mlE, Novo Nordisk, Dänemark), Dexamethason (1 μM) und antibiotischer/antimykotischer Lösung (Gibco) bei einer Konzentration von 20·10⁶ lebensfähigen Zellen/ml, wurden in zwei vorgekühlte (4°C) trockene Bioreaktoren auf eine Endmenge von 220·10⁶ Zellen/Einheit injiziert. Die gekühlten Bioreaktoren wurden in zwei separate Zellperfusionskreisläufe integriert, um die Ergebnisse in zweifacher Ausfertigung zu erhalten. Diese Apparatur wurde in eine temperaturgeregelte (37°C) Kammer (Stuart Scientific, Modell SI60, GB) gegeben, wo die Bioreaktoren auf eine Rotationsvorrichtung gemäß 11 geklemmt und mit Kulturgas (95% Luft, 5% CO₂, Gasfluß: 30 ml/min, 37°C) verbunden werden. Die Reaktoren 28 wurden horizontal entlang ihrer Längsachse 29 bei 1 Umdrehung/min für einen Zeitraum von 120 Minuten gedreht, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen durch den Reaktor zu gewährleisten und die Immobilisierung durch Einschluß, Anlagerung und Selbstaggregation von lebensfähigen Hepatozyten zu beschleunigen. Jede Minute wurde die Rotationsrichtung automatisch umgekehrt, um das Verknoten der verbindenden Rohre zu verhindern. Nach dieser Immobilisierungszeit wurde eine diskontinuierliche Abfallwaschung mit frischem Medium alle 15 Stunden durchgeführt (60 ml), um tote und nicht-angelagerte Zellen aus dem Reaktor zu spülen, um Nährstoffe zuzuführen und Toxine aus der Zellregion zu entfernen, und Rückgewinnung von Hepatozyten aus dem Isolierungsverfahren zu ermöglichen. Dann waren die Vorrichtungen betriebsbereit.
1.d. Hepatozytfunktionstests
Allgemeine Beschreibung
Die Untersuchung umfaßte Bioreaktoren mit und ohne Hepatozyten, wobei die letzteren als Kontrollen dienen. Beide Gruppen erhielten identische Behandlung und Überwachung. Die Hepatozytfunktionstests wurden unter rezirkulierenden Bedingungen durchgeführt, wobei angereichertes Williams'E-Medium (30 ml) durch den Extrafaserbioreaktorraum bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min perfundiert. Verschiedene Parameter wurden über einen Zeitraum von 4 Tagen bewertet, wobei der letzte Tag ausschließlich zur Proteinsekretion unter serumfreien Bedingungen reserviert ist. An jedem Tag während der ersten drei Tage wurde eine Reihe von Tests durchgeführt, einschließlich Galactosebeseitigung; Harnstoffsynthese, Lidokainstoffwechsel und eine anschließende 14stündige Inkubation mit angereichertem Williams'E-Medium, um den Aminosäurestoffwechsel, das Lactat/Pyruvat-Verhältnis, Enzymverlust, Glukoseniveaus und den pH zu bewerten. Jedem Test ging eine Abfallwaschung mit frischem Medium voraus. Proben, die aus dem geschlossenen Schleifenkreislauf gesammelt wurden, wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –70°C bis zur Analyse gelagert.
Galactosebeseitigung
D-Galactose (Sigma Chemical Co., St Louis, MO) wurde zu dem geschlossenen Schleifenkreislauf bei einer Konzentration von 1 mg/ml zugeführt und für 3 Stunden inkubiert. Medienproben wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten jeden Tag für drei Tage gesammelt. Die Galactosekonzentration wurde bei 340 nm (Cobas Bio, Roche, Schweiz) unter Verwendung von enzymatischen Testkits (Boehringer Mannheim, Wiesbaden, Deutschland, Kitnr. 1242-73) gemessen. Daraus wurde die Galactosebeseitigung berechnet.
Harnstoffsynthese aus NH₄Cl
Die Harnstoffsynthesekapazität des Bioreaktorsystems wurde durch Inkubieren von 10 mM NH₄Cl für 2 Stunden eingeschätzt. Medienproben wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten jeden Tag für drei Tage gesammelt. Harnstoff wurde kolorimetrisch bei 525 nm (Zeiss UV-Spektrophotometer) mit Sigma Chemical Co. Kit-Nr. 535 für Harnstoffstickstoff bestimmt.
Lidokainstoffwechsel
Lidokain-HCl (Sigma) wurde zu dem geschlossenen Schleifenkreislauf bei einer Konzentration von 500 μg/ml zugeführt und für 1 Stunde inkubiert. Medienproben wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten jeden Tag für drei Tage gesammelt. Die Proben wurden hinsichtlich Lidokain und drei Lidokainstoffwechselprodukten, Monoethyl-glycin-xylidid (MEGX), 2,6-Xylidin-HCl, Glycin-xylidid (GX), durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) analysiert. Lidokain-HCl wurde von Sigma Chemical Co. erhalten und MEGX, Xylidin, GX und Ethyl-methyl-glycin-xylidid (EMGX) waren Spenden von Dr. R. Sandberg von Astra Pain Control (Södertälje, Schweden). Die Probenherstellung zur Analyse von MEGX, Xylidin und GX umfaßt die Zugabe einer 75 μl internen Standardlösung (EMGX 5 μg/ml in destilliertem Wasser) und 150 μl destilliertem Wasser zu einer 150 μl Probe. Die Analyse der viel höheren Lidokainkonzentrationen erfordert eine 20fache Verdünnung der Probe in angereichertem Williams'E-Medium. Die Isolierung von Lidokain und seinen Stoffwechselprodukten wurde durch Extraktion durchgeführt. Dafür wurden 150 μl Natriumcarbonat (0,1 M) und 600 μl Chloroform zugegeben. Nach 1 min Verwirbeln und 4 min Zentrifugation bei 8000 U/min wurde der wässerige Überstand entfernt und 150 μl destilliertes Wasser und 350 μl HCl (0,1 M) wurden zu der organischen Phase zugegeben. Das Verwirbelungs- und Zentrifugationsverfahren wurde wiederholt und der Überstand entfernt. Ein gekühltes Probenspeicherkompartiment hielt die Reste bei 4°C vor der Analyse. Die mobile Phase (0,5 M Phosphatpuffer, pH 4,5) wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,7 ml/min (Perking Elmer 250) gepumpt und durch eine Quard-Säule vorbehandelt (Superspher 60 RP 8, Länge 10 cm, 4 μm Teilchen, Bischoff Chromatography, Deutschland). Ein Autoprobenehmer (Gilson Sample Injector Modell 231, Frankreich) injizierte 50 μl aliquote Teile auf eine temperaturgeregelte (55°C, Chrompac Column Thermostat, Niederlande) HPLC-Säule (Superspher 60 RP 8, Länge 20 cm, ID 4,6 mm, 4 μm Teilchen, Bischoff Chromatography, Deutschland). Der Nachweis erfolgte bei 198 nm (Schoeffel SI 770 UV-Spektrophotometer, Deutschland) und Peakflächen wurden mit Hilfe eines Olivetti M250-Computers unter Verwendung von Integrationssoftware (Chrompac PCI, Version 5.12, Niederlande) berechnet. Die Proben wurden durch das Vergleichen des Peak flächenverhältnisses der Komponente von Interesse mit dem internen Standard quantifiziert. Standardkurven wurden für Likokain (5 bis 80 μg/ml), MEGX (0,5 bis 16 μg/ml), Xylidin (5 bis 80 μg/ml) und GX (1 bis 32 μg/ml) erhalten und zeigten Linearität (r = 0,996, n = 6). Die Nachweisgrenze war 0,4 μg/ml für GX, 0,3 μg/ml für Xylidin, 0,2 μg/ml für MEGX, 0,4 μg/ml für EMGX und 0,5 μg/ml für Lidokain und die Verweilzeiten betrugen 2,2 min, 2,4 min, 3,2 min, 4,1 min bzw. 5,8 min. Die Säulenstabilisationszeit wurde auf 20 Minuten durch Waschen mit einem Phosphat/Acetonitril/Phosphorsäurepuffer (50 mM, pH = 1,7) und einer Acetonitrillösung (dest. Wasser : ACN = 1 : 1) begrenzt, um den Chloroformpeak zu entfernen.
Aminosäurestoffwechsel
Der Stoffwechselumsatz eines breiten Bereiches an Aminosäuren wurde untersucht. Die Aminosäurekonzentrationen wurden durch eine vollständig automatisierte Vorsäulenderivatisierung mit o-Phthaldialdehyd (OPA), gefolgt von Hochleistungsflüssigchromatographie, bestimmt, wie in van Eijk HMH, van der Heijden MAH, van Berlo CLH, Soeters PB, Clin Chem 1988; 34: 2510–13 beschrieben.
Lactat/Pyruvat-Verhältnis
Die Lactat/Pyruvat-Niveaus wurden bei 340 nm (Cobas Bio, Roche, Schweiz) durch enzymatische Testkits (Boehringer Mannheim Wiesbaden, Deutschland, Lactatkit-Nr. 149993 und Pyruvatkit-Nr. 124982) bestimmt. Daraus wurde das Lactat/Pyruvat-Verhältnis berechnet.
Enzymverlust
Die Lactatdehydrogenase-(LDH-), Glutamat-Oxalacetat-Transaminase-(GOT-) und Glutamat-Pyruvat-Transaminase-(GPT-)-Niveaus wurden durch klinische Routineanalysegeräte gemessen.
Glukose
Die Glukoseniveaus wurden unter Verwendung von Glukoseteststreifen (Hämoglukotest 1-44R, Boehringer Mannheim, Wiesbaden, Deutschland) und des zusätzlichen Reflolux-S Ablesegeräts gemessen.
pH
Der pH wurde durch Probenentnahme von 1 ml Medium mit einer Blutgasspritze (Marz-175, Sherwood Medical, Irland), die auf einem Blutgasanalysator (Radiometer Modell ABL 300, Kopenhagen) bestimmt wurde, gemessen.
Proteinsekretion
Am Tag vier wurde das gesamte Bioreaktorkultursystem mit 250 ml angereichertem Williams'E-Medium ohne FKS gewaschen und in demselben Medium inkubiert. Medienproben wurden nach 24 Stunden gesammelt und gründlich gegen eine 50 mM NH₄HCO₃-Lösung dialysiert und gefriergetrocknet. Die trockenen Reste wurden in einer solchen Menge an Elektrophoresepuffer (Tris-barbital-Puffer, pH = 8,6, Ionenstärke 0,1) in Wasser aufgelöst, daß der Kulturüberstand 20fach konzentriert wurde.
Um die Serumproteine, die von den Schweinehepatozyten abgesondert werden, sichtbar zu machen, führten wir Cross-over-Immunoelektrophorese unter Verwendung eines polyspezifischen Antiserums für Schweineserumproteine durch, wie zuvor beschrieben (28).
1.e. Mikroskopische Untersuchung
Fünf Tage alte Kultursysteme wurden zur mikroskopischen Untersuchung hergestellt, um die Orientierung der Hepatozyten in dem Bioreaktor zu bestimmen.
Lichtmikroskopie
Die Hepatozyten wurden durch Spülen des Bioreaktors mit Formalin (4%) fixiert. Nach 24 Stunden wurde der Bioreaktor aufgeschnitten und zwölf Matrixproben (1 cm²) wurden aus verschiedenen Teilen des Faservlies entnommen. Die Proben wurden mit Wasser gewaschen, in sauberen Ethanolen dehydratisiert und in Paraffin eingebettet. Daraus wurden 8 μm dicke Scheiben geschnitten, die mit Xylol entparaffiniert und mit Hämotoxylin-Eosin gefärbt wurden. Die Präparate wurden unter einem Olympus Vamox Lichtmikroskop (Typ AHBT3, Tokyo, Japan) beobachtet.
Rasterelektronenmikroskopie
Die Hepatozytaggregate von fünf Tage alten Kulturen wurden durch Spülen des Bioreaktors mit 4% Glutaraldehyd in Phosphatpuffer, pH 7,3 (Fluka Chem A. G., Buchs, Schweiz) fixiert. Der Bioreaktor wurde in der Mitte durchgeschnitten und ein Teil wurde in sauberen Ethanolen dehydratisiert und schließlich in Hexamethyldisilizan getrocknet (Sigma, München, Deutschland). Die geschnittene Oberfläche wurde mit Gold in einem Zerstäubungsbeschichter beschichtet und unter einem Rasterelektronenmikroskop (ISI SS40, Japan) beobachtet.
1.f. Statistische Analyse
Ein ungepaarter t-Test nach Student wurde verwendet, und es wurde angenommen, daß P < 0,05 statistisch signifikant war. Die Daten wurden als mittleres ±REM dargestellt.
1.g. Kernspintomographie (MRI)
MRI ist ein nicht invasives Verfahren zur Sichtbarmachung der Flüssigkeitsstromverteilung in beispielsweise einer Röhre oder im Falle der vorliegenden Erfindung dem Bioreaktor. Die Strömungsverteilung in eine Querrichtung eines kleinen (ID 1,32 cm, Volumen 11 ml, 46 Hohlfasermembranen, Durchmesser Acrylkern 0,4 cm) und eines vergrößerten Bioreaktors (ID 2,2 cm, Volumen 33 ml, 138 Hohlfasermembranen, Durchmesser Acrylkern 0,41 cm) von gleicher Länge wurde untersucht. Zunächst wurden die Bioreaktoren mit Ethanol und anschließend mit Wasser gespült, um Luftblasen zu entfernen, die den Mediumstrom blockieren können und/oder die Homogenität des Magnetfeldes verdrehen können, was zu einer verringerten Signalintensität führt. Ein Bioreaktor wurde dann in eine Affenschaukelspirale gegeben und horizontal in ein selbstgebautes Spektrometer 6.3 Tesla/20 cm Bohrung positioniert. Zellfreie Vorrichtungen wurden verwendet, da das Spektrometer nicht dahingehend ausgestattet war, lebensfähige Hepatozyten zu versorgen. Transaxiale strömungsempfindliche MRI's wurden aus der Mitte des Bioreaktors unter Verwendung einer neuen stationären Perfusionsuntersuchungstechnik entnommen. Kurz gesagt, das Wassersignal in einer Nachweisscheibe (Breite 2 mm, senkrecht zu der Fließrich tung) wird unterdrückt. Während einer Einfließzeit von 100 ms wird ein Teil der Scheibe aufgefrischt, was zu einer Erhöhung der Signalintensität führt. Je höher so die Strömung ist, desto mehr wird die Nachweisscheibe aufgefrischt, desto mehr wird die Signalintensität erhöht. Die Flüssigkeitsströmung bei höheren Geschwindigkeiten als 2 cm/s wird nicht zu einem erhöhten Signal führen, da die Nachweisscheibe dann vollständig aufgefrischt wird. Deshalb wurde die Strömung kalibriert, so daß die maximale Fließgeschwindigkeit in den meisten Strömungskanälen 2 cm/s nicht überschritt.
1.h. Alfa-GST-Assay
Toxisches Serum und Hepatozytenlebensfähigkeit
Alfa-GST wird durch Hepatozyten mit einer beschädigten Zellmembran freigesetzt und ist daher ein Marker für die Integrität der Hepatozyten. Das Leberenzym-alfa-GST wurde Spezies-spezifisch (Ratte, Schwein, Mensch) mit einem ELISA-Kit, bereitgestellt von Biotrin, Irland, bestimmt. Ratten mit Leberischämie wurden mit einem Schweinehepatozyt-basierenden BAL behandelt. Plasmaproben wurden rechtzeitig gesammelt, um die Ratten- und Schweine-alfa-GST-Niveaus (in ein und derselben Probe) zu bestimmen.
2. Ergebnisse
2.a. Hepatozytkultur
Die Untersuchung umfaßte 22 Bioreaktoren, von denen 16 Vorrichtungen (n = 8 in zweifacher Ausfertigung) verwendet wurden, um Hepatozyten zu kultivieren, und 6 Vorrichtungen ohne Zellen (n = 3 in zweifacher Ausfertigung) dienten als Kontrollen. Die Ergebnisse der Hepatozytfunktionstests in zwei Bioreaktoren mit Zellen aus demselben Isolierungsverfahren unterschieden sich nie mehr als 10%, was reproduzierbare Zellimmobilisierung und -kultivierung anzeigt. Das Kultursystem blieb steril während der Untersuchung und es wurde kein Durchsickern des Mediums in den Hohlraum der Oxygenierungshohlfasern beobachtet.
2.b. Hepatozytenfunktionstests
Galactosebeseitigung
Die Galactosebeseitigungskapazität nach der Inkubation für 180 min mit einer Standarddosis von Galactose blieb konstant über einen Zeitraum von drei Tagen.
Harnstoffsynthese
Hohe Niveaus an Ammoniak spielen eine Rolle bei der Leberenzephalopathie. Die Synthese von Harnstoff aus Ammoniak ist deshalb ein wichtiger Funktionstest. Die Harnstoffsynthese nach einer Inkubation von 120 min mit 10 mM NH₄Cl veränderte sich nicht über einen Zeitraum von drei Tagen.
Lidokainstoffwechsel
Die Zytochrom-P450-Aktivität der Hepatozyten wurde durch Bestimmen von Lidokain und seinen Stoffwechselprodukten bewertet. Die Lidokainbeseitigung und anschließende MEGX- und Xylidin-Produktion nach einer Lidokain-Inkubation von 60 min veränderte sich nicht signifikant über einen Zeitraum von drei Tagen. Xylidin war das Hauptlidokainstoffwechselprodukt an den ersten zwei Tagen. Es gab keinen signifikanten Unterschied bei der Xylidin- und MEGX-Produktion an Tag 3. Betrachtet man einzelne Experimente stimmt die Lidokain-Clearance besser mit Xylidin als der MEGX-Bildung überein. Schweinehepatozyten produzieren keine nachweisbaren Niveaus des Stoffwechselproduktes GX während der Inkubation mit Lidokain für eine Stunde.
Aminosäurestoffwechsel
Tabelle 1 zeigt die Veränderungen in der Mediumkonzentration einiger Aminosäuren, die für die Leberfunktion relevant sind. Eine Verringerung der Glutaminkonzentration stand mit einer erhöhten Glutamatkonzentration in Verbindung. Der Leberstoffwechsel von aromatischen Aminosäuren (AAA) wurde durch eine Verringerung der Konzentrationen von Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan gezeigt. Die verringerten Argininkonzentrationen und die Synthese von Ornithin lassen auf die Arginaseaktivität schließen. Eine Verringerung der Alaninkonzentration, ein Präkursor der Lebergluconeogenese, wurde beobachtet.
Zusätzlich zu Tabelle 1 verringerten sich ebenso andere Aminosäurekonzentrationen signifikant, wie Asparagin, Glycin, Histidin, Valin, Methionin, Isoleucin, Leucin und Lysin. Der gesamte Aminosäurestoffwechsel blieb über einen Zeitraum von drei Tagen stabil.
Lactat/Pyruvat-Verhältnis
Das Lactat/Pyruvat-Verhältnis ist ein Index für den funktionellen Zustand der zellulären Oxidation und des aeroben Stoffwechsels. Tabelle 1 zeigt einen Abfall des Lactat/Pyruvat-Verhältnisses, was ausschließlich an der Abnahme der Lactatkonzentration lag. Das Lactat/Pyruvat-Verhältnis von 5 bis 7 zeigte einen stabilen Oxygenierungszustand des Kultursystems über einen Zeitraum von drei Tagen.
Enzymverlust
Um die Hepatozytenlebensfähigkeit zu bewerten, wurde das Auftreten der Enzymaktivität, nämlich LDH, GOT und GPT, in dem Kulturmedium bestimmt. Die LDH-Freisetzung war nur an Tag eins signifikant (Tabelle 1), GOT-Entwicklung war über den Zeitraum von drei Tagen mit einem Abwärtstrend in der durchschnittlichen GOT-Konzentration signifikant. Geringe, aber signifikante Mengen an GPT wurden an Tag 1 und 2 freigesetzt.
Glukose
Die Glukoseniveaus veränderten sich nicht am ersten Tag der Kultivierung (Tabelle 1). Eine signifikante Verringerung der Glukosekonzentration wurde an Tag 2 und 3 beobachtet.
pH
Der pH in dem untersuchten Bioreaktor wurde (Tabelle 1) mit Hilfe eine integrierten Oxygenators, der stabile CO₂-Partialdrücke (32,6 ± 0,4 mmHg, n = 8) in dem Natriumbicarbonat-gepufferten Medium sicherstellt, konstant gehalten.
Proteinsekretion
Kultivierte Hepatozyten sondern Proteine in ihr Kulturmedium ab. Eine zweidimensionale Cross-Immunoelektrophorese wurde unter Verwendung eines Antiserums gegen Schweineserum durchgeführt, um die unterschiedlichen Mengen und Typen an Proteinen sichtbar zu machen, die durch die Hepatozyten abgesondert werden, welche in dem Bioreaktor nach einer Inkubation von 24 Stunden mit angereichertem Williams'E-Medium ohne FKS kultiviert werden. Die Ergebnisse werden in 6 gezeigt. Jeder Peak stellt ein unterschiedliches Protein dar. Die Fläche unter jedem Peak ist ein Zeichen für die Menge an abgesondertem Protein. In dem Kulturmedium von Kontrollbioreaktoren ohne Zellen wurden keine Schweineserumproteine nachgewiesen (Ergebnisse nicht gezeigt).
2.c. Mikroskopische Untersuchung
Die Hepatozyten aus der injizierten Einzellensuspension organisierten sich in kleine, ungleichmäßig geformte Aggregate mit umfassenden Zell-Zell-Kontakt (14). Die Aggregate aus dieser fünf Tage alten Kultur wurden auf dem Polyesterfasergerüst immobilisiert und darin eingekapselt. Trotz der Kultivierung mit hoher Zelldichte gibt es ausreichend Raum zwischen den Aggregaten zur ungehinderten Perfusion von Medium zu und aus den Hepatozyten. Da die 3D-Matrix relativ leer ist, weist sie das Potential auf, Hepatozyten bei sogar höheren Dichten als die vorliegenden 20·10⁶ lebensfähigen Zellen/ml zu kultivieren. Da die Aggregate so klein sind (ein Durchmesser ist nie größer als 5 Zellen, meistens 2 bis 3 Zellen), fungieren die Hepatozyten beim direkten Mediumkontakt. Der Mediumstrom durch dieses Hepatozytimmobilisierungskompartiment erreicht annähernd die in vivo-Situation, wo jedes Hepatozyt unter Perfusionsbedingungen und engen Blutkontakt agiert.
Die Beseitigung der 3D-Matrixproben, die nahe der Einlaß- und Auslaßöffnung und in der Mitte des Faservlies entnommen wurden, zeigt, daß die Hepatozyten gleichmäßig in der Bioreaktorvorrichtung verteilt werden.
Zellzählungen in zwölf mikroskopischen Präparaten der 3D-Matrix (Dimensionen: Länge 10 mm, Breite 0,5 mm, Dicke 8 μm) von einem Bioreaktor führten zu einer durchschnittlichen Zahl von 1379 ± 135 (Mittel ± sd) Hepatozyten/Präparat. Man kann berechnen, daß, wenn jeder der 220·10⁶ geimpften lebensfähigen Hepatozyten innerhalb des Faservlies immobilisieren würde, jedes Präparat etwa 1400 le bensfähige Zellen enthalten sollte. So wurden durchschnittlich 98,5% der Hepatozyten in diesem Experiment immobilisiert.
15 stellt eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von isolierten Hepatozyten nach fünf Tagen in Kultur in der 3D-Matrix des Bioreaktors dar. Wie durch die Lichtmikroskopie beobachtet, behielten die Hepatozyten aus dieser fünf Tage alten Kultur ihre Aggregatkonfiguration und blieben auf den Polyesterfasern immobilisiert. Umfassender Zell-Zell-Kontakt zwischen den sphärischen Hepatozyten kann beobachtet werden.
2.d. Kernspintomographie
15A und 15B zeigen die Strömungsverteilung in einem Querschnitt eines kleinen (A) und eines vergrößerten Bioreaktors (B). Die Fließgeschwindigkeit wurde nur in Achsenrichtung nachgewiesen und lag zwischen null (schwarz) und rund 2 cm/s (weiß). Wenn mit 1 verglichen, können mehrere Komponenten des Bioreaktors identifiziert werden, wie das nicht-gewebte Polyestergewebe, die Oxygenierungshohlfasermembranen, die Strömungskanäle und der Acrylkern. Die schwarze Darstellung des nicht-gewebten Polyestergewebes zeigt nur an, daß der Mediumstrom innerhalb der 3D-Matrix nicht in Achsenrichtung erfolgte. Die Perfusion des Gewebes in andere Richtungen wurde nicht untersucht. Die homogene Verteilung der grauen Punkte zeigt, daß alle Strömungskanäle in beiden Vorrichtungen perfundiert wurden. Der graue Ton zeigt, daß sich die Fließgeschwindigkeit pro Strömungskanal unterscheiden konnte (zwischen 0,5 und 2 cm/s, aber meistens rund 1,5 cm/s). Die Pfeile in 2B zeigen Punkte der verringerten Signalintensität infolge von eingeschlossenen Luftblasen. Spin-Echobilder (nicht gezeigt) offenbarten, daß die Größe der Luftblasen viel kleiner als die resultierende Verdrehung war. Das Spektrometer ermöglichte nur eine horizontale Richtung des Bioreaktors. Normalerweise wird die Vorrichtung vertikal positioniert, was die Entfernung der Luftblasen erleichtert.
15A und 15B zeigen transaxiale strömungsempfindliche MRI's eines kleinen (A, Innendurchmesser 1,32 cm) und eines vergrößerten Bioreaktors (B, Innendurch messer 2,2 cm). Die Fließgeschwindigkeit lag zwischen null (schwarz) und rund 2 cm/s (weiß). Wenn mit 1 verglichen, können mehrere Komponenten des Bioreaktors identifiziert werden, wie das nicht-gewebte Polyestergewebe, die Oxygenierungshohlfasermembranen, die Strömungskanäle und der Acrylkern. Die Darstellung von beiden Vorrichtungen zeigen, daß alle Strömungskanäle perfundiert wurden. Unterschiede in der Fließgeschwindigkeit der Strömungskanäle können beobachtet werden. Die Pfeile in B zeigen Punkte der verringerten Signalintensität infolge der eingeschlossenen Luftblasen.
2.e. Alfa-GST-Bestimmung
Wie erwartet, erhöhte sich die alfa-GST-Konzentration von Ratten während der BAL-Behandlung. Bemerkenswerterweise blieb die alfa-GST-Konzentration von Schweinen konstant, was angibt, daß die Lebensfähigkeit der Schweinehepatozyten in dem Bioreaktor der Erfindung nicht durch das toxische Rattenplasma bewirkt wurde.
3. Erläuterung
Im Stand der Technik sind die Hepatozyten in dem intraluminaren und Extrafaserraum der Hohlfasereinheiten kultiviert worden. Die Beliebtheit dieses Konzepts der Zellkultivierung kann leicht so verstanden werden, daß es der einfachste Weg zum Realisieren eines BALs ist. Diese Systeme erfüllen jedoch nicht die wesentlichen Bedingungen zur optimalen Stoffübertragung zu oder aus den Hepatozyten, wie sie in der intakten Leber vorliegen. Infolgedessen wird die Hepatozytstoffwechselaktivität aus folgenden Gründen beeinträchtigt:
Die klinische Behandlung von Leberversagen erfordert eine große Hepatozytkultur hoher Dichte. In vielen Bioreaktoren verursacht dies die Bildung von nichtphysiologischen Hepatozytpellets. Hepatozyten in der Mitte dieser großen Aggregate zeigten schlechte Stoffwechselaktivität und sogar mögliche Nekrose aufgrund hoher Gradienten als Folge der gehinderten Stoffübertragung von Nährstoffen und Sauerstoff zu und Kohlendioxid, Toxinen und Zellprodukten aus diesen Zellen. Dies steht im Gegensatz zu der in vivo Leber, wo jedes Hepatozyt in engem Kontakt mit dem Blut ist. Außerdem hängt in den meisten Bioreaktoren der Substrataustausch von der Diffusion ab, die die Stoffübertragung im Vergleich zu der in vivo Situation, wo die Hepatozyten unter Perfusionsbedingungen mit den entsprechenden geringen Gradienten fungieren, weiter einschränkt.
Der neue Bioreaktor der Erfindung, wenn er als ein BAL verwendet wird, richtet sich auf die oben erwähnten Erfordernisse zur physiologischen Stoffübertragung. Dies führte zu einem System mit den folgenden Merkmalen:
1. Dreidimensionales nicht-gewebtes Polyestergewebe
Die mikroskopische Untersuchung zeigte, daß die Polyesterfasern des nicht-gewebten Gewebes ein Gerüst zur Hepatozytimmobilisierung hoher Dichte (20·10⁶ Zellen/ml) und Reorganisation zu kleinen Aggregaten (wobei ein Durchmesser nie größer als 5 Zellen, meistens 2 bis 3 Zellen ist) mit Raum zwischen den Aggregaten bereitstellen. Dies ermöglicht jeder Zelle, unter in vivo ähnlichen Perfusionsbedingungen und direktem Mediumkontakt zu agieren, wodurch die physiologischen Gradienten genauer nachgeahmt werden. Die Forschung auf dem Gebiet der Schweinehepatozytaggregate offenbarte, daß diese Strukturen viele der in vivo gefunden Cyto-Architekturmerkmale aufrechterhalten, sie länger überleben und aufrechterhaltene und/oder verbesserte funktionelle Aktivität im Vergleich zu Einzelschichtkulturen zeigen. Ähnliche Ergebnisse sind für unsere neue Bioreaktorvorrichtung herausgefunden worden, die auf den Schweinehepatozytaggregaten basiert. Die mikroskopische Bewertung zeigte beträchtlichen Kontakt zwischen kugelförmigen Hepatozyten, wie in vivo beobachtet. Leberspezifische Funktionen wurden über einen Zeitraum von drei Tagen aufrechterhalten und die Harnstoffsynthesekapazität wurde im Vergleich zu der Einzelschichtkultur verdoppelt, gemäß Lazar et al.
2. Keine extrazellulären Matrixmaterialien
In einer vorhergehenden Studie (te Velde AA, Ladiges NCJJ, Flendrig LM, Chamuleau RAFM, J Hepatology 1995; 23: 184–192) wurde die funktionelle Aktivität der Schweinehepatozyten, die an hydrophilen Gewebekulturkunststoff anlagerten, mit den Zellen verglichen, die an mehrere extrazelluläre Matrixbestandteile angelagert wurden: Kollagen I und IV, Laminin, Fibronectin, Engelbreth-Holm-Swarm Matrix und in Gegenwart von Matrigel. Mit Ausnahme von Matrigel, verbesserte keines der ex trazellulären Matrixsubstrate die Schweinehepatozytenfunktion im Vergleich zu Gewebekulturkunststoff. Matrigel weist den Nachteil auf, daß es sehr teuer ist, und außerdem treten relativ große Mengen an Mäuseproteinen vom Tumorursprung aus dem Gel aus und können in den Kreislauf des Patienten gelangen. Wir entschieden daher, die Hepatozytsuspension direkt in den trockenen Bioreaktor zu injizieren und ließen die Schweinehepatozyten auf den hydrophilen Polyesterfasern immobilisieren. Kein Vorspülen mit Medium noch Beschichten mit üblichen extrazellulären Matrixmaterialien, wie Matrigel, Kollagen oder anderen, wurde durchgeführt, was zu einer sicheren, preiswerteren und praktischeren Vorrichtung führte.
3. Schnelle Hepatozytimmobilisierung
Die Hepatozyten können für zwei Stunden immobilisieren. Nach der Immobilisierungszeit werden die toten und nicht-angelagerten Zellen aus dem Bioreaktor gespült, wodurch die gesamte Lebensfähigkeit des Kultursystems verbessert wird. Theoretisch ist das System dann betriebsbereit. Die lichtmikroskopische Untersuchung eines fünf Tage alten Bioreaktors zeigte, daß 98,5% der geimpften lebensfähigen Hepatozyten in der 3D-Matrix vorlagen, was hohe Immobilisierungseffizenz und begrenzte Zellauswaschung rechtzeitig zeigt. Das letzte Ergebnis wurde durch die tägliche Lichtmikroskopuntersuchung der Mediumproben aus dem geschlossenen Schleifenkreislauf, in dem die Zellen oder Zelltrümmer selten beobachtet wurden, bestätigt.
Eine kurze Herstellungszeit könnte ein Vorteil in der klinischen Anwendung sein, aber die zusätzliche Forschung muß zeigen, welche Wirkung diese begrenzte Erholungszeit auf die Hepatozytfunktion hat. Die schnelle Immobilisierung kann folgendermaßen erklärt werden: nach der Injizierung der Einzellenhepatozytsuspension wird der Bioreaktor horizontal entlang seiner Längsachse für zwei Stunden gedreht. Dies verändert kontinuierlich die Sedimentationsrichtung der suspendierten Zellen, was den Hepatozyten ermöglicht, sich in dem Bioreaktorraum auf der Suche nach Polyesterfasern zum Anlagern daran „umzuschauen". Die Drehweise verbessert erheblich die Zell-Faser- und Zell-Zell-Wechselbeziehungen, wodurch die Anlagerung und die Aggregation von lebensfähigen Hepatozyten beschleunigt werden. Außer dem verbessert der optimale Oxygenierungsstatus des Systems weiter die Rate der Hepatozytimmobilisierung.
4. Geringe Substrat- und Stoffwechselproduktgradienten
Auf einem zellulären Niveau können geringe Substrat- und Stoffwechselproduktgradienten in einer Hepatozytkultur hoher Dichte durch Kultivieren der Hepatozyten als kleine Aggregate im Inneren des nicht-gewebten Polyestergewebes realisiert werden. Dies führt zu einer Hepatozytkultur mit ausreichend Raum zwischen den Aggregaten zur ungehinderten Perfusion aller Hepatozyten mit geringen Mediumgradienten. Betrachtet man den gesamten Bioreaktor, können die geringen Mediumgradienten entweder durch Verringern des Perfusionsabstandes zwischen der Einlaßöffnung und der Auslaßöffnung oder durch Erhöhen der Mediumfließgeschwindigkeit erhalten werden. Gerlach et al, hierin oben erwähnt, beschreiben eine komplizierte Bioreaktorkonstruktion, die die erste Option durch Kultivieren der Hepatozyten zwischen unabhängig gewebten Hohlfaserbündeln realisierte, wobei von denen eine für den Mediumzulauf und die andere für den Mediumablauf ist. Dies ermöglicht die dezentralisierte Perfusion der Zellen zwischen diesen Kapillaren mit geringen Gradienten. Eine technisch viel einfachere Lösung ist die letztere Option durch Erhöhen der Mediumfließgeschwindigkeit durch den Bioreaktor. Dies war in unserem System durchführbar, da die Hepatozyten in der 3D-Matrix kultiviert werden und dadurch durch das Polyesterfasernetzwerk geschützt sind. Die schrittweise Erhöhung der Mediumfließgeschwindigkeit von 5 ml/min auf 15 ml/min zeigte keine Anzeichen der Scherspannung, wie eine Verringerung der Hepatozytfunktionsaktivität oder eine Erhöhung des Enzymverlusts. Der einheitliche Strom und die Verteilung des Mediums zu allen Teilen der 3D-Matrix werden durch zahlreiche Kanäle gewährleistet, die gleichmäßig in dem Bioreaktorraum verteilt sind. Außerdem achten diese Kanäle ebenso auf eine homogene Zufuhr der injizierten Hepatozytsuspension zu der 3D-Matrix.
5. Dezentralisierte Oxygenierung und gleichmäßige Oxygenierungshohlfaserverteilung
Der integrierte Oxygenator beseitigt O₂- und CO₂-Gradienten entlang der Perfusionsrichtung des Mediums. Außerdem erzeugt die spiralförmig gewickelte Konstruktion (3) eine homogene Verteilung der Oxygenierungshohlfasern in dem Bioreaktor, wodurch jedes Hepatozyt einer Oxygenierungsquelle innerhalb seiner direkten Umgebung sichergestellt wird. Dies führt zu einer optimalen Oxygenierung der Hepatozyten, was durch eine starke Verringerung des Lactat/Pyruvat-Verhältnisses (32) und einen stabilen pH bestätigt wird, was sich durch konstante CO₂-Partialdrücke in dem Natriumbicarbonat-gepufferten Medium zeigt.
6. Biokompatibilität
Die Biokompatibilität ist durch das Konstruieren des Bioreaktors aus Materialien, die FDA-genehmigt worden sind und der hohen thermischen Spannung der Autoklavenbehandlung widerstehen, angesprochen worden. So weit wir wissen, ist dies der erste Bioreaktor zur Hepatozytkultivierung, der dampfsterilisiert werden kann. Dies ist biologisch wesentlich sicherer als die normalerweise verwendete sehr toxische Ethylenoxidsterilisation, da Ethylenoxidreste aus den Polymeren für Wochen ununterbrochen austreten und die Sensibilisierung und allergische Reaktionen bei Patienten hervorrufen können.
7. Leichte Vergrößerung
Das Hepatozytimmobilisierungskompartiment besteht aus vielen Wiederholungseinheiten. Jede Einheit ist vollständig in der Lage, die Hepatozytfunktion zu unterstützen, und schließt eine Oxygenierungshohlfaser, einen Kanal zur Mediumperfusion und ein dreidimensionales Trägermaterial ein. Die Vergrößerung auf die Lebermasse, die zur klinischen Anwendung benötigt wird, beinhaltet einfach die Erhöhung der Zahl an Einheiten, wodurch die Zahl an Windungen des Hohlfaser/3D-Matrix-Verbundstoffes erhöht wird, bis die erforderliche Immobilisierungskapazität erhalten worden ist. Die Verwendung von Standarddialysegehäusen und Verkapselungstechniken gewährleistet die leichte Herstellung eines breiten Bereiches an Bioreaktorgrößen.
Dieses Vergrößern wird die Plasmaverteilung in dem Bioreaktor nicht beeinflussen. Dies wurde durch strömungsempfindliches MRI bestätigt, das die Perfusion von allen Strömungskanälen in einem kleinen und einem vergrößerten Bioreaktor zeigte. Die Fließgeschwindigkeit konnte sich pro Strömungskanal unterscheiden, was ein Er gebnis der Tatsache ist, daß die Bioreaktoren handgearbeitet waren. Es wird derzeit eingeschätzt, daß die industriellen Herstellungstechniken dies lösen.
Ebenso ist es mit dem alfa-GST-Assay, der oben erwähnt wird, erstmals nun möglich, den Zustand der Leber des Patienten und der Hepatozyten in dem Bioreaktor gleichzeitig zu beobachten. Da man annimmt, daß Schweinelebern die Hepatozytquelle der Wahl für die kommenden Jahre sind, könnte dieser Test ein interessanter Kandidat zum Beobachten der Leberzellschäden während der BAL-Behandlung sein.
Ein bioartifizielles Lebererhaltungssystem zur Behandlung des fulminanten Leberversagens und als eine Überbrückung zur Lebertransplantation erfordert große Mengen an lebensfähigen und aktiv funktionierenden Hepatozyten. Schweinehepatozyten werden als beste Alternative betrachtet, da menschliche Hepatozyten kaum erhältlich sind, und den transformierten Zellen kann es an kritischen Hepatozytfunktionen fehlen. Schweinelebern können von Labortieren oder aus dem Schlachthaus erhalten werden und Schweinehepatozyten können leicht in großen Mengen mit einer einfachen Zweischritt-Kollagenase-Perfusionstechnik isoliert werden.
Zur klinischen Anwendung einer bioartifiziellen Leber sind Langzeit-kultivierte Hepatozyten nicht ratsam, da sich die Stoffwechselfunktionen von kultivierten primären Hepatozyten mit der Zeit verschlechtern. Deshalb beobachteten wir das Kultursystem nur an den ersten vier Tagen nach der Isolierung, wenn die leberspezifischen Funktionen am höchsten sind. Die Verschiedenheit in den Leberfunktionen ermöglichte nicht, daß ein Einzeltest ein Anzeichen für die Hepatozytfunktionskapazität ist. Aus diesem Grund wurde eine Testreihe durchgeführt, um die Leistung des Kultursystems einzuschätzen. Die Galactosebeseitigung, die Harnstoffsynthese und der Aminosäurestoffwechsel blieben über den untersuchten Zeitraum von drei Tagen konstant, was die Fähigkeit des Bioreaktorsystems anzeigt, die Hepatozytfunktion aufrechtzuerhalten.
Lidokain-Clearance ist ein Anzeichen für die Zytochrom-P450-Aktivität und wird als kritische Funktion betrachtet, die durch ein erfolgreiches BAL bereitgestellt werden muß. Lidokain-Clearance wurde über drei Tage aufrechterhalten, wodurch die stabile P450-Aktivität durch die Bioreaktor-kultivierten Hepatozyten dargestellt wird. In einem Einzelexperiment wurde die P450-Aktivität über 14 Tage mit einem allmählichen Verringerungstrend in der zweiten Woche auf 70% der anfänglichen Aktivität aufrechterhalten. Um auszuschließen, daß die Lidokain-Clearance durch Verdampfung, Adsorption oder unveränderte Aufnahme von Hepatozyten verursacht wird, wurde die Biotransformation von Lidokain durch Nachweisen der Stoffwechselprodukte MEGX, Xylidin und GX untersucht, die bekanntermaßen bei Menschen synthetisiert werden, wobei von MEGX berichtet wird, daß es das Hauptlidokainstoffwechselprodukt in Menschen- und Schweinehepatozytenkulturen ist. Im Gegensatz dazu war nicht MEGX sondern Xylidin das Hauptlidokainstoffwechselprodukt an den ersten zwei Tagen der Kultur in dieser Untersuchung. Außerdem erzeugen Schweinehepatozyten keine nachweisbaren Niveaus des Stoffwechselproduktes GX. Zusammenfassend bestätigten die Xylidin- und MEGX-Synthese die Zytochrom-P450-Aktivität, wie durch die Lidokain-Clearance demonstriert. Die Biotransformation von Lidokain in Schweinehepatozyten unterschied sich von dem, was bei Menschen beobachtet worden ist.
Die Konzentration von LDH, GOT und GPT, die als ein Marker der Zellmembranintegrität verwendet wurden, verringerte sich schnell über den untersuchten Zeitraum. Dieser Abfall der Enzymniveaus gibt wahrscheinlich die Rückgewinnung der kultivierten Hepatozyten aus den schädlichen Wirkungen der enzymatischen Zellisolationstechnik an. Die GPT-Konzentrationen in unserem Kultursystem waren sehr niedrig im Vergleich zu den LDH- und GOT-Niveaus, was ebenso im Stand der Technik beobachtet wurde. Deshalb schlußfolgern wir, daß GPT ein schlechter Indikator der Schweinehepatozytmembranintegrität ist und besser allein gelassen werden sollte. Der empfindlichste Marker in dieser Untersuchung war GOT.
Eine andere wichtige Leberfunktion ist die Proteinsekretion, die in dem Hepatozytbioreaktor am vierten Tag der Kultivierung untersucht wurde. Das Kultursystem war in der Lage, verschiedene Proteine abzusondern, wie durch die Cross-Immunoelektrophorese sichtbar gemacht, wobei jeder Peak ein unterschiedliches Serumprotein darstellt.
Zum Schluß stellt die Erfindung eine neue Bioreaktorkonfiguration bereit, welche die Aufrechterhaltung der verschiedenen leberspezifischen Funktionen bei der Hepatozytkultivierung hoher Dichte sicherstellt. Dies macht das System zusammen mit seiner Leichtigkeit der Handhabung, Herstellung und Vergrößerung zu einem attraktiven Kandidaten zur kurzzeitigen Unterstützung der Patienten mit Leberversagen.
Tabelle 1 Ergebnisse einer Inkubation von 14 Stunden (jeden Tag für drei Tage) von 220·10⁶ Bioreaktor-kultivierten Hepatozyten mit angereichertem Williams'E-Medium, betreffend die Veränderungen der Aminosäurekonzentrationen, Lactat- und Pyruvatkonzentrationen und Lactat/Pyruvat-Verhältnisse, des Enzymverlustes, der Glukosekonzentrationen und des pHs

Claims

Bioreaktor, umfassend eine Wand, welche einen Raum umgibt, wobei der Raum umfaßt: (a) einen festen Träger zur Zellkultivierung, welcher aus einer dreidimensionalen Matrix in Form einer hochporösen Schicht oder Matte besteht, wobei die dreidimensionale Matrix ein physiologisch verträgliches Netzwerk von Fasern oder eine physiologisch verträgliche offenporige Schaumstruktur umfaßt, und (b) Röhren zum Zuführen von gasförmigem Sauerstoff und zum Entfernen von gasförmigem Kohlendioxid, wobei die Röhren Hohlfasern sind, welche aus einem hydrophoben Material hergestellt sind und einen Außendurchmesser von 0,1 mm bis 1,0 mm aufweisen, wobei die Hohlfasern gleichmäßig durch die dreidimensionale Matrix verteilt sind und wobei der Abstand zwischen den einzelnen Hohlfasern zwischen 0,1 mm und 5 mm beträgt.
Bioreaktor nach Anspruch 1, wobei die Hohlfasern im wesentlichen parallel laufend von einem Ende der Matrix zum anderen Ende der Matrix angeordnet sind.
Bioreaktor nach Anspruch 1 oder 2, wobei der biologische Reaktor weiter mindestens eine Gaszuleitung und mindestens einen Gasabgang, welche betriebsbereit an die Hohlfasern angeschlossen sind, einschließt.
Bioreaktor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Hohlfasern an die Matrixschicht oder Matte durch Weben der Fasern in die Matrixschicht oder Matte, durch Kleben der Fasern an die Matrixschicht, durch Nähen der Fasern an die Matrixschicht oder Matte, durch Binden der Fasern an die Matrixschicht oder Matte mittels Ultraschall, gebunden sind.
Bioreaktor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der feste Träger in Form von mindestens einer gerollten oder gefalteten Schicht oder Matte oder mindestens zwei gestapelten Schichten oder Matten vorhanden ist.
Bioartifizielles Organsystem, welches aus einem Bioreaktor nach einem der Ansprüche 1 bis 5 besteht, wobei der Bioreaktor von Menschen oder Tieren abstammende Zellen umfaßt.
Bioartifizielles Organsystem nach Anspruch 6, wobei die Zellen aus der Gruppe, bestehend aus Leberzellen, Bauchspeicheldrüsenzellen, Nierenzellen, Nebenschilddrüsenzellen und Knochenmarkszellen, ausgewählt sind.
Bioartifizielles Organsystem nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Zellen Leberzellen sind, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus primären Hepatozyten, immortalisierten Leberzellen, Leberzellentransformanten, Lebertumorzellen, Hepatoblasten und daraus abstammenden Zelllinien.
Bioartifizielles Organsystem nach Anspruch 8, wobei die Zellen der Gefrierkonservierung unterworfen worden sind.
Verfahren zum Versorgen und/oder Kultivieren von Organzellen, umfassend das Einbringen der Zellen in den Raum eines Bioreaktors, wie nach einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert, so daß die Zellen an den festen Träger anhaften, und das Halten diese Zellen unter physiologisch verträglichen Bedingungen während gasförmiger Sauerstoff oder ein Sauerstoff enthaltendes Gas durch die Hohlfasern zugeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei nachdem die Zellen in den Raum des Bioreaktors eingebracht worden sind, die Zellen auf dem im Bioreaktor lokalisierten festen Träger durch Rotation des Reaktors um eine Innen- oder eine Außenlängsachse für eine Zeitdauer, welche ausreicht die Zellen an den festen Träger zu haften, immobilisiert werden.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Organzellen Leberzellen sind, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus primären Hepatozyten, immortalisierten Leberzellen, Leberzelltransformanten, Lebertumorzellen, Hepatoblasten und daraus abstammenden Zelllinien.
In vitro Verfahren zur Herstellung, Biokonversion und/oder Entfernung von Substanzen in oder von einem flüssigen oder gasförmigen Medium, das Verfahren umfaßt das Inkontaktbringen des Mediums mit Zellen, welche im Raum des bioartifiziellen Organsystems, wie nach einem der Ansprüche 6 bis 9 definiert, vorhanden sind.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das flüssige oder gasförmige Medium Blut oder Plasma ist.