JP4112616B2 - 細胞培養、特に肝細胞の培養に使用するための固相支持体、前記固相支持体を含む生物的リアクター、およびバイオ人工肝臓システムにおけるその使用 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、細胞、特に肝細胞のような付着性（adherent）組織細胞の培養の分野に関する。さらに具体的には、本発明は、細胞、特に肝細胞を培養および／または維持するための生物的方法およびリアクター、並びにバイオ人工肝臓システムにおける（BAL；bio-artificial liver system）、このような方法の使用の分野に関する。
従来技術の簡単な記述
殆どの組織細胞は、増殖、分裂するために、固相支持体を必要とすることが一般的に知られている。
ガラス瓶またはペトリ皿のような普通の容器中で、付着性組織細胞を培養することも可能であり、その間細胞は容器の壁に付着するが、細胞の付着能を増加させるために、通常表面積が広い特別な反応容器または瓶が用いられる。前記表面を改善する１つの方法は、細胞を付着させるための固相支持体を用いることである。このような固相支持体は、本分野において公知であり、例としてガラスビーズ、ミクロ担体およびセルロースファイバーが含まれる。
懸濁液または集密相（confluent layer）中での細胞培養と比べた場合、付着性細胞の培養における特別な問題点は、細胞に十分な栄養素および／または酸素を供給し、および／または老廃物および／または二酸化炭素を十分に除去することである。これは、肝細胞のように、酸素供給（oxygenation）および老廃物の除去がともに、きわめて厳格に要求される細胞において特に問題となる。適切な固相支持体が利用できず、肝細胞をインビトロで培養する方法がないために、いわゆるバイオ人工肝臓（BAL）システム（自然の肝機能を補助および／または置換するために、肝疾患患者に用いることができるシステム）の開発が、この40年間にわたって非常に困難となっていた。急性肝不全は予後がきわめて不良で、通常数日、場合によっては数時間で患者にとって致命的となる（例えば、肝不全治療の分野における一般的問題を述べている、デブリン（Devlin et al.）、Hepatology, Vol.21, No.4（1995）, 1018-1024ページ、レイクおよびスズマン（Lake and Suzman）のHepatology, Vol.21, No.3（1995）, 879-882ページ参照を参照されたい。両者は参照文献として本明細書に取り込まれる）。何故なら、移植用の肝臓は、即座に入手できないので、例えば患者が、移植用の肝臓が手に入るのを待っている間に、および／または患者の肝臓が十分に回復、および／または自力でおよび／または治療の結果再生するまで、しのいでいる間、肝機能を補助および／または置換することができるBALシステムが熱望されている。
しかし、上述したように、インビトロで肝細胞を培養および／または維持するための適切な方法および／または素材が存在しないために、従来のバイオ人工肝臓システムは不十分であることが明らかとなっている。何故なら、それらはインビボで患者の肝臓が行っている全ての機能を完全には置換せず、性能が不十分であり、および／またはそれらが治療的効果を示す期間が、実用の上では、非常に限られているからである。
バイオ人工肝臓システムの歴史は、最近の文献に多数記載されており、特にナイバーグら（Nyberg et al.）、the American Journal of Suregery, Vol.166, 1993年11月、512-521ページ、スズマンおよびケリー（Suzman and Kelly）、Scientific American, 1995年5-6月、59-77ページは参照文献として本明細書に取り込まれる。
これらの文献に記載されているように、最も初期の肝臓補助システムは、血液透析、木炭血液灌流（charcoal hemoperfusion）、またはヒトとヒトもしくはヒトと動物間の何れかでの個体間血液透析（cross-haemodialysis）に基づいていた。また、体外肝臓灌流も試みられてきた。
これらのシステムは全て不十分であることが明らかとなった。ナイバーグらが述べているように、
「初期の肝臓補助技術によって達成された成功が十分なものでなかったことに基づき、生存に不可欠な肝機能を最適に与えるのは、持続的または反復的な使用が可能となる哺乳類の肝臓調製物であろうという概念が提唱された。これらの肝臓調製物は、普通ハイブリッドシステムまたはバイオ人工システムと呼ばれており、合成フレームワークの中に生体成分を含む。生体成分には、単離した肝臓酵素、細胞成分、肝臓の断片（slide）または培養した肝細胞が含まれ得る。肝細胞は患者の体内に移植され、または体外から灌流され得る。肝細胞システムは、バイオ人工肝臓補助として最も有望であることが示されてきた。細胞成分システムと単離した酵素システムとを比較すると、細胞成分は、代謝的に活性な、完全な状態の肝臓細胞を利用しているので、肝細胞システムの方が、より多くの肝機能を供給するはずである。個体間循環（cross-circulation）および体外肝臓灌流のような従来の肝細胞移植および初期の補助技術と比べて、肝細胞と宿主免疫系との間に障壁を与える半透性の素材でバイオ人工肝臓を構築できることは、肝細胞バイオ人工肝臓の主要な利点の１つである。その結果、バイオ人工肝臓療法は、免疫抑制を用いずに行い得るかもしれず、バイオ人工肝臓の中に、異なる種からの肝細胞（異種細胞；xenocyte）を入れて使用し得る。
バイオ人工肝臓システムの欠点には、臨床に使用するために必要となる、正常な肝細胞の生存能力および高細胞密度における機能を維持する問題が含まれる。例えば、標準的細胞培養液を有するプラスチック表面上で肝細胞を増殖させると、約12〜24時間で、それらのギャップジャンクションが喪失する。また、肝細胞は平たく、顆粒状になる。組織特異的な機能は、3〜5日で失われ、その後1〜2週間以内に肝細胞は死滅する。その結果、バイオ人工肝臓補助システムの応用には、細胞培養技術の改良が必要となる。
BALシステム中で、またはBALシステムとして使用するための肝細胞および関連細胞を培養するための、多くの異なるアプローチが公表されてきた。しかし、従来の肝細胞システムは、性能および有効機能時間に関連する諸問題に直面している。サスマンおよびケリーによれば、
「十分な代謝能力の供給という点に関しては、正確には、どの程度の肝臓壊死が致命的となるのか明らかではない。動物実験から、生存のためには、元の肝機能の少なくとも30％が保持されていなければならないということが示唆されている。成人の肝臓は、約1000グラムの肝細胞を含有し、代謝が活発な細胞である。このため、我々は有効に肝臓を補助するには、300〜400gに相当する細胞が必要であることを提唱してきた。
肝細胞は、単離直後の細胞（初代培養）および連続培養で増殖させた細胞（クローニングされた、または不死化した細胞）という２つの入手源から得ることができる。正常なヒトまたは動物の肝臓から単離した細胞は、その機能の多くを保持しており、該技術には著しい制限がある。これまでのところ、単離直後の細胞を用いた人工肝臓は、必要な代謝能力の極く一部を提供するのみである。肝細胞は、単離した後には分裂せず、そのため新しい細胞を継続的に供給することが必要である。細胞の調製が労力の集中を要することと相俟って、採算をとりながら、現在の需要を満たすように生産をスケールアップすることはほぼ不可能である。さらに、単離直後の細胞は、治療の間、余り長く持続しないようである。肝臓補助装置の中には、6〜7時間しか持続しないものがあると報告されているが、明らかに肝臓の再生には不十分である。最後に、このような動物細胞を用いる装置の生産には全て、多くの問題、特に増殖性およびロット間の変動に関する問題が伴う。」
ウチノら（Uchino et al.）、ASIAO Transactions、1988年；23；972-977は、多数のプレートに分けた肝細胞単層から構成される、ハイブリッドバイオ人工肝臓を記載している。ホウケイ酸化され（borosilicated）、コラーゲンコートしたガラスプレートを200枚積み重ねてなるリアクター中で、合計80グラムの成熟イヌの培養肝細胞を培養した。これらの肝細胞は生存可能で、灌流培養中で4週間の間、よく機能した。該バイオ人工肝臓は、無肝臓（anhepatic）イヌで試験された。最長65時間の生存が得られた。
しかし、構造の複雑さ、および200枚のガラスプレートリアクターを用いることに加えて、該システムの重大な欠点は、該プレート上の肝細胞の単層培養では、有用な肝細胞の凝集体（aggregate）が形成されないことである。本分野において、凝集体中または凝集体として培養された肝細胞は、単層で培養された肝細胞に比べて、さらに長く、且つ良好に機能し、より高い活性およびより良い分化を示すことは周知である。
バイオ人工肝臓システムの開発における別のアプローチは、中空糸のバイオリアクターを使用することであり、その中で、肝細胞は糸外（extraluminar）領域に存在し、一方培養液は、通常全血または血漿とともに灌流することによって、糸の内腔（intraluminar space）を通して送液される。
ロズガ、デメトリウら（Rozga, Demetriou et al.）、Biotechnology and Bioengineering Vol.43,1994年（参照文献として本明細書に取り込まれる）は、現在の中空糸システムを概説している。彼ら自身のシステムは、木炭カラム、および、5〜6×10⁹個のミクロ担体が付着した、糸外の区画に植種された（seeded）ブタ肝細胞を有する多孔性中空糸モジュールを具備する高流量血漿灌流回路からなる。固相支持体を用いているために（コラーゲンコートしたデキストランミクロ担体）、肝細胞の付着に利用できる表面積が増加している。
しかし、該デザインでは、血漿に酸素供給するための独立した膜酸素供給装置（membrane oxygenator）を灌流回路中に取り込んで、中空糸モジュール中の肝細胞に十分な酸素を供給することが必要となる。それ故、二酸化炭素の除去のみならず、前記酸素供給も、血漿中への酸素および二酸化炭素の溶解度、およびリアクター全体への、酸素供給された血漿の輸送のような制限因子に依存する。これらの制限のために、前記中空糸リアクターは、実用的な治療に応用するために必要な性能に、容易にスケールアップすることができない。
さらに、該リアクターは、高密度のマクロ担体を有する非常に「経路が閉塞した（closed path）」のカラムを用いており、ミクロ担体の塊（pellet）の形成、およびこのような塊の中心にある細胞に関して、物質輸送（masstransfer）の問題が生じる。
該システムの別の欠点は、中空糸リアクター中に肝細胞が導入され得る前に、まず肝細胞をミクロ担体上に固定化しなければならないことである。さらに、これには、細胞の生存能力を喪失させ得る複雑な加工ステップが含まれる。
本明細書で前述したサスマンおよびケリーは、中空糸をベースにしたバイオ人工肝臓システムを記載しており、該システム中で、肝細胞は、患者からの全血が送液されている毛細管に付着している。
著者が述べているところによれば、「血漿は全血の酸素運搬能を与えない」ので、該システムでは、患者の血液によって酸素が肝細胞に供給される。
さらに、全血を用いた灌流によって、バイオリアクター中の糸および／またはその小孔が目詰まりする。この問題は、中空糸モジュールを全て交換する（肝細胞を新たに単離／固定化することが必要となる）ことによってのみ解決し得るかもしれない。
培養液として全血を用いる、該および他の中空糸システムの他の欠点には、「糸の壁を通して、栄養素および代謝物の何らかの有意な輸送が起こり得る前に、まず中空糸の膜が血漿分離装置として作用しなければならない」ということ、および「モジュール内での凝固を防止するために、ヘパリンによる全体的な抗凝固が必要となる」ことがある。
また、細胞の単離に伴う諸問題を克服するために、該BALシステム中では、子供の肝臓癌から得られ、C3Aと名付けられた特別な細胞系統が用いられる。しかし、活性および機能に関しては、このような腫瘍由来の細胞系統の使用は、一般的には、単離された初代肝細胞の使用に比べて、本分野において好適とはいえず、安全面からも好適でない。
さらに、スズマンによって用いられたC3A細胞系統は、初代肝細胞の非常に重要な機能を幾つか欠いている。また、C3A細胞はあまり分化しておらず、それ故初代肝細胞に比べて、活性が低い。
本明細書において上述したナイバーグらによって、幾分異なる中空糸システムが記載されており、肝細胞をコラーゲンゲルの中に懸濁し、これを中空糸の内腔に注入する。その後、該バイオリアクターの糸外領域には、24時間溶媒を灌流し、その後該ゲルが糸内で凝縮し、それによって培養液を灌流する第３の空間ができる。
該スリーコンパートメントデザインの背後にある考え方は、血液には糸外区画を通じて圧力を与え、一方ゲルにトラップされた細胞には、凝縮したコラーゲンに隣接した通路中を流れている培養液の中に存在する因子によって、栄養およびおそらく刺激を与えるというものである。
しかし、該システムも複雑且つ時間のかかる、肝細胞の前固定化を必要とする。
肝細胞固定化用の毛細管をベースとした、別のBALシステムが、ガーラッヒら（Gerlach et al.）、Transplantation、Vol.58、No.9、1994年によって記載されている。彼らのバイオリアクターは、代謝物の勾配が少ない、分散化された（decentralized）細胞の灌流、並びに分散化された酸素供給および二酸化炭素除去のための３次元のフレームワークからなり、４つの独立した毛細管膜システムが織り込まれたネットワークからなり、各々が異なる目的を果たしている。すなわち、１）血漿の取込（ポリアミド糸）；２）酸素供給および二酸化炭素の除去（疎水性のポリプロピレン糸またはシリコン糸）；３）血漿の排出（ポリスルフォン（polysulfon）糸）；および４）洞様毛細血管内皮の共培養（coculture）（親水性ポリプロピレン糸）である。大部分の肝細胞の周囲に４種の膜が全て存在するように、これらの毛細管を織り込まなければならない。
該リアクターは、2.5×10⁹個のブタ肝細胞とともに用いられ、生存率は88〜96％であり、該リアクターの共培養区画中に存在する自己の洞様内皮細胞と共培養された。
この種の中空糸バイオリアクターにおいて、該リアクター中には、さらなる細胞付着用のマトリックス素材が存在しないので、肝細胞は中空糸に直接付着させなければならない。細胞の付着を十分にするためには、Matrigel^Rまたは他のコラーゲンベースの素材のようなタンパク質性基底膜産物で、まず糸の表面をコートしなければならず、高価な前処理ステップが別途必要となる。そうだとしても、中空糸は、細胞培養の固相支持体として用いるために、特別にデザインされた、および／または適したものではないので、前記リアクターによって許容される、および／または得られる付着およびその速度は限られたものであり、リアクターに植種する時には、大量の接種原（inoculum）を与える必要がある。
さらに、前記３次元糸のフレームワーク中の平均糸間距離は約500μmなので同様のサイズの、大きな細胞凝集体が形成される。また、これらの大きな凝集体は、該凝集体の中心にある細胞に関して、物質輸送の問題が生じ得る。
また、中空糸は加工が難しいということは周知であり、この点で、ガーラッヒらが記載した、４つに区切られた独立の毛細管システムを具備する、極めて複雑な３次元の糸のネットワークを製造することは、経済面からみて不利である。また、該リアクターの操作は複雑で、複数の独立した取込口／排出口の制御システムが必要となる。
上述した、従来の中空糸バイオリアクターの一般的な問題点は、中空糸の膜によって、処置すべき溶媒（血液、血漿）が肝細胞から分離されているということであり、言い換えれば、リアクターの中で、溶媒と肝細胞との間に直接的な接触が全くないということである。溶媒から除去すべき、および／または溶媒中へ分泌すべき栄養素および物質は、それぞれ肝細胞および溶媒に達するために、前記膜障壁を通過しなければならない。膜を通じての通過は、物質輸送の利用を制限し、それ故BALシステムの効率を制限し得る輸送現象を引き起こし得る。
また、特に全血による灌流を用いた場合、膜は目詰まりし得る。その場合、BALシステムまたはその一部は、取り替えなければならず、このことは治療を中断または中止すらしなければならないことを意味している。
膜輸送における別の重要な制限因子は、膜の分子量遮断作用（molecularweight cut off）であり、ナイバーグによれば、
「透過性および膜の分子量遮断作用は、老廃物の除去、産物の供給、および免疫の活性化に影響を与える。生体的変化（biotransformation）機能を行うこと、および窒素性老廃物を除去することは、ビリルビンのような、崩壊した赤血球産物を除去することとともに、バイオ人工肝臓の重要な機能である。バイオ人工肝臓中の肝細胞による、凝固タンパク質および他の血清タンパク質の産生も、肝不全患者にとって有益であるかもしれない。しかし、これらのタンパク質は、抗体と同程度の大きさであり、バイオリアクター中の非自己肝細胞に対して誘導されると、悪影響を与えるかもしれない。あるいは、肝細胞の小ペプチド産物がバイオリアクターの外に出て、患者の中で抗原性刺激物質として働くかもしれない。これらの外来分子によって、有害なサイトカインの産生、免疫複合体の形成、または肝不全患者の血清の異常が生じるか否かは、これから決定しなければならない。バイオ人工肝臓に用いるために最適な分子量遮断を決定するために、起こり得る副作用に関する実験に取り組まねばならない。」
肝不全の臨床的治療には、大規模な、高密度肝細胞培養が必要である。多くのバイオリアクターでは、これによって、非生理的な肝細胞の塊が形成される。これらの大きな凝集体の中心にある肝細胞は、代謝活性が低く、これらの細胞への栄養素および酸素輸送、並びにこれらの細胞からの、二酸化炭素、毒素および細胞産物の輸送が妨げられる結果、勾配が大きいために壊死が起こる可能性さえある。これは、全ての肝細胞が血液と密接に接触している、インビボの肝臓とは対照的である。その上、多くのシステムでは、基質の交換は拡散に依存し、これにより、低い勾配の灌流条件下で肝細胞が機能している、インビボの状態と比較して、物質輸送がさらに制限される。
また、一般的には融合輸送（fusion transport）は非常に遅いので、従来のバイオリアクターは、中空糸の内腔から引き出し得る溶媒の量が制限される。それ故、中空糸内から溶媒を積極的に引き出すことが必要であり、そのようにしてさえ、中空糸自体を通じた溶媒の流量が多くても、中空糸膜を通した全流量は極めて低く、および／または望ましくない勾配が形成される。
従来のバイオ人工肝臓システムに伴う一般的な、別の問題点は、高度の生存性（＞80％）および高い付着性を有する肝細胞の調製を用いることが必要であるということである。本明細書において上述したスズマンおよびケリーが既に認めているように、このような細胞の産生は、適切な十分な生存能力および量の肝細胞を単離し、続いて培養することを要する、非常にコストがかかり、複雑且つ時間のかかる工程であり、熟練者が行っても、必要な結果が確実には得られない複雑な操作が含まれる。
さらに、治療的に受容できるレベルで、リアクター中の肝細胞の生存能力および機能を維持することができないので、肝臓を含有する既知のBALシステムを使用前に長期間保存することはできない。
また、より長期間にわたって、単離した肝細胞を保存するために用い得る唯一の技術、すなわち冷凍保存は、既知のBALシステムに使用するのに適した細胞を与えない。本明細書において上述したロズガらによれば、
「必要時に細胞を入手できることは、通知後短期間に、時間を選ばず緊急に行われるFHF患者の治療における、臨床状況で極めて重大な事柄となっている。しかし「冷凍保存」によって、細胞の生存能力および付着性（50％に及ぶ）が相当失われる。それ故、臨床状況において、我々は単離直後で、付着が良好な肝細胞の使用を好む。」
これらの問題のために、例えば透析装置、または人工心肺システムのような他の臓器補助用人工システムの場合のように、既知のBALシステムは、それらを使用することが必要となるまで、病院に保管および／または維持させ得る「在庫可能な（off the shelf）」ユニットとして用いることができない。また治療中に、機能が不十分な使用済みの、従来の初代肝細胞をベースとしたBALシステムを新鮮なBALシステムに、交換することを長期間にわたって実施するのは通常経済的に不可能である。
例えば、デメトリウは、使用後6時間に、彼のリアクター中の初代肝細胞の50％が死滅し、24時間以内に全ての細胞が死滅したと報告している。固定化した細胞またはスズマンらによって報告されたC3A細胞系統を用いることにより、さらに良い結果が得られたが、該肝芽細胞（hepatoblast）由来の該細胞系統の使用には、既に本明細書で上述したような他の欠点がある。
上記のような観点から、上述した従来システムの欠点を有しないバイオ人工肝臓システムが、引き続き必要とされている。
英国特許出願第2,178,447号は、10〜100μmの適切な孔径を有する糸ネットワークまたは開孔発泡体（open-pore foam）によって与えられる細胞付着のために利用し得る有効表面積を増大させる、インビトロ細胞培養用のマトリックスを記載している。該マトリックス素材は、シートもしくはマットの形態、または粒子もしくは薄片の形態で与えることができ、後者の形態は、FibraCel^Rの名前でビビー・ステリリン（Bibby Sterilin）によって市販されている。シートまたはマットとしては、該マトリックス素材は、濾紙またはティッシュペーパー、または薄い多孔性フェルトのような外観を有する。
製造にコストがかかり且つ困難であり、カプセル中心の細胞がしばしば死滅するので、高密度に細胞を成長させると問題が生じるミクロカプセルに比べて、該マトリックス素材は幾つかの特別な利点を有する。また、該ミクロカプセルは完成前に破裂して、その内容物を失うかもしれず、各新規接種には、新しいカプセル化操作が必要となる。ミクロ担体と比べて、英国特許出願第2,178,447号によるマトリックス素材は、細胞がマトリックス構造内に固定化されているという利点がある。ミクロ担体を用いると、これらの細胞は担体粒子の外側に固定化されるので、例えばリアクターの調製またはパッキング中に、剪断応力および粒子の衝突を受けやすくなる。
さらに、英国特許出願第2,178,447号によるマトリックス素材中では、従来の組織培養瓶、フラスコ、もしくはペトリ皿中、またはミクロ担体ビーズもしくは中空糸上のような２次元ではなく、むしろ３次元のシートの糸に沿って、細胞は増殖し得る。細胞は、１以上の糸に付着するかもしれず、細胞の増殖は、糸マトリックスの内部空間で起こる。このような理由で、本分野では、該または類似のマトリックス素材は「3D担体マトリックス」として知られている。
前記3Dマトリックス素材の別の利点は、２次元システムにおける大量の接種原負荷（飽和時の最終細胞量の20-30％）を必要とせず、10％未満、5％程度の低量で接種し得るということである。３次元ネットワークは、より多く、より迅速に細胞を「捕捉（capture）」し、それによって最適に近い付着性を有する細胞を使用することも可能となる。
さらに英国特許出願第2,178,447号は、その中で記載されているマトリックス素材を用いた、考えられるバイオリアクターのデザインを多数記述する。これらのうちの１つには、２つの平たいチューブの間で、らせん状に巻き上げられた前記マトリックス素材のシートが含まれ、その中で、各平たいチューブは１つおきに、一方は栄養素溶媒用の導管として、他方は酸素、空気、二酸化炭素および水蒸気のような気体用の導管として働く。
しかし、英国特許出願第2,178,447号は、バイオ人工肝臓システムの構築に向けられておらず、その中での肝細胞の培養および／または維持に関する特別な問題に向けられもいない。特に、英国特許出願第2,178,447号は、高度に酸素依存的な肝細胞に十分な酸素を供給する特別な問題にも関していない。
実際、英国特許出願第2,178,447号による、肝細胞培養および／または維持用の「らせん状に巻いた」リアクターを用いても、現実には、不十分な酸素供給しか起こらないであろう。何故なら、酸素は、マトリックスマットの全長にわたる唯一の導管のみによって供給されているからである。特に、マトリックスの巻き数を増加させて、該リアクターをスケールアップする場合、このような単一導管の使用では、全長に沿った望ましくない酸素勾配、または局所的な酸素欠乏さえ生じるであろう。
また、英国特許出願第2,178,447号によるバイオリアクターの構築は、溶媒を供給および／または除去するための独立した導管を考えており、そのためBALとしての使用中に、吸収または分泌される栄養素、毒素および他の物質が、肝細胞に到達するために、前記導管を取り囲む膜を通過しなければならず、本明細書において上記したように、膜輸送および物質輸送に関する問題が生じる。
さらに、らせん状に巻いた、液体輸送用の単一導管の使用は、例えば望ましくない勾配の生成によって、バイオリアクターの全ての部分に不均一な溶媒の供給が起こり得る。
これらの因子全てによって、マトリックス素材はこのようになり、英国特許出願第2,178,447号によるバイオリアクターは肝細胞の培養および／またはBALとしての使用に適さない。
発明の目的
それ故、本発明の第１の目的は、付着性細胞、特に肝臓細胞を培養および／または維持するための、改良された固相支持体およびバイオリアクターであって、大規模なバイオリアクターの中で、または大規模なバイオリアクターとして用いたときでさえ、細胞付着特性が改善され、並びに酸素および二酸化炭素のような気体成分の供給および／または除去が改善されたバイオリアクターを提供することである。
さらに、細胞と処理すべき溶媒の間に、液体が直接接することができるようにし、同時に、前記支持体の全部分に一定の流れを維持する、改良された固相支持体およびバイオリアクターを提供することは、本発明の目的である。
肝細胞を培養するための方法であって、バイオ人工肝臓中で用いるのに実用的な期間中、大量に肝細胞を生きた状態で維持し得る方法を提供することも本発明の別の目的である。
さらに本発明の目的は、患者の肝機能を置き換えるおよび／または補助するために使用し得る、改良された治療特性を有するバイオ人工肝臓を提供することである。
さらに別の本発明の目的は、バイオ人工肝臓を用いることによって、肝不全、特に急性肝不全を治療するための方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、以下の記載から明らかとなろう。
本発明および図の簡単な記述
細胞培養のための、改良された固相支持体が、本明細書において上記したような3Dマトリックス素材、特に英国特許出願第2,178,447号によるマトリックス素材に、酸素および／または二酸化炭素のような気体成分を供給および／または除去するための中空糸を与えることによって得られることが明らかとなり、前記固相支持体は、ヒトまたは動物の肝細胞のような付着性の組織細胞を培養するのに適している。
本発明の固相支持体を用いて、改良されたバイオ人工肝臓システムが提供され得ることも見出された。
それ故、一般的に言えば、本発明は、
−3Dマトリックス素材および気体輸送用の中空糸を具備する固相支持体
−3Dマトリックス素材に中空糸を付着することを具備する前記固相支持体の調製法
−本発明の固相支持体を具備する生物的リアクター
−本発明の固相支持体および／またはバイオリアクターを用いる、細胞、特に付着性組織細胞、とりわけ肝細胞を培養および／または維持する方法
−本発明の固相支持体および／またはバイオリアクターを具備するバイオ人工肝臓システム
−本発明のバイオ人工肝臓システムを使用してなる、患者の肝機能を置換および／または補助する方法、および／または肝疾患の治療法
に関する。
本発明の別の側面、実施態様および利点は、以下の記述および図によって明らかとなるであろう。
図１は、本発明の好適な固相支持体の正面図を示す
図２は、「サンドウィッチ」配置された、本発明の好適な固相支持体の断面図を示す。
図３および４は、本発明のバイオリアクターの２つの可能なデザインを示す。
図５〜９は、本発明のバイオ人工肝臓システムの４つの可能な配置を示す。
図１０は、独立したマトリックスシートおよび中空糸シートを具備する、本発明の固相支持体の別の実施態様を示す。
図１１は、本発明のバイオリアクター中に細胞を固定化するための装置を図示する。
図１２は、本発明のバイオリアクターの可能な構造を図示する。
図１３は、５日間20.10⁶の生きた細胞／mlで培養した肝細胞バイオリアクターからの3Dマトリックスの断面の光学顕微鏡写真を示す。
図１４は、20.10⁶の生きた細胞／mlで、バイオリアクター装置の3Dマトリックスの中で５日間培養した、単離されたブタの肝細胞の走査型電子顕微鏡写真を示す。図１５Aおよび１５Ｂは、小（A）内径（1.32cm）およびスケールアップしたバイオリアクター（B）の内径（2.2cm）のトランスアクショナルフロー感受性MRI（transactional flow sensitive MRI）を示す。
固相支持体
一般的に、本発明の固相支持体は、3Dマトリックス素材および中空糸を具備する。
本明細書において、3Dマトリックスは、その中で培養される細胞を増殖するために３次元を供給する素材として定義される。このような3Dマトリックスは当業者には公知であり、例には、
１．Gelfoam（ゼラチン、サイズ：20mm^*7mm、Upjohn Ltd., Tokyo Japan）
２．PVF（コラーゲンコートした網目状のポリビニルの正式な（formal）樹脂、80％の多孔性を有する、サイズ2mm厚の産業用フィルター素材、Kanebo Kasei Co., Osaka, Japan）
３．PVLA-RPU（ポリ-N-パラ-ビニルベンジル-ラクトンアミドをコートした網目状のポリウレタン、サイズ：直径34mm^*1mm厚、Sanyo Chemical Industries, Ltd., Kyoto, Japan）
４．PGA（ポリグリコール酸、Albany International Research Co., Mansfield, Mass.）
５．PVA（ポリビニルアルコール）、Unipont Industries, High-point, NC
６．PGA/PLA（ポリグリコール酸／ポリ乳酸、比率90:10）、Ethisorb
７．3Dポリウレタンフォームまたは非織マトリックス
８．多孔性シリコンゴムフォーム（foam）（Ashby Scientific Ltd, Leicestershire, UK）
がある。
好ましくは前記3Dマトリックスは、高表面積の基質を与える素材であって、その有効表面は、平面上に投射した同一の面の約10〜100倍であり、約40〜95％の多孔性および10〜100μmのオーダーの孔のサイズを有する生理的に受容され得る糸のネットワーク、またはマトリックス全体の高さが約50〜2000μmのオーダー、好ましくは100-1000μmであって、該マトリックスが高度に多孔性の非織シートまたはマットの形態である、約10〜100μmのサイズの孔を有する開孔発泡構造（open-pore foam structure）具備する。
該素材は、その調製、利点および好適な実施態様とともに、本明細書で上述した英国特許出願第2,178,447号に記載されており、参照文献として本明細書に取り込まれる。
該マトリックスは、好ましくは、約10〜100μmの孔および60〜95％の多孔性を有する開孔発泡性ポリマー構造を有する。
該マトリックスは英国特許出願第2,178,447号で挙げられている全ての適切な素材から作成し得るが、好ましくはポリエステルから作成される。
該マトリックス素材は、英国特許出願第2,178,447号で記載されているような全ての形態でも使用し得るが、好ましくはシートまたはマットのような非織３次元ファブリック構造の形態で使用される。このような平板状の、高度な多孔性の非織シートまたはマットおよびそれらの調製も前記参照文献に記載されており、Bibby Sterilin Stone, Staffordshire, U.K.から購入できる。
幾つかの3Dマトリックスシートの組み合わせ、例えば、非織ポリエステルシートと非織ポリウレタンシート、または非織構造と織物構造の組み合わせを使用することもできる。異なる密度の3Dシート、すなわち外側の方が粗い構造で、内側の方が密な構造を使用することもでき、バイオリアクターを装着している間の細胞の捕捉を改善することができる。
シートまたはマットを好適な形態で使用する場合、前記シートまたはマットは、好ましくは10〜1000μm、さらに好ましくは250〜750μm、通常約400〜500μmの厚さを有し、前記参照文献に記載されているように、直径または幅が0.5〜20μmのオーダー、好ましくは10〜15μmの、および／または0.05〜5dpfの好適な織度（dernier）の丸い糸、平坦で丸くない糸もしくは中空糸、またはこのような糸の組み合わせを具備する。
好ましくは、前記糸は、非常に無秩序に、ランダム様に、相互にもつれた状態でシートまたはマット中に配置されており、該糸の軸は、粗い多次元の配列（open multi-dimensional array）を形成している。
肝細胞の培養および／または本発明のBALシステムにおける使用のためには、該シートの厚さは、好ましくは約0.2-0.8mm程度、好ましくは約0.5mmである。
きわめて重要というわけではないが、該シートは一般的には10〜100cm、通常約20cmの幅を有する。
固相支持体に使用されている、酸素供給される中空糸は、少なくとも気体状酸素および／または気体状二酸化炭素を通過させねばならず、多孔性糸および非多孔性（「閉じた」）糸の両者を用いることができるが、多孔性糸の方が好ましい。別の観点として、糸の分子量遮断には特に制限はない。
該糸は、任意の適切な素材、好ましくはシリコン、ポリエチレン、ポリプロピレン、疎水性ポリスルフォン、または中空糸を作成し得る、任意の適切な他の疎水性素材、またはそれらの任意の組み合わせのような疎水性の素材から作成し得る。
このような糸およびそれらの調製は本分野で公知である。市販されている好適な素材には、Dow CorningのSilastic（シリコン糸）、Akzo-NobelのOxyphanおよびPlasmaphan（疎水性ポリプロピレン糸）、Fresenius A.G., Bad Homburg, ドイツの疎水性ポリスルフォン糸、またはシリコンゴムを内側および／または外側にコートしたポリプロピレン糸（Applied Membrane Technology, Minnetonka, Minnesota and Neomecs, St. Louis Park, Minnesota）がある。
該中空糸は、疎水性特性を改善するために、マトリックス素材中に取り込まれる前に、気体状プラズマで処置され得る。該糸の外径は、好ましくは10mm未満、さらに好ましくは0.05-5mm、さらに好ましくは0.1-1.0mmである。
該糸は、好ましくは、マトリックス素材全体に、均一に配置される。さらに好ましくは、それらは該マトリックス素材の一方の端から他方の端まで、平行な状態で配列され、それによって該固相支持体の構築が容易になり、互いに絡み合った中空糸の複雑なネットワークを構築する必要がない。
固相支持体中の中空糸の数および各糸間の距離は、マトリックス素材に付着している全ての細胞に十分な酸素が供給され、二酸化炭素が十分に除去されるようにする。
これを達成するためには、ある糸の中心から次の糸の中心を測定した、各糸間の距離が、通常10mm未満、さらに好ましくは0.1-5mm、より好ましくは1-3mm、最も好ましくは約2mmであり、糸の総数は糸シートの全長に関連する。好ましくは、該固相支持体は、少なくとも３つ、さらに好ましくは少なくとも１０の中空糸を具備する。
通常、該リアクターは50〜50,000、好ましくは500〜5000の中空糸を含有する。
好ましくは、該中空糸は前記3Dマトリックス素材に、付着および／または物理的に結合しているが、本発明はそれに限定されることはなく、別の実施態様を以下に記載する。
該糸は、糸の壁を通した酸素／二酸化炭素の輸送を妨げない、任意の適切な方法によって、該マトリックス素材に付着させることができる。このように該糸は、該マトリックス素材中に織り込み、該マトリックス素材上に接着させ、該マトリックス素材上に縫いつけ、超音波によって、該マトリックスの上に結合させることができる。
本発明の実施に適する、非織ポリエステルシートに付着した中空糸を具備してなるマトリックス素材の例には、AKZO-Nobelから得られる市販の中空糸マット（Wuppertal, Germany）およびMicrogon（Laguna Hils, CA, USA）が含まれる。
該マトリックス素材の結合を改良するために、および／または該マトリックス素材に損傷を与えないようにするために、該マトリックス素材には、まず適切なポリアミドもしくはシリコンのシート、または英国特許出願第2,178,447号に記載されているような粗いポリプロピレンのメッシュを重ねて、その後上述した方法によって、該糸を前記シートまたはメッシュに結合させる。
該マトリックス素材がシートまたはマットの形態の場合には、該中空糸は該マトリックス素材の両面に付着させることができるが、該マトリックスマット（matrix mat）の片面だけに付着させることが好ましい。
好適な実施態様によれば、その一般的なデザインは図１に示されており、本発明のマトリックス素材は、英国特許出願第2,178,447号による3Dポリエステルマトリックス１、該マトリックス素材中に織り込まれた、またはその片面に結合され、間隔が約2mmの距離で平行に置かれた、約0.7mmの疎水性の多孔性中空糸2からなる。
このような固相支持体素材は、製造を容易にし、有利には図２に示された、各シートの両面が中空糸２で囲まれた複数のシート１を具備する（逆でもよい）、「サンオウィッチ」配置で用いることができ、3は内腔領域（糸の内腔）、4は腔外領域である。
該サンドウィッチ配置では、気体の供給および除去が改善されるのみならず、該糸は有利には、各糸シート間のスペーサーとしても作用し、腔外領域4を通じて、該固相支持体の全部分に培養液を一様に流し、分配するための調整壁手段および／またはチャネリング手段として働く。
さらに、糸２はマトリックスシート３に対する物理的支持を与えるが、固相支持体に、液体の流れのような高剪断応力が加えられる場合には、これは特に重要である。
サンドウィッチ配置を用いる場合には、各層から各層への糸が、互いに僅かな角度をなし、または層ごとに直角であってもよい。
図10に示されている好適な別の実施態様によれば、該固相支持体は、3Dマトリックスシート26、および糸を含有する別のシート27を具備し、例えばシート中に糸を織り込むことによって、または各糸を互いに結合することによって得られる。このようなシートおよびその調製は、中空糸の調製の分野において周知である。
このような別の糸シートにおいては、該糸はある方向に対して平行であり得、または該シートは、2、3組またはそれ以上の平行な糸であって、該平行糸の組が、互いに直角、またはある角度をなしている糸を具備し得る。例えば、このようなシートは、所望の数の中空糸の組、およびこれらの組の間に所望の角度が得られるように、中空糸を織り込むことによって得られる。
異なる中空糸の組を具備するこのようなシートでは、前記糸の組の最終用途に合わせて、上述したような種々の適切な素材から該糸を作成することもできる。相互に織り込まれて、所望の中空糸シートが形成され得る限り、それらは異なる直径を有することができる。
糸を含有するシートは、マトリックス素材のシート上に積み重ねることができる。このような中空糸シートに、例えば薄片の形態でマトリックス素材を付着させることもできる。これらの実施態様は全て、図10に示されたようなサンドウィッチ配置で使用するのも好ましい。
他の全ての観点において、該実施態様は、上述したようものと同一の好適な側面及び利点を具備する。
最後に、本発明の固相支持体は、一般的には従来の中空糸リアクターのように、使用前に前処理ステップを必要としないが、細胞の付着性をさらに改善するために、それ自体は既知の様式で、Matrigel、ポリ-N-パラ-ビニルベンジル-ラクトンアミドまたはコラーゲンベースの素材のような細胞外マトリックス素材で固相支持体全体、または中空糸もしくは中空糸を含むマットのみを処理することも本発明の範囲にある。また、該固相支持体には、例えばマトリックスシート上に薄く積み重ねたり、または巻き上げ（roll up）、または本発明の固相支持体を積み重ねることによって、ポリアミド、ポリフルオロエチレン、またはシリコンのような非透過性素材のシートを与えることができ、それによって、細胞を均一に分配し続けるための小コンパートメントが、固相支持体内部に、ある程度形成される。
さらに有利な実施態様は、当業者には明らかであり、本発明の範囲に含まれる。
バイオリアクターのデザインおよび構築
一般的に、本発明のバイオリアクターは、空間を取り囲む壁からなり、本発明の固相支持体が与えられる適切な容器を具備する。
好ましくは、該固相支持体はマットまたはシートの形態であり、より好ましくは図２に示された「サンドウィッチ」配置である。前記リアクターデザインを得る好適な方法は２つある。
図３に示された実施態様によれば、固相支持体5は、渦巻き上に巻かれたマトリックス素材のマットまたはシートの形態でリアクター6の中に存在し、7はリアクター容器の壁である。本実施態様によれば、リアクターは通常円筒である。
図4に示されている実施態様によれば、固相支持体8は、リアクター9の中に積み重なった層として存在し、10はリアクター容器の壁である。本実施態様によれば、該リアクターは通常、箱のような形状である。また、各固相支持体層は、ある角度、例えば直角に積み重ねることができ、上述したような直角の中空糸配置が得られる。
本発明の固相支持体／バイオリアクターは、図10に示されているように、マトリックス素材シートと中空糸を含有するシートが交互に存在するシート、または中空糸のシートであって、該シートの間にマトリックス素材が存在する、もしくは該シートにマトリックス素材が結合しているシートを具備することもでき、または上述したように、マトリックス素材シートと中空糸シートの薄層を具備することもできる。
このようなリアクターデザイン全てにおいて、支持体／リアクターの中に、２，3またはそれ以上の、独立した（好ましくは）平行な中空糸の組であって、各糸の組が、リアクター中に存在する１以上の他の糸に対してある角度または直角であるような糸を取り込むことができる。
これらの異なる糸の組は、上述した任意の方法、例えば、互いにある角度で、中空糸をマトリックス素材の各層に積み重ね、物理的に付着させることによって、上述したように、互いにある角度をなす、２，３組またはそれ以上の糸の各組を具備する、独立した中空糸のシートを用いることによって、独立したマトリックス素材および中空糸のシートを用いて、互いにある角度で、該中空糸シートを配置することによって、または、物理的に付着した中空糸を有するマトリックス素材のシートに、別の中空糸のシートをある角度で積み重ねて使用するような、これらの任意の組み合わせによって得ることができる。
中空糸の組が幾つかある場合には、該糸の組の最終用途に合わせて、これらの組は、同じまたは異なる適切な中空糸素材から作成することができ、異なる直径等を有することができる。
さらなる適切なリアクターデザインは当業者には周知であることは明らかであり、本発明の範囲に含まれる。該デザインは、何れの場合においても、使用中、バイオリアクター中の全細胞に、酸素を十分に供給することができるように、酸素供給用の糸に適当に近接しているようなものである。
また、多くの使用法では、特にBALとして使用、またはBALの中で使用する場合、リアクターのデザインは、リアクター容器を通して灌流される培養液の殆ど、または好ましくは全てが、固相支持体上に固定化された細胞と接触するようになっている。
しかし、２組またはそれ以上の中空糸を具備する、上述の全てのリアクターデザインと、中空糸の３次元ネットワークを具備する、ガーラッヒらによって記載されたリアクターデザインとは区別されねばならない。ガーラッヒのリアクターでは、独立した、細胞付着用の3Dマトリックス素材が全くなく、細胞は中空糸自体に付着しなければならない。これを可能にするためには、ガーラッヒのリアクターで使用されている中空糸は、必要な３次元ネットワークが形成されるように、相互に織り込まなければならない。また、該ネットワーク中では、これらの糸に肝臓細胞を３次元的に付着することが可能となるように、各相互に織り込まれた中空糸間の距離は非常に小さい。これによって、ガーラッヒらによる3D中空糸ネットワークを生産するのは極めて困難且つ高価となることは明らかであろう。
本発明によれば、細胞の付着は、本質的には3Dマトリックス素材によって与えられ、中空糸によっては与えられず、そのため３次元中空糸ネットワークは、細胞を３次元的に付着させるためには必要ではない（例えば、上述した全てのリアクターデザインにおいて本質的に存在するのは、固相支持体と同一平面（内部に織り込まれた糸の組の場合）、または平行な平面（積み重ねた糸の組の場合）に存在する糸の組を有する２次元の中空糸ネットワークである）。
このため、本発明の固相支持体中の各中空糸間の距離は、あまり重要ではなく、マトリックス中に存在する全ての細胞に十分酸素を供給できる限り、ガーラッヒのリアクターに比べて大きくなり得ることは明らかであろう。
また、異なる組の糸を有する本発明の固相支持体は、２またはそれ以上の組の平行な糸を具備する２次元の糸のシートを用いて、単に積み重ねることによって容易に製造される。
通常、本発明のリアクターは、操作可能なように、中空糸に接続された気体の取込口／排出口を具備し、そのため中空糸の内腔から気体を補給し、排出できるようになっている。
また、該リアクターは通常、少なくとも１つの液体の取込口および排出口も具備し、操作可能なように、糸外領域に連結されており、そこを通じて、前記糸外領域またはその中に存在する細胞に溶媒を補給し、または前記糸外領域またはその中に存在する細胞から溶媒を除去することができる。該リアクターは、必要に応じて、ガス、液体および／または固体用取込口および排出口をさらに具備することができる。
さらに、該リアクターは、異なる取込口または排出口に、操作可能なように接続された気体および／または液体ポンプのようなもの；リアクター容器中の温度を測定および／または制御するための手段；リアクター内部への通路としてのハッチのようなもの；検査手段；さらに以下で記載されているような生存性を測定するためのプローブのような、プローブおよびプローブを挿入する手段など、生物的リアクターの全ての既知の要素を具備することができる。
さらに、該リアクターには、操作可能なようにポンプ、温度制御手段などに接続されたコンピューター手段のような、種々のリアクター機能を自動制御するための手段を与えてもよい。
該リアクターには、電気モーターのような、例えば１つの軸に沿って、該リアクターを回転させるためのリアクター攪拌手段、または該リアクター内部を攪拌させるための手段を与えてもよいが、後者は通常好ましくない。
該リアクター容器の壁は、ガラス、プレキシグラスのようなプラスチック、または金属、およびポリカーボネート、ポリスルフォンのような任意の適切な不活性素材で作成することができ、好適な蒸気殺菌のためには後者の素材が適している。該リアクター容器の内部には、培養する細胞に適合する特殊なコーティングを与えることができる。
該リアクターのサイズには制限はなく、通常必要な容量に依存する。従って、該リアクターの容積は、1mL〜1000Lの間で変えることができる。
上記のリアクターデザインのために、特に中空糸が付着しているシートまたはマットの形態で用いる場合には、本発明の固相支持体は、特に、本明細書で上記した毛細管ネットワークを含有するガーラッヒらのバイオリアクターと比較すると、製造が容易である。有利には、既存のリアクターを本発明の方法に用いるのに適合させるために、該固相支持体を用いることもできる。
例えば、図３のリアクターデザインは、本発明の固相支持体のシートを単に巻き上げ、該巻き上げられた固相支持体をリアクター容器に移すことによって得ることができる。該固相支持体のサイズは、一旦巻き上げられれば、それはリアクター容器のサイズに適合し、好ましくは該サイズにきわめて対応するサイズを有するようなものであるのは明らかであろう。もし必要なら、巻き上げる前または後の何れかに、該固相支持体は所望のサイズに切断することができる。同様に、図３のリアクターデザインは、適切なサイズの固相支持体を１以上積み重ねることによって、または１以上のシートを該リアクター容器内に折り畳むことによって得ることができる。
上述したように、独立したマトリックス素材のシートと、糸を含有するシートを巻き上げること、または独立した、マトリックス素材の層と、糸を含有するシートを交互に積み重ねることも可能である。
これらの配置では全て、中空糸は、糸外領域中の液体の流れを改善するのみならず、巻き上げられたまたは積み重ねられた固相支持体に物理的支持を与えるであろう。
一般的に、リアクター容器内に存在する固相支持体の量のみならず、その寸法が、通常リアクター容器の容量および寸法に依存および／または適合しているのは明らかであろう。
当業者には明らかなように、該リアクター容器は、固相支持体を巻き上げた、または積み重ねた状態を支持および／または維持するための手段を含有することもできる。
該固相支持体を該リアクター容器内に配置した後、中空糸および糸外領域はともに、それぞれ通常リアクター容器の一部を構成する、様々な気体取込口および排出口並びに液体取込口および排出口に、任意には、リアクターを通した気体の流れおよび／または液体の流れを均一に分配させることができる分配手段を通じて、または分配手段によって操作可能なように接続することができる。
糸が一方向性である、本発明の好適な実施態様によれば、該糸は、マトリックス素材の一方の面にある気体取込供給口にまとめて接続され、反対の面に存在する気体排出口にまとめて接続されている。
しかし、逆向きの流れ、すなわち気体の流れが、糸（層）から糸（層）毎に反対方向である、または上述したような直角配置を有する直角であるように作動するシステムも可能である。以上から、本発明によるリアクターは、４つに区切られた毛細管膜システムの、織り込まれたネットワークを具備し、それ故複数の取込口および排出口システムを必要とする、ガーラッヒらのリアクターに比べて、操作もずっと容易なことは明らかであろう。また、ガーラッヒらのリアクターに比べて、3Dマトリックス素材を具備する本発明の固相支持体は、細胞の付着性および容量単位当たりの細胞収容量がともに改善されている。
本発明によれば、細胞外の糸領域は、液体取込口／排出口システムに直接に接続することができ、これにより、前記糸外領域に溶媒を灌流（perfund）することが可能となり、糸外領域と溶媒中に存在する細胞の間に、直接的な液体の接触を与える。
本発明は、最も単純な実施態様においては、気体成分を供給および／または除去するための中空糸を１組具備するのみであり、特定の気体および／または溶媒を供給および／または除去するためには、独立した中空糸システムをさらに与えることができることを理解すべきである。これらのさらなるシステムは、気体、液体および／または上述したような、主要な気体または液体の補給とは別の溶解成分を独立に制御して、導入するためにも使用され得る。十分な酸素供給を維持できる限り、この目的で、別々になっている糸、組になっている糸、または固相支持体の糸層を用いることも可能である。
このような使用法のためには、本発明の固相支持体／バイオリアクターは通常、上述したような、互いに平行な、またはある角度をなす２以上の異なる中空糸の組を具備し、各糸の組は特定の目的に用いられ、少なくとも１組は、本発明によるリアクターに十分な酸素を供給するために用いられる。
本発明によれば、流入および流出用に、異なる中空糸の組を用いることも可能である。この実施態様では、通常該糸は、それぞれ一端が取込口で塞がれ、別の一端が排出口に接続されており、前記取込口および／または前記排出口には、任意にポンプ手段が与えられている。
気体または液体媒体は、取込口を通して、取込糸の糸内腔へ与えられ、糸の壁を通過して糸外領域内に入り、続いて排出糸によって汲み上げられて除去される。
流量の達成および／または該糸が目詰まりすることに関して問題点はあるかもしれないが、該実施態様の主な利点は、供給された全ての培養液は、糸外領域中の細胞と必ず接触するという点である。
さらなる有利な実施態様は当業者には自明であり、本発明の範囲内に含まれる。
＜バイオリアクター内での細胞の培養＞
本発明のバイオリアクターは、全ての種類の細胞を培養および／または維持するために使用することができ、本発明は更に、このような使用および細胞の培養および／または維持する方法に関する。
好ましくは、上記細胞は植物、ヒトまたは動物由来の付着性細胞（例えば組織細胞）であるが、真菌細胞並びに全ての種類の単細胞微生物（例えばバクテリア）もまた有利に培養することができる。
本発明はまた、細胞株、融合細胞、ハイブリドーマ、形質転換体等のような修飾された細胞の培養にも使用することができる。適切な細胞の更なる例は、当業者に明らかであろう。
また、本発明の固相支持体およびリアクターは、二以上の異なったタイプの細胞を同時に培養するためにも使用することができる。
一般に、本発明は、細胞の付着に利用可能な固相支持体、ガス状成分の供給および／または除去、或いはこれらの両方に対して厳格な条件を要求するような細胞を培養するために特に適している。本発明の固相支持体の有利な性質は、更に、上記で述べたように非常に高い細胞密度で、また優れた「三次元」の細胞付着および細胞増殖で、細胞を培養および／または維持することを可能にする。
該リアクターの全体の細胞容量は、通常はリアクターの大きさ、その中に存在する固相支持体の量、および使用する細胞のタイプのような因子に依存する。
一般には、細胞の付着に利用できる非常に大きな表面積、改善された酸素付加および達成可能な高い細胞密度に起因して、当該リアクターは、通常は高い細胞容量を示すであろう。また、改善された酸素付加および均一な液体流によって、当該リアクターは、例えば容量および／またはリアクターの内部に存在する固相支持体の量を増大させることにより、大規模なバイオリアクターに通常伴われるスケールの問題、例えば不十分な酸素付加および／または不均一な液体流の問題を伴うことなく、それ自体公知の方法で、必要とされる容量にまでスケールアップすることができる。
本発明のリアクターは、初代細胞または不死化細胞としての、ヒト肝臓細胞または動物肝臓細胞（例えばイヌ若しくはブタの肝臓細胞）の培養に特に適している。
該リアクターは更に、肝臓細胞由来の細胞株、肝臓細胞形質転換体；ヘパトーマ細胞および肝芽細胞、並びにこれらから誘導された細胞株（例えばSussman et al.によって記載された形質転換Ｃ３Ａ−ヘパトーマ由来の細胞株）の培養および維持のために使用することができる。なお、Sussman et al.による既述は本願明細書に組み込まれる。
本願で使用する肝臓細胞および／または均等な用語である肝細胞は、従って、これら異なったタイプの細胞および細胞株の全てを包含するものである。
前記細胞を得る方法、例えば単離、培養、形質転換等は周知であり、例えば、本願に組み込まれる上記の従来技術に記載されている。
ＢＡＬでの使用については、好ましくは80％以上の生存率をもった肝臓細胞が用いられるが、以下に述べる理由で、本発明のＧＡＬ系はまた、70％以下、または40〜50％の低い生存率を有する肝細胞を用いることも可能である。
このことは、本発明が細胞生存率に対して課する要件は、80％を超える生存率を必要とする従来技術のＢＡＬシステムよりも、厳格性が低いことを意味している。以下で述べるように、特に初代肝臓細胞について、このような高い細胞生存率の達成に通常伴われる問題を考慮すると、これは重要な実際的な利点である。
更に、本発明は、冷凍保存により保存されている肝臓細胞（通常は60〜80％未満の生存率をもった肝臓細胞を与える）を使用することを可能とし、新しいＢＡＬの夫々について、十分な生存率の新鮮な肝臓細胞を単離することがもはや必要とはされない。再度言っておくが、これは従来技術のＢＡＬシステムでは不可能である。
所望のときは、肝臓細胞の培養および維持を、成長因子、抗生物質およびホルモンのような添加物、並びに添加された付着因子および細胞外マトリックス成分の存在下で行うことができる。これらは、この特定の目的のために設けられた別の中空糸セットのようなリアクターに設けた別の手段によって、リアクターに導入される前の潅流液中に添加することができる。
また、本発明は、肝臓細胞と、例えば肝臓非実質細胞との同時培養のために用いることができる。必要なときは、これはリアクター内に存在する別の中空糸の中で行うことができる。
これらの技術は、例えば上記参照文献に記載されているように、当該分野において広く知られているが、本発明の固相支持体の有利な特性に起因して、それらの使用は常に必要なものではなく、確実に必要とされるものではない。
このバイオリアクターはまた、固相支持体に対して通常は低い付着性および／または粘着性を示すハイブリドーマ細胞を培養するために、即ち、モノクローナル抗体を製造するためにも使用することができる。
細胞を培養するために、一般には、細胞は適切な時間だけ固相支持体に付着および／または粘着させた後に、バイオ人工リアクターシステムの中に導入される。この付着相の間に、中空糸を通る酸素含有ガスまたはガス混合物、例えば純粋な酸素、空気、または好ましくは50〜90％、より好ましくは90〜99％の酸素を含有するガス混合物が、窒素または二酸化炭素のような他の不活性および／または生理学的に許容可能なガスと混合されて、酸素付加用の中空糸を通され、廃ガスはガス出口を通して除去される。
これらのガスの細胞への輸送は本質的には拡散によって行われ、その際、中空糸の利用可能な表面積が高いこと、並びに細胞とこれに最も近接した酸素付加繊維との間の距離が短いことによって十分な交換が保証される。この拡散／酸素付加によって、液体媒質による酸素付加ならびに独立した酸素付加器の使用に付随した制限は回避される。何故なら、酸素付加器はリアクター自身の中に直接組み込まれるからである。
また、一般にはルーメン外の液体流によって付着細胞に栄養素を供給することができ、老廃物を除去することができる。このように、全ての公知かつ適切な栄養素、栄養素含有溶液および培地を用いることができ、或いはこの溶液を、培養すべき細胞の必要性に特に適用させることができる。
前記栄養培地は、好ましくはマトリックス材料の一方の側から供給され、他の側から（即ち単一方向の流れにより）、形成された副生成物および老廃物と共に除去される。
また、幾つかの特殊な栄養素を制御して供給するための別々の中空糸を与えることも可能であるが、これには、一般により複雑な構成および操作が含まれるであろうから、その理由で好ましくないものである。
当業者に明らかなように、該リアクターを恒温糟の中に保つことにより、またはルーメン外の液流および／または中空糸内のガス流の温度を制御することによって、培養の間、細胞は望ましい生物学的または生理学的に許容可能な温度に維持することができる。
細胞の培養においては、少量の細胞をリアクターに充填した後、細胞を分裂させて、該リアクター内に一杯に着床させる。この実施例に従えば、本発明の固相支持体は、従来技術の支持体よりも軽い接種しか必要とせず、リアクターに有利な「三次元」増殖によって完全に着床させるために十分な合計細胞容量の10％、若しくは５％以下の量で接種すればよい。
また、マトリックス材料を付着性細胞で完全に飽和させるように、より多くの細胞をリアクターの中に供給することも可能であり、さらには過剰量の細胞を用いた後に、余分な細胞を除去することも可能である。
少量の接種細胞または大過剰の細胞埋め込み数の何れを接種するかにかかわらず、本発明の３Ｄマトリックス支持体は増大した細胞「捕獲」を与えるから、最適付着未満の細胞を使用することができ、および／または付着相のために必要な時間を顕著に短縮することができる。後者は、リアクターがＢＡＬとして使用されるときに特に有利であるが、これはＢＡＬが使用できるようになるまでに必要な時間が臨床上は極めて重要であるからである。
また、例えば細胞懸濁液の注射によってバイオリアクターの中に導入された後に、スペーサ手段、チャンネリング手段、またはバッフル手段として作用する中空糸によって、固相支持体内にルーメン外のチャンネルが形成されるため、細胞は支持体の全体を覆って迅速且つより均一に分布して、付着相のために必要とされる時間を更に減少し、より均一な細胞分布を生じる。
一般に、使用する具体的な細胞に応じて、付着相は約30分から５時間を要するであろう。
本発明の特殊な側面に従えば、リアクターに導入される細胞サンプルが生細胞および死細胞の両方を含んでいるときには、肝臓細胞の培養に関して以下で説明するように、リアクターのユニークな設計によって、生細胞を死細胞から分離することが可能になる。
本発明のバイオリアクターの更なる利点は、付着相の間に、バイオリアクターの底に大きなペレットとして細胞が沈降するのを排除できることである。これについても、以下で更に説明する。
付着相の後、および任意に細胞増殖相および／または定常状態の付着の後に、接種されたリアクターは、一般にはその意図する用途に使用できる状態にある。このような使用に際し、通常は外部繊維スペースを通して処理すべき液体培地を細胞に供給しながら、生物学的および／または生理学的に許容可能な条件を維持することによって、細胞は十分な量、生存率および活性に維持されるであろう。殆どの用途および殆どの細胞について、このバイオリアクターは従来技術の方法よりも長期間に亘って、生存率および活性を高レベルに維持することを可能にする。
以下、肝臓細胞の培養およびバイオ人工肝臓としての使用に関して本発明を更に詳細に説明するが、本発明のバイオリアクターは、他のバイオ人工システムのためにも有利に使用することができる。
このように、本発明の固相支持体および／またはバイオリアクター例えば、バイオ人工膵臓、バイオ人工腎臓および／またはバイオ人工副甲状腺、人工骨髄、上記のような中空糸リアクターに基づく現在のシステムに用いることができる。これらのシステムにおける本発明の使用は、改良された細胞の付着性および容量、リガンド媒質との直接接触および／または改善された酸素付加、並びに長い有効作用時間のような、本発明の利点をもたらす。
本発明のバイオリアクターはまた、所望の生物学的反応を行うことができる細胞を用いることにより、液体媒質もしくはガス状媒質中における物質の製造もしくは生体内変換、および／またはこれら媒質からの物質の除去のためにも用いることができる。これらの応用および他の応用に関して、本発明は有利なことに、中空糸壁を通した繊維ルーメンとルーメン外スペースとの間のガス交換に利用可能な高い表面積、並びに細胞外スペース内の細胞と液体培地との間の直接的な接触を与えるが、後者は、ポリペプチドのような高分子量の生物学的物質の分解、生体内変換または産生において特に重要である。次いで、この産生された物質は、バイオリアクターから引き出された液体培地から、それ自体公知の方法で単離することができる。
本発明のバイオリアクターの他の有利な用途は、当業者に明らかであろう。
＜バイオ人工肝臓としての固相支持体およびバイオリアクターの使用＞
上記で述べたように、本発明の固相支持体およびバイオリアクターの有利な特性は、これらを、バイオ人工肝臓システムとしての使用に特に適したものとする。
このようなシステムにおいて、上記で述べたように、本発明の固相支持体および／またはバイオリアクターを用いて適切な肝臓細胞が培養および／または維持される。
従って、一般に、本発明のバイオ人工システムは本発明のバイオリアクターを具備しており、また、概して上記で定義した肝臓細胞をも具備しているであろう。この細胞は、通常はルーメン外のスペースに存在し、特に固相支持体のマトリックス材料に付着しているであろう。
使用に際して、バイオリアクターは液体回路によって患者の血液循環系に動作的に連結され、患者から直接的または間接的に誘導された液体媒質がルーメン外の肝臓細胞に供給され、その後、前記細胞は、インビボの肝臓によって正常に行われる殆どまたは全ての機能を行うことになる。肝臓細胞による処理の後、液体媒質は患者に戻される。
従って、本発明のＢＡＬシステムは更に、液体媒質を循環させるための液体回路、並びに該回路を通して流れる液流を制御するための公知のポンプ手段を具備している。このように、本発明のバイオリアクターは、それ自体公知の如何なる回路にも組み込むことができる。例えば、上記で述べた従来技術に開示されているもの（これらは本願明細書に組み込まれる）であり、ここでは、本発明のバイオリアクターが、例えば中空糸ＢＡＬシステムで置き換えられる。
この回路にはまた、液体媒質を処理するための更なる手段、例えば、親水性毒素を吸収するための活性炭カラムおよび／または疎水性物質（例えばビリルビン）を吸着するための樹脂カラムを含めることができる。
この液体回路はまた、液流から細胞を除去するための細胞フィルターを具備していてもよい。死細胞を患者の循環系に近づけないでおくように使用する場合、この細胞フィルターは、通常はバイオリアクターの後に配置されるであろう。
この液体回路はまた、栄養素および他の所望の物質を液体媒質に添加するための手段を具備していてもよいが、この点に関しては、患者から引き出された液体媒質は、それ自身がリアクター中で肝臓細胞を生かしておくのに十分であるかもしれない。また、上記で述べたように、栄養素を添加するための別の繊維システムをリアクターに設けてもよい。
使用に際して、本発明のＢＡＬシステムは、それ自体公知の方法を用いて、患者から引き出された全血（動脈血または静脈血の何れか）で潅流することができる。この場合、リアクター中の肝臓細胞は、患者の血液と免疫学的に適合する必要があるので、通常は、ヒト肝臓細胞またはこれから誘導された細胞および細胞株が用いられるであろう。あまり好ましくない異種細胞を使用するときは、免疫抑制剤の使用が必要とされるであろう。
しかし、本発明のＢＡＬは、好ましくは患者由来の血漿で潅流される。この好ましい血漿潅流モードにおいて、当該回路は通常、患者から抜き取られた全血から血漿を分離するための血漿分離器または血漿交換ユニットを具備している。血漿交換に基づいて、適切な血漿交換ユニットと共にＢＡＬシステムを使用することは、当該技術分野において周知であり、例えば上記の従来技術に記載されている（これらは本願明細書に組み込まれる）。
当該回路はまた、その血漿交換モードにおいて、リアクターを通る血漿循環から患者の血液循環を免疫学的に分離しておくための免疫学的障壁を具備することにより、免疫抑制剤を必要とすることなく、ブタ肝臓細胞のような異種細胞を使用することを可能にする。通常は、血漿分離器／血漿交換ユニットそれ自身は、ある程度、前記免疫学的な分離を与えるであろう。しかしながら、この回路はまた、リアクターの前または後に配置された、上記のような適切な分子量カットオフを有する膜、カラムまたは中空糸モジュールのような別の分離手段、および／または当業者に公知の、抗原および／または抗体等の吸着のための特異的なカラムを含むことができる。
上記のように、別の酸素付加ユニットは、血漿潅流を用いるときでも、液体媒質回路の中に組み込まれる必要はない。
好ましい血漿交換モードにおける、本発明のＢＡＬの多くの可能な構成が図５〜図９に示されている。
図５は、患者からの動脈血が、任意にポンプ１２により、ライン１１を通して血漿交換ユニット１３供給され、そこでは全血から血漿が分離され、該血漿はライン１４を通して患者に戻される。
次いで、血漿は直接的に、任意にはポンプ１２により、ライン１５を通して肝臓細胞を含むバイオリアクター１７に供給され、そこからライン１８によって直接ライン１４中の静脈血へと戻される。
酸素含有ガスがフィード１９によって中空糸へと供給され、二酸化炭素に富んだガスがライン２０を通して運び去られる。
図６は、ポンプ２２を設けた追加のライン２１によって、リアクターに亘って血漿を再循環させるために設計された、「高速流ループ（high flow loop）」構造を示している。
図７において、この回路には、リアクターから流出した死細胞を患者の循環系に近づけないための細胞フィルター２３が設けられている。
図８においては、リアクターの後の高速流ループに配置された、免疫学的分離のための中空糸膜カートリッジが設けられている。
９ａ図および９ｂ図の回路には、上記ステップ２５で述べたように、高速流ループの内側（図９ａ）または外側（図９ｂ）の何れかに組み込まれた回路に、免疫学的予備処理カラムおよび／または親水性および／または疎水性の毒素の除去用カラムが設けられている。
上記で述べた装置および図面に示した装置の異なった装置を、一つの回路の中に組み合わせることができることは、当業者には明らかであろう。
ＢＡＬ回路の異なった部品は、一つのハウジングの中に一体化されたシステムとして与えることができ、或いは別々に連結された部品からなっていてもよい。
形状および容量、リアクター内に存在する細胞の料および活性、所望する治療的応用、並びに他の因子に依存するけれども、本発明のＢＡＬは、１分当たり１〜300ｍｌの患者から取り出された液体媒質を処理するために使用することができる。
これを達成するために、液体媒質は、図５に示すように、対応する速度でリアクター１７に直接供給することができる。
しかし、本発明のバイオリアクターは「高速流ループ」に組み込まれるのが望ましいが、これ自体は上記の従来技術から公知であり、また図６に示した通りである。
図６に示すように、リアクター１７、ライン２１およびポンプ２２、並びにライン１５および１８によって形成されるこのようなループにおいて、リアクター１７上の液体媒質の流れは、ライン１１および１４を通る患者からの液体の流れよりも高速に維持され、これによってリアクター１７に亘る液体媒質の再循環が与えられる。これは、通常ポンプ１６、２２および１８ａの適切な制御により、それを適切な比率（通常は１：２：１〜１：100：１）に夫々維持することによって実施されるであろう。
また、本発明のＢＡＬは、直列および／または並列に連結された２以上のリアクター（例えば、同じタイプおよび／または異なったタイプの肝臓細胞または他の細胞を含む）を具備することができる。
本発明のバイオ人工肝臓システムは、肝機能が損なわれている場合および／または人工肝臓による支援が望まれおよび／または必要とされる場合に、患者の肝機能を支援および／または代替えするために使用することができる。ＢＡＬシステムは、例えば、ウイルス感染または急性肝臓中毒（例えばアセトアミノフェン、ＣＣｌ₄、アルコールまたは薬物による中毒）による激症肝不全（ＦＨＦ）、並びに外傷による肝虚血および肝臓損傷の患者に使用することができる。この人工肝臓はまた、肝臓移植前の患者の症状を改善するために、肝臓移植が行われる際の肝臓がない期間および／または移植肝臓の回復期間における肝臓移植の前の期間を乗り越えるために、移植肝臓の急性拒絶反応後の拒絶期間を乗り越えるために使用することができ、或いは患者自身の肝臓が再生するための時間を可能にする。
更に、本発明のＢＡＬシステムは、患者の生活の質を向上させ、および／または悪化期間を乗り越えるための、慢性肝臓疾患の治療に用いることができる。
本発明のＢＡＬシステムはまた、患者が比較的短い危機を乗り越えるために使用して、患者自身の肝臓を再生させることにより、移植による外傷や費用をなしですませることができる。
このように、本発明のＢＡＬは、間欠的に使用することも考えられるが、好ましくは連続的に使用されるであろう。
バイオリアクターを得るために、それ自体公知および／または上記で説明した方法で、肝細胞をバイオリアクター中に導入することができる。
一実施例に従えば、総量の細胞のみがリアクター中に接種され、その後、バイオリアクターがその細動容量および／または定常状態に達するまで、前記細胞の成長および分裂が行われた後、該リアクターはＢＡＬとして使用することができる。
従って、この実施例では、支持体およびバイオリアクターは肝臓細胞の培養のために、並びにそれ自体でバイオ人工肝臓システムとして用いられる。本発明のこの側面に従えば、本発明の３Ｄ支持体は、特に細胞の成長および分裂が制限または妨げられる従来技術の中空糸システムと比較して、細胞の成長および分裂に好適であることは明らかであろう。
この実施例は、通常は、初代肝臓細胞のような、単離後に分裂および成長できない肝臓細胞には適さない。しかし、特に従来技術に比較すると、本発明の固相支持体は、初代肝臓細胞でも幾らかの成長および分裂を起こし易いことが期待される。従って、本発明の固相支持体および／またはバイオリアクターを用い、任意に成長因子等を用いた初代肝臓細胞の培養は、明らかに本発明の範囲内に含まれる。
他の実施例に従えば、細胞の量はバイオリアクターの容量に略対応し、および／またはこれを超えるものである。この場合、細胞はリアクターに添加され、固相支持体に付着され、その後、例えば洗浄により過剰の非付着細胞が除去される。その後、任意には定常状態が達成された後に、バイオリアクターはＢＡＬとして、またはＢＡＬ中で使用することができる。
この実施例は一般に、従来技術のシステムに比較して短い時間（通常は0.5〜6時間、殆どの場合は約２時間）で、ＢＡＬシステムが使用可能な状態になるという利点を有している。また、この実施例は、特に初代肝臓細胞と共に使用するのに適している。
ＢＡＬは、一般には1×10⁵〜1×10⁶細胞／ml、通常は略1-50×10⁶細胞／ml（単位容積）、合計で10８〜10１１細胞、略１〜1000ｇ細胞、好ましくは100〜500ｇの細胞を接種されるであろう。
リアクターは、通常、肝臓細胞を培養し、該細胞（または単離した後）を適切な液体培地に懸濁することにより得た肝臓細胞の懸濁液を、リアクターの中に注入することにより接種され、その後、この細胞はリアクターの全体に亘って分布され、適切な時間（通常は１分から５位時間以上、好ましくは30分から３時間、より好ましくは略２時間）の間に固相支持体に付着される。比較のために、ゲルラッハ等（Gerlach et al.）のリアクターを用いると、付着相には８時間以上を要する。
細胞懸濁液の分布を更に容易にするために、細胞懸濁液を注入した後に、リアクターを攪拌することができる。
非常に好ましい実施例に従えば、細胞懸濁液の注入の後に、上記の期間の間、リアクターをその長手軸の回り（即ち固相支持体中の中空糸の方向）に、0.01〜100ｒｐｍ、好ましくは0.1〜10ｒｐｍ、より好ましくは略１ｒｐｍの速度で間欠的（好ましくは連続的に）に回転させる。図１１に示した好ましい実施例において、図３／４に示したバイオリアクターは中心軸２９の回りに回転されるが、このリアクターは、適切な寸法のクランプ（図示せず）のような取付け手段３０によって軸に取り付けられる。細胞をリアクターの全体に分布させる方法は、バイオリアクターの底に細胞ペレットが形成されるのを防止するが、この細胞ペレットの形成は、特にペレットの細胞に関して物質輸送の問題を生じ、これは機能的活性および／または生存率の喪失を起こす可能性がある。リアクターを回転させ、好ましくは周期的に方向を反転させることによって、沈降の方向が連続的に変化するから、懸濁液中の細胞は、リアクターを通る略円形の経路を辿るとみなすことができる。その結果、細胞は繰り返しマトリックス材料と接触し、これによって前記マトリックス材料中のポリエステル遷移に捕捉される機会が著しく増大して、高い付着率および付着速度での均一な固定化が得られる。
細胞の固定化が完了した後に、付着していない細胞および／または過剰の細胞を含む残りの懸濁液をリアクターから除去し、その後に任意に、リアクターを水および／または適切な液体培地でフラッシュすることができる。
また、リアクターを攪拌し、好ましくは回転させることによって、特に初代肝臓細胞の培養懸濁液を用いるときに、少なくともある範囲で、注入された細胞懸濁液に存在する死細胞から生細胞を分離することができる。生きた細胞は固相支持体によって捕捉され、および／または固相支持体に付着するのに対して、付着しない死細胞は、リアクターを洗浄することによって、残りの懸濁液と共に除去される。
また、リアクターを適切な液体培地で灌流することによって、死細胞をリアクターから洗い出すことができる。この死細胞の「洗い出し」は、使用の最中、即ち、リアクターが灌流回路に連結されている間にも生じることができる。この場合、図７に示すように、細胞フィルター２３をリアクターの後の液体回路に組み込むのが有利である。
従来技術の中空糸バイオリアクターでは、肝臓細胞は灌流する手段のない中空糸の間の本質的に閉じた「区画」の中に存在し、または（ヒドロ）ゲルの中に捕捉されるから、前記スペースをこのような死細胞の好ましい除去は起こらない。
使用している間、リアクターの中の肝臓細胞は、それ自体公知の方法で維持される。本発明のＢＡＬは、好ましくは生理学的に許容可能な温度、好ましくは略37℃に維持される。また、必要であれば、追加の栄養素および他の適切な物質がリアクターに添加される。
肝臓細胞は、酸素ガスまたは「カルボゲン（carbogen）」（Ｏ₂／ＣＯ₂の95：５混合物）のような酸素に富むガス、または「培養ガス（culture gas）」（95％の空気、５％のＣＯ₂）のようなＣＯ₂に富む酸素含有ガスを供給することによって酸素付加される。このガスは、ガスシリンダまたはガスポンプのような何れかの適切な手段、または外部のガス供給源に連結することによって供給することができる。上記で述べたように、密にパックされた中空糸を通してのこのような直接酸素付加の方法は、危険な酸素および／または二酸化炭素の勾配が回避されることを意味する。また、灌流の間、使用される液体培地は、ガス供給に対して更に「混合」作用を有し、前記勾配を更に低下させることができる。
使用の前または使用の最中に、バイオリアクターおよびその中に含まれる細胞の機能的効果および代謝特性を、タンパク合成、尿生成、酸素取り込み（そのために、ガス入口およびガス出口での直接測定を有利に用いることができる）、チトクロームP450活性、薬物代謝試験、クリアランス技術等のように、この目的のために利用可能異な多くの試験のうちの何れかを用いて、それ自体公知の方法でモニターすることができる（例えば、本明細書に組み込まれる上記のロズガ等（Rozga et al.）を参照のこと）。また、バイオマス計（Aber）を使用することができるが、これは死細胞と生細胞との膜電位の相違に基づく導電性測定を用いるものである。このような計器は、当業者に公知である。
本発明のバイオ人工肝臓の使用は、勿論、本発明の固相支持体およびバイオリアクターの使用に関連した全ての利点、並びに以下のような更に多くの利点を与えるものである。即ち、
・本発明の適切なマトリックス材料の存在に起因した、改善された肝臓細胞の付着および改善された単位容積当たりの細胞容量。固相支持体はまた、細胞成長および細胞分裂のための改善された環境を与える。
・別の酸素付加器を必要とせず且つ有害な勾配を発生しない、酸素付加遷移の存在による肝臓細胞の改善された酸素付加。
・毒素および／または肝臓分泌物を、物質輸送に関連した膜を通過させる必要性および分子カットオフの問題を伴うことなく、肝臓細胞と処理すべき血液若しくは血漿との間の直接液体接触。
・リアクターを、治療的用途に必要とされる容量にまで容易に「スケールアップ」することができる。
・容易に製造および操作できる単純な構成で、その最も単純な形態は、一つの液体入口／出口および一つのガス入口／出口を必要とするだけである。
・従来技術のシステムに比較すると、本発明のバイオリアクターは使用する（初代）肝臓細胞プレパレーションに対する要求、特に生存性および付着性に関する要求の厳格性が低い。
・接種後の細胞付着の速度および比率が増大し、ＢＡＬが使用可能になる間での時間が短縮され、必要とされる肝臓細胞はより少なくなる。
最後に、肝臓細胞の培養および／または維持におけるＢＡＬとしての本発明の３Ｄ固相支持体およびバイオリアクターの使用、並びにリアクターに接種するための上記の回転方法の大きな利点は、リアクター中の細胞が、少なくとも一つの直径において10細胞以下、好ましくは6〜8細胞以下（100μm）の小さな細胞凝集体として存在し、および／または維持されることである。このような肝細胞凝集体が長期間に亘って機能および生存し、また単相で増殖した肝細胞または２Ｄキャリア若しくは中空糸上で増殖した肝細胞よりも活性が高く、良好に分化することは当該技術において周知である。また、このような小さい凝集体の中で培養された細胞の形態は、インビボでの肝臓における肝臓細胞の形態に類似している。また、こられの凝集体の寸法は比較的小さいから（直径方向で6〜8細胞）、該凝集体の中心にある細胞への物質輸送に関して、ゲルラッハによるリアクターまたはマイクロカプセル中に固定された500μmの凝集体のような、大きな凝集体（＞200μm）で培養された肝臓細胞の場合のような問題はない。
従って、本発明は、高容量リアクター内において、非常に高い細胞密度（即ち、20〜40×１０⁶細胞／ml以上）での肝臓細胞の培養を可能にする。また、一般的かつ従来技術のＢＡＬシステムに比較して、本発明の固層支持体は、肝臓における細胞の生物学的条件／環境により密接に適合した環境を提供する。
勿論、これらの特徴は、本発明のＢＡＬが治療的観点でも、特に従来技術のシステムと比較して、大きな利点を有していることも意味している。このＢＡＬは、一般的に長期間に亘って治療的に有効であり、改善された効率を示すであろうし、また肝臓弛緩のために十分な容量を容易に提供できるであろう。
本発明のＢＡＬの実際的な利点は、それがオートクレーブ中（120℃で20分）で滅菌できることである。従来技術のシステムは、エチレンオキシドのような有毒ガスを用いてガス滅菌する必要があり、これは利アックたー我滅菌された後にも残留し、リアクターの中空糸を劣化させる。
最後に、本発明のＢＡＬは、冷凍保存された初代肝細胞をバイオ人工肝臓システムに用いることに初めて成功したものであり、細胞の単離を集中して行い、その後に該細胞を病院に配布し、そこで必要になるまで保存できる可能性を開いたものである。これは、本発明のＢＡＬの取付け期間の短縮と共に、臨床的設置において、本発明のＢＡＬは低コストで医者がすぐに自由にできることを意味している。
次に、以下の非制限的な例によって本発明を例示する。
例 １：インビボ試験
激賞肝不全の患者を治療し、肝臓移植を乗り越えるための肝臓支援システムの開発は、極めて重要な挑戦である。多くの初期の試みは、関連毒素が患者の循環系から除去されれば肝不全は修復されるであろうとの仮説に基づいた、血液の解毒に集中された。患者の精神的状態の改善は報告されているが、長期生存は達成されていない。従って、有効な肝臓支援システムは、解毒および配設を含む肝臓の多くの合成機能および代謝機能を行えるものでなければならないと結論された。この問題に対する最も合理的なアプローチは、能動的に機能する肝細胞を導入することである。この理論を実現する従来技術の現状は、バイオ人工肝臓（ＢＡＬ）、即ち、機械的支持体上に固定化され、半透膜によって血液循環系から分離され、良好に得尿素を与え且つ酸素を付加された生存肝細胞を有する体外装置として提示されている。
従来技術では、生体適合性、機能的能力の維持、特に、ＢＡＬの開発における重要な側面が議論されている。しかし、現在のバイオリアクターの設計は、完全な肝臓に存在するような肝細胞へ、または該肝細胞からの最適な物質輸送のために不可欠な条件に合致していない。この点において、バイオリアクター構造の肝機能に対する大きな影響が過小評価されてきた。
我々の研究の目的は、高密度肝細胞培養を可能すると同時に、全ての肝細胞がインビボと同様の潅流および直接接触の条件下で確実に機能することにより、より密接に生理学的物質輸送に似たバイオリアクター構成を開発することであった。加えて、我々が望んだことは、インビボで見られる多くの細胞構造上の特徴を維持し、炭層での肝細胞培養と比較して長期の機能的活性を示すことが知られている小さい凝集体として、肝細胞を培養することであった。
他の目的は、治療的な肝臓支援のための十分な細胞マスを組み込める大きさにまでスケールアップできるバイオリアクターを開発することであった。その結果、その中で肝細胞が小さい凝集体として再組織され且つ固定化されるような、螺旋状に巻回された３Ｄの不織布ポリエステルマトリックスと、一体に組み込まれた酸素孵化器とを具備した新規なバイオリアクターがもたらされた。
以下に、本発明の一実施例の新規なバイオリアクター設計の特徴と、そのインビトロでの結果とを提示する。
１．材料及び方法
１．肝細胞単離
ブタの肝臓は、AMCアムステルダムの臨床および実験心臓学部門、AMCアムステルダム皮膚科部門及び畜殺場より快く提供された。肝細胞は、体重２０−２５ｋｇの複数匹の豚より前記（te Velde AA, Ladiges NCJJ, Flendrig LM, Chamuleau RAFM, J. Hepatology 1995; 23: 184-192，本邦に引用として取り込まれている）に記載のような簡易二段階コラゲナーゼ灌流技法を使用して単離された。単トリパンブルー排除法に基づく単離細胞の生存率は、７１−９６％（ｎ＝８、８９±７％）と変動した。単離法が異なると、ｇ肝臓湿重量当たりの肝細胞の収量は、８．１０⁶から３０．１０⁶と変化した。
１．ｂ バイオリアクター
該バイオリアクターは、固定に依存する細胞を培養するために特に考案された３Ｄポリエステル不織布（Bibby Sterilin Ltd, Stone Staffordshire, GB）と、酸素供給及び二酸化炭素除去用にAKZO-NOBEL（Plasmaphan, AKSO-NOBEL, Wuppertal, Germany）のヴィケン（J. Vienken）博士より寄贈された複数の疎水性ポリプロピレン中空糸を基本としている。３Ｄ繊維（サイズ：長さ１４０mm、幅９０ｍｍ、厚さ０．５ｍｍ、繊維の直径：１３μｍ）は、肝細胞固定化及び自己凝集の足場を提供している。その付着用表面は、高密度の肝細胞培養を可能にするその突出部の約１５倍である。複数の酸素供給中空糸（外径630μｍ、内径300μm）は、３Ｄキャリアに平行状に織り込まれて固定され、平均距離２ｍｍのスペースをおいて配置された。通常、これは、マトリックス材料を３回以上折りたたみ、２ｍｍのスペースをおいて折りたたんだマトリックス材料に針で多数の穴を作り、このように得られた穴に、適切な長さの中空糸を通し、折り目を除くように、中空糸方向に折りたたんだマトリックスを再び伸ばし、マトリックス材に中空糸を一方向に平行に配列した状態に付ける事によって行われる。
ポリエステル・ポリエチレン複合材は、アクリル核の助けを借りてスイスロールのように渦巻き状にまいた螺旋（図３）であり、ポリサルホンの透析枠（Minifilter, Amicon Ltd, Ireland，内径1.4cm，外径ED1.7cm，全長15.5cm）に載置される。酸素供給中空糸は、透析器ポット技法を使用してポリウレタン樹脂（PUR系725A, 725BF、Morton International, Bremen, Germany）に定床させ、ガス出入口の末端蓋が装着された。
得られたバイオリアクターは図１２に示される。図中、３１は架構、32は、ポリウレタンポット、33は夫々、繊維外スペースへの出入口、34は繊維外スペース及び35は中空糸である。
バイオリアクターは、オートクレーブで（２０分１２１℃）滅菌されている。
繊維外スペースへの肝細胞接種（１１ｍｌ、ラットにおけるインビトロ実験においても将来適合）は、通常透析物用に使用される出入口を経て細胞懸濁物を注入することによって実施される。同じ出入口は、細胞固定化後、培地灌流に使用される。
１．ｃ．肝細胞培養
熱失活されたＦＣＳ（10%, Boeringer Mannheim）、グルタミン（２ｍＭ，BDH labaoratory Supplied Ltd.）、インシュリン（２０ｍｌＥ，Novo Nordisk, Denmark）、デキサメタソン（１μＭ）及び抗生物質／抗真菌溶液（Gibco）が補給された氷冷ウイリアムＥ（Williams’E）培地（Gobco BRL Life Technologies, European Division）に、濃度20.16⁶生存細胞／ｍｌで懸濁された肝細胞は、最終量220.10⁶細胞／ユニットになるまで二つの予め冷却（４℃）されたドライバイオリアクターに注入された。
冷却されたバイオリアクターは、結果を二重に得るために二つの分離細胞灌流回路中に統合された。この構築機構は、温度規制（３７℃）されたキャビネット（Stuart Scientific, model SI60, GB）中に載置された。そのキャビネット中で、バイオリアクターは図１１に準じた回転装置上にクランプ固定されて、培養ガス（９５％大気、５％CO₂、ガス流：３０ml/min，３７℃）に結合されてた。リアクター２８は、その長手軸２９にそって、１回転／分で１２０分間水平に回転され、確実にリアクター全体に細胞を均一に分布させ、生存肝細胞の捕捉、付着及び自己付着によって固定化が促進された。結合チューブのもつれを防止するために、回転方向は毎分自動的に反転された。この固定化期間後、１５時間毎に新たに培地廃棄物（６０ｍｌ）の洗浄を行い死滅および非付着細胞をリアクターから洗い流し、栄養物を補充し、細胞領域から毒素を除去し、肝細胞を単離処置から回復させた。よってその装置は使用可能な状態になった。
１．ｄ 肝細胞機能テスト
概論
該研究には、肝細胞有・無によるバイオリアクターが包含された。後者はコントロールとして働く。両グループは同一の処理と追跡調査がなされた。肝細胞機能テストは再循環状況で行われ、補充ウイリアム培地（３０ｍｌ）を繊維外のバイオリアクタースペースに５ml／分の流量で灌流した。様々なパラメターが４日間に渡って評価され、最終日のみ、無血清状態における蛋白質分泌物を保存した。最初の３日間は毎日ガラクトース除去、尿素合成、リドカイン代謝、を含めた総合テストが行われ、続く１４時間は補充ウイリアム培地でインキュベーションされ、アミノ酸代謝、乳酸塩／ピルビン酸比、酵素漏出、グルコースレベル及びｐＨが評価された。各テストの前に、新たに培地老廃物洗浄が行われた。閉鎖ループ回路から採取されたサンプルの一部が液体窒素中で凍結され分析までー７０℃で貯蔵された。
ガラクトース除去
Ｄ−ガラクトース（Sigma Chemical Co., St Louis, MO）が、閉鎖ループ回路に１mg／mlの濃度で投与され、３時間インキュベートされた。培地サンプルは三日間毎日異なる時間点で採集された。ガラクトース濃度が、酵素テストキット（Boehringer Mannheim, Wiesbaden, Germany, kit no. 1242-73）を使用して３４０nm（Cobas Bio, Roche, Switzerland）で測定された。これから、除去されたガラクトースが計算された。
ＮＨ₄Ｃｌからの尿素合成
バイオリアクターシステムの尿素合成能力は、１０mMのＮＨ₄Ｃｌを二時間インキュベートすることによって評価された。培地サンプルが３日間毎日異なる時間点に採集された。尿素は、尿素窒素について、Sigma Chemical Co. kit no.535によって525nm（Zeiss UVスペクトロホトメター）にて、比色計法的に測定された。
リドカイン代謝
リドカインーＨＣｌ（Sigma）を閉鎖ループ回路に５００μg／ｍｌの濃度で投与し、１時間インキュベートした。培地サンプルは３日間毎日異なる時間点で採取された。該サンプルをリドカイン及び３つのリドカイン代謝物：モノ・エチル・グリシン・キシリダイド（ＭＥＧＸ）、２、６キシリデインＨＣｌ、グリシン・キシリダイド（ＧＸ）について逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。リドカインＨＣｌはSigma Chemical Co．から入手した。（ＭＥＧＸ）、キシリデイン、ＧＸ及びエチル・メチル・グリシン・キシリデイン（ＥＭＧＸ）は、アストラ・ペイン・コントロール（Astra Pain Control）

のサンドベルグ（R.Sandberg）博士から寄贈された。ＭＥＧＸは、キシリデイン、及びＧＸの分析用サンプルは、75μｌ内部標準液（水性分解物（aquadest）中ＥＭＧＸが５μｇ／ｍｌ）及び150μｌ水性分解物を、150μｌサンプル中に添加することによって調整した。より高濃度のリドカインを分析するには、補充ウイリアム培地にサンプルの20倍希釈物が必要とされる。リドカイン及びその代謝物の単離は抽出によって行われた。このために、150μｌの炭酸ナトリウム（０．１Ｍ）及び６００μｌのクロロホルムが添加された。１分ボルテックス攪拌後8000ｒｐｍで４分遠心分離した後、該水性上澄み液を除去し150μｌの水生分解物及び３５０μｌのＨＣｌ（0.1Ｍ）を有機相に添加した。該攪拌・遠心分離法は繰り返され上澄み液が除去された。冷却されたサンプル貯蔵室には、分析に先駆けて残渣を４℃で保持しておいた。移動相（0.5Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ４．５）を流速１．７ｍｌ／分（Perking Elmer 250）で吸い上げ、クアド（Quard）・カラム（Superspher 60RP 8，長さ10ｃｍ、4μｍ粒子，Bischoff Chomatography, Germany）で前処理した。自動サンプラー（Gilson Sample Injectorモデル231、フランス）で50μｌアリコットを温度規制された（５5℃、Chrompac, Column Thermostat，オランダ）ＨＰＬＣカラム（（Superspher 60RP 8，長さ20ｃｍ、内径４．６ｍｍ、４μｍ粒子、Bischoff Chomatography、Germany）に注入した。検出は198nm（Schoeffel SE 770 UVスペクトロホトメーター、ドイツ）行われ、ピーク領域を、オリベッティＭ２５０コンピュータ助けを借りて内蔵ソフトウエア（Chrompac PCI，バージョン5.12、オランダ）を使用して計算した。サンプルは、目的成分のピーク領域とインターナル標準の比を比較することで定量化された。リドカイン（5−80μｇ／ｍｌ）、MEGX（0.5-16μｇ／ｍｌ）、キシリデイン（5−80μg／ml）及びＧＸ（1-32μg／ml）の標準カーブが作成され、直線性がある事わかった（r＝0.996，n＝6）。検出限界は、GXで0.4μg/ml、キシリデインで0.３μg/ml、MEGXで0.2μg/ml、EMGXで0.４μg/ml及びリドカインで0.５μg/mlで、保持時間は夫々2.２分、2.4分、3.2分、4.１分、及び5.8分であった。ホスフェート／アセトニトリル／ホスホリカシド緩衝液（50mM、ｐＨ1.7）及びアセトニトリル溶液（水性分解物：ACN＝1：1）で洗浄することによるカラム安定化時間はを20分に限って、クロロホルムのピークを取り除いた。
アミノ酸代謝
アミノ酸の広範にわたる代謝回転を調査した。アミノ酸濃度は、van Eijk HMH, van der Heijden MAH, van Berlo Clh, Soeters PB, Clin Chem1988;34:2510-13に記載のように、完全自動化されたo-フタルジアルデハイド（OPA）によるプレカラム・デリバテイゼーション（derivatisation）を行いその後、高性能クロマトグラフィーを行うことで測定された。
乳酸塩／ピルビン酸比 乳酸塩／ピルビン酸レベルは、酵素テストキット（Boehringer Mannheim Wiesbaden, Germany，乳酸塩キット149993番、及びピルビン酸塩キット124982番）によって340nm（Cobas Bio Roche Switzerland）にて測定された。これから、乳酸塩／ピルビン酸比が計算された。
酵素漏出
乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（GOT）、及びグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（GPT）レベルは通常の臨床的分析によって測定された。
グルコース
グルコース・レベルは、グルコーステスト紙片（ヘマトグルコテスト、１−44Ｒ、Boehringer Mannheim、Wiesbaden、Germany）及び付属のリホラックス（Reflolux）-S読み取り装置によって測定された。
ｐＨ
ｐＨは、血液ガス注射針（Marz-175、sherwood, Medical, Ireland）で培地1mlをサンプリングして測定され、血液ガス分析機（RadiometerモデルABL300コペンハーゲン）で決定された。
蛋白分泌
４日目に全バイオリアクター培養システムは、250ｍｌの無FCS補充ウイリアムＥ培地で洗浄され、同培地中でインキュベートされた。培地のサンプルは、24時間後採集され50mMＮＨ₄ＨＣＯ₃に対して広範に透析され凍結乾燥された。乾燥残渣は、培養上澄み液が20倍に濃縮されるような量の電気泳動緩衝液（Tris-バービタール緩衝液、ｐＨ＝8.6、イオン強度0.1）で再構成された。
豚肝細胞によって分泌された血清蛋白を視覚化するために、我々は先に述べたように（28）、豚血清蛋白に対する多特異的抗血清を使用した交差免疫電気泳動を行った。
１．ｅ顕微鏡観測
５日齢培養システムを調整し、バイオリアクター中での肝細胞の配向を決定するために顕微鏡観測した。
光学顕微鏡
肝細胞は、バイオリアクターをホルマリン（４％）で洗い流す事によって固定化した。２４時間後、バイオリアクターを切り開き、不織布の様々な部分より１２のマトリックスサンプル（１cm²）を採取した。該サンプルは、水で洗浄され規格エタノール中で脱水されパラフィンに中に着床された。これから８μｍ厚のスライスを切り取り、キシロールで脱パラフィンし、ヘマトキシリン・エオジンで染色した。調整物はオリンパス、ベモックス（Vamox）光学顕微鏡（タイプAHBT３、東京、日本）下で観察された。
走査電子顕微鏡
５日齢培養物由来肝細胞凝集物は、バイオリアクターをりん酸緩衝液、pH７．３（Fluka chem a.g., Buchs、Switzerland）中に４％のグルタルアルデヒド含む物で洗い流す事によって固定された。バイオリアクターは途中で切断され一部規格エタノール中で脱水しヘキサメチルジシラン

中で最終的に乾燥された。切断面は、スパッター・コーターで金による被覆を行ない走査顕微鏡（ISI SS４０、日本）下で観察された。
１．ｆ 統計的分析
非対スチューデントｔ検定を使用し、ｐ＜0.05は、統計的有為水準とみなされた。データは、平均±SEMで表された。
1.g 磁気共鳴像（MRI）
MRIは、例えば試験管即ち本願ではバイオリアクター中の液体のフロー分布を無侵襲的に視覚化するための方法である。
同じ長さの小規模バイオリアクター（内径１．32cm、体積11ml、46中空糸膜、直径アクリル核、0.4cm）及びスケールアップされたバイオリアクター（内径2.2cm，体積33ml、138中空糸膜、直径アクリル核、0.4cm）の断面中のフロー分布を調査した。まず、バイオリアクターをエタノールで洗い流し続いて水で洗い流し、培地フローを阻止しかつ磁界の同一性を歪めその結果信号強度を減少させる可能性がある気泡を除去した。バイオリアクターは、次に鳥かごコイルに載置され、6.3テスラ／20ｃｍの、ボア・ホーム・ビルト（bore home built）スペクトロホトメター中に水平に設置された。スペクトロメータが装備されていない無細胞装置を使用し、生存肝細胞を維持した。MRIに感受性のあるトランスアキシャル（transaxial）フローが、新規の定常状態の灌流像技法を使用してバイオリアクターの途中から得られた。つまり検出スライス（幅2mm、フロー方向に垂直）の水による信号が抑制される。100msの流入時には、スライスの一部はリフレッシュされ信号強度が強くなった。よってフローが強くなると、より検出スライスがリフレッシュされ、より信号の強度が増加する。2cm／sより高速で液体が流れると、検出スライスが完全にリフレッシュされるので信号は増加しない。そこで、たいていのフロー・チャンネルでは、最大液体速度が2cm/sを超えないようにしてフローが測定される。
１．ｈ αGST分析
毒性血清及び肝細胞生存性
αGSTは、損傷を受けた細胞膜を持つ肝細胞によって分泌されるので、肝細胞の完璧性を示すマーカーである。肝臓の酵素αＧＳＴは、Biotrin, Ireland提供のエリザキットによって種特異的（ラット、豚、ヒト）に測定された。
肝臓虚血を担持するラットがBALにもとずく豚肝細胞で処置された。血しょうサンプルをある時期に採取し、ラットと豚のαGSTレベルを（ある同じサンプル中で）測定された。
２．結果
2．a 肝細胞培養
該研究は２２バイオリアクターを包含する。そのうち１６装置（n=８、二重）が肝細胞を培養するのに使用され、無細胞の６装置（n=３、二重）がコントロールとして使用された。同じ単離手法由来の細胞で２つのバイオリアクターにおいて行った肝細胞機能テストの結果は決して10％以上は相違しなかった、これは細胞固定及び培養が複製可能に行われることを示している。研究全体を通して培養システムは滅菌状態のままで、酸素供給中空糸の細胞間隙中への培養物の漏出は見られなかった。
2.b．肝細胞機能テスト
標準量のガラクトースでインキュベーションを180分行った後、ガラクトース排除能力は3日間にわたって一定であった。
尿素合成
アンモニアレベルが高度になると肝性脳障害となる。従ってアンモニアからの尿素の合成は、重要な機能テストである。10mMのNH₄Clで120分インキュベーションした後の尿素合成は、3日間にわたって変化しなかった。
リドカイン代謝
肝細胞のチロクロームｐ450活性は、リドカイン及びその代謝を調べる事によって評価された。60分後のリドカイン除去その後のMEGX及びキシリデインが産生も調べられた。リドカインインキュベーションでは３日間にわたって著しい変化は見られなかった。キシリデインは最初の二日間のリドカインの主要代謝物であった。３日目にはキシリデイン及びMEGX産生に著しい違いは見られなかった。個々の実験を見た場合、リドカインの除去はキシリデイン及びMEGX形成と良く相関していた。肝細胞を１時間リドカインでインキュベーションしている間には、検出レベル豚肝細胞代謝物GXは産生されなかった。
アミノ酸代謝
表１は、肝臓の機能に関係するあるアミノ酸の培地濃度中の変化を示す。グルタミンの濃度の減少は、グルタメートの濃度の上昇と関係していた。芳香族アミノ酸（AAA）が肝臓で代謝されると、フェニールアラニン、チロシン、トリプトファンの濃度が低下を示す。アルギニン濃度の低下及びオルニチン合成は、アルギナーゼ活性を示す。アラニン濃度の低下、肝臓の糖新生の前駆体が観察された。
表１に加えて、他のアミノ酸、例えば、アスパラギン、グリシン、ヒスチジン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、リジン等の濃度が著しく低下した。全アミノ酸代謝は、3日間にわたって安定を保った。
乳酸／ピリビン酸比
乳酸／ピルビン酸比は、細胞酸化代謝及び好気性代謝の機能状態を示す指標である。表１は、乳酸の濃度の低下にのみ起因する乳酸／ピリビン酸比の低下を示す。乳酸／ピリビン酸比５：７は、3日間の間培養系におけて酸素供給状態が安定していることを示す。
酵素漏出
肝細胞の生存性を評価するため、酵素活性つまりLDH、GOT、GPTの出現を、培養培地中で測定した。LDH分泌は、1日目にのみ著しかった（表１）。GOT遊離3日間にわたって著しく、平均GOT濃度は低下傾向にあった。低いがかなりの量のGPTが一日目及び二日目に分泌された。
グルコース
グルコースレベルは、培養の初日には変化しなかった（表１）。二日目及び三日目にはグルコースの濃度の著しい低下が観察された。
ｐＨ
ソデイウム・バイカーボネートで緩衝された培地中でCO₂分圧（32.6±0.4mmHg，n=8）を安定に保つ内蔵オキシジェネータの助けを借りて研究中のバイオリアクター中のｐＨは一定に保たれていた。
蛋白分泌
培養された肝細胞はその培養培地中に蛋白を分泌する。二次元交差免疫電気泳動を、豚血清に対する抗血清を使用して行い、無ＦＣＳ補充ウイリアムＥ培地で24時間インキュベーション後にバイオリアクターで培養された肝細胞によって分泌された様々な量とタイプの蛋白質を視覚化した。結果を図6に示す。各々のピークは、異なる蛋白を示す。各ピーク下のエリアは、分泌された蛋白の量を示している。コントロールの無細胞バイオリアクター由来の培養培地において、豚の血清蛋白は検出されなかった（結果表示せず）。
2.c顕微鏡観測
注入された単細胞懸濁物由来肝細胞は、広範な細胞対細胞の接触によって小さい不規則な形の凝集物に再組織化された（図１４）。5日齢培養物からの該凝集物は、ポリエステル繊維の枠内に固定化され捕捉された。高密度培養に拘わらず、凝集物の間には、培地から肝細胞へ及び肝細胞から培地への灌流を邪魔しないための十分なスペースがある。３Ｄマトリックスは比較的空っぽなので、現在の20.10⁶の生存細胞／mlよりも高密度においてさえ肝細胞が培養される可能性がある。凝集物は大変小さい（直径が５細胞より大きくなるものは一つもなく、大半は2−3細胞サイズである）ので、肝細胞は、直接培地と接触して機能する。肝細胞固定化のコンパートメントを通る培地の流れは、各肝細胞が灌流状態で動作し血液と接触しているというin vivo状況に近似する。出入り口近く及び不織布の真中で採取した３Ｄマトリックスサンプルの実験では、肝細胞がバイオリアクター装置で均一に分布していることがわかった。
あるバイオリアクターの３Ｄマトリックス（サイズ：長さ：10mm、幅：0.5mm、厚さ；８μｍ）の１２の顕微鏡調整物の細胞計測では、調整物中平均肝細胞数1379±135（平均±ｓｄ）となった。220.10⁶の接種された生存肝細胞が夫々が不織布内に固定化されるならば、各調整物が約1400の生存細胞を含む事になると計算できる。よって実験機に固定化された肝細胞は平均98.5%となる。
図１５は、バイオリアクターの３Ｄマトリックスにおける培養物中で5日経過後に単離された肝細胞の走査型電子顕微鏡写真を示す。光学顕微鏡で観察されたように、5日齢培養物派生肝細胞は、その凝集形態を維持し、ポリエステル繊維に固定されたままであった。球状肝細胞間に広範な細胞対細胞接触が見られた。
2.d磁気共鳴画像
図１５Ａ及び１５Ｂは、小さいバイオリアクター（A）及びスケールアップされたバイオリアクター（Ｂ）の断面におけるフロー分布を示す。液体の速度は、軸方向にのみ0（黒）から約２cm／s（白）に渡って検出された。図1と比較すると、バイオリアクターの幾つかの構成物、例えば、ポリエステル不織布、酸素供給中空膜、フロー・チャンネル、アクリル核等、が確認できる。３Ｄマトリックス内の培地フローのみを示すポリエステル不織布の黒い部分は軸方向にはなかった。他の方向の布の灌流は、調査されなかった。灰色点が均一に分布しているのは、両装置におけるすべてのフローチャンネルが灌流されていることを実証している。灰色の陰は、流体の速度がフローチャンネル（0.5-2cm/sの範囲にわたっているが大半は約1.5cm/s）毎に異なることを示す。図2Bの矢印は気泡を捕らえた結果信号強度の低下しているスポットを示す。スピンエコー像（表示せず）気泡のサイズが結果として起こるひずみよりもはるかに小さい事を示してた。スペクトロメーターのみがバイオリアクターに対して水平配向とされた。通常、装置は垂直に配置され、気泡の除去が促進される。
図15A及び15Bは、小規模バイオリアクター（Ａ，内径１．32ｃｍ）及びスケールアップされたバイオリアクター（Ｂ，内径2.2cm）のトランスアキシャル・フロー感受性MRI’sを示す。流体速度はゼロ（黒）から２cm／s（白）にわたる。図１と比較すると、バイオリアクターの幾つかの構成物、例えば、ポリエステル不織布、酸素供給中空膜、フロー・チャンネル、アクリル核等、が確認できた。両装置における像によって、すべてのフローチャンネルが灌流されていることがわかる。フローチャンネルの流体速度には相違が観察される。図Ｂの矢印は気泡が捕捉された結果、信号強度の低下した点を示す。
2.e α−ＧＳＴ測定
予想されたように、ラットのα一ＧＳＴ濃度は、ＢＡＬ処理中に増加した。豚αGSTの濃度は一定のままであった。これによって本発明のバイオリアクターにおける豚の肝細胞の生存率は、毒性のあるラットの血清に影響を受けない事が明らかに示された。
3考察
先行技術において、肝細胞は中空糸ユニットの細胞間隙内及び繊維外スペースで培養されてきた。この細胞培養の概念が人気があるのは、それがBALを実現するのに一番簡単な方法であるからである。しかしこれらのシステムは、健全な肝臓に存在するような、肝細胞へ及び肝細胞からの至適な物質輸送をするための必須な条件を満足しない。その結果、肝細胞代謝活性は下記の理由で損われる。
肝細胞の損傷の臨床的治療には、大規模の高密度の肝細胞培養物が必要となる。多くのバイオリアクターでは、非生理学的な肝細胞ペレットの形成を生じる。これらの大きな凝集物の真中にある肝細胞は、貧弱な代謝活性を示し、栄養物及び酸素を細胞に物質輸送すること及び二酸化炭素及びトキシン類及び細胞産生物を細胞から物質輸送することが妨害された結果、高勾配のため壊死になる可能性を示している。各々の肝細胞が血液と近接しているin vivoの肝臓と対照的である。更に、多くのバイオリアクターにおいて物質の交換は、拡散に依存している。拡散では、肝細胞が灌流状態下でそれに対応した低勾配で機能するin vivo状態と比較すると、更に物質輸送が制限される。
本願の新規バイオリアクターは、BALとして使用される場合、生理学的物質輸送に対する上記の要求に向けられる。この結果、下記の特徴を持つシステムとなる。
１．三次元ポリエステル不織布
顕微鏡的観察では、不織布のポリエステル繊維は、高密度（20.10⁶細胞／ml）の肝細胞固定化の枠組みを提供し、及び小さい凝集物（直径は５細胞より大きはなく、殆どは、２−３細胞の大きさ）へと凝集物の間に間隙をもって再組織化する事を提供する。これは、各細胞を灌流状態のようなin vivo下で、直接培地と接触させて操作することを可能とする。これによって生理学的勾配の模倣がより綿密になる。豚肝細胞の凝集物についての研究では、このような構築物がin vivoで見られる細胞構造的特徴を多く保持していることがわかった。該構築物は、より長く生存し、単層の培養物に比べ、機能を保持し、かつ／又は機能を高めることがわかった。同様の結果が、このような豚肝細胞凝集物を基にした我々の新規バイオリアクター装置についても見られた。顕微鏡評価では、in vivoで見られたように、球状の肝細胞間に広く接触が見られた。肝臓に特異的な機能は、３日間にわたって保持され、尿素合成能力は、単層培養物と比べて倍であった。
２．細胞外マトリックス材料
前記研究（te velde AA, Ladiges NCJJ, Flendrig LM Chamuleau RAFM, J.Hepatology 1995; 23: 184-192）では、疎水性組織培養プラスチックに付着した豚肝細胞の機能活性は、幾つかの細胞外マトリックスを構成物：コラーゲンI及びIV、ラミニン、フィブロネクチン、エンゲルブレス・ホルム・スワム・ナトリックス（Engelbreth-Holm Swam Natrix）及びマトリゲル（Matrigel）の存在下に付いた細胞と比較された。マトリゲル以外は、細胞外マトリックス物質はどれも、組織培養プラスチックと比べて、豚の肝細胞機能を高める事はなかった。マトリゲルは、大変高価であり、更に比較的大量の腫瘍起源のネズミ蛋白質がゲルからもれでて、患者の循環系に入り込むかも知れないといった欠点がある。それゆえ、我々は、肝細胞懸濁物を直接ドライバイオリアクター中に注入し、豚肝細胞を疎水性ポリエステル繊維に固定化させる事に決めた。培地は、予め洗浄せず又、マトリゲル、コラーゲン等の共通の細胞外マチリックス材料で被覆は行わなかった。その結果、安全、廉価かつ簡易な装置となった。
３．迅速肝細胞固定化
肝細胞は、二時間で固定化される。該固定化期間後、死滅及び非付着細胞は、バイオリアクターから洗い流される。よって、培養システムの全体の生存率が改善される。理論的には、該システムはいつでも使用可能である。５日齢のバイオリアクターの光学顕微鏡観測では、接種された生存肝細胞の98.5%が３Dマトリックス中に存在していた。これは、高い固定化効率及び時間内に洗い流される細胞が少なかった事を示している。後者の結果は閉鎖ループ回路から取得した培養サンプルの光学顕微鏡観測で毎日確認された。そこでは細胞及び細胞破片は殆ど観察されなかった。
調整時間が短いのは、臨床に応用する際に利点となり得るが、この回収時間が限られている事が肝細胞機能にどんな影響を与えるのかを実証するためには、更に調査研究が必要となる。固定化が迅速なのは、次のように説明される。単細胞肝細胞懸濁物を注入した後、バイオリアクターは、その長手軸にそって２時間水平に回転される。これによって懸濁細胞の沈降方向が連続的に変化し、肝細胞に付着すべきポリエステル繊維を探してバイオリアクタースペースを「冷やかし歩き」させる事ができる。該回転は、細胞と繊維及び細胞と細胞の相互作用を高める。これによって生存肝細胞の付着及び凝集が促進される。更に、システムに適度の酸素供給をすることは、肝細胞の固定化率を更に改善する。
４．物質及び代謝物の低勾配
細胞において、高密度の肝細胞培養物中で、物質及び代謝物が低勾配であるのは、ポリエステル不織布内で小凝集物としての肝細胞を培養することによって実現される。この結果、肝細胞培養物は、すべての肝細胞への灌流を邪魔しないための十分なスペースを凝集物間に持ち、低い培地勾配を持ったものとなる。全バイオリアクターをみると、低培地勾配は出入口の間の灌流距離を減らすか又は培地の流速を上昇させることによって得られる。前者のオプションを実現するための、バイオリアクターの複雑化したデザインが、上記に記載されたゲルラッチ（Gerlach）らによって提唱されている。これは、一つは培地の流入用に一つは培地の排出用にと独立して織られている中空糸の束の間で肝細胞を培養することによって実現される。これによって、これらの低勾配の毛細管の間の細胞の分散灌流が可能となる。バイオリアクターを流れる培地の流速を増加させることによる後者のオプションのほうが技術的にはもっと簡単な解決法である。これは、肝細胞を３Ｄマトリックス内で培養しこれによって肝細胞がポリエステル繊維ネットワークによって保護される我々のシステムでは実現しやすかった。５ml／分から15ml／分に培地の流速を段階的に増加させても、肝細胞機能活性の低下又は酵素漏出の増加等のせん断ストレスの兆候は見られなかった。3Dマトリックスの全ての部分に培地を均一に流し分布させる事は、多数のチャンネルをバイオリアクタースペース全体に均一に分布させる事で確実に行われる。更に、これらのチャンネルは、注入された肝細胞懸濁物を３ｄマトリックスに均一に供給する役目も果たす。
５．分散酸素供給及び中空糸の均一分布
内蔵酸素供給機は、培地の灌流方向に沿うＯ₂勾配及びＣＯ₂勾配を除去する。更に、渦巻き構造（図３）によって、酸素供給中空糸がバイオリアクター全体に均一に分布されるので、これによって酸素供給源の各肝細胞を直接囲む事ができる。この結果、肝細胞に至適に酸素が供給されることになり、これは、乳酸／ピルビン酸比（３２）が急激に低下することによって確認された。又この結果、ｐＨが安定し、ソデイウム・バイカーボネートで緩衝された培地においてＣＯ₂の分圧が一定である事をわかる。
６．生物適合性
FDAによって承認されている材料でオートクレーブ滅菌の高温の温度ストレスに耐えられる材料でバイオリアクターを構築することによる生物適合性化が求められてきている。我々が知る限り、これ（本発明）は、蒸気滅菌できる肝細胞培養用の最初のバイオリアクターである。これ（本発明）は通常使用されている大変毒性の強いエチレンオキサイド滅菌よりも生物学的にはるかに安全である。というのはエチレンオキサイド残基は何週間も続けてポリマーから漏出し、患者に免疫感作反応及びアレルギー反応を引き起こすからである。
７．スケールアップの容易性
肝細胞の固定化コンパートメントは、多数の繰り返しユニットからなる。各ユニットは十分に肝細胞機能を支持でき、酸素供給中空糸、培養灌流のチャンネル及び３次元のキャリア材を取り入れることが可能である。臨床応用に必要とされる肝臓質量をスケールアップすることは単にユニットの数を増やす事、つまり必要な固定化能力を得るまで中空糸／３Ｄマトリックス複合材の巻数を増加させる事を意味する。標準の透析枠組みとポット技術を使用するとバイオリアクターの製造が様々な広いサイズ範囲をもって容易に行える。
このようなスケールアップは、バイオリアクターのプラズマ分布に影響は与えない。これは、小規模バイオリアクター及びスケールアップバイオリアクターにおいて、すべてのフローチャンネルの灌流を示すフロー感受性のＭＲＩによって確認される。バイオリアクターが手作りであるという事実により、結果として流体速度はフローチャネル毎に違う。これを解決するために現在工業的生産技法の評価がなされている。
又、上記に記載のαＧＳＴ分析によって、まさに初めて患者の肝臓の状態とバイオリアクター中の肝細胞とを同時にモニターすることが現在可能となった。豚の肝臓は、長年このテストに供すための肝細胞供給源の選択肢として考えられているので、BAL処理の間、肝細胞障害をモニターするための興味ある候補でありうる。
急性肝臓疾患の治療用及び肝臓移植のつなぎとしての人工生物肝臓維持システムは、多量の生存及び活発に機能する肝細胞を必要とする。ヒト肝細胞が殆ど利用できないし、形質転換細胞では臨床肝臓機能を持たないので、豚の肝細胞は最良の代替物と考えられている。豚の肝臓は、実験動物又は畜殺場から入手可能であり、豚の肝細胞は、簡易二段階コラゲナーゼ灌流技法で大量に簡単に単離できる。
人工生物肝臓の臨床的応用には、長期にわたって培養されていない肝細胞が薦められる。というのは、培養された最初の肝細胞の代謝機能は時間と共に衰えるからである。よって、肝臓に特異的な機能が一番高い、単離後最初の４日にわたってのみ培養システムをモニターした。肝機能が多様なので、単一テストでは肝細胞の機能的能力を確認できない。このような理由により、培養システムの性能を評価するために一連のテストが行われた。ガラクトース除去、尿素合成、アミノ酸代謝は、３日間の調査期間中正常のままだった。これは、肝細胞機能を維持するためのバイオリアクターシステムの能力を示す。
リドカイン除去は、チトクロームｐ４５０活性を示すものであり、BALの成功には不可欠な重要な機能と考えられる。リドカイン除去は、３日間維持された。これによってバイオリアクター培養肝細胞は安定的なｐ４５０活性を持つことが実証された。ある単独実験では、ｐ４５０活性は、徐々に低下の傾向を伴って（二週間目には、初期活性の70％とまで下がった）１４日にわたって維持された。
リドカイン排除が、蒸発、肝細胞による吸着、又は肝細胞による不変の取り込みによっておきることを除外するために、人間で合成される事が知られている代謝物：MEGX、キシリデイン、GXを検出することによって調査した。MEGXは、人及び豚の肝細胞培養物における主要リドカイン代謝物であることが報告されている。これに対して、本研究では、MEGXではなくキシリデインは培養の最初の二日においては、リドカインの主要代謝物であった。更に、豚の肝細胞は検出可能な代謝物GXを産生しなかった。要するに、キシリデイン及びMEGX合成によって、リドカイン排除で実証されるようにｐ450活性が確認された。豚肝細胞におけるリドカインの生物形質転換は、人間で観察されてきた物とは相違する。
LDH、GOT及びGPTの濃度は。細胞膜の完璧性を示すマーカーとして使用されるものだが、調査期間中に急激に低下した。酵素レベルのこの低下は、たぶん、培養された肝細胞が、酵素による細胞単離技術で受けた有害な影響から回復していることを示すものでろう。該LDH及びGOTレベルと比較すると、我々の培養系におけるGPT濃度は非常に低い。これは先行技術においても観察されていた。よって我々は、GPTが豚肝細胞膜の完璧性を示すには、貧弱な指標であり、考慮しない方が良いと結論した。最も感受性の高いマーカーはＧＯＴであった。
他の重要な肝臓機能は蛋白分泌である。蛋白分泌は培養4日めに肝細胞バイオリアクター中で調査された。培養システムは、交差免疫電気泳動で視覚化されたように様々な蛋白を分泌でき、各々のピークは異なる血清蛋白を表す。
結論として、本発明は、高密度の肝細胞培養で様々な肝臓に特異的な機能の維持を確実に行える新規バイオリアクターの形態を提供する。この形態と、取り扱い、製造及びスケールアップの容易性とによって、本システムは、肝臓疾患のある患者の短期維持システムとしての興味ある候補となる。
実験II in-vivo結果
上記に述べたBALは、in-vivoラットモデルでテストされた。使用されたラットの集団は3つのグループに分割した。
a． 参照群１：一回だけ注入を受けた肝臓虚血（LIS）ラット
b． 参照群２：全BAL系に結合されているが肝細胞を持たないLISラット、この参照は、生存に及ぼす血しょう分離交換法の影響（潜在的マイナス効果）及び多量の身体外循環の影響（トキシンの希釈による潜在的にプラスの効果）を研究するために実施された。
c． 豚肝細胞を持つBALに結合されたLISラット
結論
ラットは生存についてテストされた。参照グループ１及び２の間で生存率に差は見られなかった（夫々5.9±2.0時間及び5.5±1.6時間、n=8）。身体外循環は生存に重篤な影響を与えない。参照群と比較して、肝細胞を含むBAL系で処理されたLISラットは二倍長く生存した（11.0±2.2時間、n=5）。
これは先行技術では得られない顕著な結果である。特にその理由は下記である
a．使用されたモデルは、非常に攻撃的である。ラットの肝臓は、完全に除去されたという事実は別として、ラットの循環系中に虚血肝臓からトキシンが漏出し、それは更に、テスト動物の状態に不利な効果をもたらす。これは臨床的状況に一致する。
b． ラットは同種起源の肝細胞によって処置されたのではなく豚の肝細胞で処置されてきた。これも臨床状況に一致する。

Claims (13)

1. スペースを取り囲む壁を具備するバイオリアクターであって：前記スペースは、
   （ａ）多孔性度の高いシート若しくはマットの形態である３Ｄマトリックからなる細胞培養のための固相支持体であって、前記３Ｄマトリックは、生理学的に許容可能な繊維のネットワークまたは生理学的に許容可能な開いた気泡構造を具備する固相支持体と、
   （ｂ）ガス状酸素を供給し、且つガス状二酸化炭素を除去するための導管と
   を具備しており、
   前記導管は、疎水性材料製で且つ0.1〜1.0mmの外径を有する中空糸であり、該中空糸は前記３Ｄマトリックス材料の全体に亘って均一に分布しており、且つ個々の中空糸の間の距離が0.1〜5mmであるバイオリアクター。
2. 請求項１に記載のバイオリアクターであって、前記中空糸が、前記マトリックス材料の一端から他端へと平行に走るように配置されているバイオリアクター。
3. 請求項１または２に記載のバイオリアクターであって、更に、前記中空糸に動作可能に結合された少なくとも一つのガス入り口および少なくとも一つのガス出口を含んだバイオリアクター。
4. 請求項１〜３の何れか１項に記載のバイオリアクターであって、前記中空糸は、前記糸を前記マトリックスシート若しくはマットに編み込むこと、前記糸を前記マトリックスシート若しくはマットに接着すること、前記糸を前記マトリックスシート若しくはマットに縫い付けること、または前記糸を超音波により前記マトリックスシート若しくはマットに結合することによって、前記マトリックスシート若しくはマットに取り付けられるバイオリアクター。
5. 請求項１〜４の何れか１項に記載のバイオリアクターであって、前記固相支持体は、少なくとも一つの巻かれたまたは折り畳まれたシート若しくはマット、または少なくとも二つの積み重ねられたシート若しくはマットの形態で存在するバイオリアクター。
6. 請求項１〜５の何れか１項に記載のバイオリアクターからなるバイオ人工肝臓システムであって、前記バイオリアクターがヒトまたは動物由来の肝臓細胞を含んでなるバイオ人工肝臓システム。
7. 請求項６に記載のバイオ人工肝臓システムであって、前記細胞が、初代肝細胞、不死化された肝臓細胞、肝臓細胞形質転換体、ヘパトーマ細胞、肝芽細胞、およびこれらから誘導された細胞株からなる群から選択されるバイオ人工肝臓システム。
8. 請求項７に記載のバイオ人工肝臓システムであって、前記細胞が冷凍保存されているバイオ人工肝臓システム。
9. 肝臓細胞を維持および／または培養するための方法であって、請求項１〜５の何れか１項に記載のバイオリアクターの前記スペースの中に前記細胞を導入して、前記細胞を前記固相支持体に付着させることと、前記中空糸を通してガス状酸素または酸素を含有するガスを供給しながら、これら細胞を生理学的に許容可能な条件下に維持することとを含んでなる方法。
10. 請求項９に記載の方法であって、前記細胞が前記バイオリアクターのスペースの中に導入された後に、前記細胞が前記固相支持体に付着するのを可能にするのに充分な時間だけ前記リアクターを内部または外部の長手軸の回りで回転させることによって、前記細胞が前記バイオリアクターの中に配置された前記固相支持体上に固定される方法。
11. 請求項１０に記載の方法であって、前記肝細胞が、初代肝細胞、不死化された肝臓細胞、肝臓細胞形質転換体、ヘパトーマ細胞、肝芽細胞、およびこれらから誘導された細胞株からなる群から選択される方法。
12. 液状またはガス状の媒質中で物質を製造し、生体内変換し、および／または前記媒質から前記物質を除去するためのインビトロ方法であって、前記媒質を、請求項６〜８の何れか１項に記載のバイオ人工肝臓システムの前記スペース中に存在する細胞に接触させることを含んでなる方法。
13. 請求項１２に記載の方法であって、前記液状またはガス状の媒質が血液または血漿である方法。

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