JPH07298876A - 通液性細胞培養担体と、この担体を用いる培養方法お よび培養装置 - Google Patents
通液性細胞培養担体と、この担体を用いる培養方法お よび培養装置Info
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 複数の天然または合成の糸および／または織
成体からなる通液性培養担体と、この担体上に細胞を接
着し、増殖させる培養方法。およびこの通液性培養担体
を用いた培養装置。 【効果】 動物細胞を、それが由来する生体組織または
器官と同様に自己組織形成するように長期間高生存率で
三次元培養することが可能となる。
成体からなる通液性培養担体と、この担体上に細胞を接
着し、増殖させる培養方法。およびこの通液性培養担体
を用いた培養装置。 【効果】 動物細胞を、それが由来する生体組織または
器官と同様に自己組織形成するように長期間高生存率で
三次元培養することが可能となる。
Description
【産業上の利用分野】この発明は、通液性細胞培養担体
と、この担体を用いた動物細胞の培養方法および培養装
置に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、
接着もしくは非接着細胞を三次元培養するための培養担
体と、生体に近い状態での細胞の培養方法、およびその
ための装置に関するものであり、動物個体の特定器官の
モデル体として、たとえばハイブリッド型人工臓器の開
発や、動物実験代替法としての新たな薬効および毒性評
価の開発に極めて有用な培養手段に関するものである。
と、この担体を用いた動物細胞の培養方法および培養装
置に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、
接着もしくは非接着細胞を三次元培養するための培養担
体と、生体に近い状態での細胞の培養方法、およびその
ための装置に関するものであり、動物個体の特定器官の
モデル体として、たとえばハイブリッド型人工臓器の開
発や、動物実験代替法としての新たな薬効および毒性評
価の開発に極めて有用な培養手段に関するものである。
【従来の技術】従来より、様々な医療技術や医薬品の開
発等を目的として、種々の動物実験や細胞培養実験が行
なわれてきている。しかしながら、動物や培養細胞を用
いた実験は、ヒトの全身または各種器官のモデル実験と
しては完全なものではなく、それぞれに問題点を有して
いる。たとえば動物実験の場合には、目的の作用につい
ての全身応答が解析可能であるという利点の反面、ヒト
と動物の種差により、得られた結果に対する信頼性が必
ずしも満足できるものではなかったり、あるいは多くの
動物を犠牲にしなければならないなどの欠点を有してい
る。一方、細胞培養実験の場合には、ヒトの細胞や、ま
た場合によっては患者自身の細胞を培養して目的の作用
を直接検討できるという利点があるが、通常の細胞培養
は二次元平面培養であるため、多くの細胞が立体的に擬
集している生体器官とは、組織形態だけでなく機能の発
現においても大きな差異が存在する。このような理由か
ら、近年、ヒトを含めた動物の組織細胞を三次元的に培
養し、培養細胞によって生体の器官様構造体を再構築し
ようとする試みが検討されはじめており、そのための三
次元細胞培養方法として、細胞をコラーゲンゲル内に包
埋して三次元的に培養する方法や、あるいはこの発明の
発明者らが開発した温度感受性ポリマー含有培養基質を
用いるスフェロイド形成法が知られている。
発等を目的として、種々の動物実験や細胞培養実験が行
なわれてきている。しかしながら、動物や培養細胞を用
いた実験は、ヒトの全身または各種器官のモデル実験と
しては完全なものではなく、それぞれに問題点を有して
いる。たとえば動物実験の場合には、目的の作用につい
ての全身応答が解析可能であるという利点の反面、ヒト
と動物の種差により、得られた結果に対する信頼性が必
ずしも満足できるものではなかったり、あるいは多くの
動物を犠牲にしなければならないなどの欠点を有してい
る。一方、細胞培養実験の場合には、ヒトの細胞や、ま
た場合によっては患者自身の細胞を培養して目的の作用
を直接検討できるという利点があるが、通常の細胞培養
は二次元平面培養であるため、多くの細胞が立体的に擬
集している生体器官とは、組織形態だけでなく機能の発
現においても大きな差異が存在する。このような理由か
ら、近年、ヒトを含めた動物の組織細胞を三次元的に培
養し、培養細胞によって生体の器官様構造体を再構築し
ようとする試みが検討されはじめており、そのための三
次元細胞培養方法として、細胞をコラーゲンゲル内に包
埋して三次元的に培養する方法や、あるいはこの発明の
発明者らが開発した温度感受性ポリマー含有培養基質を
用いるスフェロイド形成法が知られている。
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
三次元細胞培養法であるコラーゲンゲル培養法やスフェ
ロイド形成法の場合には、培養細胞の三次元構造体が大
きくなるにつれて、内側の細胞に栄養分を供給すること
が困難になり、また、同時にそれらの細胞の分泌する細
胞代謝物（有益な生理活性物質と有害となる老廃物）を
外側へ放出することができなくなる。このため、従来方
法で構築した細胞の三次元構造体の場合には、培養時間
が長くなるに従って、内側の細胞が壊死してしまうとい
う欠点を有していた。このような問題を解決するための
手段として、この発明の発明者は、すでに、実質的に、
植物由来の繊維状分岐体からなる培養担体とこれを用い
る動物細胞の培養方法をすでに提案している。この担体
は、より具体的には、たとえば発芽培養した植物種子よ
り単離した繊維状根からのものを活用するものである。
この担体により、より生体に近い状態での三次元培養を
可能としたものである。だが、その後の検討において、
よりその製造や取扱いが容易で、しかも三次元培養とし
ての優れた性能を持つ培養担体の開発が望まれていたこ
とから、この発明の発明者により継続して新しい培養担
体とこれを用いた培養方法の探索と検討が進められてい
た。この発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたも
のであり、従来方法およびそれに用いる培養基質の欠点
を解消し、動物細胞が三次元的に増殖して、かつ高い生
存率で自己組織形成することのできるさらに新しい培養
担体と、この担体を用いた細胞の新しい培養方法および
そのための装置を提供することを目的としている。
三次元細胞培養法であるコラーゲンゲル培養法やスフェ
ロイド形成法の場合には、培養細胞の三次元構造体が大
きくなるにつれて、内側の細胞に栄養分を供給すること
が困難になり、また、同時にそれらの細胞の分泌する細
胞代謝物（有益な生理活性物質と有害となる老廃物）を
外側へ放出することができなくなる。このため、従来方
法で構築した細胞の三次元構造体の場合には、培養時間
が長くなるに従って、内側の細胞が壊死してしまうとい
う欠点を有していた。このような問題を解決するための
手段として、この発明の発明者は、すでに、実質的に、
植物由来の繊維状分岐体からなる培養担体とこれを用い
る動物細胞の培養方法をすでに提案している。この担体
は、より具体的には、たとえば発芽培養した植物種子よ
り単離した繊維状根からのものを活用するものである。
この担体により、より生体に近い状態での三次元培養を
可能としたものである。だが、その後の検討において、
よりその製造や取扱いが容易で、しかも三次元培養とし
ての優れた性能を持つ培養担体の開発が望まれていたこ
とから、この発明の発明者により継続して新しい培養担
体とこれを用いた培養方法の探索と検討が進められてい
た。この発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたも
のであり、従来方法およびそれに用いる培養基質の欠点
を解消し、動物細胞が三次元的に増殖して、かつ高い生
存率で自己組織形成することのできるさらに新しい培養
担体と、この担体を用いた細胞の新しい培養方法および
そのための装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、複数の天然または合成の糸およ
び／またはその織成体からなることを特徴とする通液性
細胞培養担体を提供する。また、この発明は、この担体
を培養容器に装入し、担体に通液して細胞を培養する細
胞培養方法や、この担体とともに、担体を装入する培養
容器および通液のための供給手段とを有し、担体がこの
通液供給手段に接続されていることを特徴とする細胞培
養装置をも提供する。さらに詳しく説明すると、まず、
この発明の細胞培養担体については、たとえば綿、絹等
の天然の、もしくはナイロン、アクリル、ポリエステル
等の合成の糸の複数のものによって、あるいはこれらの
糸の織成体によって構成する。この場合の織成体につい
ては、たとえばメッシュ体、ガーゼ状体等とすることが
できる。これらの糸は数１０〜数１００μｍ径程度のも
の、あるいはそれ以外のものの適宜な組合わせにより構
成することができる。糸および／または織成体について
は、複数種のもの、あるいは糸の径や織成体の開口メッ
シュの大きさ等の物理的形状や性質の異なる複数のもの
を適宜に用いることができる。いずれのものにおいて
も、三次元培養のための空間形状が形成できるようにす
る。メッシュ体の場合には、この形状があらかじめ保持
されていることになる。もちろん、メッシュ体について
も複数枚のものを用いてもよいことは言うまでもない。
たとえばメッシュ体については、そのメッシュ開口を、
１０〜１０００μｍ程度、とくに２００〜４００μｍ程
度にしたもの等が良好に使用されることになる。通液の
ための吸水性の点においては、合成糸、その織成体より
も天然糸、その織成体はより大きく、なかでも絹は、綿
よりも約１．５倍も大きい。このような資質をも考慮し
て、対象とする細胞やその培養条件等を考えて担体を適
宜に構成することが可能となる。また、メッシュ体等の
織成体からなるこの発明の培養担体は、生体吸収性とす
ることも有効である。生体中において細胞培養し、か
つ、培養担体は吸収消失させることができ、医療用等と
して極めて有用となる。これらの担体使用に際しては、
アスコルビン酸を培養液に添加して細胞の増殖や多層化
（三次元）を促進することができ、細胞に対する直接的
担体として、担体に細胞接着能を付与することもでき
る。この場合には、細胞外マトリックス、ゼラチン、レ
クチン、イガイ由来の接着蛋白質、ポリリジン、接着性
オリゴペプチド、および／またはトロンボスポンジン等
により細胞接着能を付与するための手段が採用される。
細胞外マトリックスとしては、コラーゲン、フィブロネ
クチン、ビトロネクチン、ラミニン、プロテオグリカ
ン、グリコサミノグリカン等が適宜に使用される。この
ような担体については、通液性細胞培養担体上で細胞接
着能を付与した部分に、細胞を局所的に接着できるよう
にすることも有効である。さらに、この発明では、２種
類以上の細胞を通液性細胞培養担体上に同時に播種した
場合、それぞれの細胞種は自らが、より適した細胞接着
能が付与されている部分に選択的に接着するようにでき
る。また、細胞に対する間接的担体として、つまり細胞
外マトリックス担体として使用することもできる。この
場合には、たとえばコラーゲンゲルやマトリゲル（商品
名）等の細胞外マトリックス構成成分含有ゲル内包埋に
より対応することが可能となる。この発明の培養方法で
は、上記培養担体を固定した培養容器に、たとえば培養
液に懸濁した接着依存性の動物細胞を播種することによ
り、この担体上に動物細胞を接着、伸展、増殖、多層化
（三次元化）することが可能となる。動物細胞は、ヒト
を含めたあらゆる種の体組織または器官から採取したも
のを用いることができる。また、これらの細胞は、組織
や器官から直接採取した初代細胞でもよく、あるいは、
それらを何代か継代させたものでもよい。さらに、動物
細胞は、間葉系および／または上皮系の正常細胞でも、
同様に間葉系および／または上皮系の癌細胞等の疾患組
織細胞でもよい。たとえば、ホモおよびヘテロ細胞培養
として、間葉系細胞および／または皮膚、肝、がん等の
上皮系細胞等を対象として培養することが例示される。
もちろん、対象細胞はこれらに全く限定されない。培養
担体上に接着した細胞は、その担体に沿って伸展、移
動、分裂しながら増殖、多層化（三次元化）する。そし
て、この発明の培養方法では、上記の通液性細胞培養担
体を介して担体上およびその周囲の培養細胞に培養液を
供給する。このため、長期間の培養により細胞数が増加
した場合にも、内側の細胞が壊死するのを防ぐことがで
きるとともに、内側の細胞のみならず、全構成細胞か
ら、経時的に細胞代謝物（有益な生理活性物質、かつ／
または有害な老廃物）を循環培養液中に回収することが
できる。この担体は、生体組織における毛細血管と同様
の機能を有していることになる。このような培養担体と
培養細胞の集合とからなる多細胞性擬集塊は、形態的に
も、機能発現の点からも生体器官のすぐれたモデルとな
り、人工臓器の開発や新薬の薬効または毒性評価系の開
発、個人レベルでの抗癌剤の選択と癌の転移能評価等に
おいて経時的代謝物を回収測定できることも加え極めて
有用な材料となる。さらに、このような培養担体（特に
メッシュ状の絹）と培養細胞の集合とからなる多細胞性
凝集塊は、熱傷や褥瘡などの創傷治療用の移植体として
応用も可能と考えられる。その場合、絹は、生体非吸収
性の手術用縫合糸として使われていることからも、生体
内安全性は確保されている。培養装置としての構成に
は、上記のこの発明の通液性細胞培養担体を使用する限
りは特に限定はないが、たとえば通液供給手段には、支
持体に立設支持された、もしくは支持体を用いずに培養
容器に取付けたピペット状体もしくはスポイト状体を使
用することや、この供給手段にポンプを備えてもよい。
より簡便な実験室的装置としては、たとえば図１および
図２に例示したように構成することができる。すなわ
ち、たとえば図１に例示したように、メッシュ体からな
るこの発明の通液性担体（１）を培養容器（２）に装入
し、この容器（２）には、接着剤（３）によりピペット
状通液供給手段（４）を接着する。通液性担体（１）
は、その端部がこの供給手段（４）の開口端に挿入さ
れ、上方へ伸びる糸状部（５）によって、これらの引上
げ、もしくは緩和で、この開口端での担体の絞りによっ
て通液量をコントロールできるようにしている。培養液
（６）は、供給手段から担体へと通液されることにな
る。図２の場合には、通液供給手段（４）を支持体
（７）によって支持している。この通液手段（４）は、
分割部（７１）の分離で装着脱自在ともしている。もち
ろん、この簡易型装置にこの発明の装置が限定されるこ
とはない。以下、実施例を示してこの発明をさらに詳細
かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定さ
れるものではない。
を解決するものとして、複数の天然または合成の糸およ
び／またはその織成体からなることを特徴とする通液性
細胞培養担体を提供する。また、この発明は、この担体
を培養容器に装入し、担体に通液して細胞を培養する細
胞培養方法や、この担体とともに、担体を装入する培養
容器および通液のための供給手段とを有し、担体がこの
通液供給手段に接続されていることを特徴とする細胞培
養装置をも提供する。さらに詳しく説明すると、まず、
この発明の細胞培養担体については、たとえば綿、絹等
の天然の、もしくはナイロン、アクリル、ポリエステル
等の合成の糸の複数のものによって、あるいはこれらの
糸の織成体によって構成する。この場合の織成体につい
ては、たとえばメッシュ体、ガーゼ状体等とすることが
できる。これらの糸は数１０〜数１００μｍ径程度のも
の、あるいはそれ以外のものの適宜な組合わせにより構
成することができる。糸および／または織成体について
は、複数種のもの、あるいは糸の径や織成体の開口メッ
シュの大きさ等の物理的形状や性質の異なる複数のもの
を適宜に用いることができる。いずれのものにおいて
も、三次元培養のための空間形状が形成できるようにす
る。メッシュ体の場合には、この形状があらかじめ保持
されていることになる。もちろん、メッシュ体について
も複数枚のものを用いてもよいことは言うまでもない。
たとえばメッシュ体については、そのメッシュ開口を、
１０〜１０００μｍ程度、とくに２００〜４００μｍ程
度にしたもの等が良好に使用されることになる。通液の
ための吸水性の点においては、合成糸、その織成体より
も天然糸、その織成体はより大きく、なかでも絹は、綿
よりも約１．５倍も大きい。このような資質をも考慮し
て、対象とする細胞やその培養条件等を考えて担体を適
宜に構成することが可能となる。また、メッシュ体等の
織成体からなるこの発明の培養担体は、生体吸収性とす
ることも有効である。生体中において細胞培養し、か
つ、培養担体は吸収消失させることができ、医療用等と
して極めて有用となる。これらの担体使用に際しては、
アスコルビン酸を培養液に添加して細胞の増殖や多層化
（三次元）を促進することができ、細胞に対する直接的
担体として、担体に細胞接着能を付与することもでき
る。この場合には、細胞外マトリックス、ゼラチン、レ
クチン、イガイ由来の接着蛋白質、ポリリジン、接着性
オリゴペプチド、および／またはトロンボスポンジン等
により細胞接着能を付与するための手段が採用される。
細胞外マトリックスとしては、コラーゲン、フィブロネ
クチン、ビトロネクチン、ラミニン、プロテオグリカ
ン、グリコサミノグリカン等が適宜に使用される。この
ような担体については、通液性細胞培養担体上で細胞接
着能を付与した部分に、細胞を局所的に接着できるよう
にすることも有効である。さらに、この発明では、２種
類以上の細胞を通液性細胞培養担体上に同時に播種した
場合、それぞれの細胞種は自らが、より適した細胞接着
能が付与されている部分に選択的に接着するようにでき
る。また、細胞に対する間接的担体として、つまり細胞
外マトリックス担体として使用することもできる。この
場合には、たとえばコラーゲンゲルやマトリゲル（商品
名）等の細胞外マトリックス構成成分含有ゲル内包埋に
より対応することが可能となる。この発明の培養方法で
は、上記培養担体を固定した培養容器に、たとえば培養
液に懸濁した接着依存性の動物細胞を播種することによ
り、この担体上に動物細胞を接着、伸展、増殖、多層化
（三次元化）することが可能となる。動物細胞は、ヒト
を含めたあらゆる種の体組織または器官から採取したも
のを用いることができる。また、これらの細胞は、組織
や器官から直接採取した初代細胞でもよく、あるいは、
それらを何代か継代させたものでもよい。さらに、動物
細胞は、間葉系および／または上皮系の正常細胞でも、
同様に間葉系および／または上皮系の癌細胞等の疾患組
織細胞でもよい。たとえば、ホモおよびヘテロ細胞培養
として、間葉系細胞および／または皮膚、肝、がん等の
上皮系細胞等を対象として培養することが例示される。
もちろん、対象細胞はこれらに全く限定されない。培養
担体上に接着した細胞は、その担体に沿って伸展、移
動、分裂しながら増殖、多層化（三次元化）する。そし
て、この発明の培養方法では、上記の通液性細胞培養担
体を介して担体上およびその周囲の培養細胞に培養液を
供給する。このため、長期間の培養により細胞数が増加
した場合にも、内側の細胞が壊死するのを防ぐことがで
きるとともに、内側の細胞のみならず、全構成細胞か
ら、経時的に細胞代謝物（有益な生理活性物質、かつ／
または有害な老廃物）を循環培養液中に回収することが
できる。この担体は、生体組織における毛細血管と同様
の機能を有していることになる。このような培養担体と
培養細胞の集合とからなる多細胞性擬集塊は、形態的に
も、機能発現の点からも生体器官のすぐれたモデルとな
り、人工臓器の開発や新薬の薬効または毒性評価系の開
発、個人レベルでの抗癌剤の選択と癌の転移能評価等に
おいて経時的代謝物を回収測定できることも加え極めて
有用な材料となる。さらに、このような培養担体（特に
メッシュ状の絹）と培養細胞の集合とからなる多細胞性
凝集塊は、熱傷や褥瘡などの創傷治療用の移植体として
応用も可能と考えられる。その場合、絹は、生体非吸収
性の手術用縫合糸として使われていることからも、生体
内安全性は確保されている。培養装置としての構成に
は、上記のこの発明の通液性細胞培養担体を使用する限
りは特に限定はないが、たとえば通液供給手段には、支
持体に立設支持された、もしくは支持体を用いずに培養
容器に取付けたピペット状体もしくはスポイト状体を使
用することや、この供給手段にポンプを備えてもよい。
より簡便な実験室的装置としては、たとえば図１および
図２に例示したように構成することができる。すなわ
ち、たとえば図１に例示したように、メッシュ体からな
るこの発明の通液性担体（１）を培養容器（２）に装入
し、この容器（２）には、接着剤（３）によりピペット
状通液供給手段（４）を接着する。通液性担体（１）
は、その端部がこの供給手段（４）の開口端に挿入さ
れ、上方へ伸びる糸状部（５）によって、これらの引上
げ、もしくは緩和で、この開口端での担体の絞りによっ
て通液量をコントロールできるようにしている。培養液
（６）は、供給手段から担体へと通液されることにな
る。図２の場合には、通液供給手段（４）を支持体
（７）によって支持している。この通液手段（４）は、
分割部（７１）の分離で装着脱自在ともしている。もち
ろん、この簡易型装置にこの発明の装置が限定されるこ
とはない。以下、実施例を示してこの発明をさらに詳細
かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定さ
れるものではない。
（実施例１：三次元通液性動物細胞培養装置の作製）日
本薬局方収載の滅菌ガーゼタイプIII （ケーパイン、川
本繃帯材料（株）製）を、無菌的に約２．０×１０．０
ｃｍの大きさに切断して、長端の片側を約１．０ｃｍ折
り返した。そして、折り返し末端の中央部分に、滅菌済
み約３０ｃｍの４号絹製手術用縫合糸（（株）村瀬縫合
糸製）を無菌的に結びつけた。この縫合糸を、滅菌済み
ポリプロピレン製スポイト（Falcon＃７５７５）の手つ
まみ末端を無菌的に切断し管状としたものの吸い上げ末
端より通して、手つまみ末端側に縫合糸を引っ張り上げ
ることで、吸い上げ側の細い管状部分に上述のガーゼの
一部を挿入固定する。これを、図２の構成となるよう
に、アクリル板で作製し７０％エタノールで滅菌した支
持体に、縫合糸が上側でガーゼが下側となるようにスポ
イトの管部を垂直に固定した。そして、手つまみ末端側
より、管内部に約５．０ｍｌの細胞培養液* （１０％牛
胎児血清、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００units ／ｍｌペ
ニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有ダ
ルベッコ改変イーグル培地）を満たすと、培養液はガー
ゼを構成する綿糸にまず吸水され、ガーゼ全体に分布
し、徐々に重力に従いガーゼを通液性媒体として数時間
で完全に落下した。なお、単位時間当たりの通液量は、
吸い上げ部のガーゼ挿入強度を変えることで調節できる
（０．５〜５．０ｍｌ／ｈｒで確認済み）。この装置
は、以下の実施例で具体的に動物細胞の培養方法を示す
ように、通液性ガーゼの周囲に動物細胞を三次元状態で
培養することを提供する。 （実施例２：通液性ガーゼ上での動物細胞の三次元培養
法）実施例１で作製した、縫合糸付きガーゼを挿入固定
した手つまみ末端切断スポイトを、疎水性ポリスチレン
性培養用シャーレ（φ３５ｍｍ：Falcon＃１００８）の
内壁にシリコンで垂直に固定し、シャーレ底面より余分
なガーゼを切断して、紫外線滅菌した。このシャーレ底
面上のガーゼ部分（約２．０×２．０ｃｍ）に、約０．
３ｍｌの０．５％Ｉ型コラーゲン水溶液（CELLGEN I-P
C、（株）高研製）を塗布して無菌的に風乾すること
で、このガーゼ部分をシャーレ底面に伸展接着すると共
に細胞付着能を与えた。このシャーレ内に、２ｍｌの細
胞培養液*に懸濁したヒト真皮由来線維芽細胞を終濃度
を３．３×１０5 個／シャーレで播種し、５％ＣＯ2 、
９５％空気、３７℃の保湿インキュベータ内で培養し
た。培養１日目に、０．１ｍＭＬ−アスコルビン酸リン
酸エステルマグネシウム塩（和光純薬工業（株）製）含
有の細胞培養液に培地交換し、以降２日毎にこの培地で
培地交換して、ガーゼメッシュ上で細胞を多層状態に増
殖させた（図３写真：培養８日目位相差）。培養１０日
目に、シリコン固定部をメスで破壊しスポイトごと物理
的に取り出すと、細胞はガーゼメッシュ上で多層化して
いた（図４写真：培養１０日目取り出し後の位相差）。
これを、実施例１のアクリル板支持体にガーゼメッシュ
上の多層化細胞が気相でガーゼ下端がシャーレ内細胞培
養液に浸るように、スポイトの管部を垂直に固定した。
そして、スポイトの管内部にこの培地を満たして、およ
そ１．０ｍｌ／ｈｒで通液することで、細胞をガーゼ周
囲に三次元的に増殖維持した。 （比較例１）実施例２に於いて、培養１日目以降もＬ−
アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩を含まな
い通常の細胞培養液を用いて２日毎に培地交換しても、
細胞はガーゼメッシュ上に多層化増殖することなく、ガ
ーゼメッシュ間で単相コンフルエントとなった（図５写
真：培養８日目位相差）。培養１０日目に、シリコン固
定部をメスで破壊しスポイトごと物理的に取り出すと、
ガーゼメッシュ上には細胞はほとんど付着していなかっ
た（図６写真：培養１０日目取り出し後の位相差）。こ
の結果から明らかなように、アスコルビン酸の添加によ
り、通液性細胞培養担体上に細胞増殖が多層化（三次元
化）されることがわかる。 （実施例３：通液性ガーゼ含有コラーゲンゲル内での動
物細胞の三次元培養法）実施例１で作成した縫合糸付き
ガーゼを挿入固定した手つまみ末端切断スポイトを、ア
クリル板支持体にスポイト管部を垂直に固定して、細胞
培養液* を予め通液することで湿らせたガーゼ部分を、
２ｍｌの０．２４％Ｉ型コラーゲン含有の細胞培養液に
懸濁したヒト真皮由来線維目細胞を終濃度３．３×１０
5 個／シャーレ（φ３５ｍｍ：Falcon＃１００８）で播
種した中に浸し入れて、５％ＣＯ2 、９５％空気、３７
℃の保湿インキュベータ内で培養することで、細胞と共
にコラーゲンゲル内に包埋した。培養３時間目には、コ
ラーゲンは完全にゲル化し半透明になっていたので、ピ
ンセットでシャーレとゲルの間を分離し、２ｍｌの細胞
培養液を加えて、シャーレ内でガーゼ含有ゲルを浮遊さ
せて培養を続けた。培養１日目以降は、ガーゼ含有ゲル
が気相でガーゼ下端がシャーレ内細胞培養液に浸るよう
に、アクリル板支持体にスポイトの管部を垂直に固定し
て、スポイトの管内部にこの培養液を満たし、およそ
１．０ｍｌ／ｈｒで通液することで、ガーゼ含有ゲル内
で三次元的に配置した細胞を維持した。なお、周囲のガ
ーゼを含まないゲルは徐々に収縮凝集したが、通液性ガ
ーゼを含むゲル部分は物理的に収縮が阻害された。培養
１０日目でさえも、通液性ガーゼを含むゲル部分の細胞
は、ゲル内で伸展しており良好な細胞形態が位相差顕微
鏡で観察できた（図７写真：培養１０日目位相差）。 （比較例２）２ｍｌの０．２４％ｌ型コラーゲン含有の
細胞培養液に懸濁したヒト真皮由来線維芽細胞を終濃度
を３．３×１０5 個／シャーレ（φ３５ｍｍ：Falcon＃
１００８）で播種して、５％ＣＯ2 、９５％空気、３７
℃の保湿インキュベータ内で培養することで、細胞をコ
ラーゲンゲル内に包埋した。培養３時間目には、コラー
ゲンは完全にゲル化し半透明になっていたので、ピンセ
ットでシャーレとゲルの間を分離し、２ｍｌの細胞培養
液を加えて、シャーレ内でゲルを浮遊させて培養を続け
た。その後は、細胞培養液を２日毎に交換して培養を続
けた。ゲルは、徐々に収縮凝集して培養１０日目には、
平均直径約７ｍｍの円盤形となった。また、ゲル内の細
胞は、培養６時間目には伸展しており良好な細胞形態を
示した。（図８：培養６時間目位相差）が、培養４日目
にはゲル収縮のため良好な細胞形態は位相差顕微鏡では
観察できなかった（図９：培養４日目位相差）。 （実施例４ ガーゼ担体による培養）約２×２ｃｍの大
きさのガーゼを予め細胞培養液で湿らせ、２ｍｌの０．
２４％ｌ型コラーゲン含有の細胞培養液に懸濁したヒト
真皮由来線維芽細胞を終濃度３．３×１０5 個／シャー
レ（φ３５ｍｍ：Falcon＃１００８）で播種した中に浸
し入れて、５％ＣＯ2 、９５％空気、３７℃の保湿イン
キュベータ内で培養することで、細胞と共にコラーゲン
ゲル内に包埋した。培養３時間目には、コラーゲンは完
全にゲル化し半透明になっていたので、ピンセットでシ
ャーレとゲルの間を分離し、２ｍｌの細胞培養液を加え
て、シャーレ内でゲルを浮遊させて培養を続けた。その
後は、細胞培養液を２日毎に交換して培養を続けた。周
囲のガーゼを含まないゲルは徐々に収縮凝集したが、ガ
ーゼを含むゲル部分は物理的に収縮が阻害されて、培養
１０日目には、平均直径約２５ｍｍの円盤形となった。
また、ガーゼを含むゲル部分の細胞は、培養６時間目に
は伸展しており良好な細胞形態を示し（図１０写真：培
養６時間目位相差）、培養１０日目でさえも、伸展して
おり良好な細胞形態が位相差顕微鏡で観察できた（図１
１写真：培養１０日目位相差）。 （実施例５ 三次元培養装置）さらに、日本薬局方収載
の滅菌ガーゼタイプIII （ケーパイン、川本繃帯材料
（株）製）を、無菌的に図１２に示すような形（固定の
ための突出部を有する直径５．０ｃｍの円形）に切断し
た（図１３）。この切断したガーゼの突出部を、滅菌延
長チューブ（サフィードＳＦ−ＥＴ５５２７ 長さ７．
５ｃｍ 内容量５．５ｍｌ テルモ（株）製、図１４）
の先端サックを無菌的に切断して（図１５）挿入はめ込
み固定した後、チューブを３〜１０ｍｍ残して無菌的に
切断することで、ガーゼ固定チューブ先端を作製した
（図１６）。容量５０ｍｌの滅菌済コニカルチューブ
（Falcon＃２０７０）のキャップに直径約７ｍｍの円形
の孔を開け、この孔に滅菌延長チューブの先端サックを
無菌的に切断したもの（図１７）を挿入はめ込み固定し
（図１８）、さらにこの先端に上述のガーゼ固定チュー
ブ先端のチューブ部を挿入固定した（図１９）。その
後、コニカルチューブ本体を装着した（図２０）。この
延長チューブを定量送液ポンプ（ＭＰ−３Ａ、（株）東
京理化製）に装着し、ガーゼの固定してない末端を細胞
培養液の満ちたビンに入れて、ガーゼ固定末端側へ培養
液を送液すると、培養液はガーゼを構成する線糸に吸収
されてガーゼ全体に分布し、徐々に過剰となった培養液
は、ガーゼを通液性媒体として落下し、コニカルチュー
ブ内に満ちた。なお、単位時間当たりの培養液の通液量
は、定量送液ポンプのダイアルを調節すること、延
長チューブ内径の異なるものを用いること、もしくは、
定量送液ポンプの内部ギアを交換することで、１０μ
ｌ〜３．３ｍｌ／ｍｉｎの範囲で正確に制御できる。さ
らに、前記のコニカルチューブのキャップに直径約４ｍ
ｍの円形の孔を開け、この孔に適当な長さに無菌的に切
断した滅菌液のプラスチックピペット（Falcon＃７５２
０、規格１ｍｌ）を挿入した（図２１）後に、このキャ
ップに上述のごとくガーゼを装置して、ガーゼの固定し
てないチューブ末端をピペットの上端に装置すれば、１
つのコニカルチューブ内で培養液を循環することができ
る（図２２）。 （実施例６：動物細胞の三次元培養法）疎水性ポリスチ
レン性培養用シャーレ（φ６０ｍｍ：Falcon＃１００
７）に、実施例５で作製した突出部付円形（直径５．０
ｃｍ）ガーゼを入れて、この円形ガーゼ部分に、約０．
８ｍｌの０．２５％Ｉ型コラーゲン水溶液（CELLEGEN
Ｉ−ＰＣ、（株）高研製）を塗布して無菌的に風乾する
ことで、このガーゼ部分をシャーレ底面に伸展接着する
と共に細胞付着能を与えた。さらに必要に応じてガーゼ
付着シャーレ底面に紫外線（短波長２５４ｎｍ）を約３
０分間照射した。このシャーレ内に、０．１ｍＭ Ｌ−
アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩（和光純
薬工業（株）製）含有の細胞培養液５．０ｍｌに懸濁し
たヒト真皮由来線維芽細胞を終濃度８．０×１０5 個／
シャーレで播種し、５％ＣＯ2 、９５％空気、３７℃の
保湿インキュベータ内で培養した。２日毎に同じ新鮮な
培地に培地交換して、培養１０日目までガーゼメッシュ
上で細胞を多層状態に増殖させた（図２３位相差写
真）。培養１０日目に、ガーゼ突出部をピンセットで物
理的に摘み上げることで、ガーゼメッシュ上で多層増殖
した細胞をシャーレから脱着した。ガーゼを脱着したシ
ャーレには細胞はほとんど残らず（図２４位相差写
真）、ほとんど全ての細胞は脱着したガーゼに付着して
いた（図２５位相差写真）。この多層増殖した細胞が付
着したガーゼを、実施例５で作製した通液装置に装着
し、同様の培養液１０ｍｌを用いて、約０．８ｍｌ／ｍ
ｉｎの流速で循環通液しながら、５％ＣＯ2 、９５％空
気、３７℃の保湿インキュベータ内で培養した（図２
６、図２７）。２日毎に同じ新鮮な培地に培地交換し
て、３週間循環通液培養を行なった後、ガーゼ部を取り
出し、位相差顕微鏡観察したところ、各々の細胞は、細
いガーゼ繊維の周囲で巧みに自己組織形成能を発揮し、
全体的にガーゼ繊維が分布した多細胞性凝集塊を形成し
た（図２８位相差写真）。さらに、この多細胞性凝集塊
をホルマリンで固定し、脱水後、光顕用樹脂に包埋し
て、４μｍに薄切し、クマシーブルーとヘマトキシリン
の２重染色を行なうことで、内部組織形態の観察を行な
った。同じヒト真皮由来線維芽細胞で従来の技術を用い
て形成し、３週間培養した直径約６００μｍのスフェロ
イド（多細胞性球状凝集塊）と比較したところ、スフェ
ロイド内部には多数の核萎縮細胞や死細胞破片が見られ
る（図２９、図３０）のに対し、長径５ｍｍ以上短径約
２ｍｍのガーゼ含有多細胞性凝集塊断面にはほとんど核
萎縮細胞は見られず、細胞間にはクマシーブルー陽性の
線維の生合成が観察でき（図３１、図３２）、内部構成
細胞は極めて良好な生細胞活性を有していると考えられ
た。 （比較例３）実施例６に於いて、Ｌ−アスコルビン酸リ
ン酸マグネシウム塩を含まない通常の細胞培養液に細胞
を懸濁して同じ終濃度で播種し、２日毎に培地交換して
１０日間培養した。培養１０日目には、細胞はガーゼメ
ッシュ上に多層化増殖することなく、ガーゼメッシュ間
で単層コンフルエントとなった（図３３位相差写真）。
実施例６のようにガーゼ突出部をピンセットで摘みガー
ゼメッシュをシャーレから脱着したところ脱着したガー
ゼには、ほとんど細胞は付着することなく（図３４位相
差写真）、ガーゼを脱着した後のシャーレにほとんどの
細胞は残っていた（図３５位相差写真）。この結果から
明らかなように、アスコルビン酸の添加により、通液性
細胞培養担体上に細胞が増殖し多層化（三次元化）され
ることがわかる。
本薬局方収載の滅菌ガーゼタイプIII （ケーパイン、川
本繃帯材料（株）製）を、無菌的に約２．０×１０．０
ｃｍの大きさに切断して、長端の片側を約１．０ｃｍ折
り返した。そして、折り返し末端の中央部分に、滅菌済
み約３０ｃｍの４号絹製手術用縫合糸（（株）村瀬縫合
糸製）を無菌的に結びつけた。この縫合糸を、滅菌済み
ポリプロピレン製スポイト（Falcon＃７５７５）の手つ
まみ末端を無菌的に切断し管状としたものの吸い上げ末
端より通して、手つまみ末端側に縫合糸を引っ張り上げ
ることで、吸い上げ側の細い管状部分に上述のガーゼの
一部を挿入固定する。これを、図２の構成となるよう
に、アクリル板で作製し７０％エタノールで滅菌した支
持体に、縫合糸が上側でガーゼが下側となるようにスポ
イトの管部を垂直に固定した。そして、手つまみ末端側
より、管内部に約５．０ｍｌの細胞培養液* （１０％牛
胎児血清、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００units ／ｍｌペ
ニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有ダ
ルベッコ改変イーグル培地）を満たすと、培養液はガー
ゼを構成する綿糸にまず吸水され、ガーゼ全体に分布
し、徐々に重力に従いガーゼを通液性媒体として数時間
で完全に落下した。なお、単位時間当たりの通液量は、
吸い上げ部のガーゼ挿入強度を変えることで調節できる
（０．５〜５．０ｍｌ／ｈｒで確認済み）。この装置
は、以下の実施例で具体的に動物細胞の培養方法を示す
ように、通液性ガーゼの周囲に動物細胞を三次元状態で
培養することを提供する。 （実施例２：通液性ガーゼ上での動物細胞の三次元培養
法）実施例１で作製した、縫合糸付きガーゼを挿入固定
した手つまみ末端切断スポイトを、疎水性ポリスチレン
性培養用シャーレ（φ３５ｍｍ：Falcon＃１００８）の
内壁にシリコンで垂直に固定し、シャーレ底面より余分
なガーゼを切断して、紫外線滅菌した。このシャーレ底
面上のガーゼ部分（約２．０×２．０ｃｍ）に、約０．
３ｍｌの０．５％Ｉ型コラーゲン水溶液（CELLGEN I-P
C、（株）高研製）を塗布して無菌的に風乾すること
で、このガーゼ部分をシャーレ底面に伸展接着すると共
に細胞付着能を与えた。このシャーレ内に、２ｍｌの細
胞培養液*に懸濁したヒト真皮由来線維芽細胞を終濃度
を３．３×１０5 個／シャーレで播種し、５％ＣＯ2 、
９５％空気、３７℃の保湿インキュベータ内で培養し
た。培養１日目に、０．１ｍＭＬ−アスコルビン酸リン
酸エステルマグネシウム塩（和光純薬工業（株）製）含
有の細胞培養液に培地交換し、以降２日毎にこの培地で
培地交換して、ガーゼメッシュ上で細胞を多層状態に増
殖させた（図３写真：培養８日目位相差）。培養１０日
目に、シリコン固定部をメスで破壊しスポイトごと物理
的に取り出すと、細胞はガーゼメッシュ上で多層化して
いた（図４写真：培養１０日目取り出し後の位相差）。
これを、実施例１のアクリル板支持体にガーゼメッシュ
上の多層化細胞が気相でガーゼ下端がシャーレ内細胞培
養液に浸るように、スポイトの管部を垂直に固定した。
そして、スポイトの管内部にこの培地を満たして、およ
そ１．０ｍｌ／ｈｒで通液することで、細胞をガーゼ周
囲に三次元的に増殖維持した。 （比較例１）実施例２に於いて、培養１日目以降もＬ−
アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩を含まな
い通常の細胞培養液を用いて２日毎に培地交換しても、
細胞はガーゼメッシュ上に多層化増殖することなく、ガ
ーゼメッシュ間で単相コンフルエントとなった（図５写
真：培養８日目位相差）。培養１０日目に、シリコン固
定部をメスで破壊しスポイトごと物理的に取り出すと、
ガーゼメッシュ上には細胞はほとんど付着していなかっ
た（図６写真：培養１０日目取り出し後の位相差）。こ
の結果から明らかなように、アスコルビン酸の添加によ
り、通液性細胞培養担体上に細胞増殖が多層化（三次元
化）されることがわかる。 （実施例３：通液性ガーゼ含有コラーゲンゲル内での動
物細胞の三次元培養法）実施例１で作成した縫合糸付き
ガーゼを挿入固定した手つまみ末端切断スポイトを、ア
クリル板支持体にスポイト管部を垂直に固定して、細胞
培養液* を予め通液することで湿らせたガーゼ部分を、
２ｍｌの０．２４％Ｉ型コラーゲン含有の細胞培養液に
懸濁したヒト真皮由来線維目細胞を終濃度３．３×１０
5 個／シャーレ（φ３５ｍｍ：Falcon＃１００８）で播
種した中に浸し入れて、５％ＣＯ2 、９５％空気、３７
℃の保湿インキュベータ内で培養することで、細胞と共
にコラーゲンゲル内に包埋した。培養３時間目には、コ
ラーゲンは完全にゲル化し半透明になっていたので、ピ
ンセットでシャーレとゲルの間を分離し、２ｍｌの細胞
培養液を加えて、シャーレ内でガーゼ含有ゲルを浮遊さ
せて培養を続けた。培養１日目以降は、ガーゼ含有ゲル
が気相でガーゼ下端がシャーレ内細胞培養液に浸るよう
に、アクリル板支持体にスポイトの管部を垂直に固定し
て、スポイトの管内部にこの培養液を満たし、およそ
１．０ｍｌ／ｈｒで通液することで、ガーゼ含有ゲル内
で三次元的に配置した細胞を維持した。なお、周囲のガ
ーゼを含まないゲルは徐々に収縮凝集したが、通液性ガ
ーゼを含むゲル部分は物理的に収縮が阻害された。培養
１０日目でさえも、通液性ガーゼを含むゲル部分の細胞
は、ゲル内で伸展しており良好な細胞形態が位相差顕微
鏡で観察できた（図７写真：培養１０日目位相差）。 （比較例２）２ｍｌの０．２４％ｌ型コラーゲン含有の
細胞培養液に懸濁したヒト真皮由来線維芽細胞を終濃度
を３．３×１０5 個／シャーレ（φ３５ｍｍ：Falcon＃
１００８）で播種して、５％ＣＯ2 、９５％空気、３７
℃の保湿インキュベータ内で培養することで、細胞をコ
ラーゲンゲル内に包埋した。培養３時間目には、コラー
ゲンは完全にゲル化し半透明になっていたので、ピンセ
ットでシャーレとゲルの間を分離し、２ｍｌの細胞培養
液を加えて、シャーレ内でゲルを浮遊させて培養を続け
た。その後は、細胞培養液を２日毎に交換して培養を続
けた。ゲルは、徐々に収縮凝集して培養１０日目には、
平均直径約７ｍｍの円盤形となった。また、ゲル内の細
胞は、培養６時間目には伸展しており良好な細胞形態を
示した。（図８：培養６時間目位相差）が、培養４日目
にはゲル収縮のため良好な細胞形態は位相差顕微鏡では
観察できなかった（図９：培養４日目位相差）。 （実施例４ ガーゼ担体による培養）約２×２ｃｍの大
きさのガーゼを予め細胞培養液で湿らせ、２ｍｌの０．
２４％ｌ型コラーゲン含有の細胞培養液に懸濁したヒト
真皮由来線維芽細胞を終濃度３．３×１０5 個／シャー
レ（φ３５ｍｍ：Falcon＃１００８）で播種した中に浸
し入れて、５％ＣＯ2 、９５％空気、３７℃の保湿イン
キュベータ内で培養することで、細胞と共にコラーゲン
ゲル内に包埋した。培養３時間目には、コラーゲンは完
全にゲル化し半透明になっていたので、ピンセットでシ
ャーレとゲルの間を分離し、２ｍｌの細胞培養液を加え
て、シャーレ内でゲルを浮遊させて培養を続けた。その
後は、細胞培養液を２日毎に交換して培養を続けた。周
囲のガーゼを含まないゲルは徐々に収縮凝集したが、ガ
ーゼを含むゲル部分は物理的に収縮が阻害されて、培養
１０日目には、平均直径約２５ｍｍの円盤形となった。
また、ガーゼを含むゲル部分の細胞は、培養６時間目に
は伸展しており良好な細胞形態を示し（図１０写真：培
養６時間目位相差）、培養１０日目でさえも、伸展して
おり良好な細胞形態が位相差顕微鏡で観察できた（図１
１写真：培養１０日目位相差）。 （実施例５ 三次元培養装置）さらに、日本薬局方収載
の滅菌ガーゼタイプIII （ケーパイン、川本繃帯材料
（株）製）を、無菌的に図１２に示すような形（固定の
ための突出部を有する直径５．０ｃｍの円形）に切断し
た（図１３）。この切断したガーゼの突出部を、滅菌延
長チューブ（サフィードＳＦ−ＥＴ５５２７ 長さ７．
５ｃｍ 内容量５．５ｍｌ テルモ（株）製、図１４）
の先端サックを無菌的に切断して（図１５）挿入はめ込
み固定した後、チューブを３〜１０ｍｍ残して無菌的に
切断することで、ガーゼ固定チューブ先端を作製した
（図１６）。容量５０ｍｌの滅菌済コニカルチューブ
（Falcon＃２０７０）のキャップに直径約７ｍｍの円形
の孔を開け、この孔に滅菌延長チューブの先端サックを
無菌的に切断したもの（図１７）を挿入はめ込み固定し
（図１８）、さらにこの先端に上述のガーゼ固定チュー
ブ先端のチューブ部を挿入固定した（図１９）。その
後、コニカルチューブ本体を装着した（図２０）。この
延長チューブを定量送液ポンプ（ＭＰ−３Ａ、（株）東
京理化製）に装着し、ガーゼの固定してない末端を細胞
培養液の満ちたビンに入れて、ガーゼ固定末端側へ培養
液を送液すると、培養液はガーゼを構成する線糸に吸収
されてガーゼ全体に分布し、徐々に過剰となった培養液
は、ガーゼを通液性媒体として落下し、コニカルチュー
ブ内に満ちた。なお、単位時間当たりの培養液の通液量
は、定量送液ポンプのダイアルを調節すること、延
長チューブ内径の異なるものを用いること、もしくは、
定量送液ポンプの内部ギアを交換することで、１０μ
ｌ〜３．３ｍｌ／ｍｉｎの範囲で正確に制御できる。さ
らに、前記のコニカルチューブのキャップに直径約４ｍ
ｍの円形の孔を開け、この孔に適当な長さに無菌的に切
断した滅菌液のプラスチックピペット（Falcon＃７５２
０、規格１ｍｌ）を挿入した（図２１）後に、このキャ
ップに上述のごとくガーゼを装置して、ガーゼの固定し
てないチューブ末端をピペットの上端に装置すれば、１
つのコニカルチューブ内で培養液を循環することができ
る（図２２）。 （実施例６：動物細胞の三次元培養法）疎水性ポリスチ
レン性培養用シャーレ（φ６０ｍｍ：Falcon＃１００
７）に、実施例５で作製した突出部付円形（直径５．０
ｃｍ）ガーゼを入れて、この円形ガーゼ部分に、約０．
８ｍｌの０．２５％Ｉ型コラーゲン水溶液（CELLEGEN
Ｉ−ＰＣ、（株）高研製）を塗布して無菌的に風乾する
ことで、このガーゼ部分をシャーレ底面に伸展接着する
と共に細胞付着能を与えた。さらに必要に応じてガーゼ
付着シャーレ底面に紫外線（短波長２５４ｎｍ）を約３
０分間照射した。このシャーレ内に、０．１ｍＭ Ｌ−
アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩（和光純
薬工業（株）製）含有の細胞培養液５．０ｍｌに懸濁し
たヒト真皮由来線維芽細胞を終濃度８．０×１０5 個／
シャーレで播種し、５％ＣＯ2 、９５％空気、３７℃の
保湿インキュベータ内で培養した。２日毎に同じ新鮮な
培地に培地交換して、培養１０日目までガーゼメッシュ
上で細胞を多層状態に増殖させた（図２３位相差写
真）。培養１０日目に、ガーゼ突出部をピンセットで物
理的に摘み上げることで、ガーゼメッシュ上で多層増殖
した細胞をシャーレから脱着した。ガーゼを脱着したシ
ャーレには細胞はほとんど残らず（図２４位相差写
真）、ほとんど全ての細胞は脱着したガーゼに付着して
いた（図２５位相差写真）。この多層増殖した細胞が付
着したガーゼを、実施例５で作製した通液装置に装着
し、同様の培養液１０ｍｌを用いて、約０．８ｍｌ／ｍ
ｉｎの流速で循環通液しながら、５％ＣＯ2 、９５％空
気、３７℃の保湿インキュベータ内で培養した（図２
６、図２７）。２日毎に同じ新鮮な培地に培地交換し
て、３週間循環通液培養を行なった後、ガーゼ部を取り
出し、位相差顕微鏡観察したところ、各々の細胞は、細
いガーゼ繊維の周囲で巧みに自己組織形成能を発揮し、
全体的にガーゼ繊維が分布した多細胞性凝集塊を形成し
た（図２８位相差写真）。さらに、この多細胞性凝集塊
をホルマリンで固定し、脱水後、光顕用樹脂に包埋し
て、４μｍに薄切し、クマシーブルーとヘマトキシリン
の２重染色を行なうことで、内部組織形態の観察を行な
った。同じヒト真皮由来線維芽細胞で従来の技術を用い
て形成し、３週間培養した直径約６００μｍのスフェロ
イド（多細胞性球状凝集塊）と比較したところ、スフェ
ロイド内部には多数の核萎縮細胞や死細胞破片が見られ
る（図２９、図３０）のに対し、長径５ｍｍ以上短径約
２ｍｍのガーゼ含有多細胞性凝集塊断面にはほとんど核
萎縮細胞は見られず、細胞間にはクマシーブルー陽性の
線維の生合成が観察でき（図３１、図３２）、内部構成
細胞は極めて良好な生細胞活性を有していると考えられ
た。 （比較例３）実施例６に於いて、Ｌ−アスコルビン酸リ
ン酸マグネシウム塩を含まない通常の細胞培養液に細胞
を懸濁して同じ終濃度で播種し、２日毎に培地交換して
１０日間培養した。培養１０日目には、細胞はガーゼメ
ッシュ上に多層化増殖することなく、ガーゼメッシュ間
で単層コンフルエントとなった（図３３位相差写真）。
実施例６のようにガーゼ突出部をピンセットで摘みガー
ゼメッシュをシャーレから脱着したところ脱着したガー
ゼには、ほとんど細胞は付着することなく（図３４位相
差写真）、ガーゼを脱着した後のシャーレにほとんどの
細胞は残っていた（図３５位相差写真）。この結果から
明らかなように、アスコルビン酸の添加により、通液性
細胞培養担体上に細胞が増殖し多層化（三次元化）され
ることがわかる。
【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明によ
って、動物細胞をそれが由来する組織または器官と同様
に自己組織形成するように三次元培養することが可能と
なる。特に、この発明の担体としてのメッシュ体の場合
には、通液性のほかに、培養細胞に張力を与え、より生
体に近い状態での三次元の、高効率培養が可能となる。
しかもこの発明の担体装置の取扱いは極めて容易である
とともに、従来のスフェロイド培養法等の三次元凝集塊
に比べて、１つの凝集塊の大きさと構成細胞数を自由に
制御することができ、特に生物活性評価に十分な細胞数
を確保できるという点で有用である。
って、動物細胞をそれが由来する組織または器官と同様
に自己組織形成するように三次元培養することが可能と
なる。特に、この発明の担体としてのメッシュ体の場合
には、通液性のほかに、培養細胞に張力を与え、より生
体に近い状態での三次元の、高効率培養が可能となる。
しかもこの発明の担体装置の取扱いは極めて容易である
とともに、従来のスフェロイド培養法等の三次元凝集塊
に比べて、１つの凝集塊の大きさと構成細胞数を自由に
制御することができ、特に生物活性評価に十分な細胞数
を確保できるという点で有用である。
【図１】この発明の培養装置の一例を示した斜視図であ
る。
る。
【図２】別の培養装置の一例を示した斜視図である。
【図３】この発明方法によって培養した８日後の状態を
示した位相差顕微鏡写真像図である。写真上の６．５ｍ
ｍが実際の２００μｍに相当する。
示した位相差顕微鏡写真像図である。写真上の６．５ｍ
ｍが実際の２００μｍに相当する。
【図４】この発明の方法によって培養した１０日後の状
態を示した位相差顕微鏡写真図である。写真上の６．５
ｍｍが実際の２００μｍに相当する。
態を示した位相差顕微鏡写真図である。写真上の６．５
ｍｍが実際の２００μｍに相当する。
【図５】比較例としての８日後の状態を示した位相差顕
微鏡写真像図である。写真上の６．５ｍｍが実際の２０
０μｍに相当する。
微鏡写真像図である。写真上の６．５ｍｍが実際の２０
０μｍに相当する。
【図６】比較例としての１０日後の状態を示した位相差
顕微鏡写真像図である。写真上の６．５ｍｍが実際の２
００μｍに相当する。
顕微鏡写真像図である。写真上の６．５ｍｍが実際の２
００μｍに相当する。
【図７】実施例としての１０日後の培養状態を示した位
相差顕微鏡写真像図である。写真上の１６ｍｍが実際の
２００μｍに相当する。
相差顕微鏡写真像図である。写真上の１６ｍｍが実際の
２００μｍに相当する。
【図８】比較例としての６時間後のゲル状態を示した位
相差顕微鏡像図である。写真上の３２ｍｍが実際の２０
０μｍに相当する。
相差顕微鏡像図である。写真上の３２ｍｍが実際の２０
０μｍに相当する。
【図９】比較例としての４日後のゲル状態を示した位相
差顕微鏡像図である。写真上の３２ｍｍが実際の２００
μｍに相当する。
差顕微鏡像図である。写真上の３２ｍｍが実際の２００
μｍに相当する。
【図１０】６時間後のガーゼゲルの状態を示した位相差
顕微鏡像図である。写真上の３２ｍｍが実際の２００μ
ｍに相当する。
顕微鏡像図である。写真上の３２ｍｍが実際の２００μ
ｍに相当する。
【図１１】１０日後のガーゼゲルの状態を示した位相差
顕微鏡像図である。写真上の１６ｍｍが実際の２００μ
ｍに相当する。
顕微鏡像図である。写真上の１６ｍｍが実際の２００μ
ｍに相当する。
【図１２】この発明の実施例としての別のガーゼ状担体
の形状を例示した平面図である。
の形状を例示した平面図である。
【図１３】図１２に対応する平面状態図である。
【図１４】滅菌延長チューブを示した斜視図である。
【図１５】図１４のチューブの先端部の切断状態を示し
た斜視図である。
た斜視図である。
【図１６】ガーゼを固定したチューブ先端を示した斜視
図である。
図である。
【図１７】チューブ先端サックの切断状態を示した斜視
図である。
図である。
【図１８】コニカルチューブのキャップに延長チューブ
の先端サックの切断したものを挿入した状態を示した斜
視図である。
の先端サックの切断したものを挿入した状態を示した斜
視図である。
【図１９】図１８において、ガーゼ固定したチューブを
挿入固定した状態を示した斜視図である。
挿入固定した状態を示した斜視図である。
【図２０】コニカルチューブ本体に図１９の挿入固定体
を装着した状態を示した斜視図である。
を装着した状態を示した斜視図である。
【図２１】コニカルチューブキャップにプラスチックピ
ペットを挿入固定した状態を示した斜視図である。
ペットを挿入固定した状態を示した斜視図である。
【図２２】循環培養器を例示した斜視図である。
【図２３】１０日目まで多層状態で細胞増殖させた状態
を示した位相差顕微鏡写真である。写真上の１６ｍｍが
実際の５００μｍに相当する。
を示した位相差顕微鏡写真である。写真上の１６ｍｍが
実際の５００μｍに相当する。
【図２４】ガーゼ担体の脱着後のシャーレの状態を示し
た位相差顕微鏡写真である。写真上の１６μｍが実際の
５００μｍに相当する。
た位相差顕微鏡写真である。写真上の１６μｍが実際の
５００μｍに相当する。
【図２５】ガーゼ担体の脱着後のガーゼ担体への細胞付
着の状態を示した位相差顕微鏡写真である。写真上の１
６ｍｍが実際の５００μｍに相当する。
着の状態を示した位相差顕微鏡写真である。写真上の１
６ｍｍが実際の５００μｍに相当する。
【図２６】循環培養の担体を示した斜視図である。
【図２７】循環培養の状態を示した斜視図である。
【図２８】多細胞凝集塊を形成した状態を示した位相差
顕微鏡写真である。写真上の１６ｍｍが実際の５００μ
ｍに相当する。
顕微鏡写真である。写真上の１６ｍｍが実際の５００μ
ｍに相当する。
【図２９】比較のためのスフェロイドを示した写真で、
写真上の１９ｍｍが実際の５００μｍに相当する。
写真上の１９ｍｍが実際の５００μｍに相当する。
【図３０】図２９の拡大図である。写真上の１９ｍｍが
実際の１００μｍに相当する。
実際の１００μｍに相当する。
【図３１】この発明の場合のスフェロイドを示した写真
で、写真上の１９ｍｍが実際の５００μｍに相当する。
で、写真上の１９ｍｍが実際の５００μｍに相当する。
【図３２】図３１の拡大図である。写真上の１９ｍｍ
が、実際の１００μｍに相当する。
が、実際の１００μｍに相当する。
【図３３】比較例としての培養１０日目のガーゼ状態を
示した位相差顕微鏡写真である。写真上の１６ｍｍが５
００μｍに相当する。
示した位相差顕微鏡写真である。写真上の１６ｍｍが５
００μｍに相当する。
【図３４】ガーゼをシャーレより脱着した後のガーゼの
状態を示した位相差顕微鏡写真である。写真上の１６ｍ
ｍが５００μｍに相当する。
状態を示した位相差顕微鏡写真である。写真上の１６ｍ
ｍが５００μｍに相当する。
【図３５】ガーゼ脱着後のシャーレの状態を示した位相
差顕微鏡写真である。写真上の１６ｍｍが５００μｍに
相当する。
差顕微鏡写真である。写真上の１６ｍｍが５００μｍに
相当する。
【手続補正書】
【提出日】平成７年３月２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１３】
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１４】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１５】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１６】
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１７】
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１８】
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１９】
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２０
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２０】
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２１】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２２】
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２６】
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２７】
Claims (17)
- 【請求項１】 複数の天然または合成の糸および／また
はその織成体からなることを特徴とする通液性細胞培養
担体。 - 【請求項２】 織成体がメッシュ体からなる請求項１の
通液性細胞培養担体。 - 【請求項３】 生体吸収性の織成体またはメッシュ体か
らなる請求項１または２の通液性細胞培養担体。 - 【請求項４】 アスコルビン酸が培養液に添加されて細
胞の増殖と多層化が促進される請求項１または２の通液
性細胞培養担体。 - 【請求項５】 細胞接着能が付与されている請求項１ま
たは２の通液性細胞培養担体。 - 【請求項６】 選択的、かつ局所的な細胞接着能が付与
されている請求項５の通液性細胞培養担体。 - 【請求項７】 細胞外マトリックス、ゼラチン、レクチ
ン、イガイ由来の接着蛋白質、ポリリジン、接着性オリ
ゴペプチドおよび／またはトロンボスポンジンにより細
胞接着能が付与されている請求項４の通液性細胞培養担
体。 - 【請求項８】 細胞間接担体としての請求項１または２
の通液性細胞培養担体。 - 【請求項９】 細胞外マリトックス構成成分含有ゲルの
内部に包埋させてなる請求項８の通液性細胞培養担体。 - 【請求項１０】 請求項１ないし９のいずれかの通液性
培養担体を培養容器に装入して細胞培養することを特徴
とする通液性担体による細胞培養方法。 - 【請求項１１】 複数の天然または合成の糸および／ま
たはその織成体からなる通液性培養担体と、この担体を
装入する培養容器と、担体に通液するための通液供給手
段とを有し、通液性培養担体はこの供給手段に接続され
ていることを特徴とする通液性培養担体による培養装
置。 - 【請求項１２】 通液供給手段は支持体に立設支持され
たピペット状体もしくはスポイト状体からなる請求項９
の培養装置。 - 【請求項１３】 通液供給手段は、容器キャップ体に装
着されるチューブ状体である請求項９の培養装置。 - 【請求項１４】 培養担体を取付け固定したチューブ体
の他端が培養液中に装入されている請求項１３の培養装
置。 - 【請求項１５】 通液供給手段は、ポンプを備えている
請求項１１ないし１４のいずれかの培養装置。 - 【請求項１６】 通液性培養担体と通液供給手段との接
続部には通液量制御手段を備えている請求項１１ないし
１５のいずれかの培養装置。 - 【請求項１７】 培養液の循環手段を備えている請求項
１１ないし１６のいずれかの培養装置。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6339979A JPH07298876A (ja) | 1994-03-09 | 1994-12-29 | 通液性細胞培養担体と、この担体を用いる培養方法お よび培養装置 |
| EP95301532A EP0671469B1 (en) | 1994-03-09 | 1995-03-09 | A medium-penetrating cell culture carrier and a culturing method and a device using this carrier |
| DE69535324T DE69535324T2 (de) | 1994-03-09 | 1995-03-09 | Mediumdurchdringender Zellkulturträger und seine Verwendungen in eine Kulturmethode und einem Apparat |
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| US08/401,255 US5736399A (en) | 1994-03-09 | 1995-03-09 | Medium-penetrating cell culture carrier, a culturing method and a device using this carrier |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3887894 | 1994-03-09 | ||
| JP6-38878 | 1994-03-09 | ||
| JP6339979A JPH07298876A (ja) | 1994-03-09 | 1994-12-29 | 通液性細胞培養担体と、この担体を用いる培養方法お よび培養装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07298876A true JPH07298876A (ja) | 1995-11-14 |
Family
ID=26378169
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP6339979A Pending JPH07298876A (ja) | 1994-03-09 | 1994-12-29 | 通液性細胞培養担体と、この担体を用いる培養方法お よび培養装置 |
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| JP (1) | JPH07298876A (ja) |
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