WO2015005349A1 - 細胞培養支持体、細胞培養装置、細胞培養キット、及び細胞シート - Google Patents

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WO2015005349A1
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cell culture
cell
cells
culture support
sheet
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ケネディ オモンディ オケヨ
鷲津 正夫
秀俊 小寺
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国立大学法人東京大学
国立大学法人京都大学
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    • C12M25/00Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/14Scaffolds; Matrices
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50Proteins
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    • C12N2533/50Proteins
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    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2535/00Supports or coatings for cell culture characterised by topography

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture support having a mesh structure, and a cell sheet produced using the support.
  • Cells are the basic components of living things. Artificial growth and maintenance of cells removed from living organisms is called cell culture, and cell culture technology makes this possible. This technology is an important technology that supports basic research and medical care, and has high industrial value.
  • a general culture method of adherent cells such as fibroblasts and epithelial cells
  • cells are seeded on the bottom surface of a container such as a petri dish or a flask and amplified to a sufficient number.
  • a major feature of such a culture method is that the cell seeding surface is wide and flat.
  • cell contact failure contact inhibition
  • the state of the cells deteriorates. Therefore, when the number of cells increases to about 70% of the confluent state, the cells are passaged, that is, the cells adhered to the bottom of the container are detached, transferred to a new culture apparatus and cultured. It is common. In particular, in the case of rapidly proliferating cells, it has to be passaged every day, which is troublesome and the cost is very high.
  • a typical example is a cell sheet.
  • the cell sheet refers to a cell aggregate of at least a single layer formed by mutual bonding between adjacent cells.
  • Cell sheets have begun to be widely used as materials in fields such as regenerative medicine (for example, Patent Documents 1 and 2, Non-Patent Documents 1 and 2).
  • Non-Patent Documents 3 and 4 As a chemical cell sheet peeling method, proteolytic enzymes such as proteolytic enzymes (proteases) and collagen degrading enzymes (collagenase) are allowed to act to weaken the bond between cells and cell culture support to support cell cultures. The method of peeling from a body is mention
  • proteolytic enzymes proteolytic enzymes
  • collagen degrading enzymes collagen degrading enzymes
  • adhesion molecules between cells forming the cell sheet are also decomposed by the action of these proteolytic enzymes (for example, Non-Patent Document 3).
  • trypsin which is a general proteolytic enzyme used for peeling, has been shown to be cytotoxic (for example, Non-Patent Documents 3 and 4). Therefore, when chemical peeling is performed, there has been a problem of a decrease in utility value due to destruction of cell sheets or deterioration of quality.
  • a new cell sheet peeling method using a stimulus-responsive polymer has also been proposed. For example, after culturing cells in a container coated with a stimuli-responsive polymer material such as a temperature-responsive material or a photo-responsive material to produce a cell sheet, hydrophilicity can be obtained by applying a stimulus such as temperature or light.
  • a stimuli-responsive polymer material such as a temperature-responsive material or a photo-responsive material to produce a cell sheet
  • hydrophilicity can be obtained by applying a stimulus such as temperature or light.
  • There is a method of peeling the cell sheet from the container by changing the characteristics of the surface of the polymer material such as hydrophobic or hydrophobic for example, Patent Document 3 and Non-Patent Document 5.
  • this method requires a special polymer material, which increases the cost.
  • stimulation such as temperature and light applied at the time of peeling not only changes the cell culture environment, but when the scaffold disappears, the intracellular skeletal structure that maintains the strength of the cell sheet is broken and the sheet shrinks
  • the properties of the cell sheet deteriorate (for example, Non-Patent Document 6).
  • the stimulus-responsive polymer is easily affected by the cell culture medium, and may not function in the culture medium.
  • Patent Documents 2-4 As another cell sheet preparation means, a technique has been proposed in which cells are cultured on unevenness formed on the surface of the culture container, or on micropillars or nanopillars standing on the culture container (for example, Patent Documents 2-4). These methods are considered to be easy to detach cells and cause little damage to the cells.
  • Patent Document 2 and Non-Patent Documents 7 and 8 the cell adhesion and the behavior of the adhered cells are different between the case of adhering to a flat surface and the case of adhering to an uneven surface. There are problems that adhesion and extension are slow, and temporary feet are generated from the cell surface.
  • the concave portion has a width of 20 ⁇ m or more, there is a problem that cells infiltrate.
  • Non-Patent Document 7 describes a product in which highly biocompatible wire materials are formed in a coil shape and accumulated.
  • Patent Document 8 a thin titanium plate is immersed in an alkaline aqueous solution.
  • a scaffold having a mesh-like eroded layer for inducing and proliferating cells is disclosed.
  • a method of culturing using a porous polymer sheet as a scaffold during cell culture has also been proposed (Patent Document 9).
  • each of these scaffolds has a large scaffold as compared with cells, and is cultured in such a state that the cells are on the scaffold. That is, the size is designed so that cells do not fall from the gaps between the nonwoven fabric, the coil, and the network structure.
  • the pore diameter of the porous polymer needs to be about 2 ⁇ m to 20 ⁇ m, and the pore diameter is less than 2 ⁇ m.
  • monocytes cannot be efficiently adsorbed and cultured even when used as a culture scaffold, and that the function as a culture scaffold is reduced when it exceeds 20 ⁇ m.
  • JP 2010-29680 A JP 2004-261533 A Japanese Patent Publication No. 6-104061 Japanese Patent Laid-Open No. 2008-11766 JP 2004-170935 A JP 2005-168494 A JP 2011-15959 A JP 2007-277718 A JP 2006-262882 A
  • the present invention provides a cell culture support capable of producing and maintaining a high-quality and safe cell sheet formed only with cells in good condition without requiring passage, a cell sheet produced using the same, and the like It is an issue to provide.
  • the present inventors have prepared a cell culture support having a planar mesh structure, in which the openings of the mesh structure are larger than the cells to be cultured.
  • the cells When cells are seeded in a state where the cell culture support is suspended in the culture medium, the cells spontaneously extend to the openings of the mesh structure, and the contacted cells adhere and connect to each other to open the mesh structure. It was found that a single-layer cell sheet was formed by filling the portion. In addition, according to such a cell sheet, the cells do not become confluent, and even if the cells grow, dead cells and bad cells are naturally dropped from the cell culture support. It was confirmed that a highly safe cell sheet consisting only of living cells in good condition can be obtained.
  • a cell culture support for cell culture which has a planar mesh structure, and the opening of the mesh structure has a size that allows passage of one cell to be cultured.
  • Described method [19] The method according to any one of [13] to [18] above, wherein, in the step of culturing the cells, a plurality of cell culture apparatuses are installed in the cell apparatus to perform mass culture of the cells; [20] A cell sheet comprising the cell culture support according to any one of [1] to [8] above; [21] The cell culture device according to any one of [9] to [12] above, the cell culture kit according to [12] above, or any one of [13] to [20] above A cell sheet produced using the method for producing a cell sheet according to the above; and [22] a cell structure formed by deforming or laminating the cell sheet according to [20] or [21] above, About.
  • cells expand so as to fill a mesh structure having an opening larger than the cell size, and a cell sheet having excellent strength and flexibility can be obtained by adhesion between cells. Can do. Since the cells are not cultured by adhering to the bottom surface of the container as in the conventional method, the obtained cell sheet does not need to be peeled from the container, and is not damaged by the peeling. Further, in the conventional cell culture method in which cells are cultured on the bottom surface of the container to form a cell colony, there is a problem that oxygen, nutrients, etc. are difficult to turn to the inside of the colony and the state of the cell is deteriorated.
  • the cell culture support according to the present invention since both surfaces of the cell sheet are in contact with the medium, oxygen, nutrition, etc. are equally distributed to all cells. Furthermore, when cultured on the cell culture support according to the present invention, the cells do not become confluent, and dead cells and bad cells are naturally dropped from the cell culture support. Therefore, the cells can be cultured and maintained for a long time without any change or deterioration of the cells, and a high-quality and highly safe cell sheet can be obtained. In addition, since the cells do not become confluent, there is no need for passage, so that labor is not required and costs are reduced. Furthermore, since a cell sheet can be produced by installing a large number of cell culture supports in one container, it is also suitable for mass production.
  • the cell sheet according to the present invention may be formed into a desired shape by laminating, deforming, or the like, and the cell culture support is previously deformed (rounded, folded, etc.) into a desired shape and then back and forth. You may sprinkle cells. Therefore, by molding the cell sheet according to the present invention, a higher-order cell structure can be produced, which is useful for various studies and regenerative medicine.
  • FIG. 1 is a schematic view showing an example of a method for producing a cell culture support according to the present invention.
  • FIG. 2 is a microscopic image showing an example of a cell culture support according to the present invention.
  • FIG. 3A is a conceptual diagram showing one embodiment of a method for producing a cell sheet using the cell culture support and the cell culture device according to the present invention.
  • FIG. 3B is a conceptual diagram showing a state immediately after cells are seeded on the cell culture support according to the present invention.
  • FIG. 4 is a conceptual diagram showing a state in which a cell sheet is formed using the cell culture support according to the present invention.
  • FIG. 5 is a microscopic image showing a state in which a cell sheet made of MEF cells was produced using the cell culture support according to the present invention.
  • FIG. 6A is a bright-field microscopic image of a cell sheet of TIG cells prepared using the cell culture support according to the present invention.
  • FIG. 6A is a fixed-stained image of a cell sheet with TIG cells prepared using the cell culture support according to the present invention.
  • FIG. 7 is a microscope image which shows a mode (A) which culture
  • FIG. 8 is an application example of the cell sheet according to the present invention, and shows a two-layer tissue model in which the cell sheet is installed in a microfluidic device.
  • FIG. 1 is a microscope image which shows a mode (A) which culture
  • FIG. 8 is an application example of the cell sheet according to the present invention, and shows a two-layer tissue model in which
  • FIG. 9 is an application example of the cell sheet according to the present invention, and is a conceptual diagram showing a method of manufacturing a blood vessel model by producing a two-layer cell sheet and then deforming it.
  • FIG. 10 is a conceptual diagram showing a method for producing a cell sheet by previously deforming a cell culture support and then seeding and culturing the cells.
  • FIG. 11 shows a state in which extra cells formed by cell division are piled up when a cell sheet is produced on a cell culture support placed horizontally.
  • FIG. 12 shows a cell sheet produced with the cell culture support placed vertically.
  • FIG. 13 is a conceptual diagram of a cell sheet production apparatus in which a cell culture support is placed vertically and a flow is generated in a culture solution by a stirrer.
  • FIG. 14 shows a cell sheet produced by the apparatus of FIG.
  • the cell culture support according to the present invention has a planar mesh structure, and each opening of the mesh structure has a size that allows cells to be cultured to pass through.
  • the “cell culture support” refers to a structure in which cells proliferate along its shape when placed in a culture solution.
  • the cell culture support according to the present invention is characterized in that the cells spontaneously extend into the openings of the mesh, instead of being fixed and proliferating on a scaffold having a larger area than the cells as in the conventional scaffold.
  • a scaffold having a smaller opening than a cell such as a pore is used as a culture support on the bottom surface of a uniform container, so that the cells settle on the scaffold and grow to form a tissue. It was thought to be. That is, conventionally, it has not been thought at all that cells spontaneously extend into an opening larger than the cell to fill the opening. In contrast, when the present inventors use a mesh-structured support having an opening larger than the cell, the cells spontaneously extend toward the center of the opening and adhere to each other, so that the opening is covered. It was found that a single-layer cell sheet was formed. The present invention is based on such knowledge.
  • cells extend means that cells deform, grow or proliferate in a specific direction.
  • the “planar mesh structure” means a planar structure in which openings having a predetermined shape are regularly or irregularly arranged.
  • the opening having the predetermined shape is typically a regular polygon such as a regular triangle, a square, or a regular hexagon, but may be a circle, an ellipse, or another polygon.
  • the openings may not all have the same shape, and a planar structure in which a plurality of openings are set as a set and such a set is regularly or irregularly arranged is also referred to as a “plane” according to the present invention.
  • ”Like mesh structure In the present specification, portions other than the openings of the planar mesh structure may be referred to as “frames” or “frame portions”.
  • the opening of the cell culture support according to the present invention has a size that allows one cell to be cultured to pass through.
  • the size of the opening allows one cell to be cultured to pass means that each size of the opening and the cell can pass through the opening with or without deformation of the cell. means.
  • the size of the opening may be such that cells can pass without contacting the opening, or the size that allows the cell to pass while deforming in contact with the opening.
  • the size of the opening is such that one cell to be cultured can pass through
  • the maximum area of one cell means the area when the cell is cut so that the cross-sectional area is maximized.
  • the maximum area of the cells at the time of seeding means the maximum area when the cells are seeded, that is, before the cells adhere to the support and spread.
  • the cell culture support according to the present invention may have a minimum diameter of the opening larger than a maximum diameter at the time of seeding of the cells to be cultured.
  • the minimum diameter of the opening can be appropriately measured by those skilled in the art. For example, in the case of a regular polygon, the minimum diameter of the straight line connecting two points on the side through the center is referred to.
  • the maximum cell diameter refers to the length of the longest straight line connecting two points around the cell.
  • the minimum diameter of the openings may be larger than the maximum diameter at the time of seeding the cells to be cultured only in any one of the openings. The minimum diameter may be larger than the maximum diameter when seeding cells to be cultured.
  • the minimum diameter of the opening is larger than the maximum diameter of the cell, if the cell culture support is placed horizontally and seeded from above, some cells will settle in the frame and fall down without touching the frame There are also cells. Although only the cells settled in the frame part do not initially fill the opening, the cells spontaneously extend toward the center of the opening, resulting in the formation of a cell sheet.
  • the minimum diameter of the opening may be 2 times, 3 times, 4 times, 5 times, 7 times, 10 times, or the like of the maximum diameter of the cells to be cultured. Also in such a case, the cells seeded in the frame part spontaneously extend to the opening part, and the cells are connected to fill the opening part to form a cell sheet.
  • the length of one side is not particularly limited, but can be, for example, about 30 to 250 ⁇ m.
  • the length of one side may be 50 ⁇ m or more, 60 ⁇ m or more, 80 ⁇ m or more, 100 ⁇ m or more, or less than 200 ⁇ m, less than 180 ⁇ m, less than 150 ⁇ m, or the like.
  • the openings of the mesh structure can be triangular, quadrangular, hexagonal, etc., and this shape also controls physical properties such as the time until the cell sheet is formed and the strength and flexibility of the cell sheet. Is possible.
  • the width of the frame portion of the mesh structure of the cell culture support according to the present invention is not particularly limited, and may be, for example, half or less of the maximum cell diameter.
  • a structure having a width equal to or larger than the maximum diameter of the cell was used so that the cell settled, but in the cell culture support according to the present invention, the cell size is larger than the cell size.
  • a mesh structure having a thin frame portion may be used.
  • the “width of the frame portion” means a width in a direction perpendicular to the length direction of the frame.
  • the width of the frame portion may be 1/3 or less of the maximum diameter of the cell, 1/4 or less, 1/5 or less, or less.
  • the width of the frame portion can be, for example, 1 to 20 ⁇ m, and may be 2 ⁇ m to 15 ⁇ m, 3 ⁇ m to 10 ⁇ m, 4 ⁇ m to 5 ⁇ m, and the like, but is not limited thereto.
  • a person skilled in the art can appropriately determine the size according to the cell size.
  • the strength and flexibility of the cell sheet can also be controlled by adjusting the width of the frame portion.
  • the number of cells to be adhered can be controlled by adjusting the width of the frame portion.
  • the “single-layer cell sheet” refers to a structure in which cells are arranged approximately two-dimensionally and adjacent cells adhere to each other with substantially no gap. Whether or not the cell sheet is a single layer can be confirmed, for example, by staining cell nuclei and arranging the cell nuclei approximately in a plane.
  • the shape may be a shape that can be recognized as a single layer as a whole, and some cells may be layered.
  • the thickness of the cell culture support may be smaller than the maximum diameter of the cells adhered to the cell culture support.
  • the thickness may be 1 to 20 ⁇ m, and may be 2 ⁇ m to 15 ⁇ m, 3 ⁇ m to 10 ⁇ m, 4 ⁇ m to 5 ⁇ m, but is not limited thereto. You may determine the thickness of a support body according to the use of the cell sheet obtained.
  • the mesh structure may have shape anisotropy. As shown in the examples described later, when the mesh structure is asymmetrical, anisotropy occurs and the cell orientation can be controlled, so that a cell sheet having a desired ordered structure can be obtained. On the contrary, depending on the shape of the mesh structure, cells expand isotropically, and a cell sheet having no orientation can be obtained.
  • the material of the cell culture support according to the present invention is not particularly limited as long as it does not exhibit cytotoxicity and a cell sheet is formed.
  • a photocurable resin a biocompatible material, a biodegradable material, or the like is used. Can do. If a photocurable resin is used, a cell culture support can be produced by a photolithography method as described later.
  • the photocurable resin include acrylate compounds, methacrylate compounds, epoxy compounds, isocyanate compounds, thiol compounds, silicone compounds, and the like. Two or more of these may be used in combination.
  • the photocurable resin examples include urethane acrylate, polyester acrylate, epoxy acrylate, poly (meth) acrylate methyl, ethoxylated bisphenol A acrylate, aliphatic urethane acrylate, polyester acrylate, polyethylene terephthalate, polystyrene, polycarbonate, acrylic modification Examples include, but are not limited to, alicyclic epoxides, bifunctional alcohol ether type epoxides, acrylic silicones, and acrylic dimethylsiloxanes.
  • a cell sheet obtained by using a biocompatible material or a biodegradable material is suitably used for regenerative medicine such as transplantation to a living body as it is.
  • biocompatible materials include silicone, polyether block amide (PEBAX), polyurethane, silicone-polyurethane copolymer, ceramics, collagen, hydroxyapatite, nylon, polyethylene terephthalate, Gore-Tex (trademark) and other ultrahigh molecular weight polyethylene, Examples include, but are not limited to, polyvinyl chloride and other biological materials.
  • the cell culture support according to the present invention may be formed of a material other than the biocompatible material and the surface thereof may be treated with the biocompatible material.
  • Biodegradable materials include polylactide (PLA), polyglycolide (PGA), polycaprolactone (PCL), and copolymers thereof, PHB-PHV poly (alkanoic acids), polyesters, starch, cellulose, chitosan Examples thereof include natural polymers such as, but are not limited to.
  • the cell culture support according to the present invention is made of an elastically deformable material.
  • the cell culture support according to the present invention can be devised in various ways, for example, to reinforce the surroundings and facilitate carrying, and the support with such a contrivance is also included in the present invention.
  • the cell culture support according to the present invention can be appropriately produced by a person skilled in the art according to a known method or a method according to the structure, application, material, etc., but as an example, a method of producing by a photolithography method Is mentioned.
  • photolithography for example, it can be manufactured by the method shown in FIG.
  • a mesh structure is drawn on the surface of the photomask by methods such as electron beam drawing, laser beam drawing, and photo printing.
  • gelatin as a sacrificial layer is spin-coated (2).
  • the photocurable resin is appropriately patterned by heating, exposing and developing (3), and the gelatin is dissolved in hot water (5).
  • a formed cell culture support can be obtained.
  • a method for reinforcing the cell culture support for example, a method of pasting a Kapton tape or the like can be mentioned (4).
  • the method of FIG. 1 is particularly effective when the width of the frame portion is smaller than 1 ⁇ m or when it is desired to form the width of the frame portion with high accuracy.
  • the present invention also includes a cell culture apparatus for culturing cells using the cell culture support according to the present invention.
  • the cell culture device according to the present invention is characterized by comprising means for holding the cell culture support in a suspended state in the culture solution.
  • “in a state of being suspended in the culture medium” means that both surfaces of the cell culture support are not in contact with the inner wall and bottom surface of the cell culture apparatus, and both surfaces can be sufficiently in contact with the culture medium.
  • the cell culture support may be installed horizontally or vertically in the cell culture apparatus.
  • the “member for holding the cell culture support in a state of being floated in the culture solution” may be any means as long as the cell culture support can be stably held.
  • a portion can be a stand installed in the cell culture device or a groove formed on the inner wall or bottom of the cell culture device.
  • the cell culture device is characterized by including a member for vertically holding the cell culture support.
  • “Holding the cell culture support vertically” means holding the cell culture support on a plane upright.
  • stem cells with high proliferative ability often accumulate to form colonies when cultured, and the cells may die because no nutrients rotate around the cells in the center of the colonies.
  • excess cells are dropped, colony formation is suppressed, and a single-layer cell sheet can be obtained efficiently.
  • the cell culture device may be capable of mounting a plurality of cell culture supports. For example, if a plurality of grooves parallel to the bottom surface of the cell culture support are formed, a plurality of cell culture supports are inserted so that the periphery of the cell culture support is inserted into the groove and perpendicular to the bottom surface. Can be installed in parallel. According to such a configuration, it is possible to culture a large amount of cells in a small space.
  • the cell culture device may include a member that causes a flow in the culture solution.
  • the flow can be generated by stirring with a stirrer.
  • the direction of the flow is not particularly limited, but may be a direction parallel to the main surface of the cell culture support, for example. Thereby, a monolayer cell sheet can be manufactured efficiently. If the cell culture support is installed vertically and a flow is generated in the culture solution, a uniform monolayer cell sheet can be produced more efficiently.
  • the present invention also includes a cell culture kit comprising a cell culture support and a cell culture device.
  • a cell culture kit comprising a cell culture support and a cell culture device.
  • a kit may include a powder medium, a culture solution, a material that promotes cell adhesion (described later), a buffer for dilution, instructions for use, and the like.
  • the present invention also includes a method for producing a cell sheet using the cell culture support according to the present invention.
  • the method for producing a cell sheet according to the present invention includes a step of seeding cells on a cell culture support in a cell culture device, and a step of culturing the cells.
  • a cell culture support is placed on the cell culture device prior to the step of seeding the cells.
  • the cell culture device and the cell culture support are preferably sterilized as appropriate.
  • the cell culture apparatus is filled with a culture solution to such an extent that the cell culture support can be immersed.
  • a culture solution can be appropriately selected and prepared by a person skilled in the art according to the type of cell. Culture fluid and other materials may be sterilized by autoclaving or filtration.
  • the cell culture support may be coated with a cell adhesion promoting material in advance.
  • the “cell adhesion promoting material” is used for fixing cells to a culture support to facilitate spreading and proliferation.
  • an extracellular matrix protein such as collagen, fibronectin, laminin, poly-L lysine, etc.
  • examples include positively charged substances such as, but not limited to.
  • coating with a material that promotes cell adhesion can be performed by immersing the cell culture support in an approximately 0.1% solution and incubating for a certain period of time.
  • fibronectin a solution of about 10 ⁇ g / ml can be used, and for Matrigel, a 1% solution (ice temperature) can be used. The concentration and temperature can be appropriately adjusted by those skilled in the art.
  • the cell culture support that has undergone the necessary pretreatment is appropriately placed in the cell culture apparatus “in a state of being floated in the culture medium”.
  • Cell seeding can be appropriately performed by a known method or a method analogous thereto.
  • the cells may be suspended with a culture solution and dropped onto the cell culture support with a pipette or the like.
  • the number of cells can be appropriately determined according to the type of cells to be cultured and the size of the cell sheet to be produced. What is necessary is just to determine suitably the temperature and environment of culture
  • a flow may be generated in the culture solution.
  • the flow of the culture solution may be continuously generated during the step of culturing the cells, or may be intermittently generated.
  • the cells may be seeded without causing a flow for a while after seeding the cells, and then flow may occur intermittently (for example, every 5 to 20 hours).
  • the nutrients necessary for all cells can be taken from the culture solution and unnecessary substances can be discharged, so that the cells can be maintained in a good state.
  • it is not necessary to subculture cells i.e., to transfer to another container. It may be circulated.
  • the cells repeat division even after the cell sheet is formed, and dead cells and deteriorated cells are naturally dropped from the cell culture support. Cell sheets can be cultured and maintained for long periods.
  • epithelial cells When culturing epithelial cells, muscle cells, chondrocytes, etc., the function of these cells can be enhanced by repeatedly applying stress to the cell sheet. In addition, differentiation into epithelial cells, muscle cells, and chondrocytes can be promoted by the same operation.
  • the cell culture support may be deformed into a desired form in advance, and the cells may be seeded and cultured.
  • a cell culture support is formed into a tube shape, placed in a culture apparatus so as to float in the culture solution, and cells are seeded and cultured, a tube-shaped sheet can be obtained. it can.
  • the present invention also includes a cell sheet manufactured by the method for manufacturing a cell sheet according to the present invention and a cell structure manufactured using the cell sheet.
  • the cell sheet according to the present invention includes a cell culture support. Since such a cell sheet is produced without going through the process of peeling from the container, it is not damaged by peeling, and dead cells and deteriorated cells are automatically dropped during the manufacturing process. It is formed and has high quality and safety. In addition, it has excellent storage stability and is easy to transport.
  • the cell culture support is formed of a biocompatible material or a biodegradable material, it can be used for transplantation as it is.
  • the cell sheet has no polarity, it is possible to produce a higher-order cell structure having a heterogeneous cell binding surface by seeding and amplifying heterogeneous cells on at least one surface.
  • Such a structure is useful for various basic researches and regenerative medicine, and can also be used, for example, for screening drug candidates.
  • the cell sheet according to the present invention can freely control strength and flexibility, a cell sheet having appropriate strength and flexibility can be produced and deformed or laminated to obtain a desired sheet.
  • a cell structure having a shape and a function can also be produced.
  • a cell sheet is rolled to produce a blood vessel-like structure.
  • cell sheets can be laminated, or other types of cells can be cultured in the form of cell sheets.
  • Cell structures can be produced from such sheets, and models and pathological models that mimic tissues and organs in the body. It is also possible to do.
  • a cell sheet having a desired orientation and ordered structure can be produced.
  • Such a cell sheet can be applied to, for example, regeneration of myocardial tissue having cell orientation.
  • FIG. 8 shows an example in which a planar cell sheet laminated in two layers is installed in a microfluidic device 600 to produce a living body model such as an alveoli.
  • the microfluidic device 600 including the chamber 601 and the microchannels 602 and 603 above and below can be manufactured using a transparent material (for example, dimethylpolysiloxane (PDMS)) that can be microscopically observed.
  • a transparent material for example, dimethylpolysiloxane (PDMS)
  • PDMS dimethylpolysiloxane
  • a generally known microfabrication technique can be used for the production of the chamber by PDMS. Specifically, a PDMS solution that has been sufficiently degassed is poured into a mold made from the photocurable resin SU-8, heated at 120 ° C. for 15 minutes to solidify, and then peeled off from the mold.
  • a PDMS chamber 601 having microchannels above and below can be produced. Bonding was performed after the cell sheet 500 was installed so as to partition the upper and lower microchannels.
  • the microchannels 602 and 603 can have a depth of 4 mm to 8 mm, a channel height of 100 ⁇ m to 200 ⁇ m, and a longitudinal length of 2 to 3 cm, for example.
  • the tube 606 is connected so as to connect to each microchannel, and the microchannel 602 can be filled with the fluid A and the microchannel 603 can be filled with the fluid B using a commercially available small fluid pump 607.
  • Supply of the fluid B to the microchannel 603 is performed from the supply tank 605 via the pump 607, for example.
  • the supply of the fluid A to the microchannel 602 can be similarly performed from the supply tank via a pump (not shown in the figure).
  • the fluid A and the fluid B may be the same or different.
  • a medium suitable for cells in contact with each fluid may be used.
  • the alveoli are the basic units of the embryo, and are important organs that take oxygen into the blood and breathe carbon dioxide out of the blood during respiration.
  • the alveoli consists of lung epithelial cells that are outside the blood vessels and touching the air and vascular endothelial cells that are inside the blood vessels and are exposed to blood.
  • the two-layer cell sheet 500 made of each cell is arranged so that the lung epithelial cells are on the microchannel 602 side and the vascular endothelial cells are on the microchannel 603 side.
  • air is used as fluid A
  • vascular endothelial cell medium (DMEM and 10% serum) is used as fluid B.
  • DMEM and 10% serum vascular endothelial cell medium
  • a biological model can be easily produced by incorporating a cell sheet into a microfluidic device, and drug inspection and disease mechanisms can be investigated without using costly and laborious animal experiments.
  • FIG. 9 shows an example in which a planar cell sheet is deformed to produce a higher-order cell sheet structure.
  • the cell culture support made of SU-8 is strong even in a thin film, and the cell sheet according to the present invention is formed by strong adhesion between cells, it can be rolled using a tool such as tweezers.
  • a blood vessel model 700 can be produced, for example, by rolling a two-layer cell sheet composed of two different types of cells.
  • epithelial cells are seeded on a cell culture support having a mesh structure to prepare a cell sheet, and then vascular endothelial cells are seeded on the back side or the front side to prepare a second-layer cell sheet.
  • a cell sheet of each cell may be prepared first using another cell culture support and then bonded to produce a two-layer cell sheet.
  • a blood vessel model having epithelial cells on the outside and endothelial cells on the inside and having a lumen can be prepared.
  • the blood vessel model shown in FIG. 9 can be incorporated into a microfluidic device similar to that in FIG. 8, and fluid can be flowed to simulate various phenomena that occur in blood vessels.
  • a medium is placed around the epithelial cells, and a fluid (medium) is passed through the lumen on the endothelial cell side. Since the blood flow (blood pressure) can be imitated by flowing the culture medium at different flow rates, the influence of changes in blood pressure on the vascular cell tissue can be examined by such a configuration.
  • a layer of other cells may be further formed on the epithelial cell side.
  • FIG. 10 shows another method for producing a higher order structure of a cell sheet.
  • cells are seeded on a cell culture structure that has been deformed in advance into a desired shape, and, as in the case of a planar cell sheet, by extension and connection between cells, the surface of the deformed cell culture support or Cell sheets can be manufactured inside.
  • a cell culture support was made using a photolithographic method. First, a square mesh pattern was drawn on a photomask blank by electron beam drawing using an electron beam drawing apparatus of the University of Tokyo VDEC. Thereafter, gelatin as a sacrificial layer was applied onto the surface of a 4-inch silicon wafer by spin coating. Subsequently, the photocurable resin SU-8 was spin-coated on gelatin so as to have a thickness of 2 ⁇ m. Then, it was heated in steps of 65 ° C. for 1 minute and 95 ° C. for 2 minutes, followed by soft baking, followed by exposure and development.
  • a Kapton tape having a thickness of 75 ⁇ m was applied around the mesh pattern to reinforce (4), and then the wafer was immersed in hot water at 80 ° C. to dissolve the gelatin, and the SU-8 thin film formed on the wafer was recovered.
  • a cell culture support was obtained. An image of the obtained cell culture support is shown in FIG. Similarly, a cell culture support having a triangular or hexagonal mesh structure was also produced. The mesh region was a circle with a diameter of 4 mm, and the periphery was reinforced with 50 ⁇ m Kapton tape.
  • the cell culture support was first coated in a fibronectin solution (concentration 50-100 ⁇ g / mL) for 1 hour.
  • a cell culture apparatus in which a substrate 101 for suspension is installed in a container 10 is prepared, and a cell culture support 100 reinforced with a 50 ⁇ m-thick Kapton tape 102 is placed in a culture solution 11. Installed in a floating state.
  • mouse fetal fibroblasts (MEF), human fetal lung fibroblasts (TIG120), as adherent cells previously suspended in culture medium 11 in the direction of arrow 301 on cell culture support 100, Or it seed
  • a generally used culture dish was used for the container 10.
  • the cell culture medium used was Dulbecco's Modified Eagle Medium supplemented with 10% fetal bovine serum (Fetal Bovine Serum, FBS).
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • FIG. 5 shows a state in which MEF cells are stretched to fill the opening of the cell culture support and a cell sheet is formed.
  • the left panel of FIG. 5 is 18 hours and 40 minutes after seeding of the cells, and the right panel is 58 hours and 20 minutes after seeding. In the left panel, the mesh opening was not filled with cells, but in the right panel it was observed that a significant opening was filled with cells.
  • FIG. 6 shows a bright-field microscope image (A) and a fixed-stained image (B) of a cell sheet formed by culturing TIG cells for 3 days using a cell culture support having a triangular mesh structure.
  • Fixed staining was performed by a generally known method. First, formaldehyde (use concentration 4% in phosphate buffer) was added to the container 10 containing the cell sheet, allowed to stand at room temperature for 5 minutes, and then washed three times with a phosphate buffer. Next, a surfactant TritonX100 (use concentration 1% in phosphate buffer) was added and allowed to stand for 10 minutes, and then washed three times with a phosphate buffer.
  • formaldehyde use concentration 4% in phosphate buffer
  • TritonX100 use concentration 1% in phosphate buffer
  • the cell sheet was formed by a group of cells that were uniformly extended in a single layer. Moreover, it was confirmed from the state that the cytoskeleton structure extends in the lateral direction that the cell sheet has cell orientation.
  • FIG. 7 shows an image (A) obtained by culturing mouse ES cells in a culture dish and an image (B) obtained by culturing on a cell culture support.
  • FIG. 7A since mouse ES cells tend to form colonies with overlapping cells when cultured at the bottom of a culture dish, it was difficult to form a cell sheet by the conventional method.
  • using the cell culture support of the present invention it was confirmed that a cell sheet can be formed even with ES cells.
  • Cell sheets formed of pluripotent stem cells are considered to be particularly useful for regenerative medicine and research applications.
  • ES cells can be cultured by the method of FIG. 3A to produce a cell sheet. However, in this step, a cell sheet is formed 130 hours after the seeding of ES cells. However, if it is attempted to maintain the completed sheet for a long period of time, excess cells formed by cell division will gradually accumulate. This is shown in FIG. Therefore, as a measure for obtaining a single-layer cell sheet by dropping excess cells, a cell sheet was prepared with the cell culture support placed vertically. The results are shown in FIG.
  • FIG. 14A shows a state 45 hours after sowing
  • FIGS. 14B and 14C show a state after 140 hours. As shown in FIGS. 14B and 14C, there was no portion where cells were stacked, and a uniform and monolayer cell sheet could be obtained.

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Abstract

 本発明は、状態のよい細胞で形成された高品質で安全性の高い細胞シートを、継代を必要とせず作製及び維持できる細胞培養支持体、及びこれを使用して製造した細胞シート等を提供することを課題とする。本発明は、細胞培養を行うための細胞培養支持体であって、平面状メッシュ構造を有し、前記メッシュ構造の開口部は、培養する細胞が通過できる大きさである、細胞培養支持体を提供する。

Description

細胞培養支持体、細胞培養装置、細胞培養キット、及び細胞シート
 本発明は、メッシュ構造の細胞培養支持体、及びそれを用いて製造された細胞シート等に関する。
 細胞は生物の基本構成要素である。生物から取り出した細胞を人工的に増殖、維持することを細胞培養といい、これを可能にするのが細胞培養技術である。この技術は、基礎研究や医療を支える重要な技術であり、産業的価値も高い。
 線維芽細胞や上皮細胞などの接着性細胞の一般的な培養方法では、シャーレやフラスコ等の容器の底面上に細胞を播種して、十分な数まで増幅させる。このような培養方法では、細胞を播種する面が広く平坦であることが大きな特徴である。
 シャーレやフラスコを用いて培養する場合、細胞の数が増えてコンフルエント状態になると、細胞の接触障害(コンタクトインヒビション)が生じる。それ以上培養を続けると細胞の状態が悪くなるので、コンフルエント状態の70%程度まで細胞が増えたら、細胞を継代、すなわち容器底面に接着した細胞を剥離し、新しい培養装置に移して培養するのが一般的である。特に増殖の速い細胞の場合、毎日継代しなければならないため手間がかかり、コストも非常に高くなる。
 近年、培養した細胞を用いて様々な高次細胞構造を作製する方法が提案されている。その代表的な例として、細胞シートがあげられる。細胞シートとは、隣り合う細胞同士の相互結合により形成される、少なくとも単層のシート状の細胞集合体のことを言う。細胞シートは材料として再生医療などの分野で広く用いられ始めている(例えば特許文献1、2、非特許文献1、2)。
 このような細胞シートを製造する方法として、従来、目的の細胞をシャーレ等の容器に播種し、増殖させる方法が用いられている。しかしながら、上述のとおり、コンフルエント状態になると、コンタクトインヒビションが生じるので、継代が必要となり、手間とコストの問題が生じる。また、コンタクトインヒビションによって細胞の状態が変化しやすくなるため、長期間(例えば1ヶ月以上)細胞シートを安定に維持することが難しい。
 さらに、シャーレ等の容器を用いて培養する方法では、細胞が容器に接着するため、得られた細胞シートを容器から剥離させる必要がある。特に、細胞が容器に強く結合している場合、細胞シートを回収するために、機械的または化学的な操作を加える必要がある。
 機械的な細胞シート剥離方法としては、流れを起こして流体力学的なせん断応力の効果で細胞シートを容器から剥離させる方法(例えば特許文献1)や、器具等を用いて力学的に細胞シートを剥離させる方法がある(例えば非特許文献3、4)。しかし、このような剥離操作は、細胞にダメージを与えるのみならず、細胞同士の接着も壊してしまうため、細胞シートの実用的価値が損なわれてしまう(例えば非特許文献3、4)。
 化学的な細胞シート剥離方法としては、タンパク質分解酵素(プロテアーゼ)やコラーゲン分解酵素(コラーゲナーゼ)等のタンパク質分解酵素を作用させ、細胞と細胞培養支持体の結合を弱めて細胞シートを細胞培養支持体から剥離させる方法があげられる。しかし、これらのたんぱく質分解酵素の作用により細胞シートを形成する細胞同士の間の接着分子も分解されてしまう(例えば非特許文献3)。また、剥離に使われている一般的なタンパク分解酵素であるトリプシンは細胞毒性があることが明らかになっている(例えば非特許文献3、4)。よって、化学的な剥離を施した場合、細胞シートの破壊や品質の劣化による利用価値の低下が問題であった。
 刺激応答性高分子を用いた新たな細胞シート剥離方法も提案されている。例えば、温度応答性材料や光応答性材料等の刺激応答性高分子材料で被覆した容器で細胞を培養して細胞シートを作製した後、温度や光等の刺激を付与することにより、親水性や疎水性等の高分子材料表面の特性を変化させて、容器から細胞シートを剥離させる方法がある(例えば特許文献3、非特許文献5)。しかし、この方法では、特殊な高分子材料が必要なため、コストが高くなる。また、剥離の際に付与される温度や光等の刺激が細胞培養環境を変化させてしまうのみならず、足場がなくなると細胞シートの強度を保つ細胞内骨格構造が壊され、シートが縮まってしまうなど、細胞シートの性質が低下する(例えば非特許文献6)。さらに、刺激応答性高分子は、細胞培養液の影響を受けやすく、培養液中では機能しなくなることがあるという問題もあった。
 別の細胞シート作製手段として、培養容器表面に形成した凹凸の上や、培養容器に立てたマイクロピラーやナノピラーの上で細胞を培養する技術が提案されている(例えば特許文献2-4)。これらの方法は、細胞の剥離が容易で細胞へのダメージも少ないとされる。しかしながら、特許文献2および非特許文献7、8に記載されているように、細胞接着や接着した細胞の挙動は平面に接着する場合と凹凸表面に接着する場合とでは異なり、ナノピラー上では細胞の接着や伸展が遅くなったり、細胞表面から仮足が発生したりするという問題がある。また凹部が20μm以上の幅を有する場合には細胞が潜入してしまうという問題もある。凹部に細胞が隔離されると、細胞が隣の細胞と結合することが難しくなるため細胞シートを形成しにくい。また、凹部に細胞を高密度に播種すると、細胞同士が重なり合うため、均一な細胞シートの作製が難しい。
 従来、スキャフォールド(足場)として、細胞を誘導、増殖させるため、金属多孔質体、チタン等の生体適合性の高い金属の線材を絡合した不織布状のものが用いられている。これ以外にも、例えば非特許文献7には、生体適合性の高い線材をコイル状に形成し集積したものが記載されており、特許文献8では、チタンの薄板をアルカリ水溶液に浸漬させることで、細胞を誘導、増殖させる網目状の浸食層を備えた足場が開示されている。さらに、細胞培養の際、多孔性ポリマーのシートを足場として培養する方法も提案されている(特許文献9)。しかしながら、これらのスキャフォールドは、いずれも細胞に比較して大きな足場を有し、その足場に細胞が乗るような状態で培養される。すなわち、不織布、コイル、網目構造の隙間から細胞が落ちないようなサイズに設計されている。例えば、特許文献9には、ヒトPVMC由来の単球が吸着して培養されるためには、多孔性ポリマーの孔径が2μm~20μm程度であることが必要であり、孔径が2μm未満であると、培養足場として使用したとしても単球を効率的に吸着・培養させることができず、また、20μmを超える場合には、培養足場としての機能が低下すると記載されている。
 さらに、細胞シートを再生医療に用いる場合は、安全性が重要となる。しかしながら、シャーレ等の容器表面で細胞シートを作製する従来の方法では、死細胞を選択的に駆除することはできず、生細胞と死細胞の混在した細胞シートしか作製できなかった。また、上述のとおり、コンタクトインヒビションによる細胞の劣化も生じるので、安全上、このような細胞シートは再生医療を目的とした用途には向かない。
特開2010-29680号公報 特開2004-261533号公報 特公平6-104061号公報 特開2008-11766号公報 特開2004-170935号公報 特開2005-168494号公報 特開2011-15959号公報 特開2007-277718号公報 特開2006-262782号公報
S. Ito et al.、 Biomaterials et al.、 33、 2012:5278-5286. H. Masumoto et al. Stem Cells、 30(6)、 2012、:1196-1205. H. E. Canavan et al.、 J. Biomed. Mater. Res. A 25A、 2005:1-13. K. Jung et al.、 Cell Physiol. Biochem. 5、 1995: 353-360. Y. Hong et al.、 Biomaterials 34(1)、 2013: 11-18. T. Okano et al.、 Biomaterials、 16(4)、 1995. M. J. Dalby et al.、 Biomaterials 25 (2004) 5415-5422. C. C. Berry et al.、 Biomaterials 25 (2004) 5781-5788.
 本発明は、状態のよい細胞のみで形成された高品質で安全性の高い細胞シートを、継代を必要とせず作製及び維持できる細胞培養支持体、及びこれを使用して製造した細胞シート等を提供することを課題とする。
 本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体であって、メッシュ構造の開口部が培養する細胞より大きい細胞培養支持体を用意し、この細胞培養支持体を培養液中に浮かせた状態で細胞を播種すると、細胞が自発的にメッシュ状構造の開口部に伸展し、接触した細胞同士が接着・連結してメッシュ構造の開口部を埋め、単層の細胞シートが形成されることを見出した。
 また、このような細胞シートによれば、細胞がコンフルエント状態になることがなく、細胞が増殖しても死細胞や状態の悪い細胞は細胞培養支持体から自然に脱落するので、継代を行わずに長期間培養維持できること、状態の良い生細胞のみからなる安全性の高い細胞シートが得られることを確認した。
 さらに、平面状メッシュ構造の細胞培養支持体を、培養容器内に垂直(鉛直)に設置することにより、細胞同士が重なり合うことなく、単層のシートを得られることを見出し、このような効果は、培養液に流れを生じさせることでさらに高められることを確認した。
 得られる細胞シートは、細胞同士が連携して十分な強度を有する一方、適度な柔軟性を有しているので、1枚又は複数枚積層して様々な形状に成形することができ、各種の研究や再生医療に用いることができることを確認し、本発明を完成した。
 すなわち、本発明は、
〔1〕細胞培養を行うための細胞培養支持体であって、平面状メッシュ構造を有し、前記メッシュ構造の開口部は、培養する1個の細胞が通過できる大きさである、細胞培養支持体;
〔2〕前記メッシュ構造の開口部の最小径は、播種時の細胞の最大径より大きい、上記〔1〕に記載の細胞培養支持体;
〔3〕前記メッシュ構造のフレーム部の幅は、前記細胞培養支持体に接着した状態の細胞の最大径の半分以下である、上記〔1〕又は〔2〕に記載の細胞培養支持体;
〔4〕前記細胞培養支持体の厚みは、前記細胞培養支持体に接着した状態の細胞の最大径より小さい、上記〔1〕から〔3〕のいずれか1項に記載の細胞培養支持体;
〔5〕前記メッシュ構造の開口部が、三角形、四角形、六角形、又は多角形である、上記〔1〕から〔4〕のいずれか1項に記載の細胞培養支持体;
〔6〕前記メッシュ構造は、形状的異方性を有する、上記〔1〕から〔5〕のいずれか1項に記載の細胞培養支持体;
〔7〕光硬化性樹脂、生体適合性材料、及び生体分解性材料からなる群より選択される少なくとも1つの材料を含む、上記〔1〕から〔6〕のいずれか1項に記載の細胞培養支持体;
〔8〕弾性変形可能な材料で作製されている、上記〔1〕から〔6〕のいずれか1項に記載の細胞培養支持体;
〔9〕上記〔1〕から〔8〕のいずれか1項に記載の細胞培養支持体を装着可能な細胞培養装置であって、
 1又は2以上の前記細胞培養支持体を、培養液中に浮かせた状態で保持する部材を備える、細胞培養装置;
〔10〕上記〔1〕から〔8〕のいずれか1項に記載の細胞培養支持体を装着可能な細胞培養装置であって、
 1又は2以上の前記細胞培養支持体を、垂直に保持する部材を備える、細胞培養装置;
〔11〕さらに、培養液に流れを生じさせる部材を備える、上記〔9〕又は〔10〕に記載の細胞培養装置;
〔12〕上記〔1〕から〔8〕のいずれか1項に記載の細胞培養支持体と、上記〔9〕から〔11〕のいずれか1項に記載の細胞培養装置とを含む、細胞培養キット;
〔13〕上記〔1〕から〔8〕のいずれか1項に記載の細胞培養支持体に細胞を播種する工程と、
 前記細胞を培養する工程と、を含む細胞シートの製造方法;
〔14〕前記細胞を播種する工程の前に、細胞接着促進材料で細胞培養支持体をコーティングする工程をさらに含む、上記〔13〕に記載の方法;
〔15〕前記細胞を培養する工程において、繰り返し応力を印加することにより、細胞機能の強化及び/又は細胞の分化の促進を行う、上記〔13〕又は〔14〕に記載の方法;
〔16〕予め、前記細胞培養支持体を変形させてから、細胞培養装置に設置する、上記〔13〕から〔15〕のいずれか1項に記載の方法;
〔17〕前記細胞を培養する工程において、1又は2以上の前記細胞培養支持体を細胞培養装置内に垂直に設置し、培養液に、細胞培養支持体の主面と平行な方向の流れを生じさせる、上記〔13〕から〔15〕のいずれか1項に記載の方法;
〔18〕前記細胞を培養する工程において、1又は2以上の前記細胞培養支持体を細胞培養装置内に浮かせた状態で水平に設置する、上記〔13〕から〔15〕のいずれか1項に記載の方法;
〔19〕前記細胞を培養する工程において、複数の細胞培養装置を細胞装置内に設置し、細胞の大量培養を行う、上記〔13〕から〔18〕のいずれか1項に記載の方法;
〔20〕上記〔1〕から〔8〕のいずれか1項に記載の細胞培養支持体を含む細胞シート;
〔21〕上記〔9〕から〔12〕のいずれか1項に記載の細胞培養装置、上記〔12〕に記載の細胞培養キット、又は上記〔13〕から〔20〕のいずれか1項に記載の細胞シートの製造方法を用いて製造された細胞シート;及び
〔22〕上記〔20〕又は〔21〕に記載の細胞シートを変形又は積層して構成された細胞構造体、
に関する。
 本発明に係る細胞培養支持体によれば、細胞のサイズよりも大きな開口を有するメッシュ構造を埋めるように細胞が伸展し、細胞同士の接着により、強度及び柔軟性に優れた細胞シートを得ることができる。従来法のように容器の底面に接着させて細胞を培養しないため、得られた細胞シートを容器から剥離させる必要がなく、剥離によるダメージを受けることがない。
 また、容器の底面で細胞を培養して細胞のコロニーを形成するという従来の細胞培養方法では、コロニーの内側まで酸素・栄養等が回りにくく、細胞の状態が悪くなるという課題があった。これに対し、本発明に係る細胞培養支持体によれば、細胞シートの両面が培地に接していることから、どの細胞にも平等に酸素・栄養等がまわる。
 さらに、本発明に係る細胞培養支持体で培養すると、細胞がコンフルエント状態になることがなく、また死細胞や状態の悪い細胞は細胞培養支持体から自然に脱落する。したがって、細胞に変化や劣化が生じることなく長期間培養し維持することができるとともに、高品質で安全性の高い細胞シートを得ることができる。
 また、細胞がコンフルエント状態にならないことから継代の必要もないので手間がかからずコストも低下する。さらに、一つの容器の中で多数の細胞培養支持体を設置して細胞シートを作製することができるので、大量生産にも適する。
 本発明に係る細胞培養支持体を垂直方向に設置し、任意で培養液に流れを生じさせることにより、単層の培養シートをより短時間で得ることもできる。
 本発明に係る細胞シートは、積層、変形等して所望の形状に成形してもよく、また予め細胞培養支持体を要望の形状に変形させて(丸める、折り畳むなど)おいてからその裏表に細胞をまいてもよい。したがって、本発明に係る細胞シートの成形により、更に高次細胞構造体を作製でき、各種の研究や再生医療に有用である。
図1は、本発明に係る細胞培養支持体の製造方法の一例を示す概略図である。 図2は、本発明に係る細胞培養支持体の一例を示す顕微鏡画像である。 図3Aは、本発明に係る細胞培養支持体及び細胞培養装置を用いる細胞シートの製造方法の一態様を示す概念図である。 図3Bは、本発明に係る細胞培養支持体に、細胞を播種した直後の様子を示す概念図である。 図4は、本発明に係る細胞培養支持体を用いて細胞シートが形成された様子を示す概念図である。 図5は、本発明に係る細胞培養支持体を用いてMEF細胞による細胞シートを作製した様子を示す顕微鏡画像である。 図6Aは、本発明に係る細胞培養支持体を用いて作製したTIG細胞による細胞シートの明視野顕微鏡画像である。 図6Aは、本発明に係る細胞培養支持体を用いて作製したTIG細胞による細胞シートの固定染色画像である。 図7は、マウスES細胞を培養ディッシュで培養した様子(A)と、本発明に係る細胞培養支持体を用いて培養した様子(B)を示す顕微鏡画像である。 図8は、本発明に係る細胞シートの応用例であり、細胞シートをマイクロ流体デバイスに設置した2層構造の組織モデルを示す。 図9は、本発明に係る細胞シートの応用例であり、2層の細胞シートを作製してから変形させて血管モデルを製造する方法を示す概念図である。 図10は、予め細胞培養支持体を変形させてから細胞を播種・培養して細胞シートを製造する方法を示す概念図である。 図11は、水平に置いた細胞培養支持体で細胞シートを作製したときに、細胞分裂でできた余分な細胞が積みあがった様子を示す。 図12は、細胞培養支持体を垂直に置いた状態で作製した細胞シートを示す。 図13は、細胞培養支持体を垂直に置き、スターラーによって培養液に流れを生じさせる細胞シート作製装置の概念図である。 図14は、図13の装置で作製した細胞シートを示す。
(細胞培養支持体)
 本発明に係る細胞培養支持体は、平面状メッシュ構造を有し、メッシュ構造の各開口部が、培養する細胞が通過できる大きさであることを特徴とする。
 本明細書において「細胞培養支持体」は、培養液中に設置するとその形状に沿って細胞が増殖する構造体をいう。本発明に係る細胞培養支持体では、従来のスキャフォールドのように細胞より面積の大きな足場に細胞が定着して増殖するのではなく、メッシュの開口部に細胞が自発的に伸展することを特徴とする。
 従来は、一様な容器の底面で、あるいは、ポア等の細胞よりも小さい開口部を有する足場(スカフォルド)を培養支持体として用いていたため、細胞は足場に定着して増殖して組織を形成すると考えられていた。すなわち、従来は、細胞よりも大きい開口部に細胞が自発的に伸展して開口部を埋めるとはまったく考えられていなかった。これに対し、本発明者らは、細胞より大きな開口部を有するメッシュ構造の支持体を用いると、細胞同士が開口中心に向かって自発的に伸展して接着する結果、開口部を覆うように単層の細胞シートが形成されることを見出した。本発明は、かかる知見に基づくものである。
 本明細書において「細胞が伸展する」とは、細胞が特定の方向に向かって変形、成長、又は増殖することをいう。
 本明細書において「平面状メッシュ構造」とは、所定の形状の開口部が規則的または非規則的に繰り返し並んだ平面状の構造体を意味する。所定の形状の開口は、典型的には正三角形、正方形、正六角形などの正多角形であるが、円や楕円、その他の多角形であってもよい。また、開口部は、すべて同じ形状でなくてもよく、複数の開口部を1セットとして、かかるセットが規則的または非規則的に繰り返し並んだ平面状の構造体も、本発明に係る「平面状メッシュ構造」に含まれる。
 本明細書においては、平面状メッシュ構造の開口部以外の部分を「フレーム」又は「フレーム部」と呼ぶ場合もある。
 本発明に係る細胞培養支持体の開口部は、培養する細胞1個が通過できる大きさである。「開口部が培養する細胞1個が通過できる大きさである」とは、開口部と細胞のそれぞれの大きさが、細胞が変形して又はしないで、開口部を通過できる関係であることを意味する。開口部は、細胞が開口部に接触しないで通過できる大きさであってもよいし、開口部に接触して変形しながら通過できる大きさであってもよい。
 「開口部が培養する細胞1個が通過できる大きさである」例として、メッシュ構造の開口部の面積が、播種時の細胞1個の最大面積より大きい場合が挙げられる。細胞1個の最大面積とは、断面積が最大になるように細胞を切断した場合の面積をいう。播種時の細胞の最大面積とは、細胞が播種された時の状態、すなわち細胞が支持体に接着して伸展する前の状態での最大面積を意味する。
 また、本発明に係る細胞培養支持体は、開口部の最小径が、培養する細胞の播種時の最大径よりも大きいものであってもよい。開口部の最小径は、当業者が適宜測定することができるが、例えば、正多角形の場合、中心を通って辺上の二点を結ぶ直線のうち最短の直線の長さをいう。細胞の最大径は、細胞の周辺の二点を結ぶ直線のうち最長の直線の長さをいう。
 開口部の形状が2種以上ある場合、いずれかの開口部においてのみ、開口部の最少径が培養する細胞の播種時の最大径より大きくてもよいし、すべての開口部において、開口部の最少径が培養する細胞の播種時の最大径より大きくてもよい。
 開口部の最小径が、細胞の最大径より大きい場合、細胞培養支持体を水平に置いてその上方から細胞を播種すると、フレーム部に定着する細胞もあり、フレームに接触せずに下に落ちる細胞もある。フレーム部に定着した細胞だけでは、当初は開口部が埋まらないが、細胞が開口中心に向かって自発的に伸展していく結果、細胞シートが形成される。
 本発明に係る細胞培養支持体は、開口部の最小径が、培養する細胞の最大径の2倍、3倍、4倍、5倍、7倍、10倍等であってもよい。かかる場合も、フレーム部に播種された細胞が自発的に開口部に伸展し、細胞同士が連結して開口部を埋め、細胞シートが形成される。
 開口部が正多角形の場合、一辺の長さは特に限定されないが、例えば、30~250μm程度とすることができる。一辺の長さを調節することにより、細胞シートが形成されるまでの時間や、細胞シートの強度、柔軟性を制御することができる。一辺の長さは、50μm以上、60μm以上、80μm以上、100μm以上としてもよく、200μm未満、180μm未満、150μm未満等としてもよい。
 上述のとおりメッシュ構造の開口部は、三角形、四角形、六角形等とすることもでき、この形状によっても、細胞シートが形成されるまでの時間、細胞シートの強度や柔軟性などの物性を制御することが可能である。
 本発明に係る細胞培養支持体のメッシュ構造のフレーム部の幅は、特に限定されないが、例えば、細胞の最大径の半分以下としてもよい。上述のとおり、従来のスキャフォールドでは、細胞が定着するよう細胞の最大径と同等か、より大きな幅の構造体が用いられていたが、本発明に係る細胞培養支持体では、細胞の大きさよりも細いフレーム部を有するメッシュ構造を用いてもよい。
 本明細書において、「フレーム部の幅」は、フレームの長さ方向に垂直な方向の幅を意味する。フレーム部の幅は、細胞の最大径の3分の1以下、4分の1以下、5分の1以下、あるいはそれ以下であってもよい。
 また、フレーム部の幅は、例えば1~20μmとすることができ、2μm~15μm、3μm~10μm、4μm~5μm等としてもよいがこれらに限定されず、細胞培養支持体の材料や、培養する細胞の大きさに合わせて、当業者が適宜決定することができる。フレーム部の幅を調節することによっても、細胞シートの強度や柔軟性を制御することができる。また、最初に細胞を播種する際、細胞はフレーム部に接着するので、フレーム部の幅を調節することにより、接着する細胞数も制御できる。
 このように、比較的細いフレーム部と、比較的大きな開口部分を有するメッシュ構造を用いることにより、細胞が開口部に自発的に伸展し、隣り合った細胞が互いに接着して単層の細胞シートが形成される。
 本明細書において「単層の細胞シート」とは、細胞が略二次元に並び、隣り合った細胞同士が略隙間なく接着した構造体をいう。細胞シートが単層であるか否かは、例えば細胞核を染色し、細胞核がほぼ平面的に並んでいることによって確認することができる。全体として単層と認められる形状であればよく、一部の細胞が層状に重なっていてもよい。
 細胞培養支持体の厚みは、細胞培養支持体に接着した状態の細胞の最大径より小さくてもよい。例えば、例えば1~20μmとすることができ、2μm~15μm、3μm~10μm、4μm~5μm等としてもよいがこれらに限定されない。支持体の厚みは、得られる細胞シートの用途に応じて決定してもよい。
 メッシュ構造は、形状的異方性を有するものであってもよい。後述する実施例に示すとおり、メッシュ構造を非対称な形状にすると異方性が生じ、細胞の配向性を制御することができるので、所望の秩序構造を有する細胞シートを得ることができる。逆に、メッシュ構造の形状によっては、細胞が等方性に伸展し、配向性を有しない細胞シートが得られる。
 本発明に係る細胞培養支持体の材料は、細胞毒性を示さず、細胞シートが形成される限り特に限定されないが、例えば、光硬化性樹脂、生体適合性材料、生体分解性材料などを用いることができる。
 光硬化性樹脂を用いれば、後述するようにフォトリソグラフィ法によって細胞培養支持体を作製することができる。光硬化性樹脂としては、例えば、アクリレート化合物、メタクリレート化合物、エポキシ化合物、イソシアネート化合物、チオール化合物、シリコーン系化合物などが挙げられる。これらの2種以上を組み合わせて用いてもよい。光硬化性樹脂の具体例としては、ウレタンアクリレート、ポリエステルアクリレート、エポキシアクリレート、ポリ(メタ)アクリル酸メチル、エトキシ化ビスフェノールAアクリレート、脂肪族ウレタンアクリレート、ポリエステルアクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリカーボネート、アクリル変性脂環式エポキシド、2官能アルコールエーテル型エポキシド、アクリルシリコーン、アクリルジメチルシロキサン等が挙げられるがこれらに限定されない。
 生体適合性材料や生体分解性材料を用いて得られる細胞シートは、そのまま生体に移植するなど再生医療に好適に用いられる。
 生体適合性材料としては、シリコーン、ポリエーテルブロックアミド(PEBAX)、ポリウレタン、シリコーン-ポリウレタン共重合体、セラミックス、コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、ナイロン、ポリエチレンテレフタレート、ゴアテックス(商標)などの超高分子量ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、その他生体由来材料などが挙げられるがこれらに限定されない。
 本発明に係る細胞培養支持体は、生体適合性材料以外の材料で形成し、表面を生体適合性材料で処理したものであってもよい。
 生体分解性材料としては、ポリラクチド(PLA)、ポリグリコリド(PGA)、ポリカプロラクトン(PCL)、及びそれらの共重合体、PHB-PHV系ポリ(アルカン酸)類、ポリエステル類、デンプン、セルロース、キトサンなどの天然高分子やその誘導体などが挙げられるがこれらに限定されない。
 また、本発明に係る細胞培養支持体を、弾性変形可能な材料で作製することも好ましい。
 本発明に係る細胞培養支持体は、例えば周囲を補強して持ち運びしやすくするなど、各種の工夫を加えることができ、かかる工夫を加えた支持体も本発明に包含される。
(細胞培養支持体の製造方法)
 本発明に係る細胞培養支持体は、その構造、用途、材料等に応じて、当業者が公知の方法やそれに準ずる方法で適宜作製することができるが、一例として、フォトリソグラフィ法によって作製する方法が挙げられる。
 フォトリソグラフィを用いる場合、例えば、図1に示す方法で製造することができる。
 まず電子線描画、レーザ線描画、写真印刷等の方法によりフォトマスクの表面にメッシュ構造を描く。フォトマスクの表面に犠牲層となるゼラチンをスピンコーティングにより塗布した後(1)、光硬化性樹脂をスピンコーティングする(2)。その後、光硬化性樹脂の種類等に合わせて適宜加熱、露光、現像を行って光硬化性樹脂をパターニングし(3)、熱湯中でゼラチンを溶かすことにより(5)、光硬化性樹脂薄膜によって形成された細胞培養支持体を得ることができる。
 得られた細胞培養支持体は、周囲を補強することによって、細胞の培養に加え、移動や成形などの操作もしやすくなる。細胞培養支持体を補強する方法としては、例えばカプトンテープなどを周囲に貼る方法が挙げられる(4)。
 図1の方法は、特に、フレーム部の幅が1μmより小さい場合や、フレーム部の幅を高精度に成形したい場合に有効である。
 フォトリソグラフィを用いる場合、後述する実施例に示されるように、シリコンウェハー上にゼラチンと光硬化性樹脂を積層し、電子線描画などの方法によりメッシュパターンを描いたフォトマスクを介して露光及び現像してもよい。
(細胞培養装置)
 本発明は、本発明に係る細胞培養支持体を用いて細胞を培養するための細胞培養装置も包含する。
 一態様において、本発明に係る細胞培養装置は、細胞培養支持体を培養液中に浮かせた状態で保持する手段を備えることを特徴とする。
 本明細書において「培養液中に浮かせた状態で」とは、細胞培養支持体の両面が、細胞培養装置の内壁や底面に接触しておらず、両面とも培養液と十分に接触できる状態をいう。細胞培養支持体は、細胞培養装置内において、水平に設置しても垂直に設置してもよい。
 本明細書において「細胞培養支持体を培養液中に浮かせた状態で保持する部材」は、細胞培養支持体を安定に保持できる限り、どのような手段であってもよい。例えば、かかる部分は、細胞培養装置中に設置された台や、細胞培養装置の内壁や底に形成された溝とすることができる。
 一態様において、本発明に係る細胞培養装置は、細胞培養支持体を垂直に保持する部材を備えることを特徴とする。「細胞培養支持体を垂直に保持する」とは、平面上の細胞培養支持体を立てて保持することを意味する。一般に、増殖能の高い幹細胞は、培養すると積み重なってコロニーを形成することが多く、コロニーの中心の細胞に栄養が回らないことから細胞が死んでいくことがある。しかしながら、細胞培養支持体を垂直に置いて培養すると、余分な細胞を落とし,コロニーの形成が抑制され、単層の細胞シートを効率よく得ることができる。
 本発明に係る細胞培養装置は、細胞培養支持体を複数装着できるものであってもよい。例えば、細胞培養支持体の底面に平行な溝を複数形成しておけば、周囲を補強した細胞培養支持体を溝に差し込んで、底面に対し垂直になるように、複数の細胞培養支持体を平行に設置することができる。かかる構成によれば、少ないスペースで大量に細胞を培養することが可能となる。
 また、本発明に係る細胞培養装置は、培養液に流れを生じさせる部材を備えていてもよい。例えば、スターラーで撹拌することによって流れを生じさせることができる。流れを生じさせる場合、流れの方向は特に限定されないが、例えば細胞培養支持体の主面と平行な方向としてもよい。これにより、単層の細胞シートを効率よく製造することができる。細胞培養支持体を垂直に設置して、且つ、培養液に流れを生じさせると、一様な単層の細胞シートを、より効率よく作製することができる。
(細胞培養キット)
 本発明は、細胞培養支持体と細胞培養装置を備える細胞培養キットも包含する。かかるキットは、その他、粉末培地、培養液、細胞接着を促す材料(後述)、希釈用緩衝液等、使用説明書等を備えていてもよい。
(細胞シートの製造方法)
 本発明は、本発明に係る細胞培養支持体を用いて細胞シートを製造する方法も包含する。
 本発明に係る細胞シートの製造方法は、細胞培養装置に細胞培養支持体に細胞を播種する工程と、細胞を培養する工程とを含む。本発明に係る細胞培養装置を用いる場合は、細胞を播種する工程に先立って、細胞培養装置に細胞培養支持体を設置する。
 細胞培養装置に細胞培養支持体を設置する工程に先立ち、細胞培養装置及び細胞培養支持体は、適宜滅菌しておくことが好ましい。また細胞培養支持体を設置する前に、細胞培養装置には、細胞培養支持体を浸漬できる程度に培養液を満たしておく。培養液は細胞の種類に合わせて、当業者が適宜選択、調製することができる。培養液その他の材料もオートクレーブまたはろ過により滅菌するとよい。
 また、細胞培養支持体は、予め細胞接着促進材料でコーティングしてもよい。本明細書において「細胞接着促進材料」は、細胞を培養支持体に定着させて伸展や増殖をしやすくするために用いられ、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなどの細胞外マトリックスタンパク質、ポリLリジンなどの陽性電荷物質などが挙げられるがこれらに限定されない。細胞接着を促す材料によるコーティングは、例えば、コラーゲンの場合、約0.1%溶液に細胞培養支持体を浸漬させて一定時間インキュベートすることにより行うことができる。フィブロネクチンの場合は、約10μg/mlの溶液、マトリゲルは1%溶液(氷温)等を用いることができるが、濃度や温度は、当業者が適宜調節することができる。
 必要な前処理を行った細胞培養支持体は、「培養液中に浮かせた状態で」細胞培養装置に適宜設置する。細胞の播種は、公知の方法又はそれに準ずる方法で適宜行うことができる。例えば、培養液で細胞を懸濁し、ピペット等で細胞培養支持体に滴下すればよい。細胞数は、培養する細胞の種類や製造する細胞シートのサイズに応じて、適宜決定することができる。
 培養の温度や環境も細胞の種類に応じて、適宜決定すればよい。
 細胞を培養する工程では、培養液に流れを生じさせてもよい。細胞培養支持体の主面の近傍で、当該主面と平行な方向に流れを生じさせることにより、余分な細胞が積み重なってコロニーを形成するのを防ぐことができ、単層の細胞シートをより短時間で得ることができる。
 このとき、細胞培養支持体を垂直に置くと、一様な単層の細胞シートをより短時間で得ることができる。
 培養液の流れは、細胞を培養する工程の間、継続して生じさせてもよく、断続的に生じさせてもよい。例えば、細胞を播種してからしばらくは流れを起こさずに静置し、その後断続的に(例えば、5~20時間ごとに)、流れを起こしてもよい。
 培養液中に浮かせた状態で細胞培養支持体を設置することにより、すべての細胞が必要な栄養を培養液から取り込み、不要物を排出することができるので、細胞を良い状態で維持できる。また、本発明に係る細胞シートの製造方法では、細胞を継代、すなわち別の容器に移す必要がなく、必要に応じて細胞培養装置中に細胞培養支持体を設置したまま培養液を交換又は循環等すればよい。本発明に係る細胞培養支持体によれば、細胞シートが形成された後も細胞は分裂を繰り返し、死細胞や劣化した細胞は自然に細胞培養支持体から脱落するので、細胞培養装置中で、細胞シートを長期間培養及び維持することができる。
 上皮細胞、筋細胞、軟骨細胞などを培養する場合、細胞シートに繰り返し応力を印加することにより、これらの細胞の機能を強化することができる。また、同様の操作で、上皮細胞、筋細胞、軟骨細胞への分化を促進することも可能である。
 また、本発明に係る細胞シートの製造方法では、予め、細胞培養支持体を所望の形態に変形させてから、細胞を播種し培養してもよい。例えば、細胞培養支持体をチューブ状に成形し、培養液中に浮いた状態となるように培養装置内に配置し、これに細胞を播種して培養すれば、チューブ状のシートを得ることができる。
(細胞シート、細胞構造体)
 本発明は、本発明に係る細胞シートの製造方法によって製造された細胞シートと、これを利用して製造される細胞構造体も包含する。
 本発明に係る細胞シートは、細胞培養支持体を内包する。かかる細胞シートは、容器から剥離する工程を経ずに作製されるため、剥離によるダメージを受けず、また死細胞や劣化した細胞は製造過程で自動的に脱落するので、状態のよい細胞のみで形成されており、品質及び安全性が高い。また、保存性にも優れ、輸送もしやすい。
 細胞培養支持体を生体適合性材料や生体分解性材料で形成すれば、そのまま移植に用いることもできる。
 また、細胞シートは極性を持たないので、少なくとも1面に異種の細胞を播種して増幅させ、異種細胞の結合面を有する高次細胞構造体を製造することもできる。かかる構造体は、各種基礎研究及び再生医療に有用であり、例えば医薬品候補のスクリーニング等に用いることもできる。
 また、本発明に係る細胞シートは、強度や柔軟性を自由に制御できるので、適当な強度及び柔軟性を有する細胞シートを作製し、これを変形させたり、積層させたりすることにより、所望の形状及び機能を有する細胞構造体を作製することもできる。一例として、細胞シートを丸めて血管様構造を作製することが挙げられる。
 また、細胞シートを積層したり、細胞シート状で別の種類の細胞を培養したりすることもでき、かかるシートで細胞構造体を作製し、体内の組織や器官を模したモデルや病態モデルとすることも可能である。
 また、上述のとおり、メッシュ構造に形状的異方性を持たせることにより、所望の配向性や秩序構造を有する細胞シートを作製することができる。かかる細胞シートは、例えば細胞配向性を有する心筋組織の再生等に応用することが可能である。
 図8~10に、細胞シートの応用例を示す。
 図8は、2層に積層した平面状細胞シートをマイクロ流体デバイス600中に設置し、肺胞等の生体モデルを作製する例を示している。チェンバー601を備え、上下にマイクロチャネル602および603を備えたマイクロ流体デバイス600は、顕微鏡観察のできる透明な材料(例えばジメチルポリシロキサン(PDMS:Polydymethylsiloxane))により作製することができる。PDMSによるチェンバーの作製は一般的に知られる微細加工技術を用いることができる。具体的には光硬化樹脂SU-8より作製したモールドに十分に脱気したPDMS溶体を流し込み、120℃で15分加熱して固めてからモールドから剥離すればよい。
 この方法で作った2つのPDMSを精密に合わせて接着剤でボンディングすることにより、上下にマイクロチャネルを有するPDMSチェンバー601を作製することができる。
 ボンディングは細胞シート500が上下マイクロチャネルを仕切るように設置してから行った。
 マイクロチャネル602および603は、例えば、奥行4mm~8mm、チャネル高さ100μm~200μm、そして長手方向の長さ2~3cmとすることができる。
 それぞれのマイクロチャネルに繋がるように管606を繋ぎ、市販の小型流体ポンプ607を用いてマイクロチャネル602に流体A、マイクロチャネル603に流体Bを充満させることができる。マイクロチャネル603への流体Bの供給は、例えば、ポンプ607を介して供給タンク605から行う。マイクロチャネル602への流体Aの供給も、同様にポンプを介して供給タンクから行うことができる(図中省略)。なお、流体Aおよび流体Bは同じであっても良く、異なってもよい。例えば、それぞれの流体に接する細胞に適した培地であっても良い。
 図8に示すマイクロ流体デバイス600を、肺胞モデルとして利用する方法を説明する。
 肺胞は胚の基礎ユニットであり、呼吸の際、酸素を血液に取り込み、逆に二酸化炭素を血液から排出する、重要な器官である。肺胞の構成は、血管の外側にあり空気に触れている肺上皮細胞と血管の内側にあり血液にさらされている血管内皮細胞からなる。
 上記マイクロ流体デバイス600を用いた肺胞の生体モデルでは、マイクロチャネル602側に肺上皮細胞、マイクロチャネル603側に血管内皮細胞がくるように、それぞれの細胞で製造した2層細胞シート500を配置する。そして流体Aとして空気を用い、流体Bとして血管内皮細胞の培地(DMEMと10%血清)を用いる。流体Bの流速604を変化させることにより、血圧の変化を模すことができる。その際、空気に触れている上皮細胞の応答を、対物レンズ608を通して経時的顕微鏡観察を行うことにより評価する。細胞応答の評価指標には計測方法が一般的に知られる細胞内カルシウムイオン濃度変化を用いてもよい。
 この肺胞モデルを用いれば、薬品検査を行うことも可能である。その場合、効果を調べたい薬品を例えばマイクロチャネル603の流体Bに異なる濃度で混合しておき、一定時間流体Bを流した後、それぞれの細胞への影響を顕微鏡観察により行う。同様に、マイクロチャネル602の空気にも目的の薬品を異なる濃度で混合して充満させ、一定時間作用させた後、細胞応答(細胞の形状や細胞の活動等)を計測することにより薬品効果を調べることができる。
 以上のように細胞シートをマイクロ流体デバイスに組み込むことで簡単に生体モデルを作製でき、コストと手間のかかる動物実験を用いずに薬品検査や病気のメカニズムを調べることができる。
 図9に、平面細胞シートを変形させて高次細胞シート構造体を作製する例を示す。SU-8でできた細胞培養支持体は薄膜でも強靭であり、かつ本発明に係る細胞シートは細胞同士の強い接着によってできているため、ピンセット等の道具を用いて丸めることができる。例えば、図9に示すように、異なる2種の細胞からなる2層細胞シートを丸めることにより、例えば血管のモデル700を作製できる。この場合は、メッシュ構造の細胞培養支持体にまず上皮細胞を播種して細胞シートを作製した後、その裏側または表側に血管内皮細胞を播種して2層目の細胞シートを作製する。
 別の方法では、別の細胞培養支持体を用いてそれぞれの細胞の細胞シートをまず作製し、次に張り合わせて2層の細胞シートを作製しても良い。
 次に、血管内皮細胞が内側に来るように2層の細胞シートを丸めることにより、外側に上皮細胞、内側に内皮細胞が存在し、内腔を有する血管モデルを作製できる。図9に示している血管モデルを、図8と同様のマイクロ流体デバイスに組み込み、流体を流して、血管に生じる様々な現象を模すことができる。
 例えば、上皮細胞の周囲には培地を配置し、内皮細胞側の内腔に流体(培地)を流す。異なる流速で培地を流すことにより、血流(血圧)を模すことができるので、このような構成により、血圧の変化が血管細胞組織に及ぼす影響を調べることができる。上皮細胞側には、さらに他の細胞による層を形成してもよい。
 図10には、別の細胞シート高次構造の作製方法を示す。この方法では、予め所望の形に変形した細胞培養構造体上に細胞を播種し、平面細胞シートの場合と同様に、細胞同士の伸展と連結により、変形された細胞培養支持体の表面上または内部に細胞シートを製造できる。
 本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
 以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。
(細胞培養支持体の作製)
 細胞培養支持体を、フォトリソグラフィ法を用いて作製した。まず、東京大学VDECの電子線描画装置を用い、電子線描画によりフォトマスクブランクに正方形のメッシュパターンを描いた。その後、4インチのシリコンウェハーの表面上に犠牲層となるゼラチンをスピンコーティングにより塗布した。続いて、ゼラチンの上に光硬化性樹脂SU-8を、厚みが2μmとなるようにスピンコーティングした。その後、65℃で1分、95℃で2分と段階的に加熱しソフトベークを行い、次に露光及び現像を行った。その後、メッシュパターンの周囲に厚み75μmのカプトンテープを貼って補強し(4)、次にウェハーを80℃の熱湯に浸してゼラチンを溶かし、ウェハー上に形成されたSU-8薄膜を回収し、細胞培養支持体を得た。
 得られた細胞培養支持体の画像を図2に示す。
 同様に三角形状、六角形状のメッシュ構造の細胞培養支持体も作製した。メッシュ領域は直径4mmの円とし、周囲を50μmのカプトンテープで補強した。
(細胞培養装置への細胞培養支持体の設置、及び細胞の播種)
 細胞培養支持体は、まずフィブロネクチン溶液(濃度50~100μg/mL)に1時間浸してコーティングした。
 次に、図3Aに示すように、容器10に吊るし用基材101を設置した細胞培養装置を用意し、厚み50μmのカプトンテープ102で補強された細胞培養支持体100を、培養液11中に浮かせた状態でに設置した。
 続いて、細胞培養支持体100の上に、矢印301の方向で、培養液11に予め懸濁した付着性細胞として、マウス胎児線維芽細胞(MEF)、ヒト胎児肺線維芽細胞(TIG120)、又はマウス胚性幹細胞(ES細胞)を載せるように播種した。
 容器10には、一般的に用いられる培養ディッシュを用いた。細胞培養液には、Dulbecco's Modified Eagle Mediumに牛胎児血清(Fetal Bovine Serum、FBS)を10%加えたものを用いた。
 細胞培養支持体100に細胞を播種した直後の概念図を図3Bに示す。
(細胞の培養、細胞シートの形成1)
 細胞は37℃、5%CO2環境で培養した。
 細胞21は、まず細胞培養支持体のフレーム部に付着するが、徐々に伸展し、細胞シートを形成した。形成された細胞シートの概念図を図4に示す。細胞培養支持体100のメッシュ間隔は、細胞21の最大径のおよそ3倍程度であるが、細胞はメッシュの開口部に自発的に伸展し、接触した細胞同士が連結して、細胞シート22を形成した。
 図5に、MEF細胞が伸展して細胞培養支持体の開口部が埋められ、細胞シートが形成される様子を示す。図5の左側のパネルは細胞の播種から18時間40分後、右側のパネルは58時間20分後である。左側のパネルでは、メッシュの開口部が細胞で埋まっていなかったが、右側のパネルではかなりの開口部が細胞で埋まっていることが観察された。
 図6に、三角形状のメッシュ構造の細胞培養支持体を用いて、TIG細胞を3日間培養して形成された細胞シートの明視野顕微鏡画像(A)と、固定染色画像(B)を示す。固定染色は一般的に知られる方法で行った。まず、formaldehyde(使用濃度4% in リン酸バッファー)を細胞シートを含む容器10に加え、常温で5分間安置した後、リン酸バッファーで3回洗浄した。次に、界面活性剤TritonX100(使用濃度1% in リン酸バッファー)を加え、10分間安置した後、リン酸バッファーで3回洗浄した。次に、非特異的染色防止のため1%BSA(牛胎児血清)により30分間ブロッキング処理を行い、アクチン細胞骨格構造の蛍光染色試薬であるAlexa488-Phalloidin(Invitrogen社)によりメーカー指定濃度で1時間染色を行った。その後、リン酸バッファーで3回洗浄し、顕微鏡観察を行い、明視野顕微鏡画像(A)および固定染色画像(B)を取得した。
 細胞培養支持体100の開口部を細胞21が満遍なく伸展し、細胞シート22が形成された。図6Bでは、細胞核23とアクチン細胞骨格構造24が観察された。細胞核の局在から、細胞シートは略単層で均一に伸展した細胞群によって形成されていることがわかった。
 また、細胞骨格構造が横方向に伸びている様子から、細胞シートには細胞の配向性があることが確認された。
 図7に、マウスES細胞を培養ディッシュで培養した画像(A)と、細胞培養支持体で培養した画像(B)を示す。図7Aに示されるように、マウスES細胞は、培養ディッシュの底で培養すると細胞が重なり合ったコロニーを形成する傾向があるため、従来法では細胞シートを形成するのが困難であった。一方、本発明の細胞培養支持体を用いれば、ES細胞でも細胞シートが形成できることが確認された。多能性幹細胞で形成された細胞シートは、再生医療や研究用途に特に有用であると考えられる。
(細胞の培養、細胞シートの形成2)
 上記「細胞の培養、細胞シートの形成1」に記載したとおり、図3Aの方法でES細胞を培養して細胞シートを作製することが可能である。但し、この工程では、ES細胞を播種してから130時間で細胞シートが形成されるが、できあがったシートを長期的に維持しようとすると、細胞分裂でできた余分な細胞が段々積もってくる。この様子を図11に示す。
 そこで、余分な細胞を落として単層な細胞シートを得るための対策として、細胞培養支持体を垂直に置いた状態で細胞シートを作製した。結果を図12に示す。
 また、より効果的に余分な細胞を落とす方法として、細胞培養支持体を垂直に置き、且つ、スターラーによって培養液を撹拌しながら細胞シートを作製した。この方法を実施した時の装置の様子を図13に示す。細胞播種後、45時間静置培養した後、7時間流れを付加し、再度15時間静置培養した後、6時間流れを付加した。スターラーの回転数は250rpmとした。
 播種から45時間後と140時間後の様子を図14に示す。図14Aは、播種から45時間後の様子であり、図14B及びCは140時間後の様子である。図14B及びCに示されるとおり、細胞が積もった部分がなく,、一様で単層の細胞シートを得ることができた。
 10…容器、11…培養液、21…細胞、22…細胞シート、23…細胞核、24…細胞骨格構造、100…細胞培養支持体、101…吊るし用基材、102…補強剤、600…マイクロ流体デバイス、700…血管モデル

Claims (22)

  1.  細胞培養を行うための細胞培養支持体であって、平面状メッシュ構造を有し、前記メッシュ構造の開口部は、培養する1個の細胞が通過できる大きさである、細胞培養支持体。
  2.  前記メッシュ構造の開口部の最小径は、播種時の細胞の最大径より大きい、請求項1に記載の細胞培養支持体。
  3.  前記メッシュ構造のフレーム部の幅は、前記細胞培養支持体に接着した状態の細胞の最大径の半分以下である、請求項1又は2に記載の細胞培養支持体。
  4.  前記細胞培養支持体の厚みは、前記細胞培養支持体に接着した状態の細胞の最大径より小さい、請求項1から3のいずれか1項に記載の細胞培養支持体。
  5.  前記メッシュ構造の開口部が、三角形、四角形、六角形、又は多角形である、請求項1から4のいずれか1項に記載の細胞培養支持体。
  6.  前記メッシュ構造は、形状的異方性を有する、請求項1から5のいずれか1項に記載の細胞培養支持体。
  7.  光硬化性樹脂、生体適合性材料、及び生体分解性材料からなる群より選択される少なくとも1つの材料を含む、請求項1から6のいずれか1項に記載の細胞培養支持体。
  8.  弾性変形可能な材料で作製されている、請求項1から6のいずれか1項に記載の細胞培養支持体。
  9.  請求項1から8のいずれか1項に記載の細胞培養支持体を装着可能な細胞培養装置であって、
     1又は2以上の前記細胞培養支持体を、培養液中に浮かせた状態で保持する部材を備える、細胞培養装置。
  10.  請求項1から8のいずれか1項に記載の細胞培養支持体を装着可能な細胞培養装置であって、
     1又は2以上の前記細胞培養支持体を、垂直に保持する部材を備える、細胞培養装置。
  11.  さらに、培養液に流れを生じさせる部材を備える、請求項9又は10に記載の細胞培養装置。
  12.  請求項1から8のいずれか1項に記載の細胞培養支持体と、請求項9から11のいずれか1項に記載の細胞培養装置とを含む、細胞培養キット。
  13.  請求項1から8のいずれか1項に記載の細胞培養支持体に細胞を播種する工程と、
     前記細胞を培養する工程と、を含む細胞シートの製造方法。
  14.  前記細胞を播種する工程の前に、細胞接着促進材料で細胞培養支持体をコーティングする工程をさらに含む、請求項13に記載の方法。
  15.  前記細胞を培養する工程において、繰り返し応力を印加することにより、細胞機能の強化及び/又は細胞の分化の促進を行う、請求項13又は14に記載の方法。
  16.  予め、前記細胞培養支持体を変形させてから、細胞培養装置に設置する、請求項13から15のいずれか1項に記載の方法。
  17.  前記細胞を培養する工程において、1又は2以上の前記細胞培養支持体を細胞培養装置内に垂直に設置し、培養液に、細胞培養支持体の主面と平行な方向の流れを生じさせる、請求項13から15のいずれか1項に記載の方法。
  18.  前記細胞を培養する工程において、1又は2以上の前記細胞培養支持体を細胞培養装置内に浮かせた状態で水平に設置する、請求項13から15のいずれか1項に記載の方法。
  19.  前記細胞を培養する工程において、複数の細胞培養装置を細胞装置内に設置し、細胞の大量培養を行う、請求項13から18のいずれか1項に記載の方法。
  20.  請求項1から8のいずれか1項に記載の細胞培養支持体を含む細胞シート。
  21.  請求項9から12のいずれか1項に記載の細胞培養装置、請求項12に記載の細胞培養キット、又は請求項13から20のいずれか1項に記載の細胞シートの製造方法を用いて製造された細胞シート。
  22.  請求項20又は21に記載の細胞シートを変形又は積層して構成された細胞構造体。
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