JP6690001B2 - 細胞組織の製造方法、及び多孔フィルム - Google Patents

Description

本開示は、細胞組織の製造方法、及び細胞組織の製造に供する多孔フィルムに関する。

生体内へ細胞又は細胞組織を移植することを目的に使用される、細胞を濃縮するフィルタ、細胞を増殖させるための足場材、細胞を生着させて生体内へと移植するための移植材が知られている。

例えば特開２０１２−００６０１０号公報には、目的とする細胞を大きさで分離する複合多孔膜が開示されている。例えば国際公開第２００６／０９３２０７号には、細胞培養面に孔がハニカム配列した培養基材が開示されている。例えば特開２００５−１１０７０９号公報には、骨髄間葉系幹細胞を生着させ骨芽細胞に分化誘導後に骨欠損部に移植する骨補填材として、貫通孔と連通孔とが組み合わされてなる骨補填材が開示されている。例えば特開２００４−２１６１１９号公報には、細胞が生着して増殖するための足場材として、厚さ方向に長い形状の孔が面方向に並列的に配置され各孔間が小孔で連通した構造を有する多孔性支持体が開示されている。例えば特開２００８−１９９９６２号公報には、三次元網目構造を有する多孔質フィルム表面に、複数個の細胞接着性領域と、細胞接着性領域を取り囲む細胞非接着性領域とが配置されたスフェロイド形成用基材が開示されている。例えば特開２００１−５２３４８３号公報には、骨形成原細胞が生着して増殖するための足場材として、相互に連結した孔を含んでなる多孔性ポリマースカフォードが開示されている。例えば特開２００８−３０７１８０号公報には、構造体内部に幹細胞を注入し生体内に移植する移植材として、縦横格子状に配置した支柱を積層してなるスカフォールドが開示されている。例えば特許第４４３７２２７号公報には、非水溶性ポリマーからなる筒状多孔質体と、筒状多孔質体の内面を被覆する血管内皮細胞と、筒状多孔質体の外面を被覆する血管平滑筋細胞とを含む人工血管が開示されている。

現在、皮膚、軟骨といった、構造が比較的単純な細胞組織が人工的に作られ、移植医療の現場で使われている。一方で、多様な細胞が複雑な構造を形成している臓器、例えば肝臓、膵臓などを代替する人工的な細胞組織の実用化が待ち望まれているが、そのためには、臓器特異的な細胞が機能的に配置し且つ血管網とリンパ管網とを備えた細胞組織を製造する必要がある。また、動物実験や臨床試験に替わる試験用細胞組織としても、生体内の臓器に似た構造を有する細胞組織が待たれている。

本開示は、上記状況のもとになされた。
本開示は、マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織を製造する製造方法、及び、マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織の製造に供する多孔フィルムを提供することを目的とする。

上記の課題を解決するための具体的手段には、以下の態様が含まれる。

［１］ 表面に設けられた複数の開孔と、互いに隣接する開孔どうしを連通する連通孔とを有する多孔フィルムの開孔及び連通孔の内部で、フィーダー能を有する細胞を培養する培養工程を含む、細胞組織の製造方法。
［２］ 培養工程が、フィーダー能を有する細胞と、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞の少なくともいずれかとを、開孔及び連通孔の内部で共培養する培養工程である、［１］に記載の細胞組織の製造方法。
［３］ 培養工程が、フィーダー能を有する細胞と、実質臓器を形成する細胞とを、開孔及び連通孔の内部で共培養する培養工程である、［１］に記載の細胞組織の製造方法。
［４］ 培養工程が、フィーダー能を有する細胞と、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞の少なくともいずれかと、実質臓器を形成する細胞とを、開孔及び連通孔の内部で共培養する培養工程である、［１］に記載の細胞組織の製造方法。
［５］ フィーダー能を有する細胞が、間葉系幹細胞及び線維芽細胞の少なくともいずれかである、［１］〜［４］のいずれか１つに記載の細胞組織の製造方法。
［６］ 複数の開孔が、多孔フィルムの表面にハニカム状に配置されている、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の細胞組織の製造方法。
［７］ 連通孔が、多孔フィルムの面方向全域に亘って略同一の深さに設けられている、［１］〜［６］のいずれか１つに記載の細胞組織の製造方法。
［８］ 連通孔の孔径が、多孔フィルムに播種される細胞の長径に対して５０％〜５００％の範囲である、［１］〜［７］のいずれか１つに記載の細胞組織の製造方法。
［９］ 連通孔の孔径が５μｍ〜５０μｍの範囲である、［１］〜［８］のいずれか１つに記載の細胞組織の製造方法。
［１０］ 連通孔の孔径の変動係数が３０％以下である、［１］〜［９］のいずれか１つに記載の細胞組織の製造方法。
［１１］ 開孔の、多孔フィルムの面方向における長径が１０μｍ〜１００μｍの範囲である、［１］〜［１０］のいずれか１つに記載の細胞組織の製造方法。
［１２］ 開孔の深さが１０μｍ〜１００μの範囲である、［１］〜［１１］のいずれか１つに記載の細胞組織の製造方法。
［１３］ 開孔の開口径が５μｍ〜９０μｍの範囲である、［１］〜［１２］のいずれか１つに記載の細胞組織の製造方法。
［１４］ 開孔の開口径の変動係数が２０％以下である、［１］〜［１３］のいずれか１つに記載の細胞組織の製造方法。
［１５］ 培養工程の前に、多孔フィルムの複数の開孔が開口した側の面に細胞を播種した後、細胞を播種した側の面から反対面に向かう方向に遠心力をかけ細胞を複数の開孔の内部に移動させる遠心処理工程を含む、［１］〜［１４］のいずれか１つに記載の細胞組織の製造方法。
［１６］ 表面に設けられた複数の開孔と、互いに隣接する開孔どうしを連通する連通孔とを有する多孔フィルムであって、開孔の、多孔フィルムの面方向における長径が２０μｍ〜１００μｍの範囲である、多孔フィルム。
［１７］ 表面に設けられた複数の開孔と、互いに隣接する開孔どうしを連通する連通孔とを有する多孔フィルムであって、開孔の深さが２０μｍ〜１００μｍの範囲である、多孔フィルム。
［１８］ 開孔の開口径が５μｍ〜９０μｍの範囲である、［１６］又は［１７］に記載の多孔フィルム。
［１９］ 連通孔の孔径が５μｍ〜５０μｍの範囲である、［１６］〜［１８］のいずれか１つに記載の多孔フィルム。
［２０］ 複数の開孔が、多孔フィルムの表面にハニカム状に配置されている、［１６］〜［１９］のいずれか１つに記載の多孔フィルム。

本開示によれば、マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織を製造する製造方法、及び、マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織の製造に供する多孔フィルムが提供される。

多孔フィルムの構造を示す斜視図である。 図１Ａにおける開口面側から見た平面図である。 図１Ｂにおけるｃ−ｃ線に沿った断面図である。 図１Ｂにおけるｄ−ｄ線に沿った断面図である。 多孔フィルムの製造方法の一例を示す模式図である。 多孔フィルムの走査型電子顕微鏡像である。 培養デバイスの部品及び培養デバイスの一例である。 多孔フィルムの断面及び表面の走査型電子顕微鏡像である。 多孔フィルムの断面及び表面の走査型電子顕微鏡像である。 間葉系幹細胞から分化誘導した細胞におけるアクチンの蛍光免疫染色像である。 血管内皮細胞を単独培養した又は間葉系幹細胞と血管内皮細胞を共培養した培養３日目の細胞におけるＣＤ３１の蛍光免疫染色像（低倍率）である。 同じく培養３日目の細胞におけるＣＤ３１の蛍光免疫染色像（高倍率）である。 同じく培養７日目の細胞におけるＣＤ３１の蛍光免疫染色像（高倍率）である。 間葉系幹細胞と血管内皮細胞の共培養におけるネットワークの全長及び総面積を示すグラフである。 間葉系幹細胞又は線維芽細胞と血管内皮細胞を共培養した培養３日目の細胞におけるＣＤ３１の蛍光免疫染色像である。 同じく培養７日目の細胞におけるＣＤ３１の蛍光免疫染色像である。 培養３日目におけるネットワークの全長及び総面積を示すグラフである。 培養７日目におけるネットワークの全長及び総面積を示すグラフである。 開孔寸法の異なる多孔フィルムを用いて間葉系幹細胞と血管内皮細胞を共培養した培養３日目の細胞におけるＣＤ３１の蛍光免疫染色像（低倍率）である。 同じく培養３日目の細胞におけるＣＤ３１の蛍光免疫染色像（高倍率）である。 同じく培養７日目の細胞におけるＣＤ３１の蛍光免疫染色像（低倍率）である。 同じく培養７日目の細胞におけるＣＤ３１の蛍光免疫染色像（高倍率）である。 培養３日目及び７日目におけるネットワークの全長及び総面積を示すグラフである。 ３種類の細胞を同時に共培養した培養３日目の蛍光像である。 同じく培養３日目の細胞におけるＣＤ３１の蛍光免疫染色像である。 ３種類の細胞を段階的に共培養した共培養３日目の蛍光像である。 同じく共培養３日目の細胞におけるＣＤ３１の蛍光免疫染色像である。 共培養３日目における、同時共培養、段階的共培養それぞれのネットワークの全長及び総面積を示すグラフである。

以下に、本開示の実施形態について説明する。これらの説明及び実施例は実施形態を例示するものであり、発明の範囲を制限するものではない。

本開示において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ下限値及び上限値として含む範囲を示す。

本開示において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。

本開示において組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数種存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数種の物質の合計量を意味する。

本開示においては、変動係数を百分率で示す。変動係数は、ある集団について標準偏差を平均で除した値であり、その集団のばらつきの度合いを示す指標である。

＜多孔フィルム＞
本実施形態の細胞組織の製造方法は、生体外において細胞組織を製造する方法であり、表面に設けられた複数の開孔と、互いに隣接する開孔どうしを連通する連通孔とを有する多孔フィルムの開孔及び連通孔の内部で、細胞を培養する培養工程を含む。まず、細胞組織の製造に供する多孔フィルムについて説明する。本実施形態の多孔フィルムは、細胞が生着し組織を形成するための足場として機能する。

本実施形態の多孔フィルムは、表面に設けられた複数の開孔と、互いに隣接する開孔どうしを連通する連通孔とを有する。多孔フィルムが備える開孔及び連通孔の壁面は、細胞が生着する足場となる。本実施形態の多孔フィルムに播種された細胞は、開孔及び連通孔の内部に生着し、マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織を形成する。

以下、多孔フィルムの一例を、図面を参照しつつ説明する。各図面において同一又は等価な構成要素及び部分には同一の参照符号を付与している。以下の説明において、「面方向」とは、多孔フィルムの主面方向を意味し、「厚さ方向」とは、多孔フィルムの厚さ方向を意味する。以下の説明において、「長径」とは、輪郭上の任意の２点間距離のうちの最大長を意味し、但し方向が特定されている場合は、その方向の任意の２点間距離のうちの最大長を意味する。以下の説明において、「開口の中心」とは、開口を面方向の２次元図形と捉えた場合の重心を意味する。

図１Ａは、多孔フィルムの構造を示す斜視図であり、図１Ｂは、図１Ａにおける開口面側から見た平面図であり、図１Ｃは、図１Ｂにおけるｃ−ｃ線に沿った断面図であり、図１Ｄは、図１Ｂにおけるｄ−ｄ線に沿った断面図である。図１Ａ〜図１Ｄには、本実施形態の一例である多孔フィルム２００を示す。

多孔フィルム２００は、面方向に複数の開孔２１０が配置された多孔層２０４と、多孔層２０４を支持する支持体２０２とを備える積層体である。ほかの例として、多孔フィルム２００は、支持体２０２を備えず、多孔層２０４のみの単層体でもよい。

多孔フィルム２００の多孔層２０４には、面方向全域に亘って開孔２１０が配置されている。ただし、多孔層２０４に細胞が接触し得ない領域が有る場合、該領域には開孔２１０が配置されていなくてもよい。

多孔フィルム２００の開口面２０６は、複数の開孔２１０が開口した側の面であり、細胞を播種する側の面である。開口面２０６において、互いに隣接する開孔２１０の開口どうしは、開口部２１０ａの間に延在する平坦部２０８により離間されている。開口面２０６における開孔２１０の開口を通じ、開孔２１０及び連通孔２１２の内部に液体培地が供給される。

各々の開孔２１０は、多孔層２０４を貫通していない有底孔である。ほかの例として、各々の開孔２１０は、多孔層２０４を貫通し、支持体２０２の表面を底面とする有底孔でもよい。多孔フィルム２００が多孔層２０４の単層体である例において、各々の開孔２１０は、多孔層２０４を貫通していない有底孔でもよく、多孔層２０４を貫通した貫通孔でもよい。

開孔２１０各々の形状としては、例えば、球体の一部を切り取った球欠形状、バレル形状、円柱形状、又は角柱形状が挙げられる。開孔２１０各々の開口の形状としては、例えば、円形、楕円形、又は多角形が挙げられる。

複数の開孔２１０は、規則的に配置されており、具体的には、ハニカム状に配置されている。ほかの例として、複数の開孔２１０は、格子状又は面心格子状に配置されていてもよい。複数の開孔２１０の配置をランダムとしてもよいが、面方向における開孔２１０の密度を均一にし、多孔フィルム２００において細胞が形成する組織の均質性を高める観点から、複数の開孔２１０は規則的に配置されていることが好ましい。規則的な配置は、途切れたりズレがあったりしてもよいが、あらゆる方向に隙間無く連続して繰り返していることが好ましい。ハニカム状の配置とは、平行六辺形（好ましくは正六角形）又はこれに近い形状を単位とし、これら図形の頂点及び対角線の交点に開口の重心が位置する配置である。格子状の配置とは、平行四辺形（言うまでもないが、正方形、長方形、菱形が含まれる。好ましくは正方形）又はこれに近い形状を単位とし、これら図形の頂点に開口の重心が位置する配置である。面心格子状の配置とは、平行四辺形（言うまでもないが、正方形、長方形、菱形が含まれる。好ましくは正方形）又はこれに近い形状を単位とし、これら図形の頂点及び対角線の交点に開口の重心が位置する配置である。規則的に配置されていることの目安は、配置の単位である平行六辺形又は平行四辺形の面積に関し、その変動係数が１０％以下である。

多孔フィルム２００において、互いに隣接する開孔２１０どうしは、多孔層２０４の内部において、連通孔２１２により連通している。１個の開孔２１０は、隣接する全部の開孔２１０と連通していることが好ましい。複数の開孔２１０がハニカム状に配置されている多孔フィルム２００においては、１個の開孔２１０は、隣接する６個の開孔２１０と連通していることが好ましく、即ち、１個の開孔２１０は、６個の連通孔２１２を有することが好ましい。

多孔フィルム２００において、互いに隣接する開孔２１０どうしは、それぞれの壁面の一部を連続させて配置されており、連通孔２１２は、開孔２１０間の連結部２１０ｂで囲まれる孔である。ほかの例として、隣接する開孔２１０どうしは独立しており、筒状の空隙である連通孔２１２が、隣接する開孔２１０どうしを繋いでいてもよい。

以下、多孔フィルム２００の構造の寸法について説明する。

複数の開孔２１０は、多孔フィルム２００に播種された細胞が入り込み生着できる大きさを有する。多孔フィルム２００に播種される細胞の長径は、例えば、１０μｍ〜５０μｍである。

開孔２１０の開口径Ｄａは、多孔フィルム２００に播種される細胞の長径に対して５０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、１２０％以上であることが更に好ましい。５０％以上（より好ましくは８０％以上、更に好ましくは１２０％以上）であることにより、多孔フィルム２００に播種された細胞が開孔２１０の内部に入り込むことが可能となる。具体的には、開孔２１０の開口径Ｄａは、５μｍ以上であることが好ましく、８μｍ以上であることがより好ましく、１２μｍ以上であることが更に好ましい。開孔２１０の開口径Ｄａは、開孔２１０の好ましい配置及び大きさとの関係により、９０μｍ以下であることが好ましく、７０μｍ以下であることがより好ましく、５０μｍ以下であることが更に好ましい。開口径Ｄａは、開孔２１０の開口の長径であり、開口径Ｄａの範囲は、任意に選択した１０個以上の開口の開口径を測定し確認する。

開孔２１０の開口径Ｄａの変動係数は、２０％以下であることが好ましく、小さいほど好ましい。開口径Ｄａの変動係数が小さいほど、多孔フィルム２００において細胞が形成する組織の均質性が高まる。

多孔フィルム２００の細胞培養領域において、開口面２０６の全面積に占める開孔２１０の開口の合計面積の割合は、２０％〜９０％であることが好ましく、３０％〜８０％であることがより好ましく、４０％〜７０％であることが更に好ましい。

開孔２１０の面方向における長径Ｄｂは、１０μｍ〜１００μｍの範囲であることが好ましく、２０μｍ〜８０μｍの範囲であることがより好ましく、３０μｍ〜６０μｍの範囲であることが更に好ましい。１０μｍ以上（より好ましくは２０μｍ以上、更に好ましくは３０μｍ以上）であることにより、増殖性の細胞が増殖する空間が確保され、また、共培養する複数種の細胞が共存する空間が確保される。１００μｍ以下（より好ましくは８０μｍ以下、更に好ましくは６０μｍ以下）であることにより、マイクロオーダーのネットワーク構造の形成が可能となる。長径Ｄｂは、開孔２１０をその開口の長軸上（つまり開口径Ｄａ上）且つ厚さ方向に切断した切断面に現れる開孔２１０の輪郭の面方向の長径である。面方向に等方的な形状且つ略同一（同一を含む）の大きさの複数の開孔２１０が正六角形又はこれに近い形状を単位にしたハニカム状に配置されており、互いに隣接する開孔２１０どうしがそれぞれの壁面の一部を連続させて配置されている多孔フィルム２００においては、互いに隣接する開口の間の中心間距離Ｐ１を長径Ｄｂとみなす。この場合、長径Ｄｂの範囲は、中心間距離Ｐ１を、角度を略６０度（６０度を含む）ずつずらした３方向に合計１０個以上測定し確認する。上記配置以外の多孔フィルムについては、上記に準じ、開孔２１０の配置の規則性に応じて確認する。

開孔２１０の深さＤｃは、１０μｍ〜１００μｍの範囲であることが好ましく、２０μｍ〜８０μｍの範囲であることがより好ましく、３０μｍ〜６０μｍの範囲であることが更に好ましい。１０μｍ以上（より好ましくは２０μｍ以上、更に好ましくは３０μｍ以上）であることにより、増殖性の細胞が増殖する空間が確保され、また、共培養する複数種の細胞が共存する空間が確保される。１００μｍ以下（より好ましくは８０μｍ以下、更に好ましくは６０μｍ以下）であることにより、マイクロオーダーのネットワーク構造の形成が可能となる。深さＤｃは、各々の開孔２１０において開口面２０６から開孔２１０の最深部までの距離である。複数の開孔２１０が正六角形又はこれに近い形状を単位にしたハニカム状に配置されている多孔フィルム２００においては、開口の中心間を結ぶ線上で厚さ方向に切断した切断面に現れる開孔２１０の輪郭において、開口面２０６から開孔２１０の最深部までの距離を、深さＤｃとする。この場合、深さＤｃの範囲は、切断線の角度を略６０度（６０度を含む）ずつずらした３個の切断面を形成し、合計１０個以上測定し確認する。

連通孔２１２の孔径Ｄｄは、多孔フィルム２００に播種される細胞の長径に対して５０％〜５００％の範囲であることが好ましい。連通孔２１２の孔径Ｄｄが播種される細胞の長径に対して５０％以上であることにより、互いに隣接する開孔２１０間を細胞が移動することが可能となる。該観点から、連通孔２１２の孔径Ｄｄは、播種される細胞の長径に対して、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは１２０％以上である。一方、連通孔２１２の孔径Ｄｄが播種される細胞の長径に対して５００％以下であることにより、連通孔２１２に生着する細胞数が適切になる。該観点から、連通孔２１２の孔径Ｄｄは、播種される細胞の長径に対して、より好ましくは４００％以下、更に好ましくは３００％以下である。

連通孔２１２の孔径Ｄｄは、上記の観点から、５μｍ〜５０μｍの範囲であることが好ましく、８μｍ〜４５μｍの範囲であることがより好ましく、１２μｍ〜４０μｍの範囲であることが更に好ましい。孔径Ｄｄは、開口の中心間を結ぶ線上で厚さ方向に切断した切断面に現れる連通孔２１２の輪郭において、厚さ方向の長径である。複数の開孔２１０が正六角形又はこれに近い形状を単位にしたハニカム状に配置されている多孔フィルム２００においては、孔径Ｄｄの範囲は、切断線の角度を略６０度（６０度を含む）ずつずらした３個の切断面を形成し、合計１０個以上測定し確認する。上記配置以外の多孔フィルムについては、上記に準じ、開孔２１０の配置の規則性に応じた切断面を形成して確認する。

連通孔２１２の孔径Ｄｄの変動係数は、３０％以下であることが好ましく、２０％以下であることがより好ましく、小さいほど好ましい。孔径Ｄｄの変動係数が小さいほど、多孔フィルム２００において細胞が形成する組織の均質性が高まる。

連通孔２１２は、面方向全域に亘って略同一（同一を含む）の深さに設けられていることが好ましい。これにより、多孔フィルム２００において細胞が形成する組織の均質性が確保される。略同一の目安は、孔径Ｄｄを測定するための切断面において、開口面２０６から連通孔２１２の最深部までの距離の変動係数が１０％以下である。

平坦部２０８の幅Ｗは、細胞の長径よりも狭いことが好ましい。これにより、平坦部２０８上で培養される細胞の割合を小さくし、開孔２１０及び連通孔２１２の内部で培養される細胞の割合を大きくする。幅Ｗは、開口の中心間において測定される、平坦部２０８の長さである。

以下、多孔フィルム２００の素材について説明する。多孔フィルム２００の素材は、細胞の接着性の観点、生体内における移植部位との親和性の観点、生体内での分解又は吸収の難易の観点等から選択される。

多孔層２０４の素材としては、後述する製造方法により多孔フィルム２００を製造する観点からは、疎水性の有機溶媒に溶解可能な疎水性ポリマーが好ましい。疎水性の有機溶媒は、２５℃の水に対する溶解度が１０（ｇ／１００ｇ水）以下の液体である。
疎水性ポリマーとしては、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン、ポリヘキサフルオロプロペン、ポリビニルエーテル、ポリビニルカルバゾール、ポリ酢酸ビニル、ポリテトラフルオロエチレン等）、ポリエステル（例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリエチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート、ポリ乳酸、ポリ−３−ヒドロキシブチレート等）、ポリラクトン(例えば、ポリカプロラクトン等)、ポリアミド又はポリイミド（例えば、ナイロン、ポリアミド酸等）、ポリウレタン、ポリウレア、ポリブタジエン、ポリカーボネート、ポリアロマティックス、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリシロキサン誘導体、セルロースアシレート（例えば、トリアセチルセルロース、セルロースアセテートプロピオネート、セルロースアセテートブチレート）などのポリマーが挙げられる。これらのポリマーは、溶剤への溶解性、光学的物性、電気的物性、膜強度、弾性等の観点から、必要に応じてホモポリマー、コポリマー、ポリマーブレンド又はポリマーアロイとしてよい。これらのポリマーは、１種単独で又は２種以上を混合して使用してよい。生体吸収性の観点からは、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリ−３−ヒドロキシブチレート等が好ましい。

支持体２０２の素材は、多孔層２０４と同一でもよく異なっていてもよい。支持体２０２の素材としては、合成樹脂、ガラス、金属などが挙げられる。細胞組織の製造に使用する際又は細胞組織を製造した後に多孔層２０４を支持体２０２から剥離する場合は、支持体２０２の素材は、多孔層２０４とは異なる素材であることが好ましい。

多孔フィルム２００は、例えば、下記の工程（ａ）〜工程（ｅ）を順次行う製造方法により製造される。図２は、工程（ａ）〜工程（ｅ）にある多孔フィルム２００の断面を示した模式図である。

［工程（ａ）］
多孔層２０４を構成する疎水性ポリマーを溶媒に溶解した塗布液を用意し、塗布液を支持体２０２の上に塗布して、支持体２０２上に塗膜２０４ａを形成する。

塗布液は、疎水性ポリマーと、溶媒と、両親媒性化合物とを混合して調製する。溶媒としては、疎水性ポリマーの良溶媒と疎水性の液体との混合溶媒、又は、疎水性ポリマーの良溶媒である疎水性有機溶剤が好ましい。後者としては、トリクロロメタン、ジクロロメタン、クロロホルム等のハロゲン系溶剤が挙げられ、これら溶剤に疎水性の液体であるｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、ｎ−ペンタン、ｎ−オクタン、ｎ−ヘプタン等の炭化水素化合物を混合して用いてもよい。
両親媒性化合物は、親水性基と疎水性基を両方有する化合物である。両親媒性化合物を塗布液に配合することにより、塗膜の表面に水滴を形成しやすくなる。また、溶媒に対する疎水性ポリマーの分散状態を両親媒性化合物によって制御することにより、水滴の成長をより容易に制御することができる。両親媒性化合物としては、市販されている多くの界面活性剤、二量体や三量体等のオリゴマー、ポリマー等の高分子化合物が挙げられる。両親媒性化合物としては、具体的には例えば、ポリアクリル骨格を主鎖とし、親油性側鎖として長鎖脂肪族基（例えばドデシル基）及び親水性側鎖としてカルボキシル基を有する化合物；ポリエチレングリコール／ポリプロピレングリコールブロックコポリマー；リン脂質；等が挙げられる。
塗布液において、疎水性ポリマーの濃度は、０. １質量％〜１０質量％が好ましく、両親媒性化合物の濃度は、０．０１質量％〜１質量％が好ましい。

［工程（ｂ）］
加湿空気を塗膜２０４ａの表面全体に亘って流し、結露現象によって塗膜２０４ａ上に水滴２１０Ｓを形成する。この際、塗膜２０４ａの近傍を流れる加湿空気の露点Ｔｄと、塗膜２０４ａの表面温度Ｔｓとの差分ΔＴ（＝Ｔｄ−Ｔｓ）が、下記の式（１）を満たすように、Ｔｄ及びＴｓの少なくとも一方を制御する。
式（１）：３℃≦ΔＴ≦３０℃

［工程（ｃ）］
加湿空気の供給を継続することにより水滴２１０Ｓを成長させる。水滴２１０Ｓの各々は、互いに略同一（同一を含む）の大きさに成長する。水滴２１０Ｓは、塗膜２０４ａに含まれる溶媒の蒸発に伴って、横毛細管力によりハニカム状に配置されるとともに、塗膜２０４ａの中に入り込む。これと並行して、塗膜２０４ａに含まれる溶媒の蒸発に伴って、疎水性ポリマーが水滴２１０Ｓの周囲に析出する。

［工程（ｄ）］
加湿空気の供給を続け、塗膜２０４ａの中で水滴２１０Ｓどうしが、両親媒性化合物の膜２２０を隔てて密接するまで水滴２１０Ｓを成長させる。

［工程（ｅ）］
溶媒の蒸発に並行して又は溶媒を蒸発させた後に、水滴２１０Ｓを蒸発させ、塗膜２０４ａに水滴２１０Ｓが入り込んだ部分を開孔２１０として残し、並行して、密接する水滴２１０Ｓどうしを隔てていた両親媒性化合物の膜２２０を破膜する。こうして、複数の開孔２１０がハニカム状に配置し且つ内部で連結した多孔層２０４が形成される。

以上の工程（ａ）〜工程（ｅ）を経て、多孔層２０４と支持体２０２の積層体が得られる。多孔層２０４と支持体２０２の積層体を多孔フィルム２００としてもよく、多孔層２０４を支持体２０２から剥離し、多孔層２０４の単層体を多孔フィルム２００としてもよく、多孔層２０４を支持体２０２から剥離し別の支持体に貼り付けて多孔フィルム２００としてもよい。多孔フィルム２００の細胞を播種する側の面に、プラズマ放電等による電荷処理を施してもよい。図３は、工程（ａ）〜工程（ｅ）を経て製造された多孔フィルムの一例を、開口面側から、走査型電子顕微鏡を用いて撮影した写真である。

開孔２１０の開口径Ｄａ、長径Ｄｂ及び深さＤｃと、連通孔２１２の孔径Ｄｄとは、水滴２１０Ｓの大きさを調整することで制御可能である。水滴２１０Ｓの大きさの調整は、塗膜２０４ａの膜厚、加湿空気に含まれる水蒸気量、及び水滴２１０Ｓを蒸発させるタイミングにより調整可能である。

上記の製造方法によれば、複数の開孔がハニカム状に均一性高く配置された多孔フィルムを、型やマスクを使用することなく製造可能である。上記の製造方法の詳細は、例えば、特開２００７−２９１３６７号公報、特開２００９−２５６６２４号公報、特開２０１１−７４１４０号公報、特開２０１１−２０２１００号公報に記載されている。多孔フィルム２００は、エッチング、サンドブラスト、プレス成形等によっても製造可能である。

＜細胞組織の製造方法＞
本実施形態の細胞組織の製造方法は、生体外において細胞組織を製造する製造方法であり、本開示の多孔フィルムの開孔及び連通孔の内部で、細胞を培養する培養工程を含む。以下、多孔フィルムの開孔と連通孔とを総称して「孔」という。

本実施形態によれば、本開示の多孔フィルムが備える孔が、細胞がマイクロオーダーの網状に配列する軌道の働きをするので、マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織が形成される。マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織は、生体内への移植材料として、また、動物実験や臨床試験に替わる試験用細胞組織として、有用である。細胞組織は、多孔フィルムごと使用してもよく、多孔フィルムの開口周囲の平坦部を除去して多孔フィルムの孔内から取り出して使用してもよい。細胞組織は、複数個を積層して使用することも可能である。

本実施形態の培養工程には、以下の実施形態（１）〜（４）が含まれる。

実施形態（１）：フィーダー能を有する細胞を単独で培養する培養工程。ただし、フィーダー能を有する細胞は、１種でもよく２種以上でもよい。

実施形態（１）によれば、フィーダー細胞のネットワーク構造を備えた細胞組織が提供される。実施形態（１）によって製造された細胞組織は、例えば、生体外で細胞培養を行う際の足場材、又は、生体内に移植され移植部位において組織を再生する足場材として用いられる。

フィーダー能を有する細胞としては、間葉系幹細胞、線維芽細胞が挙げられる。間葉系幹細胞（Mesenchymal Stem Cell、ＭＳＣ）は、筋細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等へ分化可能な体性幹細胞であり、フィーダー能を有することも知られている。培養工程において間葉系幹細胞に対する分化誘導因子を培地に添加し、間葉系幹細胞を体細胞（例えば、筋細胞、脂肪細胞、軟骨細胞）に分化させることも可能である。この場合、例えば、マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた筋肉組織、脂肪組織又は軟骨組織などが提供される。

実施形態（２）：フィーダー能を有する細胞と、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞の少なくともいずれかとを共培養する培養工程。

実施形態（２）によれば、血管内皮細胞又はリンパ管内皮細胞のネットワーク構造を備えた細胞組織が提供される。実施形態（２）によって製造された細胞組織は、例えば、生体外で体細胞の培養を行う際の足場材、又は、生体内に移植され移植部位において組織を再生する足場材として用いられる。

血管内皮細胞としては、臍帯静脈、臍帯動脈、大動脈、冠状動脈、肺動脈、肺微小血管、皮膚微小血管などに由来する血管内皮細胞、多能性幹細胞から分化誘導した血管内皮細胞が挙げられる。リンパ管内皮細胞としては、皮膚微小リンパ管、肺微小リンパ管などに由来するリンパ管内皮細胞、多能性幹細胞から分化誘導したリンパ管内皮細胞が挙げられる。培養工程において培地組成を変化させることにより、血管内皮細胞又はリンパ管内皮細胞の増殖、遊走、管形成を制御することが可能である。

実施形態（３）：フィーダー能を有する細胞と、実質臓器を形成する細胞とを共培養する培養工程。

実施形態（３）によれば、マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織が提供される。実施形態（３）によって製造された細胞組織は、例えば、生体内に移植され組織又は臓器の機能を補うために用いられる。ほかに、実施形態（３）によって製造された細胞組織は、動物実験や臨床試験に替わる試験用細胞組織として用いられる。

実質臓器（parenchymal organ）としては、肝臓、膵臓、腎臓、脾臓、心臓、肺、乳腺組織、脂肪組織、卵巣、精巣、胸腺などが挙げられ、実質臓器を形成する細胞としては、これら臓器を形成する実質細胞、上皮細胞、腺細胞、脂肪細胞、これらの細胞の幹細胞又は前駆細胞などが挙げられる。実質臓器を形成する細胞は、１種を用いてもよく、２種以上を用いてもよい。実質臓器を形成する細胞の２種以上の組合せとしては、例えば、肝細胞と胆管上皮細胞；膵α細胞と膵β細胞と膵δ細胞；Ｉ型肺胞上皮細胞とＩＩ型肺胞上皮細胞；乳腺腺房細胞と乳管上皮細胞；などが挙げられる。

実質臓器を形成する細胞としては、多能性幹細胞も挙げられる。多能性幹細胞は、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己複製能」と三胚葉系列すべてに分化できる「多分化能」とを有する未分化細胞である。多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（embryonic stem cell；ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell；ｉＰＳ細胞）、胚性生殖細胞（embryonic germ cell；ＥＧ細胞）、胚性癌細胞（embryonal carcinoma cell；ＥＣ細胞）、多能性成体前駆細胞（multipotent adult progenitor cell；ＭＡＰ細胞）、成体多能性幹細胞（adult pluripotent stem cell；ＡＰＳ細胞）、Ｍｕｓｅ細胞（multi-lineage differentiating stress enduring cell）；などが挙げられる。培養工程において目的の体細胞へと分化誘導する分化誘導因子を培地に添加し、多能性幹細胞を体細胞に分化させる。

実施形態（４）：フィーダー能を有する細胞と、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞の少なくともいずれかと、実質臓器を形成する細胞とを共培養する培養工程。

実施形態（４）によれば、実質臓器の細胞組織の表面又は内部に、血管内皮細胞又はリンパ管内皮細胞のネットワーク構造を備えた細胞組織が提供される。実施形態（４）によって製造された細胞組織は、例えば、生体内に移植され組織又は臓器の機能を補うために用いられる。ほかに、実施形態（４）によって製造された細胞組織は、動物実験や臨床試験に替わる試験用細胞組織として用いられる。

実施形態（４）の培養工程は、３種の細胞を同時期に播種して３種の細胞を同時に共培養する培養工程でもよく、３種の細胞を段階的に播種して３種の細胞を段階的に共培養する培養工程でもよい。後者としては、例えば、フィーダー能を有する細胞と、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞の少なくともいずれかとを同時期に播種し、数日間培養を行い血管内皮細胞又はリンパ管内皮細胞のネットワーク構造を形成した後、実質臓器を形成する細胞を播種して培養を継続する。

培養工程は、例えば、多孔フィルムを複数の開孔が開口した側の面を上にして培養容器に載置し、多孔フィルムに細胞懸濁液を播種し、播種した細胞種に合せた培養条件にて行う。多孔フィルムを載置する培養容器としては、細胞培養用として公知のあらゆる培養容器が挙げられる。培養容器の材質としては、例えば、樹脂（例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン樹脂）、ガラス、セラミックス、金属等が挙げられる。培養容器の形状としては、例えば、マルチウェルプレート、ペトリディッシュ、マイクロアレイ用プレート、チューブ、フラスコ、ローラーボトル、バッグ等が挙げられる。

本実施形態は、培養工程の前に、多孔フィルムの複数の開孔が開口した側の面に細胞を播種した後、細胞を播種した側の面から反対面に向かう方向に遠心力をかけ細胞を複数の開孔の内部に移動させる遠心処理工程を含むことが好ましい。多孔フィルムに播種された細胞が遠心処理工程によって多孔フィルムの開孔内に移行するので、孔内で培養される細胞の割合が大きくなる。

本実施形態に遠心処理工程を含む場合、遠心処理工程の実施を容易にするため、比較的少ない量の培地に細胞を懸濁した細胞懸濁液を播種して遠心処理工程を実施することが好ましい。そして、遠心処理工程後に培養容器内に培地を追加する。

［培地、培養条件］
本実施形態に用いる培地は、哺乳類細胞の培養に用いられる公知の培地の中から、培養対象となる細胞種に合せて選択される。具体的な培地としては、例えば、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）、ＤＭＥＭ：Ｆ−１２（Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12）、ＥＭＥＭ（Eagle's minimal essential medium）、ＭＥＭα（Minimum Essential Medium Alpha）、ＢＭＥ（Basal Medium Eagle）等の基本培地に細胞増殖因子を添加し、細胞種に合せて最適化した培地が挙げられる。このような培地は市販品として入手可能である。本実施形態に用いる培地は、共培養する細胞種に応じて、複数種の培地を混合した培地でもよい。培地のｐＨは、例えばｐＨ７．０〜８．０であり、好ましくはｐＨ７．３〜７．４である。

培地には、一般的に添加される各種の成分、例えば、ＦＧＦ−２（Fibroblast Growth Factor-2）、ＴＧＦ−β（Transforming Growth Factor-β）、ＥＧＦ（Epidermal Growth Factor）、ＶＥＧＦ（Vascular Endothelial Growth Factor）等の細胞増殖因子；アスコルビン酸、レチノイン酸等のビタミン又はビタミン誘導体；グルコース等の糖源；アミノ酸；亜セレン酸ナトリウム、塩化ナトリウム等の無機塩；トランスフェリン等のタンパク質；インスリン等のホルモン；分化抑制因子；分化誘導因子；２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール等の抗酸化剤；ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質；などを添加してもよい。上記成分は、培養期間全体に亘って濃度を所期の範囲に保つために、細胞の培養中に培地に補充してもよい。培地は、抗原性物質や感染源などが細胞組織に混入することを抑制する観点から、血清及び血清代替物を含まないことが好ましい。

本実施形態における培養工程においては、適宜、培地交換を行うことが好ましい。一連の培養工程に用いる培地は、同一組成でなくてもよい。共培養する細胞種に応じて異なる組成の培地に置き換えながら培養を継続してもよい。

フィーダー能を有する細胞（第一の細胞）と、血管内皮細胞又はリンパ管内皮細胞（第二の細胞）とを共培養する際、又は、フィーダー能を有する細胞（第一の細胞）と、実質臓器を形成する細胞（第二の細胞）とを共培養する際の二者の混合比は、例えば、第一の細胞の細胞数：第二の細胞の細胞数＝１：０．５〜１：５であり、好ましくは第一の細胞の細胞数：第二の細胞の細胞数＝１：１〜１：３である。

フィーダー能を有する細胞（第一の細胞）と、血管内皮細胞又はリンパ管内皮細胞（第二の細胞）と、実質臓器を形成する細胞（第三の細胞）とを共培養する際の三者の混合比は、例えば、（第一の細胞の細胞数＋第二の細胞の細胞数）：第三の細胞の細胞数＝１：１〜１：１０であり、好ましくは（第一の細胞の細胞数＋第二の細胞の細胞数）：第三の細胞の細胞数＝１：２〜１：５である。第一の細胞と第二の細胞の混合比は、上記の範囲が好ましい。

多孔フィルムに対する細胞の播種密度は、例えば１×１０^３cells/cm^２〜１×１０^６cells/cm^２であり、好ましくは１×１０^４cells/cm^２〜１×１０^６cells/cm^２である。複数種の細胞を共培養する場合は、合計の播種密度を上記範囲とすることが好ましい。

本実施形態における培養条件には、一般的な条件を適用してよい。例えば、温度３７℃且つ５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２濃度のインキュベーター内での培養が適用される。培養期間は、特に制限されず、細胞のネットワーク構造が十分に発達する期間、培養することが好ましい。

以下に実施例を挙げて、発明の実施形態を詳細に説明する。発明の実施形態は、以下に示す実施例により限定的に解釈されるべきものではない。

以下において、「ＰＥＴ」とは、ポリエチレンテレフタレート（Polyethylene Terephthalate）を意味し、「ＰＭＭＡ」とは、ポリメチルメタクリレート（Polymethyl methacrylate) を意味し、「ＰＤＭＳ」とは、ポリジメチルシロキサン（Polydimethylsiloxane）を意味し、「ＳＥＭ」とは、走査型電子顕微鏡（Scanning Electron Microscope）を意味し、「ＦＢＳ」とは、ウシ胎児血清（Fetal Bovine Serum）を意味する。

以下において、多孔フィルムの開孔と連通孔とを総称して「孔」という。

＜多孔フィルム及び培養デバイスの作製＞
［多孔フィルム］
ポリ乳酸５質量部、トリクロロメタン９４．５質量部、両親媒性化合物としてポリアクリルアミド系の両親媒性ポリマー０．５質量部を混合し、塗布液を調製した。塗布液をＰＥＴフィルム（膜厚１８８μｍ）の上に塗布してＰＥＴフィルム上に塗膜を形成した。加湿空気を塗膜の表面全体に亘って流し、結露現象によって塗膜上に水滴を形成した。加湿空気の供給を継続して水滴を成長させながら、水滴を塗膜の中に入り込ませた。塗膜の中で水滴どうしが両親媒性化合物の膜を隔てて密接するまで水滴を成長させながら、塗膜に含まれる溶媒の蒸発により水滴の周囲にポリ乳酸を析出させた。次いで、加湿空気の供給を停止し、雰囲気温度を上げて水滴を蒸発させ、塗膜に水滴が入り込んだ部分を開孔として残し、複数の開孔がハニカム状に配列し且つ連通構造を有するポリ乳酸からなる多孔層と、ＰＥＴフィルム層とを備える多孔フィルムを得た。塗膜の膜厚、加湿空気に含まれる水蒸気量、及び水滴を蒸発させるタイミングにより、多孔層における開孔及び連通孔の寸法を調整し、表１に示す各多孔フィルムを得た。

［培養デバイス］
多孔フィルムを直径２３ｍｍの円形に切り出し、その外周部に、リング（外径２２ｍｍ、内径１６ｍｍ、高さ８ｍｍ。ＰＭＭＡ製、側面にＰＤＭＳコート）を、両面粘着テープ（３Ｍ社の品番１５１０、皮膚貼付用テープ）を用いて貼り付け、リング付き多孔フィルムを作製した。リング付き多孔フィルムを、滅菌を目的に７０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液に数分間浸し、次いで滅菌水で洗浄してエタノールを除去した。図４に、多孔フィルム、リング及び培養デバイスの一例を示す。

リング付き多孔フィルムを、多孔フィルムのＰＥＴフィルム層側が下になるように、組織培養用ディッシュに置き、培養デバイスを得た。滅菌を目的に、培養デバイスに対して紫外線照射を２時間行った。表１に、各培養デバイスが備える多孔フィルムの構造の寸法を示す。

図５Ａは、ＰＬＡ１０が備える多孔フィルムの断面及び表面のＳＥＭ像であり、図５Ｂは、ＰＬＡ４０が備える多孔フィルムの断面及び表面のＳＥＭ像である。表１に示すすべての多孔フィルムにおいて、隣接する開孔の開口どうしは平坦部により離間されており、隣接する開孔どうしはそれぞれの壁面の一部が連続しており連通していた。表１に示すすべての多孔フィルムにおいて、ポリ乳酸からなる多孔層に配列している開孔は、多孔層を貫通していなかった。

対照用培養デバイスとして、開孔のない平坦なポリ乳酸からなる層をＰＥＴフィルム上に積層した積層体を、多孔フィルムの代わりに備えるデバイス（「Ｆｌａｔ」という。）と、組織培養用ディッシュ（Tissue culture polystyrene：ＴＣＰＳ、直径３５ｍｍ、商品名：Ｆａｌｃｏｎセルカルチャーディッシュ３５３００１、コーニング社製）の培養面にリングを貼り付けたデバイス（「ＴＣＰ」という。）を用意した。

これら培養デバイスにおいては、リング内の底面が細胞を培養する培養面であり、リングで囲まれた底面の面積は２ｃｍ^２である。

＜培養実験の材料＞
［細胞］
・間葉系幹細胞：ヒト成人骨髄由来正常細胞、ロンザジャパン社から購入。以下「ＭＳＣ」という。
・線維芽細胞：ヒト皮膚由来正常細胞ＮＨＳＦ４６、理化学研究所バイオリソースセンター（日本国茨城県つくば市高野台３−１−１）から分譲。
・血管内皮細胞：ヒト新生児臍帯静脈由来正常細胞、ロンザジャパン社から購入。以下「ＨＵＶＥＣ」という。
・肝臓由来の増殖性細胞：ヒト肝癌由来細胞ＨｅｐＧ２、理化学研究所バイオリソースセンター（日本国茨城県つくば市高野台３−１−１）から分譲。

［培養液］
・ＭＳＣ培地：ヒト間葉系幹細胞培地キットMSCGM BulletKit、ロンザジャパン社
・ＮＨＳＦ４６培地：ＭＥＭα＋１０％ＦＢＳ
・ＨＵＶＥＣ培地：ヒト内皮細胞培地キットEGM-2 BulletKit、ロンザジャパン社
・ＨｅｐＧ２培地：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ

＜培養実験１：間葉系幹細胞の単独培養＞
培養デバイスとしてＴＣＰ、Ｆｌａｔ、ＰＬＡ３、ＰＬＡ１０、ＰＬＡ３０を用いて、下記の培養条件でＭＳＣを単独培養した。

・播種密度：１×１０^５cells/disk（５×１０^４cells/cm^２）
・播種後の遠心処理：多孔フィルムを備えた培養デバイスに対して、回転半径１２０ｍｍ、回転数１１００ｒｐｍ、回転時間３分間の遠心処理を施した。
・骨分化誘導培地：hMSC differentiation BulletKit-osteogenic（商品番号：PT-3002、ロンザジャパン社）
・脂肪分化誘導培地：hMSC differentiation BulletKit-adipogenic（商品番号：PT-3004、ロンザジャパン社）
・培養液量：１．０ml/disk
・インキュベーター：３７℃、５％ＣＯ_２

ＭＳＣ培地を用いて培養を開始し、培養１日目に、骨分化誘導培地と脂肪分化誘導培地を１：１で混合した分化誘導培地に交換し、その後３日毎に分化誘導培地を交換し、合計１５日間培養した。分化誘導１４日目にリアルタイムＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）により、骨細胞の分化マーカーであるＲｕｎｘ２及びＯｓｘ、並びに、脂肪細胞の分化マーカーであるＣ／ＥＢＰα及びＰＰＡＲγの発現を解析した。また、分化誘導１４日目にアクチンの蛍光免疫染色を行った。図６に、分化誘導１４日目におけるアクチンの蛍光免疫染色像を示す。

本実験から、以下のことが明らかになった。
・多孔フィルムの開孔の大きさに応じて細胞の形態が変化した。ＰＬＡ１０及びＰＬＡ３０において、細胞は多孔フィルムの孔内で細長い形態を示した。ＴＣＰ、Ｆｌａｔ及びＰＬＡ３において、細胞は多孔フィルムの表面において伸展した形態を示した。
・ＰＬＡ３及びＰＬＡ１０における細胞の増殖性は、Ｆｌａｔと同程度であったが、ＰＬＡ３０における細胞の増殖性は、Ｆｌａｔに比べ低かった。このことから、細胞が多孔フィルムの孔内に侵入すると増殖が抑制されることが示唆された。
・リアルタイムＰＣＲの解析結果は、いずれの培養デバイスにおいても、骨細胞への分化と脂肪細胞への分化とが起こることを示していた。

＜培養実験２：間葉系幹細胞と血管内皮細胞の共培養＞
培養デバイスとしてＴＣＰとＰＬＡ４０を用いて、下記の培養条件で、ＨＵＶＥＣを単独培養、又は、ＭＳＣとＨＵＶＥＣを共培養した。

・単独培養：ＨＵＶＥＣの播種密度１×１０^５cells/disk（５×１０^４cells/cm^２）。ＭＳＣ培地とＨＵＶＥＣ培地の混合培地（ＭＳＣ培地：ＨＵＶＥＣ培地＝体積比１：２）で培養。
・共培養：ＭＳＣとＨＵＶＥＣを混合したのち播種した。ＭＳＣの播種密度０．５×１０^５cells/disk、ＨＵＶＥＣの播種密度１×１０^５cells/disk、合計播種密度１．５×１０^５cells/disk（７．５×１０^４cells/cm^２）。ＭＳＣ培地とＨＵＶＥＣ培地の混合培地（ＭＳＣ培地：ＨＵＶＥＣ培地＝体積比１：２）で培養。
・播種後の遠心処理：多孔フィルムを備えた培養デバイスの半数に対して、回転半径１２０ｍｍ、回転数１１００ｒｐｍ、回転時間３分間の遠心処理を施した。
・培養液量：１．０ml/disk
・インキュベーター：３７℃、５％ＣＯ_２
・培養期間：７日間培養。２日毎に培地を交換した。

培養３日目と７日目に、ＨＵＶＥＣ特異的な細胞表面マーカーであるＣＤ３１の蛍光免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡システム（Ｎｉｋｏｎ社Ｃ２^＋、１０倍対物レンズ）を用いて観察した。細胞組織においてネットワーク構造が最も発達している深度に焦点を合せ、１．２７ｍｍ×１．２７ｍｍ（＝１．６１ｍｍ^２）の領域を任意に１０個選択して蛍光画像を取得し、取得した蛍光画像を画像解析ソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ社NIS-Elements Basic Research）を用いて二値化処理した。二値化処理した画像全体に散在する蛍光領域の長径を個別に計測し、その長さを足し合わせ、さらに１０領域の合計を算出し、ＨＵＶＥＣが形成しているネットワークの全長とした。二値化処理した画像全体中に散在する蛍光領域の面積を個別に計測し、その面積を足し合わせ、さらに１０領域の合計を算出し、ＨＵＶＥＣが形成しているネットワークの総面積とした。

図７Ａ〜図７Ｄ及び表２に、共焦点レーザー顕微鏡像及びネットワークの解析結果を示す。図７Ａ〜図７Ｃにおいて、「Ｍｏｎｏ−」が単独培養を意味し、「Ｃｏ−」が共培養を意味する。図７Ａ〜図７Ｄにおいては、「ｃｆｇ」を付した像が、遠心処理を施した培養例であり、「ｃｆｇ」を付していない像が、遠心処理を施していない培養例である。

・図７Ａ：培養３日目のＣＤ３１の蛍光免疫染色像（低倍率）。
・図７Ｂ：培養３日目のＣＤ３１の蛍光免疫染色像（高倍率）。
・図７Ｃ：培養７日目のＣＤ３１の蛍光免疫染色像（高倍率）。
・図７Ｄ、表２：共培養におけるネットワークの全長及び総面積。

本実験から、以下のことが明らかになった。
・ＨＵＶＥＣは血管内膜を形成する細胞であるところ、ＨＵＶＥＣのみでは毛細血管網様のネットワークの形成は難しいが、ＭＳＣとＨＵＶＥＣの共培養により毛細血管網様のネットワークが形成された。内皮細胞が管腔構造を形成するには内皮細胞を支持する細胞が必要であると考えられるところ、ＭＳＣは内皮細胞に作用するサイトカインを分泌すること及び壁細胞への分化が可能であることから、ＨＵＶＥＣの毛細血管網様のネットワーク形成にＭＳＣが効果的に作用していることが示唆された。
・毛細血管網様のネットワークの形成は経時に伴って進行し、培養７日目では、培養３日目に比べ、より発達したネットワークが形成された。
・ＰＬＡ４０においては、多くの細胞が多孔フィルムの孔内に存在した。ＰＬＡ４０においては、ＴＣＰに比べ、発達した毛細血管網様のネットワークが形成された。
・遠心処理を施したＰＬＡ４０においては、遠心処理を施していないＰＬＡ４０に比べ、毛細血管網様のネットワークがより長く発達していた。遠心処理を施すことにより、多孔フィルムの孔内に移行する細胞の割合が大きくなることが示唆された。
・通常の播種操作後の培養においては、培養デバイスのリング周辺において細胞密度が高い傾向が見られたが、遠心処理を施した後の培養では、培養面全体において比較的均一なネットワーク形成が見られた。播種された細胞が遠心処理によって多孔フィルムの孔内に移行するので、リング周辺に細胞が移行することが抑制されることが示唆された。

＜培養実験３：間葉系幹細胞又は線維芽細胞と血管内皮細胞の共培養＞
培養デバイスとしてＴＣＰ、Ｆｌａｔ、ＰＬＡ４０を用いて、下記の培養条件で、ＭＳＣとＨＵＶＥＣを共培養、又は、ＮＨＳＦ４６とＨＵＶＥＣを共培養した。

・ＭＳＣとＨＵＶＥＣの共培養：ＭＳＣとＨＵＶＥＣを混合したのち播種した。ＭＳＣの播種密度０．５×１０^５cells/disk、ＨＵＶＥＣの播種密度１×１０^５cells/disk、合計播種密度１．５×１０^５cells/disk（７．５×１０^４cells/cm^２）。ＭＳＣ培地とＨＵＶＥＣ培地の混合培地（ＭＳＣ培地：ＨＵＶＥＣ培地＝体積比１：２）で培養。
・ＮＨＳＦ４６とＨＵＶＥＣの共培養：ＮＨＳＦ４６とＨＵＶＥＣを混合したのち播種した。ＮＨＳＦ４６の播種密度０．５×１０^５cells/disk、ＨＵＶＥＣの播種密度１×１０^５cells/disk、合計播種密度１．５×１０^５cells/disk（７．５×１０^４cells/cm^２）。ＮＨＳＦ４６培地とＨＵＶＥＣ培地の混合培地（ＮＨＳＦ４６培地：ＨＵＶＥＣ培地＝体積比１：２）で培養。
・播種後の遠心処理：多孔フィルムを備えた培養デバイスに対して、回転半径１２０ｍｍ、回転数１１００ｒｐｍ、回転時間３分間の遠心処理を施した。
・培養液量：１．０ml/disk
・インキュベーター：３７℃、５％ＣＯ_２
・培養期間：７日間培養。毎日培地を交換した。

培養３日目と７日目にＣＤ３１の蛍光免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。図８Ａ〜図８Ｄ及び表３に、顕微鏡像及びネットワークの解析結果を示す。

・図８Ａ：培養３日目のＣＤ３１の蛍光免疫染色像（高倍率）。
・図８Ｂ：培養７日目のＣＤ３１の蛍光免疫染色像（高倍率）。
・図８Ｃ、表３：培養３日目のネットワークの全長及び総面積。
・図８Ｄ、表３：培養７日目のネットワークの全長及び総面積。

本実験から、以下のことが明らかになった。
・ＮＨＳＦ４６とＨＵＶＥＣの共培養により、ＭＳＣとＨＵＶＥＣの共培養と同様に、毛細血管網様のネットワークが形成された。
・毛細血管網様のネットワークは、経時に伴って発達した。
・ＰＬＡ４０においては、ＴＣＰ及びＦｌａｔに比べ、より発達したネットワークが形成された。

＜培養実験４：多孔フィルムの寸法の検討＞
培養デバイスとしてＴＣＰ、Ｆｌａｔ、ＰＬＡ３、ＰＬＡ１０、ＰＬＡ２０、ＰＬＡ４０を用いて、下記の培養条件でＭＳＣとＨＵＶＥＣを共培養した。

・播種：ＭＳＣとＨＵＶＥＣを混合したのち播種した。
・播種密度：ＭＳＣ ０．５×１０^５cells/disk、ＨＵＶＥＣ １×１０^５cells/disk、合計１．５×１０^５cells/disk（７．５×１０^４cells/cm^２）。
・培地：ＭＳＣ培地とＨＵＶＥＣ培地の混合培地、ＭＳＣ培地：ＨＵＶＥＣ培地＝体積比１：２。
・播種後の遠心処理：多孔フィルムを備えた培養デバイスに対して、回転半径１２０ｍｍ、回転数１１００ｒｐｍ、回転時間３分間の遠心処理を施した。
・培養液量：１．０ml/disk
・インキュベーター：３７℃、５％ＣＯ_２
・培養期間：７日間培養。２日毎に培地を交換した。

培養３日目と７日目にＣＤ３１の蛍光免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。図９Ａ〜図９Ｅ及び表４に、顕微鏡像及びネットワークの解析結果を示す。

・図９Ａ：培養３日目のＣＤ３１の蛍光免疫染色像（低倍率）。
・図９Ｂ：培養３日目のＣＤ３１の蛍光免疫染色像（高倍率）。
・図９Ｃ：培養７日目のＣＤ３１の蛍光免疫染色像（低倍率）。
・図９Ｄ：培養７日目のＣＤ３１の蛍光免疫染色像（高倍率）。
・図９Ｅ、表４：ネットワークの全長及び総面積。

本実験から、以下のことが明らかになった。
・ＰＬＡ３及びＰＬＡ１０においては、細胞は、多孔フィルムの表面において伸展した形態を示し、ネットワークは形成されなかった。
・ＰＬＡ２０においては、細胞は、多孔フィルムの表面で伸展した形態と、多孔フィルムの孔内でネットワークを形成した形態を示した。
・ＰＬＡ４０においては、毛細血管網様のネットワークが形成された。
・上記のとおり、多孔フィルムの開孔の大きさに応じて細胞の形態が変化した。本実験で使用した細胞の長径が２０μｍ程度であることから、多孔フィルムの開孔の大きさが細胞サイズと同等以上であると、細胞は多孔フィルムの孔内でネットワークを形成しやすいことが示唆された。

＜培養実験５：３種類の細胞の同時共培養＞
培養デバイスとしてＴＣＰ、ＰＬＡ４０を用いて、下記の培養条件でＭＳＣとＨＵＶＥＣとＨｅｐＧ２を共培養した。

・播種：ＭＳＣとＨＵＶＥＣとＨｅｐＧ２を混合したのち播種した。予めＨｅｐＧ２を蛍光染料CellTracker Redで標識した。
・播種密度：ＭＳＣ ０．５×１０^５cells/disk、ＨＵＶＥＣ １×１０^５cells/disk、ＨｅｐＧ２ ５×１０^５cells/disk。
・培地：ＭＳＣ培地とＨＵＶＥＣ培地とＨｅｐＧ２培地の混合培地、ＭＳＣ培地：ＨＵＶＥＣ培地：ＨｅｐＧ２培地＝体積比１：２：３。
・播種後の遠心処理：多孔フィルムを備えた培養デバイスに対して、回転半径１２０ｍｍ、回転数１１００ｒｐｍ、回転時間３分間の遠心処理を施した。
・培養液量：１．０ml/disk
・インキュベーター：３７℃、５％ＣＯ_２
・培養期間：３日間培養。毎日培地を交換した。

培養３日目にＣＤ３１の蛍光免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察し、細胞が形成しているネットワークを解析した。図１０Ａ〜図１０Ｂに顕微鏡像を示す。

・図１０Ａ：培養３日目の蛍光像（緑色蛍光と赤色蛍光の重ね合せ画像）。
・図１０Ｂ：培養３日目におけるＣＤ３１の蛍光免疫染色像。

本実験から、以下のことが明らかになった。
・ＰＬＡ４０においては、細胞はネットワーク構造を形成したが、ネットワーク間の連結状態は乏しかった。
・ＭＳＣとＨＵＶＥＣとＨｅｐＧ２の３種共培養は、ＭＳＣとＨＵＶＥＣの２種共培養に比べ、播種密度が高く、多孔フィルムの孔内に高密度に細胞が充填されたことにより細胞の遊走性が低下し、ネットワーク形成の低下あるいは遅延が起こっていることが示唆された。播種密度の最適化又は培養時間の延長により、ネットワーク形成が可能と推測された。

＜培養実験６：３種類の細胞の段階的共培養＞
培養デバイスとしてＴＣＰ、ＰＬＡ４０を用いて、下記の培養条件でＭＳＣとＨＵＶＥＣとＨｅｐＧ２を共培養した。

・播種：ＭＳＣとＨＵＶＥＣを混合したのち播種し、３日間培養した後、ＨｅｐＧ２を播種した。予めＨｅｐＧ２を蛍光染料CellTracker Redで標識した。
・播種密度：ＭＳＣ ０．５×１０^５cells/disk、ＨＵＶＥＣ １×１０^５cells/disk、ＨｅｐＧ２ ５×１０^５cells/disk。
・播種後の遠心処理：多孔フィルムを備えた培養デバイスに対して、回転半径１２０ｍｍ、回転数１１００ｒｐｍ、回転時間３分間の遠心処理を施した。
・培養液量：１．０ml/disk
・インキュベーター：３７℃、５％ＣＯ_２
・培養期間：２種共培養を３日間、３種共培養を３日間行った。
・培地：培養開始から３日間は、ＭＳＣ培地とＨＵＶＥＣ培地の混合培地（体積比１：２）で培養し、１日目に培地交換を行った。ＨｅｐＧ２を播種した後は、ＭＳＣ培地とＨＵＶＥＣ培地とＨｅｐＧ２培地の混合培地（体積比１：２：３）に交換し、毎日培地を交換しながら培養した。

ＨｅｐＧ２を播種してから３日目にＣＤ３１の蛍光免疫染色を行い、ＣＤ３１の蛍光像とＨｅｐＧ２の蛍光像とから、細胞が形成しているネットワークを解析した。図１１Ａ〜図１１Ｂに顕微鏡像を示す。図１１Ｃ及び表５に、ＣＤ３１の蛍光像を解析して得たネットワークの全長及び総面積を示す。

・図１１Ａ：ＨｅｐＧ２を播種した後の培養３日目の蛍光像（緑色蛍光と赤色蛍光の重ね合せ画像）。
・図１１Ｂ：ＨｅｐＧ２を播種した後の培養３日目におけるＣＤ３１の蛍光免疫染色像。
・図１１Ｃ、表５：３種の共培養３日目における、同時共培養（培養実験５）、段階的共培養（培養実験６）それぞれのネットワークの全長及び総面積。

本実験から、以下のことが明らかになった。
・ＰＬＡ４０においては、ＴＣＰに比べ、細く長いネットワークが形成された。
・段階的共培養は、同時共培養に比べ、ネットワークの連結が増していた。ＭＳＣとＨＵＶＥＣを共培養してネットワークを予め形成した後にＨｅｐＧ２を播種することが、高次のネットワーク構造の形成に効果的であることが示唆された。

２０１６年９月２７日に出願された日本国出願番号第２０１６−１８８６２７号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。

本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

Claims (14)

1. 表面に設けられた複数の開孔と、互いに隣接する前記開孔どうしを連通する連通孔とを有し、前記開孔の開口径が１８μｍ以上である多孔フィルムの前記開孔及び前記連通孔の内部で、フィーダー能を有する細胞と、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞の少なくともいずれかとを共培養する培養工程を含む、
   マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織の製造方法。
2. 表面に設けられた複数の開孔と、互いに隣接する前記開孔どうしを連通する連通孔とを有し、前記開孔の多孔フィルムの面方向における長径が２０μｍ以上である多孔フィルムの前記開孔及び前記連通孔の内部で、フィーダー能を有する細胞と、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞の少なくともいずれかとを共培養する培養工程を含む、
   マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織の製造方法。
3. 前記培養工程が、フィーダー能を有する細胞と、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞の少なくともいずれかと、実質臓器を形成する細胞とを、前記開孔及び前記連通孔の内部で共培養する培養工程である、請求項１又は請求項２に記載の、マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織の製造方法。
4. 前記フィーダー能を有する細胞が、間葉系幹細胞及び線維芽細胞の少なくともいずれかである、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の、マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織の製造方法。
5. 前記複数の開孔が、前記多孔フィルムの表面にハニカム状に配置されている、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の、マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織の製造方法。
6. 前記連通孔が、前記多孔フィルムの面方向全域に亘って略同一の深さに設けられている、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の、マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織の製造方法。
7. 前記連通孔の孔径が、前記多孔フィルムに播種される細胞の長径に対して５０％〜５００％の範囲である、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の、マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織の製造方法。
8. 前記連通孔の孔径が５μｍ〜５０μｍの範囲である、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の、マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織の製造方法。
9. 前記連通孔の孔径の変動係数が３０％以下である、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の、マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織の製造方法。
10. 前記開孔の、前記多孔フィルムの面方向における長径が２０μｍ〜１００μｍの範囲である、請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の、マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織の製造方法。
11. 前記開孔の深さが２０μｍ〜１００μｍの範囲である、請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の、マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織の製造方法。
12. 前記開孔の開口径が１８μｍ〜９０μｍの範囲である、請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載の、マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織の製造方法。
13. 前記開孔の開口径の変動係数が２０％以下である、請求項１〜請求項１２のいずれか１項に記載の、マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織の製造方法。
14. 前記培養工程の前に、
    前記多孔フィルムの前記複数の開孔が開口した側の面に細胞を播種した後、前記細胞を播種した側の面から反対面に向かう方向に遠心力をかけ前記細胞を前記複数の開孔の内部に移動させる遠心処理工程を含む、
    請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の、マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織の製造方法。