KR20190039283A - 세포 조직의 제조 방법, 및 다공 필름 - Google Patents

세포 조직의 제조 방법, 및 다공 필름 Download PDF

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Abstract

표면에 마련된 복수의 개공과, 서로 인접하는 개공끼리를 연통하는 연통 구멍을 갖는 다공 필름의 개공 및 연통 구멍의 내부에서, 피더능을 갖는 세포를 배양하는 배양 공정을 포함하는, 세포 조직의 제조 방법, 및 표면에 마련된 복수의 개공과, 서로 인접하는 개공끼리를 연통하는 연통 구멍을 갖는 다공 필름.

Description

세포 조직의 제조 방법, 및 다공 필름
본 개시는, 세포 조직의 제조 방법, 및 세포 조직의 제조에 이용하는 다공 필름에 관한 것이다.
생체 내에 세포 또는 세포 조직을 이식하는 것을 목적으로 사용되는, 세포를 농축하는 필터, 세포를 증식시키기 위한 스캐폴드재, 세포를 생착(生着)시켜 생체 내로 이식하기 위한 이식재가 알려져 있다.
예를 들면 일본 공개특허공보 2012-006010호에는, 목적으로 하는 세포를 크기로 분리하는 복합 다공막이 개시되어 있다. 예를 들면 국제 공개공보 제2006/093207호에는, 세포 배양면에 구멍이 허니콤 배열한 배양 기재가 개시되어 있다. 예를 들면 일본 공개특허공보 2005-110709호에는, 골수 간엽계 줄기 세포를 생착시켜 골아 세포에 분화 유도 후에 골결손부에 이식하는 골보전재(骨補塡材)로서, 관통 구멍과 연통 구멍이 조합되어 이루어지는 골보전재가 개시되어 있다. 예를 들면 일본 공개특허공보 2004-216119호에는, 세포가 생착하여 증식하기 위한 스캐폴드재로서, 두께 방향으로 긴 형상의 구멍이 면 방향으로 병렬적으로 배치되어 각 구멍 간이 작은 구멍으로 연통된 구조를 갖는 다공성 지지체가 개시되어 있다. 예를 들면 일본 공개특허공보 2008-199962호에는, 3차원 그물 구조를 갖는 다공질 필름 표면에, 복수 개의 세포 접착성 영역과, 세포 접착성 영역을 둘러싸는 세포 비접착성 영역이 배치된 스페로이드 형성용 기재가 개시되어 있다. 예를 들면 일본 공개특허공보 2001-523483호에는, 골형성원 세포가 생착하여 증식하기 위한 스캐폴드재로서, 서로 연결한 구멍을 포함하여 이루어지는 다공성 폴리머 스캐폴드가 개시되어 있다. 예를 들면 일본 공개특허공보 2008-307180호에는, 구조체 내부에 줄기 세포를 주입하여 생체 내에 이식하는 이식재로서, 종횡 격자 형상으로 배치한 지주(支柱)를 적층하여 이루어지는 스캐폴드가 개시되어 있다. 예를 들면 일본 특허공보 제4437227호에는, 비수용성 폴리머로 이루어지는 통 형상 다공질체와, 통 형상 다공질체의 내면을 피복하는 혈관 내피 세포와, 통 형상 다공질체의 외면을 피복하는 혈관 평활근 세포를 포함하는 인공 혈관이 개시되어 있다.
현재, 피부, 연골과 같은, 구조가 비교적 단순한 세포 조직이 인공적으로 만들어져, 이식 의료의 현장에서 사용되고 있다. 한편, 다양한 세포가 복잡한 구조를 형성하고 있는 장기, 예를 들면 간장, 췌장 등을 대체하는 인공적인 세포 조직의 실용화가 요망되고 있지만, 이를 위해서는, 장기 특이적인 세포가 기능적으로 배치되고 또한 혈관망과 임파관망을 구비한 세포 조직을 제조할 필요가 있다. 또, 동물 실험이나 임상 시험을 대신하는 시험용 세포 조직으로서도, 생체 내의 장기와 비슷한 구조를 갖는 세포 조직이 기다려지고 있다.
본 개시는, 상기 상황하에 이루어졌다.
본 개시는, 마이크로 오더의 네트워크 구조를 구비한 세포 조직을 제조하는 제조 방법, 및 마이크로 오더의 네트워크 구조를 구비한 세포 조직의 제조에 이용하는 다공 필름을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기의 과제를 해결하기 위한 구체적 수단에는, 이하의 양태가 포함된다.
[1] 표면에 마련된 복수의 개공(開孔)과, 서로 인접하는 개공끼리를 연통하는 연통 구멍을 갖는 다공 필름의 개공 및 연통 구멍의 내부에서, 피더능을 갖는 세포를 배양하는 배양 공정을 포함하는, 세포 조직의 제조 방법.
[2] 배양 공정이, 피더능을 갖는 세포와, 혈관 내피 세포 및 임파관 내피 세포 중 적어도 어느 하나를, 개공 및 연통 구멍의 내부에서 공배양하는 배양 공정인, [1]에 기재된 세포 조직의 제조 방법.
[3] 배양 공정이, 피더능을 갖는 세포와, 실질 장기를 형성하는 세포를, 개공 및 연통 구멍의 내부에서 공배양하는 배양 공정인, [1]에 기재된 세포 조직의 제조 방법.
[4] 배양 공정이, 피더능을 갖는 세포와, 혈관 내피 세포 및 임파관 내피 세포 중 적어도 어느 하나와, 실질 장기를 형성하는 세포를, 개공 및 연통 구멍의 내부에서 공배양하는 배양 공정인, [1]에 기재된 세포 조직의 제조 방법.
[5] 피더능을 갖는 세포가, 간엽계 줄기 세포 및 섬유 아세포 중 적어도 어느 하나인, [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 세포 조직의 제조 방법.
[6] 복수의 개공이, 다공 필름의 표면에 허니콤 형상으로 배치되어 있는, [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 세포 조직의 제조 방법.
[7] 연통 구멍이, 다공 필름의 면 방향 전역에 걸쳐 대략 동일한 깊이로 마련되어 있는, [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 세포 조직의 제조 방법.
[8] 연통 구멍의 구멍 직경이, 다공 필름에 파종되는 세포의 긴 직경에 대하여 50%~500%의 범위인, [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 세포 조직의 제조 방법.
[9] 연통 구멍의 구멍 직경이 5μm~50μm의 범위인, [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 세포 조직의 제조 방법.
[10] 연통 구멍의 구멍 직경의 변동 계수가 30% 이하인, [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 세포 조직의 제조 방법.
[11] 개공의, 다공 필름의 면 방향에 있어서의 긴 직경이 10μm~100μm의 범위인, [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 기재된 세포 조직의 제조 방법.
[12] 개공의 깊이가 10μm~100μ의 범위인, [1] 내지 [11] 중 어느 하나에 기재된 세포 조직의 제조 방법.
[13] 개공의 개구 직경이 5μm~90μm의 범위인, [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 세포 조직의 제조 방법.
[14] 개공의 개구 직경의 변동 계수가 20% 이하인, [1] 내지 [13] 중 어느 하나에 기재된 세포 조직의 제조 방법.
[15] 배양 공정 전에, 다공 필름의 복수의 개공이 개구한 측의 면에 세포를 파종한 후, 세포를 파종한 측의 면으로부터 반대면을 향하는 방향으로 원심력을 가하여 세포를 복수의 개공의 내부로 이동시키는 원심 처리 공정을 포함하는, [1] 내지 [14] 중 어느 하나에 기재된 세포 조직의 제조 방법.
[16] 표면에 마련된 복수의 개공과, 서로 인접하는 개공끼리를 연통하는 연통 구멍을 갖는 다공 필름으로서, 개공의, 다공 필름의 면 방향에 있어서의 긴 직경이 20μm~100μm의 범위인, 다공 필름.
[17] 표면에 마련된 복수의 개공과, 서로 인접하는 개공끼리를 연통하는 연통 구멍을 갖는 다공 필름으로서, 개공의 깊이가 20μm~100μm의 범위인, 다공 필름.
[18] 개공의 개구 직경이 5μm~90μm의 범위인, [16] 또는 [17]에 기재된 다공 필름.
[19] 연통 구멍의 구멍 직경이 5μm~50μm의 범위인, [16] 내지 [18] 중 어느 하나에 기재된 다공 필름.
[20] 복수의 개공이, 다공 필름의 표면에 허니콤 형상으로 배치되어 있는, [16] 내지 [19] 중 어느 하나에 기재된 다공 필름.
본 개시에 의하면, 마이크로 오더의 네트워크 구조를 구비한 세포 조직을 제조하는 제조 방법, 및 마이크로 오더의 네트워크 구조를 구비한 세포 조직의 제조에 이용하는 다공 필름이 제공된다.
도 1a는 다공 필름의 구조를 나타내는 사시도이다.
도 1b는 도 1a에 있어서의 개구면 측으로부터 본 평면도이다.
도 1c는 도 1b에 있어서의 c-c선을 따른 단면도이다.
도 1d는 도 1b에 있어서의 d-d선을 따른 단면도이다.
도 2는 다공 필름의 제조 방법의 일례를 나타내는 모식도이다.
도 3은 다공 필름의 주사형 전자 현미경상이다.
도 4는 배양 디바이스의 부품 및 배양 디바이스의 일례이다.
도 5a는 다공 필름의 단면 및 표면의 주사형 전자 현미경상이다.
도 5b는 다공 필름의 단면 및 표면의 주사형 전자 현미경상이다.
도 6은 간엽계 줄기 세포로부터 분화 유도한 세포에 있어서의 액틴의 형광 면역 염색상이다.
도 7a는 혈관 내피 세포를 단독 배양한 또는 간엽계 줄기 세포와 혈관 내피 세포를 공배양한 배양 3일째의 세포에 있어서의 CD31의 형광 면역 염색상(저배율)이다.
도 7b는 동일하게 배양 3일째의 세포에 있어서의 CD31의 형광 면역 염색상(고배율)이다.
도 7c는 동일하게 배양 7일째의 세포에 있어서의 CD31의 형광 면역 염색상(고배율)이다.
도 7d는 간엽계 줄기 세포와 혈관 내피 세포의 공배양에 있어서의 네트워크의 전체 길이 및 총 면적을 나타내는 그래프이다.
도 8a는 간엽계 줄기 세포 또는 섬유 아세포와 혈관 내피 세포를 공배양한 배양 3일째의 세포에 있어서의 CD31의 형광 면역 염색상이다.
도 8b는 동일하게 배양 7일째의 세포에 있어서의 CD31의 형광 면역 염색상이다.
도 8c는 배양 3일째에 있어서의 네트워크의 전체 길이 및 총 면적을 나타내는 그래프이다.
도 8d는 배양 7일째에 있어서의 네트워크의 전체 길이 및 총 면적을 나타내는 그래프이다.
도 9a는 개공 치수가 다른 다공 필름을 이용하여 간엽계 줄기 세포와 혈관 내피 세포를 공배양한 배양 3일째의 세포에 있어서의 CD31의 형광 면역 염색상(저배율)이다.
도 9b는 동일하게 배양 3일째의 세포에 있어서의 CD31의 형광 면역 염색상(고배율)이다.
도 9c는 동일하게 배양 7일째의 세포에 있어서의 CD31의 형광 면역 염색상(저배율)이다.
도 9d는 동일하게 배양 7일째의 세포에 있어서의 CD31의 형광 면역 염색상(고배율)이다.
도 9e는 배양 3일째 및 7일째에 있어서의 네트워크의 전체 길이 및 총 면적을 나타내는 그래프이다.
도 10a는 3종류의 세포를 동시에 공배양한 배양 3일째의 형광상이다.
도 10b는 동일하게 배양 3일째의 세포에 있어서의 CD31의 형광 면역 염색상이다.
도 11a는 3종류의 세포를 단계적으로 공배양한 공배양 3일째의 형광상이다.
도 11b는 동일하게 공배양 3일째의 세포에 있어서의 CD31의 형광 면역 염색상이다.
도 11c는 공배양 3일째에 있어서의, 동시 공배양, 단계적 공배양 각각의 네트워크의 전체 길이 및 총 면적을 나타내는 그래프이다.
이하에, 본 개시의 실시형태에 대하여 설명한다. 이들의 설명 및 실시예는 실시형태를 예시하는 것이며, 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
본 개시에 있어서 "~"를 이용하여 나타난 수치 범위는, "~"의 전후에 기재되는 수치를 각각 하한값 및 상한값으로서 포함하는 범위를 나타낸다.
본 개시에 있어서 "공정"이라는 말은, 독립적인 공정뿐만 아니라, 다른 공정과 명확하게 구별할 수 없는 경우여도 그 공정의 소기의 목적이 달성되면, 본 용어에 포함된다.
본 개시에 있어서 조성물 중의 각 성분의 양에 대하여 언급하는 경우, 조성물 중에 각 성분에 해당하는 물질이 복수 종 존재하는 경우에는, 특별히 설명하지 않는 한, 조성물 중에 존재하는 당해 복수 종의 물질의 합계량을 의미한다.
본 개시에 있어서는, 변동 계수를 백분율로 나타낸다. 변동 계수는, 어느 집단에 대하여 표준 편차를 평균으로 나눈 값이며, 그 집단의 편차의 정도를 나타내는 지표이다.
<다공 필름>
본 실시형태의 세포 조직의 제조 방법은, 생체 외에 있어서 세포 조직을 제조하는 방법이며, 표면에 마련된 복수의 개공과, 서로 인접하는 개공끼리를 연통하는 연통 구멍을 갖는 다공 필름의 개공 및 연통 구멍의 내부에서, 세포를 배양하는 배양 공정을 포함한다. 먼저, 세포 조직의 제조에 이용하는 다공 필름에 대하여 설명한다. 본 실시형태의 다공 필름은, 세포가 생착하여 조직을 형성하기 위한 스캐폴드로서 기능한다.
본 실시형태의 다공 필름은, 표면에 마련된 복수의 개공과, 서로 인접하는 개공끼리를 연통하는 연통 구멍을 갖는다. 다공 필름이 구비하는 개공 및 연통 구멍의 벽면은, 세포가 생착하는 스캐폴드가 된다. 본 실시형태의 다공 필름에 파종된 세포는, 개공 및 연통 구멍의 내부에 생착하여, 마이크로 오더의 네트워크 구조를 구비한 세포 조직을 형성한다.
이하, 다공 필름의 일례를, 도면을 참조하면서 설명한다. 각 도면에 있어서 동일 또는 등가인 구성 요소 및 부분에는 동일한 참조 부호를 부여하고 있다. 이하의 설명에 있어서, "면 방향"이란, 다공 필름의 주면(主面) 방향을 의미하고, "두께 방향"이란, 다공 필름의 두께 방향을 의미한다. 이하의 설명에 있어서, "긴 직경"이란, 윤곽 상의 임의의 2점 간 거리 중 최대 길이를 의미하고, 단 방향이 특정되어 있는 경우는, 그 방향의 임의의 2점 간 거리 중 최대 길이를 의미한다. 이하의 설명에 있어서, "개구의 중심"이란, 개구를 면 방향의 2차원 도형으로 인식한 경우의 무게 중심을 의미한다.
도 1a는, 다공 필름의 구조를 나타내는 사시도이고, 도 1b는, 도 1a에 있어서의 개구면 측으로부터 본 평면도이며, 도 1c는, 도 1b에 있어서의 c-c선을 따른 단면도이고, 도 1d는, 도 1b에 있어서의 d-d선을 따른 단면도이다. 도 1a~도 1d에는, 본 실시형태의 일례인 다공 필름(200)을 나타낸다.
다공 필름(200)은, 면 방향으로 복수의 개공(210)이 배치된 다공층(204)와, 다공층(204)를 지지하는 지지체(202)를 구비하는 적층체이다. 다른 예로서, 다공 필름(200)은, 지지체(202)를 구비하지 않고, 다공층(204)만의 단층체여도 된다.
다공 필름(200)의 다공층(204)에는, 면 방향 전역에 걸쳐 개공(210)이 배치되어 있다. 단, 다공층(204)에 세포가 접촉할 수 없는 영역이 있는 경우, 그 영역에는 개공(210)이 배치되어 있지 않아도 된다.
다공 필름(200)의 개구면(206)은, 복수의 개공(210)이 개구한 측의 면이고, 세포를 파종하는 측의 면이다. 개구면(206)에 있어서, 서로 인접하는 개공(210)의 개구끼리는, 개구부(210a)의 사이에 뻗어 있는 평탄부(208)에 의하여 이간되어 있다. 개구면(206)에 있어서의 개공(210)의 개구를 통하여, 개공(210) 및 연통 구멍(212)의 내부에 액체 배지가 공급된다.
각각의 개공(210)은, 다공층(204)를 관통하고 있지 않는 바닥이 있는 구멍이다. 다른 예로서 각각의 개공(210)은, 다공층(204)를 관통하여, 지지체(202)의 표면을 바닥면으로 하는 바닥이 있는 구멍이어도 된다. 다공 필름(200)이 다공층(204)의 단층체인 예에 있어서, 각각의 개공(210)은, 다공층(204)를 관통하고 있지 않는 바닥이 있는 구멍이어도 되고, 다공층(204)를 관통한 관통 구멍이어도 된다.
개공(210) 각각의 형상으로서는, 예를 들면 구체의 일부를 잘라낸 구결(球缺) 형상, 배럴 형상, 원기둥 형상, 또는 각기둥 형상을 들 수 있다. 개공(210) 각각의 개구의 형상으로서는, 예를 들면 원형, 타원형, 또는 다각형을 들 수 있다.
복수의 개공(210)은, 규칙적으로 배치되어 있고, 구체적으로는, 허니콤 형상으로 배치되어 있다. 다른 예로서, 복수의 개공(210)은, 격자 형상 또는 면심 격자 형상으로 배치되어 있어도 된다. 복수의 개공(210)의 배치를 랜덤으로 해도 되지만, 면 방향에 있어서의 개공(210)의 밀도를 균일하게 하여, 다공 필름(200)에 있어서 세포가 형성하는 조직의 균질성을 높이는 관점에서, 복수의 개공(210)은 규칙적으로 배치되어 있는 것이 바람직하다. 규칙적인 배치는, 도중에 끊어지거나 어긋남이 있거나 해도 되지만, 모든 방향으로 간극 없이 연속하여 반복하고 있는 것이 바람직하다. 허니콤 형상의 배치란, 평행 육변형(바람직하게는 정육각형) 또는 이에 가까운 형상을 단위로 하여, 이들 도형의 정점 및 대각선의 교점에 개구의 무게 중심이 위치하는 배치이다. 격자 형상의 배치란, 평행 사변형(말할 필요도 없지만, 정사각형, 직사각형, 마름모형이 포함된다. 바람직하게는 정사각형) 또는 이에 가까운 형상을 단위로 하여, 이들 도형의 정점에 개구의 무게 중심이 위치하는 배치이다. 면심 격자 형상의 배치란, 평행 사변형(말할 필요도 없지만, 정사각형, 직사각형, 마름모형이 포함된다. 바람직하게는 정사각형) 또는 이에 가까운 형상을 단위로 하여, 이들 도형의 정점 및 대각선의 교점에 개구의 무게 중심이 위치하는 배치이다. 규칙적으로 배치되어 있는 것의 기준은, 배치의 단위인 평행 육변형 또는 평행 사변형의 면적에 관하여, 그 변동 계수가 10% 이하이다.
다공 필름(200)에 있어서, 서로 인접하는 개공(210)끼리는, 다공층(204)의 내부에 있어서, 연통 구멍(212)에 의하여 연통하고 있다. 1개의 개공(210)은, 인접하는 전부의 개공(210)과 연통하고 있는 것이 바람직하다. 복수의 개공(210)이 허니콤 형상으로 배치되어 있는 다공 필름(200)에 있어서는, 1개의 개공(210)은, 인접하는 6개의 개공(210)과 연통하고 있는 것이 바람직하고, 즉, 1개의 개공(210)은, 6개의 연통 구멍(212)를 갖는 것이 바람직하다.
다공 필름(200)에 있어서, 서로 인접하는 개공(210)끼리는, 각각의 벽면의 일부를 연속시켜 배치되어 있고, 연통 구멍(212)는, 개공(210) 간의 연결부(210b)로 둘러싸이는 구멍이다. 다른 예로서, 인접하는 개공(210)끼리는 독립하고 있고, 통 형상의 공극인 연통 구멍(212)가, 인접하는 개공(210)끼리를 연결하고 있어도 된다.
이하, 다공 필름(200)의 구조의 치수에 대하여 설명한다.
복수의 개공(210)은, 다공 필름(200)에 파종된 세포가 들어가 생착할 수 있는 크기를 갖는다. 다공 필름(200)에 파종되는 세포의 긴 직경은, 예를 들면 10μm~50μm이다.
개공(210)의 개구 직경(Da)는, 다공 필름(200)에 파종되는 세포의 긴 직경에 대하여 50% 이상인 것이 바람직하고, 80% 이상인 것이 보다 바람직하며, 120% 이상인 것이 더 바람직하다. 50% 이상(보다 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 120% 이상)이면, 다공 필름(200)에 파종된 세포가 개공(210)의 내부에 들어가는 것이 가능해진다. 구체적으로는, 개공(210)의 개구 직경(Da)는, 5μm 이상인 것이 바람직하고, 8μm 이상인 것이 보다 바람직하며, 12μm 이상인 것이 더 바람직하다. 개공(210)의 개구 직경(Da)는, 개공(210)의 바람직한 배치 및 크기와의 관계에 의하여, 90μm 이하인 것이 바람직하고, 70μm 이하인 것이 보다 바람직하며, 50μm 이하인 것이 더 바람직하다. 개구 직경(Da)는, 개공(210)의 개구의 긴 직경이며, 개구 직경(Da)의 범위는, 임의로 선택한 10개 이상의 개구의 개구 직경을 측정하여 확인한다.
개공(210)의 개구 직경(Da)의 변동 계수는, 20% 이하인 것이 바람직하고, 작을수록 바람직하다. 개구 직경(Da)의 변동 계수가 작을수록, 다공 필름(200)에 있어서 세포가 형성하는 조직의 균질성이 높아진다.
다공 필름(200)의 세포 배양 영역에 있어서, 개구면(206)의 전체 면적에 차지하는 개공(210)의 개구의 합계 면적의 비율은, 20%~90%인 것이 바람직하고, 30%~80%인 것이 보다 바람직하며, 40%~70%인 것이 더 바람직하다.
개공(210)의 면 방향에 있어서의 긴 직경(Db)는, 10μm~100μm의 범위인 것이 바람직하고, 20μm~80μm의 범위인 것이 보다 바람직하며, 30μm~60μm의 범위인 것이 더 바람직하다. 10μm 이상(보다 바람직하게는 20μm 이상, 더 바람직하게는 30μm 이상)이면, 증식성의 세포가 증식하는 공간이 확보되고, 또 공배양하는 복수 종의 세포가 공존하는 공간이 확보된다. 100μm 이하(보다 바람직하게는 80μm 이하, 더 바람직하게는 60μm 이하)이면, 마이크로 오더의 네트워크 구조의 형성이 가능해진다. 긴 직경(Db)는, 개공(210)을 그 개구의 장축 상(즉 개구 직경(Da) 상) 또한 두께 방향으로 절단한 절단면에 나타나는 개공(210)의 윤곽의 면 방향의 긴 직경이다. 면 방향으로 등방적인 형상 또한 대략 동일(동일을 포함함)한 크기의 복수의 개공(210)이 정육각형 또는 이에 가까운 형상을 단위로 한 허니콤 형상으로 배치되어 있고, 서로 인접하는 개공(210)끼리가 각각의 벽면의 일부를 연속시켜 배치되어 있는 다공 필름(200)에 있어서는, 서로 인접하는 개구의 사이의 중심 간 거리(P1)을 긴 직경(Db)로 간주한다. 이 경우, 긴 직경(Db)의 범위는, 중심 간 거리(P1)을, 각도를 대략 60도(60도를 포함함)씩 어긋나게 한 3방향으로 합계 10개 이상 측정하여 확인한다. 상기 배치 이외의 다공 필름에 대해서는, 상기에 준하여, 개공(210)의 배치의 규칙성에 따라 확인한다.
개공(210)의 깊이(Dc)는, 10μm~100μm의 범위인 것이 바람직하고, 20μm~80μm의 범위인 것이 보다 바람직하며, 30μm~60μm의 범위인 것이 더 바람직하다. 10μm 이상(보다 바람직하게는 20μm 이상, 더 바람직하게는 30μm 이상)이면, 증식성의 세포가 증식하는 공간이 확보되고, 또 공배양하는 복수 종의 세포가 공존하는 공간이 확보된다. 100μm 이하(보다 바람직하게는 80μm 이하, 더 바람직하게는 60μm 이하)이면, 마이크로 오더의 네트워크 구조의 형성이 가능해진다. 깊이(Dc)는, 각각의 개공(210)에 있어서 개구면(206)으로부터 개공(210)의 최심부까지의 거리이다. 복수의 개공(210)이 정육각형 또는 이에 가까운 형상을 단위로 한 허니콤 형상으로 배치되어 있는 다공 필름(200)에 있어서는, 개구의 중심 간을 연결하는 선 상에서 두께 방향으로 절단한 절단면에 나타나는 개공(210)의 윤곽에 있어서, 개구면(206)으로부터 개공(210)의 최심부까지의 거리를, 깊이(Dc)로 한다. 이 경우, 깊이(Dc)의 범위는, 절단선의 각도를 대략 60도(60도를 포함함)씩 어긋나게 한 3개의 절단면을 형성하고, 합계 10개 이상 측정하여 확인한다.
연통 구멍(212)의 구멍 직경(Dd)는, 다공 필름(200)에 파종되는 세포의 긴 직경에 대하여 50%~500%의 범위인 것이 바람직하다. 연통 구멍(212)의 구멍 직경(Dd)가 파종되는 세포의 긴 직경에 대하여 50% 이상이면, 서로 인접하는 개공(210) 간을 세포가 이동하는 것이 가능해진다. 그 관점에서, 연통 구멍(212)의 구멍 직경(Dd)는, 파종되는 세포의 긴 직경에 대하여, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 120% 이상이다. 한편, 연통 구멍(212)의 구멍 직경(Dd)가 파종되는 세포의 긴 직경에 대하여 500% 이하이면, 연통 구멍(212)에 생착하는 세포수가 적절해진다. 그 관점에서, 연통 구멍(212)의 구멍 직경(Dd)는, 파종되는 세포의 긴 직경에 대하여, 보다 바람직하게는 400% 이하, 더 바람직하게는 300% 이하이다.
연통 구멍(212)의 구멍 직경(Dd)는, 상기의 관점에서, 5μm~50μm의 범위인 것이 바람직하고, 8μm~45μm의 범위인 것이 보다 바람직하며, 12μm~40μm의 범위인 것이 더 바람직하다. 구멍 직경(Dd)는, 개구의 중심 간을 연결하는 선 상에서 두께 방향으로 절단한 절단면에 나타나는 연통 구멍(212)의 윤곽에 있어서, 두께 방향의 긴 직경이다. 복수의 개공(210)이 정육각형 또는 이에 가까운 형상을 단위로 한 허니콤 형상으로 배치되어 있는 다공 필름(200)에 있어서는, 구멍 직경(Dd)의 범위는, 절단선의 각도를 대략 60도(60도를 포함함)씩 어긋나게 한 3개의 절단면을 형성하여, 합계 10개 이상 측정하여 확인한다. 상기 배치 이외의 다공 필름에 대해서는, 상기에 준하여 개공(210)의 배치의 규칙성에 따른 절단면을 형성하여 확인한다.
연통 구멍(212)의 구멍 직경(Dd)의 변동 계수는, 30% 이하인 것이 바람직하고, 20% 이하인 것이 보다 바람직하며, 작을수록 바람직하다. 구멍 직경(Dd)의 변동 계수가 작을수록, 다공 필름(200)에 있어서 세포가 형성하는 조직의 균질성이 높아진다.
연통 구멍(212)는, 면 방향 전역에 걸쳐 대략 동일(동일을 포함함)한 깊이에 마련되어 있는 것이 바람직하다. 이로써, 다공 필름(200)에 있어서 세포가 형성하는 조직의 균질성이 확보된다. 대략 동일한 기준은, 구멍 직경(Dd)를 측정하기 위한 절단면에 있어서, 개구면(206)으로부터 연통 구멍(212)의 최심부까지의 거리의 변동 계수가 10% 이하이다.
평탄부(208)의 폭(W)는, 세포의 긴 직경보다 좁은 것이 바람직하다. 이로써, 평탄부(208) 상에서 배양되는 세포의 비율을 작게 하고, 개공(210) 및 연통 구멍(212)의 내부에서 배양되는 세포의 비율을 크게 한다. 폭(W)는, 개구의 중심 간에 있어서 측정되는, 평탄부(208)의 길이이다.
이하, 다공 필름(200)의 소재에 대하여 설명한다. 다공 필름(200)의 소재는, 세포의 접착성의 관점, 생체 내에 있어서의 이식 부위와의 친화성의 관점, 생체 내에서의 분해 또는 흡수의 난이(難易)의 관점 등으로부터 선택된다.
다공층(204)의 소재로서는, 후술하는 제조 방법에 의하여 다공 필름(200)을 제조하는 관점에서는, 소수성의 유기 용매에 용해 가능한 소수성 폴리머가 바람직하다. 소수성의 유기 용매는, 25℃의 물에 대한 용해도가 10(g/100g 물) 이하의 액체이다.
소수성 폴리머로서는, 폴리스타이렌, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴아마이드, 폴리메타크릴아마이드, 폴리 염화 바이닐, 폴리 염화 바이닐리덴, 폴리 불화 바이닐리덴, 폴리헥사플루오로프로페인, 폴리바이닐에터, 폴리바이닐카바졸, 폴리 아세트산 바이닐, 폴리테트라플루오로에틸렌 등), 폴리에스터(예를 들면, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리에틸렌나프탈레이트, 폴리에틸렌석시네이트, 폴리뷰틸렌석시네이트, 폴리 락트산, 폴리-3-하이드록시뷰티레이트 등), 폴리락톤(예를 들면, 폴리카프로락톤 등), 폴리아마이드 또는 폴리이미드(예를 들면, 나일론, 폴리아마이드산 등), 폴리유레테인, 폴리유레아, 폴리뷰타다이엔, 폴리카보네이트, 폴리아로마틱스, 폴리설폰, 폴리에터설폰, 폴리실록세인 유도체, 셀룰로스아실레이트(예를 들면, 트라이아세틸셀룰로스, 셀룰로스아세테이트프로피오네이트, 셀룰로스아세테이트뷰틸레이트) 등의 폴리머를 들 수 있다. 이들 폴리머는, 용제에 대한 용해성, 광학적 물성, 전기적 물성, 막강도, 탄성 등의 관점에서, 필요에 따라 호모폴리머, 코폴리머, 폴리머 브렌드 또는 폴리머알로이로 해도 된다. 이들 폴리머는, 1종 단독으로 사용해도 되고 또는 2종 이상을 혼합하여 사용해도 된다. 생체 흡수성의 관점에서는, 폴리 락트산, 폴리카프로락톤, 폴리-3-하이드록시뷰티레이트 등이 바람직하다.
지지체(202)의 소재는, 다공층(204)와 동일해도 되고 달라도 된다. 지지체(202)의 소재로서는, 합성 수지, 유리, 금속 등을 들 수 있다. 세포 조직의 제조에 사용할 때 또는 세포 조직을 제조한 후에 다공층(204)를 지지체(202)로부터 박리하는 경우는, 지지체(202)의 소재는, 다공층(204)와는 다른 소재인 것이 바람직하다.
다공 필름(200)은, 예를 들면 하기의 공정 (a)~공정 (e)를 순차적으로 행하는 제조 방법에 의하여 제조된다. 도 2는, 공정 (a)~공정 (e)에 있는 다공 필름(200)의 단면을 나타낸 모식도이다.
[공정 (a)]
다공층(204)를 구성하는 소수성 폴리머를 용매에 용해한 도포액을 준비하고, 도포액을 지지체(202) 상에 도포하여, 지지체(202) 상에 도막(204a)를 형성한다.
도포액은, 소수성 폴리머와, 용매와, 양친매성(兩親媒性) 화합물을 혼합하여 조제한다. 용매로서는, 소수성 폴리머의 양용매(良溶媒)와 소수성의 액체와의 혼합 용매, 또는 소수성 폴리머의 양용매인 소수성 유기 용제가 바람직하다. 후자로서는, 트라이클로로메테인, 다이클로로메테인, 클로로폼 등의 할로젠계 용제를 들 수 있고, 이들 용제에 소수성의 액체인 n-헥세인, 사이클로헥세인, n-펜테인, n-옥테인, n-헵테인 등의 탄화 수소 화합물을 혼합하여 이용해도 된다.
양친매성 화합물은, 친수성기와 소수성기를 양쪽 모두 갖는 화합물이다. 양친매성 화합물을 도포액에 배합함으로써, 도막의 표면에 물방울을 형성하기 쉬워진다. 또, 용매에 대한 소수성 폴리머의 분산 상태를 양친매성 화합물에 의하여 제어함으로써, 물방울의 성장을 보다 용이하게 제어할 수 있다. 양친매성 화합물로서는, 시판되고 있는 많은 계면활성제, 이량체나 삼량체 등의 올리고머, 폴리머 등의 고분자 화합물을 들 수 있다. 양친매성 화합물로서는, 구체적으로는 예를 들면, 폴리아크릴 골격을 주쇄로 하고, 친유성 측쇄로서 장쇄 지방족기(예를 들면 도데실기) 및 친수성 측쇄로서 카복실기를 갖는 화합물; 폴리에틸렌글라이콜/폴리프로필렌글라이콜 블록 코폴리머; 인지질 등을 들 수 있다.
도포액에 있어서, 소수성 폴리머의 농도는, 0.1질량%~10질량%가 바람직하고, 양친매성 화합물의 농도는, 0.01질량%~1질량%가 바람직하다.
[공정 (b)]
가습 공기를 도막(204a)의 표면 전체에 걸쳐 흘려 보내고, 결로 현상에 의하여 도막(204a) 상에 물방울(210S)를 형성한다. 이때, 도막(204a)의 근방을 흐르는 가습 공기의 노점 Td와, 도막(204a)의 표면 온도 Ts와의 차분 ΔT(=Td-Ts)가, 하기의 식 (1)을 충족하도록, Td 및 Ts 중 적어도 한쪽을 제어한다.
식 (1): 3℃≤ΔT≤30℃
[공정 (c)]
가습 공기의 공급을 계속함으로써 물방울(210S)를 성장시킨다. 물방울(210S)의 각각은, 서로 대략 동일(동일을 포함함)한 크기로 성장한다. 물방울(210S)는, 도막(204a)에 포함되는 용매의 증발에 따라, 횡모세관력(橫毛細管力)에 의하여 허니콤 형상으로 배치됨과 함께, 도막(204a) 중에 들어간다. 이것과 병행하여, 도막(204a)에 포함되는 용매의 증발에 따라, 소수성 폴리머가 물방울(210S)의 주위에 석출된다.
[공정 (d)]
가습 공기의 공급을 계속하여, 도막(204a) 중에서 물방울(210S)끼리가, 양친매성 화합물의 막(220)을 구획하여 밀접할 때까지 물방울(210S)를 성장시킨다.
[공정 (e)]
용매의 증발에 병행하거나 또는 용매를 증발시킨 후에, 물방울(210S)를 증발시켜, 도막(204a)에 물방울(210S)가 들어간 부분을 개공(210)으로서 남기고, 병행하여, 밀접하는 물방울(210S)끼리를 구획하고 있었던 양친매성 화합물의 막(220)을 파막한다. 이렇게 하여, 복수의 개공(210)이 허니콤 형상으로 배치되고 또한 내부에서 연결한 다공층(204)가 형성된다.
이상의 공정 (a)~공정 (e)를 거쳐, 다공층(204)와 지지체(202)의 적층체가 얻어진다. 다공층(204)와 지지체(202)의 적층체를 다공 필름(200)으로 해도 되고, 다공층(204)를 지지체(202)로부터 박리하여, 다공층(204)의 단층체를 다공 필름(200)으로 해도 되며, 다공층(204)를 지지체(202)로부터 박리하고 다른 지지체에 첩부하여 다공 필름(200)으로 해도 된다. 다공 필름(200)의 세포를 파종하는 측의 면에, 플라즈마 방전 등에 의한 전하 처리를 실시해도 된다. 도 3은, 공정 (a)~공정 (e)를 거쳐 제조된 다공 필름의 일례를, 개구면 측으로부터, 주사형 전자 현미경을 이용하여 촬영한 사진이다.
개공(210)의 개구 직경(Da), 긴 직경(Db) 및 깊이(Dc)와, 연통 구멍(212)의 구멍 직경(Dd)는, 물방울(210S)의 크기를 조정함으로써 제어 가능하다. 물방울(210S)의 크기의 조정은, 도막(204a)의 막두께, 가습 공기에 포함되는 수증기량, 및 물방울(210S)를 증발시키는 타이밍에 의하여 조정 가능하다.
상기의 제조 방법에 의하면, 복수의 개공이 허니콤 형상으로 균일성 높게 배치된 다공 필름을, 형이나 마스크를 사용하지 않고 제조 가능하다. 상기의 제조 방법의 상세는, 예를 들면 일본 공개특허공보 2007-291367호, 일본 공개특허공보 2009-256624호, 일본 공개특허공보 2011-074140호, 일본 공개특허공보 2011-202100호에 기재되어 있다. 다공 필름(200)은, 에칭, 샌드블래스트, 프레스 성형 등에 의해서도 제조 가능하다.
<세포 조직의 제조 방법>
본 실시형태의 세포 조직의 제조 방법은, 생체 외에 있어서 세포 조직을 제조하는 제조 방법이며, 본 개시의 다공 필름의 개공 및 연통 구멍의 내부에서, 세포를 배양하는 배양 공정을 포함한다. 이하, 다공 필름의 개공과 연통 구멍을 총칭하여 "구멍"이라고 한다.
본 실시형태에 의하면, 본 개시의 다공 필름이 구비하는 구멍이, 세포가 마이크로 오더의 망 형상으로 배열하는 궤도의 기능을 하기 때문에, 마이크로 오더의 네트워크 구조를 구비한 세포 조직이 형성된다. 마이크로 오더의 네트워크 구조를 구비한 세포 조직은, 생체 내로의 이식 재료로서, 또 동물 실험이나 임상 시험을 대신하는 시험용 세포 조직으로서 유용하다. 세포 조직은, 다공 필름마다 사용해도 되고, 다공 필름의 개구 주위의 평탄부를 제거하여 다공 필름의 구멍 내로부터 취출하여 사용해도 된다. 세포 조직은, 복수 개를 적층하여 사용하는 것도 가능하다.
본 실시형태의 배양 공정에는, 이하의 실시형태 (1)~(4)가 포함된다.
실시형태 (1): 피더능을 갖는 세포를 단독으로 배양하는 배양 공정. 단, 피더능을 갖는 세포는, 1종이어도 되고 2종 이상이어도 된다.
실시형태 (1)에 의하면, 피더 세포의 네트워크 구조를 구비한 세포 조직이 제공된다. 실시형태 (1)에 의하여 제조된 세포 조직은, 예를 들면 생체 외에서 세포 배양을 행할 때의 스캐폴드재, 또는 생체 내에 이식되어 이식 부위에 있어서 조직을 재생하는 스캐폴드재로서 이용된다.
피더능을 갖는 세포로서는, 간엽계 줄기 세포, 섬유 아세포를 들 수 있다. 간엽계 줄기 세포(Mesenchymal Stem Cell, MSC)는, 근세포, 지방 세포, 연골 세포 등으로 분화 가능한 체성 줄기 세포이며, 피더능을 갖는 것도 알려져 있다. 배양 공정에 있어서 간엽계 줄기 세포에 대한 분화 유도 인자를 배지에 첨가하여, 간엽계 줄기 세포를 체세포(예를 들면, 근세포, 지방 세포, 연골 세포)에 분화시키는 것도 가능하다. 이 경우, 예를 들면 마이크로 오더의 네트워크 구조를 구비한 근육 조직, 지방 조직 또는 연골 조직 등이 제공된다.
실시형태 (2): 피더능을 갖는 세포와, 혈관 내피 세포 및 임파관 내피 세포 중 적어도 어느 하나를 공배양하는 배양 공정.
실시형태 (2)에 의하면, 혈관 내피 세포 또는 임파관 내피 세포의 네트워크 구조를 구비한 세포 조직이 제공된다. 실시형태 (2)에 의하여 제조된 세포 조직은, 예를 들면 생체 외에서 체세포의 배양을 행할 때의 스캐폴드재, 또는 생체 내에 이식되어 이식 부위에 있어서 조직을 재생하는 스캐폴드재로서 이용된다.
혈관 내피 세포로서는, 제대(臍帶) 정맥, 제대 동맥, 대동맥, 관상 동맥, 폐동맥, 폐 미소 혈관, 피부 미소 혈관 등에서 유래하는 혈관 내피 세포, 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도한 혈관 내피 세포를 들 수 있다. 임파관 내피 세포로서는, 피부 미소 임파관, 폐 미소 임파관 등에서 유래하는 임파관 내피 세포, 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도한 임파관 내피 세포를 들 수 있다. 배양 공정에 있어서 배지 조성을 변화시킴으로써, 혈관 내피 세포 또는 임파관 내피 세포의 증식, 유주(遊走), 관형성을 제어하는 것이 가능하다.
실시형태 (3): 피더능을 갖는 세포와, 실질 장기를 형성하는 세포를 공배양하는 배양 공정.
실시형태 (3)에 의하면, 마이크로 오더의 네트워크 구조를 구비한 세포 조직이 제공된다. 실시형태 (3)에 의하여 제조된 세포 조직은, 예를 들면 생체 내에 이식되어 조직 또는 장기의 기능을 보완하기 위하여 이용된다. 그 외에, 실시형태 (3)에 의하여 제조된 세포 조직은, 동물 실험이나 임상 시험을 대신하는 시험용 세포 조직으로서 이용된다.
실질 장기(parenchymal organ)로서는, 간장, 췌장, 신장, 비장, 심장, 폐, 유선 조직, 지방 조직, 난소, 정소, 흉선 등을 들 수 있고, 실질 장기를 형성하는 세포로서는, 이들 장기를 형성하는 실질 세포, 상피 세포, 선세포(腺細胞), 지방 세포, 이들 세포의 줄기 세포 또는 전구 세포 등을 들 수 있다. 실질 장기를 형성하는 세포는, 1종을 이용해도 되고, 2종 이상을 이용해도 된다. 실질 장기를 형성하는 세포의 2종 이상의 조합으로서는, 예를 들면 줄기 세포와 담관 상피 세포; 췌α 세포와 췌β 세포와 췌δ 세포; I형 폐포 상피 세포와 II형 폐포 상피 세포; 유선 선방 세포와 유관 상피 세포 등을 들 수 있다.
실질 장기를 형성하는 세포로서는, 다능성 줄기 세포도 들 수 있다. 다능성 줄기 세포는, 미분화 상태를 유지한 채로 증식할 수 있는 "자기 복제능"과 삼배엽 계열 모두에 분화할 수 있는 "다분화능"을 갖는 미분화 세포이다. 다능성 줄기 세포로서는, 예를 들면 배성 줄기 세포(embryonic stem cell; ES 세포), 인공 다능성 줄기 세포(induced pluripotent stem cell; iPS 세포), 배성 생식 세포(embryonic germ cell; EG 세포), 배성 암 세포(embryonal carcinoma cell; EC 세포), 다능성 성체 전구 세포(multipotent adult progenitor cell; MAP 세포), 성체 다능성 줄기 세포(adult pluripotent stem cell; APS 세포), Muse 세포(multi-lineage differentiating stress enduring cell) 등을 들 수 있다. 배양 공정에 있어서 목적의 체세포로 분화 유도하는 분화 유도 인자를 배지에 첨가하여, 다능성 줄기 세포를 체세포에 분화시킨다.
실시형태 (4): 피더능을 갖는 세포와, 혈관 내피 세포 및 임파관 내피 세포 중 적어도 어느 하나와, 실질 장기를 형성하는 세포를 공배양하는 배양 공정.
실시형태 (4)에 의하면, 실질 장기의 세포 조직의 표면 또는 내부에, 혈관 내피 세포 또는 임파관 내피 세포의 네트워크 구조를 구비한 세포 조직이 제공된다. 실시형태 (4)에 의하여 제조된 세포 조직은, 예를 들면 생체 내에 이식되어 조직 또는 장기의 기능을 보완하기 위하여 이용된다. 그 외에, 실시형태 (4)에 의하여 제조된 세포 조직은, 동물 실험이나 임상 시험을 대신하는 시험용 세포 조직으로서 이용된다.
실시형태 (4)의 배양 공정은, 3종의 세포를 동 시기에 파종하여 3종의 세포를 동시에 공배양하는 배양 공정이어도 되고, 3종의 세포를 단계적으로 파종하여 3종의 세포를 단계적으로 공배양하는 배양 공정이어도 된다. 후자로서는, 예를 들면 피더능을 갖는 세포와, 혈관 내피 세포 및 임파관 내피 세포 중 적어도 어느 하나를 동 시기에 파종하고, 수일간 배양을 행하여 혈관 내피 세포 또는 임파관 내피 세포의 네트워크 구조를 형성한 후, 실질 장기를 형성하는 세포를 파종하여 배양을 계속한다.
배양 공정은, 예를 들면 다공 필름을 복수의 개공이 개구한 측의 면을 위로 하여 배양 용기에 재치하고, 다공 필름에 세포 현탁액을 파종하여, 파종한 세포종에 조제한 배양 조건으로 행한다. 다공 필름을 재치하는 배양 용기로서는, 세포 배양용으로서 공지의 모든 배양 용기를 들 수 있다. 배양 용기의 재질로서는, 예를 들면 수지(예를 들면, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리에스터, 아크릴로나이트릴-뷰타다이엔-스타이렌 수지), 유리, 세라믹스, 금속 등을 들 수 있다. 배양 용기의 형상으로서는, 예를 들면 멀티 웰 플레이트, 페트리디시, 마이크로 어레이용 플레이트, 튜브, 플라스크, 롤러 보틀, 백 등을 들 수 있다.
본 실시형태는, 배양 공정 전에, 다공 필름의 복수의 개공이 개구한 측의 면에 세포를 파종한 후, 세포를 파종한 측의 면으로부터 반대면을 향하는 방향으로 원심력을 가하여 세포를 복수의 개공의 내부로 이동시키는 원심 처리 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 다공 필름에 파종된 세포가 원심 처리 공정에 의하여 다공 필름의 개공 내로 이행하기 때문에, 구멍 내에서 배양되는 세포의 비율이 커진다.
본 실시형태에 원심 처리 공정을 포함하는 경우, 원심 처리 공정의 실시를 용이하게 하기 위하여, 비교적 적은 양의 배지에 세포를 현탁한 세포 현탁액을 파종하여 원심 처리 공정을 실시하는 것이 바람직하다. 그리고, 원심 처리 공정 후에 배양 용기 내에 배지를 추가한다.
[배지, 배양 조건]
본 실시형태에 이용하는 배지는, 포유류 세포의 배양에 이용되는 공지의 배지 중에서, 배양 대상이 되는 세포종에 맞춰 선택된다. 구체적인 배지로서는, 예를 들면 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), DMEM: F-12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12), EMEM(Eagle's minimal essential medium), MEMα(Minimum Essential Medium Alpha), BME(Basal Medium Eagle) 등의 기본 배지에 세포 증식 인자를 첨가하여, 세포종에 맞춰 최적화한 배지를 들 수 있다. 이와 같은 배지는 시판품으로서 입수 가능하다. 본 실시형태에 이용하는 배지는, 공배양하는 세포종에 따라, 복수 종의 배지를 혼합한 배지여도 된다. 배지의 pH는, 예를 들면 pH 7.0~8.0이고, 바람직하게는 pH 7.3~7.4이다.
배지에는, 일반적으로 첨가되는 각종 성분, 예를 들면 FGF-2(Fibroblast Growth Factor-2), TGF-β(Transforming Growth Factor-β), EGF(Epidermal Growth Factor), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor) 등의 세포 증식 인자; 아스코브산, 레티노인산 등의 비타민 또는 비타민 유도체; 글루코스 등의 당원; 아미노산; 아셀레늄산 나트륨, 염화 나트륨 등의 무기염; 트랜스페린 등의 단백질; 인슐린 등의 호르몬; 분화 억제 인자; 분화 유도 인자; 2-머캅토에탄올, 다이싸이오트레이톨 등의 항산화제; 페니실린, 스트렙토마이신 등의 항생 물질 등을 첨가해도 된다. 상기 성분은, 배양 기간 전체에 걸쳐 농도를 소기의 범위로 유지하기 위하여, 세포의 배양 중에 배지에 보충해도 된다. 배지는, 항원성 물질이나 감염원 등이 세포 조직에 혼입되는 것을 억제하는 관점에서, 혈청 및 혈청 대체물을 포함하지 않는 것이 바람직하다.
본 실시형태에 있어서의 배양 공정에 있어서는, 적절히 배지 교환을 행하는 것이 바람직하다. 일련의 배양 공정에 이용하는 배지는, 동일 조성이 아니어도 된다. 공배양하는 세포종에 따라 다른 조성의 배지에 치환하면서 배양을 계속해도 된다.
피더능을 갖는 세포(제1 세포)와, 혈관 내피 세포 또는 임파관 내피 세포(제2 세포)를 공배양할 때, 또는 피더능을 갖는 세포(제1 세포)와, 실질 장기를 형성하는 세포(제2 세포)를 공배양할 때의 양자의 혼합비는, 예를 들면 제1 세포의 세포수:제2 세포의 세포수=1:0.5~1:5이고, 바람직하게는 제1 세포의 세포수:제2 세포의 세포수=1:1~1:3이다.
피더능을 갖는 세포(제1 세포)와, 혈관 내피 세포 또는 임파관 내피 세포(제2 세포)와, 실질 장기를 형성하는 세포(제3 세포)를 공배양할 때의 삼자의 혼합비는, 예를 들면 (제1 세포의 세포수+제2 세포의 세포수):제3 세포의 세포수=1:1~1:10이고, 바람직하게는(제1 세포의 세포수+제2 세포의 세포수):제3 세포의 세포수=1:2~1:5이다. 제1 세포와 제2 세포의 혼합비는, 상기의 범위가 바람직하다.
다공 필름에 대한 세포의 파종 밀도는, 예를 들면 1×103cells/cm2~1×106cells/cm2 이고, 바람직하게는 1×104cells/cm2~1×106cells/cm2이다. 복수 종의 세포를 공배양하는 경우는, 합계의 파종 밀도를 상기 범위로 하는 것이 바람직하다.
본 실시형태에 있어서의 배양 조건에는, 일반적인 조건을 적용해도 된다. 예를 들면, 온도 37℃ 또한 5%(v/v) CO2 농도의 인큐베이터 내에서의 배양이 적용된다. 배양 기간은, 특별히 제한되지 않고, 세포의 네트워크 구조가 충분히 발달하는 기간, 배양하는 것이 바람직하다.
실시예
이하에 실시예를 들어, 발명의 실시형태를 상세하게 설명한다. 발명의 실시형태는, 이하에 나타내는 실시예에 의하여 한정적으로 해석되어야 할 것은 아니다.
이하에 있어서, "PET"란, 폴리에틸렌테레프탈레이트(Polyethylene Terephthalate)를 의미하고, "PMMA"란, 폴리메틸메타크릴레이트(Polymethyl methacrylate)를 의미하며, "PDMS"란, 폴리다이메틸실록세인(Polydimethylsiloxane)을 의미하고, "SEM"이란, 주사형 전자 현미경(Scanning Electron Microscope)을 의미하며, "FBS"란, 소태아 혈청(Fetal Bovine Serum)을 의미한다.
이하에 있어서, 다공 필름의 개공과 연통 구멍을 총칭하여 "구멍"이라고 한다.
<다공 필름 및 배양 디바이스의 제작>
[다공 필름]
폴리 락트산 5질량부, 트라이클로로메테인 94.5질량부, 양친매성 화합물로서 폴리아크릴아마이드계의 양친매성 폴리머 0.5질량부를 혼합하여, 도포액을 조제했다. 도포액을 PET 필름(막두께 188μm) 상에 도포하여 PET 필름 상에 도막을 형성했다. 가습 공기를 도막의 표면 전체에 걸쳐 흘려 보내고, 결로 현상에 의하여 도막 상에 물방울을 형성했다. 가습 공기의 공급을 계속하여 물방울을 성장시키면서, 물방울을 도막 중에 들어가게 했다. 도막 중에서 물방울끼리가 양친매성 화합물의 막을 구획하여 밀접할 때까지 물방울을 성장시키면서, 도막에 포함되는 용매의 증발에 의하여 물방울의 주위에 폴리 락트산을 석출시켰다. 이어서, 가습 공기의 공급을 정지하고, 분위기 온도를 높여 물방울을 증발시켜, 도막에 물방울이 들어간 부분을 개공으로서 남기며, 복수의 개공이 허니콤 형상으로 배열하고 또한 연통 구조를 갖는 폴리 락트산으로 이루어지는 다공층과, PET 필름층을 구비하는 다공 필름을 얻었다. 도막의 막두께, 가습 공기에 포함되는 수증기량, 및 물방울을 증발시키는 타이밍에 의하여, 다공층에 있어서의 개공 및 연통 구멍의 치수를 조정하여, 표 1에 나타내는 각 다공 필름을 얻었다.
[배양 디바이스]
다공 필름을 직경 23mm의 원형으로 잘라내고, 그 외주부에, 링(외경 22mm, 내경 16mm, 높이 8mm. PMMA제, 측면에 PDMS 코트)을, 양면 점착 테이프(3M사의 품번 1510, 피부 첩부용 테이프)를 이용하여 첩부하고 링 부착 다공 필름을 제작했다. 링 부착 다공 필름을, 멸균을 목적으로 70%(v/v) 에탄올 수용액에 수분간 침지하고, 이어서 멸균수로 세정하여 에탄올을 제거했다. 도 4에, 다공 필름, 링 및 배양 디바이스의 일례를 나타낸다.
링 부착 다공 필름을, 다공 필름의 PET 필름층 측이 아래가 되도록, 조직 배양용 디시에 두고, 배양 디바이스를 얻었다. 멸균을 목적으로, 배양 디바이스에 대하여 자외선 조사를 2시간 행했다. 표 1에, 각 배양 디바이스가 구비하는 다공 필름의 구조의 치수를 나타낸다.
[표 1]
Figure pct00001
도 5a는, PLA10이 구비하는 다공 필름의 단면 및 표면의 SEM상이며, 도 5b는, PLA40이 구비하는 다공 필름의 단면 및 표면의 SEM상이다. 표 1에 나타내는 모든 다공 필름에 있어서, 인접하는 개공의 개구끼리는 평탄부에 의하여 이간되어 있고, 인접하는 개공끼리는 각각의 벽면의 일부가 연속하고 있으며 연통하고 있었다. 표 1에 나타내는 모든 다공 필름에 있어서, 폴리 락트산으로 이루어지는 다공층에 배열되어 있는 개공은, 다공층을 관통하고 있지 않았다.
대조용 배양 디바이스로서, 개공이 없는 평탄한 폴리 락트산으로 이루어지는 층을 PET 필름 상에 적층한 적층체를, 다공 필름 대신에 구비하는 디바이스("Flat"이라고 함)와, 조직 배양용 디시(Tissue culture polystyrene: TCPS, 직경 35mm, 상품명: Falcon 셀 컬쳐 디시 353001, 코닝사제)의 배양면에 링을 첩부한 디바이스("TCP"라고 함)를 준비했다.
이들 배양 디바이스에 있어서는, 링 내의 바닥면이 세포를 배양하는 배양면이며, 링으로 둘러싸인 바닥면의 면적은 2cm2이다.
<배양 실험의 재료>
[세포]
·간엽계 줄기 세포: 인간 성인 골수 유래 정상 세포, 론자 재팬사로부터 구입. 이하 "MSC"라고 한다.
·섬유 아세포: 인간 피부 유래 정상 세포 NHSF46, 이화학 연구소 바이오 리소스 센터(일본 이바라키현 쓰쿠바시 고야다이 3-1-1)로부터 분양.
·혈관 내피 세포: 인간 신생아 제대 정맥 유래 정상 세포, 론자 재팬사로부터 구입. 이하 "HUVEC"라고 한다.
·간장 유래의 증식성 세포: 인간 간암 유래 세포 HepG2, 이화학 연구소 바이오 리소스 센터(일본 이바라키현 쓰쿠바시 고야다이 3-1-1)로부터 분양.
[배양액]
·MSC 배지: 인간 간엽계 줄기 세포 배지 키트 MSCGM BulletKit, 론자 재팬사
·NHSF46 배지: MEMα+10% FBS
·HUVEC 배지: 인간 내피 세포 배지 키트 EGM-2 BulletKit, 론자 재팬사
·HepG2 배지: DMEM+10% FBS
<배양 실험 1: 간엽계 줄기 세포의 단독 배양>
배양 디바이스로서 TCP, Flat, PLA3, PLA10, PLA30을 이용하여, 하기의 배양 조건으로 MSC를 단독 배양했다.
·파종 밀도: 1×105cells/disk(5×104cells/cm2)
·파종 후의 원심 처리: 다공 필름을 구비한 배양 디바이스에 대하여, 회전 반경 120mm, 회전수 1100rpm, 회전 시간 3분간의 원심 처리를 실시했다.
·골분화 유도 배지: hMSC differentiation BulletKit-osteogenic(상품 번호: PT-3002, 론자 재팬사)
·지방 분화 유도 배지: hMSC differentiation BulletKit-adipogenic(상품 번호: PT-3004, 론자 재팬사)
·배양액량: 1.0ml/disk
·인큐베이터: 37℃, 5% CO2
MSC 배지를 이용하여 배양을 개시하고, 배양 1일째에, 골분화 유도 배지와 지방 성분화 유도 배지를 1:1로 혼합한 분화 유도 배지에 교환하며, 그 후 3일마다 분화 유도 배지를 교환하여, 합계 15일간 배양했다. 분화 유도 14일째에 리얼 타임 PCR(Polymerase Chain Reaction)에 의하여, 골세포의 분화 마커인 Runx2 및 Osx와, 지방 세포의 분화 마커인 C/EBPα 및 PPARγ의 발현을 해석했다. 또, 분화 유도 14일째에 액틴의 형광 면역 염색을 행했다. 도 6에, 분화 유도 14일째에 있어서의 액틴의 형광 면역 염색상을 나타낸다.
본 실험으로부터, 이하가 분명해졌다.
·다공 필름의 개공의 크기에 따라 세포의 형태가 변화했다. PLA10 및 PLA30에 있어서, 세포는 다공 필름의 구멍 내에서 가늘고 긴 형태를 나타냈다. TCP, Flat 및 PLA3에 있어서, 세포는 다공 필름의 표면에 있어서 신전(伸展)한 형태를 나타냈다.
·PLA3 및 PLA10에 있어서의 세포의 증식성은, Flat와 동일한 정도였지만, PLA30에 있어서의 세포의 증식성은, Flat에 비하여 낮았다. 이 점에서, 세포가 다공 필름의 구멍 내에 침입하면 증식이 억제되는 것이 시사되었다.
·리얼 타임 PCR의 해석 결과는, 어느 배양 디바이스에 있어서도, 골세포에 대한 분화와 지방 세포에 대한 분화가 일어나는 것을 나타내고 있었다.
<배양 실험 2: 간엽계 줄기 세포와 혈관 내피 세포의 공배양>
배양 디바이스로서 TCP와 PLA40을 이용하여, 하기의 배양 조건으로, HUVEC를 단독 배양, 또는 MSC와 HUVEC를 공배양했다.
·단독 배양: HUVEC의 파종 밀도 1×105cells/disk(5×104cells/cm2). MSC 배지와 HUVEC 배지의 혼합 배지(MSC 배지:HUVEC 배지=체적비 1:2)로 배양.
·공배양: MSC와 HUVEC를 혼합한 후 파종했다. MSC의 파종 밀도 0.5×105cells/disk, HUVEC의 파종 밀도 1×105cells/disk, 합계 파종 밀도 1.5×105cells/disk(7.5×104cells/cm2). MSC 배지와 HUVEC 배지의 혼합 배지(MSC 배지:HUVEC 배지=체적비 1:2)로 배양.
·파종 후의 원심 처리: 다공 필름을 구비한 배양 디바이스의 절반 개수에 대하여, 회전 반경 120mm, 회전수 1100rpm, 회전 시간 3분간의 원심 처리를 실시했다.
·배양액량: 1.0ml/disk
·인큐베이터: 37℃, 5% CO2
·배양 기간: 7일간 배양. 2일마다 배지를 교환했다.
배양 3일째와 7일째에, HUVEC 특이적인 세포 표면 마커인 CD31의 형광 면역 염색을 행하고, 공초점 레이저 현미경 시스템(Nikon사 C2+, 10배 대물 렌즈)을 이용하여 관찰했다. 세포 조직에 있어서 네트워크 구조가 가장 발달되어 있는 심도에 초점을 맞춰, 1.27mm×1.27mm(=1.61mm2)의 영역을 임의로 10개 선택하여 형광 화상을 취득하며, 취득한 형광 화상을 화상 해석 소프트웨어(Nikon사 NIS-Elements Basic Research)를 이용하여 이치화 처리했다. 이치화 처리한 화상 전체에 산재하는 형광 영역의 긴 직경을 개별적으로 계측하여, 그 길이를 모두 더하고 또한 10영역의 합계를 산출하여, HUVEC가 형성하고 있는 네트워크의 전체 길이로 했다. 이치화 처리한 화상 전체 중에 산재하는 형광 영역의 면적을 개별적으로 계측하여, 그 면적을 모두 더하고 또한 10영역의 합계를 산출하여, HUVEC가 형성하고 있는 네트워크의 총 면적으로 했다.
도 7a~도 7d 및 표 2에, 공초점 레이저 현미경상 및 네트워크의 해석 결과를 나타낸다. 도 7a~도 7c에 있어서, "Mono-"가 단독 배양을 의미하고, "Co-"가 공배양을 의미한다. 도 7a~도 7d에 있어서는, "cfg"를 붙인 상이, 원심 처리를 실시한 배양예이며, "cfg"를 붙이지 않은 상이, 원심 처리를 실시하지 않은 배양예이다.
·도 7a: 배양 3일째의 CD31의 형광 면역 염색상(저배율).
·도 7b: 배양 3일째의 CD31의 형광 면역 염색상(고배율).
·도 7c: 배양 7일째의 CD31의 형광 면역 염색상(고배율).
·도 7d, 표 2: 공배양에 있어서의 네트워크의 전체 길이 및 총 면적.
[표 2]
Figure pct00002
본 실험으로부터, 이하가 분명해졌다.
·HUVEC는 혈관 내막을 형성하는 세포인바, HUVEC만으로는 모세 혈관 망상의 네트워크의 형성은 어렵지만, MSC와 HUVEC의 공배양에 의하여 모세 혈관 망상의 네트워크가 형성되었다. 내피 세포가 관강 구조를 형성하기 위해서는 내피 세포를 지지하는 세포가 필요하다고 생각되는바, MSC는 내피 세포에 작용하는 사이토카인을 분비하는 것 및 벽세포에 대한 분화가 가능한 점에서, HUVEC의 모세 혈관 망상의 네트워크 형성에 MSC가 효과적으로 작용하고 있는 것이 시사되었다.
·모세 혈관 망상의 네트워크의 형성은 경시에 따라 진행되며, 배양 7일째에서는, 배양 3일째에 비하여, 보다 발달한 네트워크가 형성되었다.
·PLA40에 있어서는, 많은 세포가 다공 필름의 구멍 내에 존재했다. PLA40에 있어서는, TCP에 비하여, 발달한 모세 혈관 망상의 네트워크가 형성되었다.
·원심 처리를 실시한 PLA40에 있어서는, 원심 처리를 실시하고 있지 않은 PLA40에 비하여, 모세 혈관 망상의 네트워크가 보다 길게 발달하고 있었다. 원심 처리를 실시함으로써, 다공 필름의 구멍 내로 이행하는 세포의 비율이 커지는 것이 시사되었다.
·통상의 파종 조작 후의 배양에 있어서는, 배양 디바이스의 링 주변에 있어서 세포 밀도가 높은 경향이 보였지만, 원심 처리를 실시한 후의 배양에서는, 배양면 전체에 있어서 비교적 균일한 네트워크 형성이 보였다. 파종된 세포가 원심 처리에 의하여 다공 필름의 구멍 내로 이행하기 때문에, 링 주변에 세포가 이행하는 것이 억제되는 것이 시사되었다.
<배양 실험 3: 간엽계 줄기 세포 또는 섬유 아세포와 혈관 내피 세포의 공배양>
배양 디바이스로서 TCP, Flat, PLA40을 이용하여, 하기의 배양 조건으로, MSC와 HUVEC를 공배양, 또는 NHSF46과 HUVEC를 공배양했다.
·MSC와 HUVEC의 공배양: MSC와 HUVEC를 혼합한 후 파종했다. MSC의 파종 밀도 0.5×105cells/disk, HUVEC의 파종 밀도 1×105cells/disk, 합계 파종 밀도 1.5×105cells/disk(7.5×104cells/cm2). MSC 배지와 HUVEC 배지의 혼합 배지(MSC 배지:HUVEC 배지=체적비 1:2)로 배양.
·NHSF46과 HUVEC의 공배양: NHSF46과 HUVEC를 혼합한 후 파종했다. NHSF46의 파종 밀도 0.5×105cells/disk, HUVEC의 파종 밀도 1×105cells/disk, 합계 파종 밀도 1.5×105cells/disk(7.5×104cells/cm2). NHSF46 배지와 HUVEC 배지의 혼합 배지(NHSF46 배지:HUVEC 배지=체적비 1:2)로 배양.
·파종 후의 원심 처리: 다공 필름을 구비한 배양 디바이스에 대하여, 회전 반경 120mm, 회전수 1100rpm, 회전 시간 3분간의 원심 처리를 실시했다.
·배양액량: 1.0ml/disk
·인큐베이터: 37℃, 5% CO2
·배양 기간: 7일간 배양. 매일 배지를 교환했다.
배양 3일째와 7일째에 CD31의 형광 면역 염색을 행하여, 공초점 레이저 현미경을 이용하여 관찰했다. 도 8a~도 8d 및 표 3에, 현미경상 및 네트워크의 해석 결과를 나타낸다.
·도 8a: 배양 3일째의 CD31의 형광 면역 염색상(고배율).
·도 8b: 배양 7일째의 CD31의 형광 면역 염색상(고배율).
·도 8c, 표 3: 배양 3일째의 네트워크의 전체 길이 및 총 면적.
·도 8d, 표 3: 배양 7일째의 네트워크의 전체 길이 및 총 면적.
[표 3]
Figure pct00003
본 실험으로부터, 이하가 분명해졌다.
·NHSF46과 HUVEC의 공배양에 의하여, MSC와 HUVEC의 공배양과 동일하게, 모세 혈관 망상의 네트워크가 형성되었다.
·모세 혈관 망상의 네트워크는, 경시에 따라 발달했다.
·PLA40에 있어서는, TCP 및 Flat에 비하여, 보다 발달한 네트워크가 형성되었다.
<배양 실험 4: 다공 필름의 치수의 검토>
배양 디바이스로서, TCP, Flat, PLA3, PLA10, PLA20, PLA40을 이용하여, 하기의 배양 조건으로 MSC와 HUVEC를 공배양했다.
·파종: MSC와 HUVEC를 혼합한 후 파종했다.
·파종 밀도: MSC 0.5×105cells/disk, HUVEC 1×105cells/disk, 합계 1.5×105cells/disk(7.5×104cells/cm2).
·배지: MSC 배지와 HUVEC 배지의 혼합 배지, MSC 배지:HUVEC 배지=체적비 1:2.
·파종 후의 원심 처리: 다공 필름을 구비한 배양 디바이스에 대하여, 회전 반경 120mm, 회전수 1100rpm, 회전 시간 3분간의 원심 처리를 실시했다.
·배양액량: 1.0ml/disk
·인큐베이터: 37℃, 5% CO2
·배양 기간: 7일간 배양. 2일마다 배지를 교환했다.
배양 3일째와 7일째에 CD31의 형광 면역 염색을 행하여, 공초점 레이저 현미경을 이용하여 관찰했다. 도 9a~도 9e 및 표 4에, 현미경상 및 네트워크의 해석 결과를 나타낸다.
·도 9a: 배양 3일째의 CD31의 형광 면역 염색상(저배율).
·도 9b: 배양 3일째의 CD31의 형광 면역 염색상(고배율).
·도 9c: 배양 7일째의 CD31의 형광 면역 염색상(저배율).
·도 9d: 배양 7일째의 CD31의 형광 면역 염색상(고배율).
·도 9e, 표 4: 네트워크의 전체 길이 및 총 면적.
[표 4]
Figure pct00004
본 실험으로부터, 이하가 분명해졌다.
·PLA3 및 PLA10에 있어서는, 세포는, 다공 필름의 표면에 있어서 신전한 형태를 나타내고, 네트워크는 형성되지 않았다.
·PLA20에 있어서는, 세포는, 다공 필름의 표면에서 신전한 형태와, 다공 필름의 구멍 내에서 네트워크를 형성한 형태를 나타냈다.
·PLA40에 있어서는, 모세 혈관 망상의 네트워크가 형성되었다.
·상기와 같이, 다공 필름의 개공의 크기에 따라 세포의 형태가 변화했다. 본 실험에서 사용한 세포의 긴 직경이 20μm 정도인 점에서, 다공 필름의 개공의 크기가 세포 사이즈와 동등 이상이면, 세포는 다공 필름의 구멍 내에서 네트워크를 형성하기 쉬운 것이 시사되었다.
<배양 실험 5: 3종류의 세포의 동시 공배양>
배양 디바이스로서 TCP, PLA40을 이용하여, 하기의 배양 조건으로 MSC와 HUVEC와 HepG2를 공배양했다.
·파종: MSC와 HUVEC와 HepG2를 혼합한 후 파종했다. 미리 HepG2를 형광 염료 CellTracker Red로 표식했다.
·파종 밀도: MSC 0.5×105cells/disk, HUVEC 1×105cells/disk, HepG2 5×105cells/disk.
·배지: MSC 배지와 HUVEC 배지와 HepG2 배지의 혼합 배지, MSC 배지:HUVEC 배지:HepG2 배지=체적비 1:2:3.
·파종 후의 원심 처리: 다공 필름을 구비한 배양 디바이스에 대하여, 회전 반경 120mm, 회전수 1100rpm, 회전 시간 3분간의 원심 처리를 실시했다.
·배양액량: 1.0ml/disk
·인큐베이터: 37℃, 5% CO2
·배양 기간: 3일간 배양. 매일 배지를 교환했다.
배양 3일째에 CD31의 형광 면역 염색을 행하여, 공초점 레이저 현미경을 이용하여 관찰하고, 세포가 형성하고 있는 네트워크를 해석했다. 도 10a~도 10b에 현미경상을 나타낸다.
·도 10a: 배양 3일째의 형광상(녹색 형광과 적색 형광의 중합 화상).
·도 10b: 배양 3일째에 있어서의 CD31의 형광 면역 염색상.
본 실험으로부터, 이하가 분명해졌다.
·PLA40에 있어서는, 세포는 네트워크 구조를 형성했지만, 네트워크간의 연결 상태는 부족했다.
·MSC와 HUVEC와 HepG2의 3종 공배양은, MSC와 HUVEC의 2종 공배양에 비하여, 파종 밀도가 높아, 다공 필름의 구멍 내에 고밀도로 세포가 충전됨으로써 세포의 유주성이 저하되고, 네트워크 형성의 저하 혹은 지연이 일어나고 있는 것이 시사되었다. 파종 밀도의 최적화 또는 배양 시간의 연장에 의하여, 네트워크 형성이 가능하다고 추측되었다.
<배양 실험 6: 3종류의 세포의 단계적 공배양>
배양 디바이스로서 TCP, PLA40을 이용하여, 하기의 배양 조건으로 MSC와 HUVEC와 HepG2를 공배양했다.
·파종: MSC와 HUVEC를 혼합한 후 파종하여, 3일간 배양한 후, HepG2를 파종했다. 미리 HepG2를 형광 염료 CellTracker Red로 표식했다.
·파종 밀도: MSC 0.5×105cells/disk, HUVEC 1×105cells/disk, HepG2 5×105cells/disk.
·파종 후의 원심 처리: 다공 필름을 구비한 배양 디바이스에 대하여, 회전 반경 120mm, 회전수 1100rpm, 회전 시간 3분간의 원심 처리를 실시했다.
·배양액량: 1.0ml/disk
·인큐베이터: 37℃, 5% CO2
·배양 기간: 2종 공배양을 3일간, 3종 공배양을 3일간 행했다.
·배지: 배양 개시부터 3일간은, MSC 배지와 HUVEC 배지의 혼합 배지(체적비 1:2)로 배양하고, 1일째에 배지 교환을 행했다. HepG2를 파종한 후에는, MSC 배지와 HUVEC 배지와 HepG2 배지의 혼합 배지(체적비 1:2:3)에 교환하여, 매일 배지를 교환하면서 배양했다.
HepG2를 파종한 후 3일째에 CD31의 형광 면역 염색을 행하여, CD31의 형광상과 HepG2의 형광상으로부터, 세포가 형성하고 있는 네트워크를 해석했다. 도 11a~도 11b에 현미경상을 나타낸다. 도 11c 및 표 5에, CD31의 형광상을 해석하여 얻은 네트워크의 전체 길이 및 총 면적을 나타낸다.
·도 11a: HepG2를 파종한 후의 배양 3일째의 형광상(녹색 형광과 적색 형광의 중합 화상).
·도 11b: HepG2를 파종한 후의 배양 3일째에 있어서의 CD31의 형광 면역 염색상.
·도 11c, 표 5: 3종의 공배양 3일째에 있어서의, 동시 공배양(배양 실험 5), 단계적 공배양(배양 실험 6) 각각의 네트워크의 전체 길이 및 총 면적.
[표 5]
Figure pct00005
본 실험으로부터, 이하가 분명해졌다.
·PLA40에 있어서는, TCP에 비하여, 가늘고 긴 네트워크가 형성되었다.
·단계적 공배양은, 동시 공배양에 비하여, 네트워크의 연결이 증가하고 있었다. MSC와 HUVEC를 공배양하여 네트워크를 미리 형성한 후에 HepG2를 파종하는 것이, 고차의 네트워크 구조의 형성에 효과적인 것이 시사되었다.
2016년 9월 27일에 출원된 일본 출원 번호 제2016-188627호의 개시는, 그 전체가 참조에 의하여 본 명세서에 원용된다.
본 명세서에 기재된 모든 문헌, 특허 출원, 및 기술 규격은, 개개의 문헌, 특허 출원, 및 기술 규격이 참조에 의하여 원용되는 것이 구체적이고 또한 개개에 기재된 경우와 동일한 정도로, 본 명세서 중에 참조에 의하여 원용된다.

Claims (20)

  1. 표면에 마련된 복수의 개공과, 서로 인접하는 상기 개공끼리를 연통하는 연통 구멍을 갖는 다공 필름의 상기 개공 및 상기 연통 구멍의 내부에서, 피더능을 갖는 세포를 배양하는 배양 공정을 포함하는, 세포 조직의 제조 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 배양 공정이, 피더능을 갖는 세포와, 혈관 내피 세포 및 임파관 내피 세포 중 적어도 어느 하나를, 상기 개공 및 상기 연통 구멍의 내부에서 공배양하는 배양 공정인, 세포 조직의 제조 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 배양 공정이, 피더능을 갖는 세포와, 실질 장기를 형성하는 세포를, 상기 개공 및 상기 연통 구멍의 내부에서 공배양하는 배양 공정인, 세포 조직의 제조 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 배양 공정이, 피더능을 갖는 세포와, 혈관 내피 세포 및 임파관 내피 세포 중 적어도 어느 하나와, 실질 장기를 형성하는 세포를, 상기 개공 및 상기 연통 구멍의 내부에서 공배양하는 배양 공정인, 세포 조직의 제조 방법.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피더능을 갖는 세포가, 간엽계 줄기 세포 및 섬유 아세포 중 적어도 어느 하나인, 세포 조직의 제조 방법.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 복수의 개공이, 상기 다공 필름의 표면에 허니콤 형상으로 배치되어 있는, 세포 조직의 제조 방법.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 연통 구멍이, 상기 다공 필름의 면 방향 전역에 걸쳐 대략 동일한 깊이로 마련되어 있는, 세포 조직의 제조 방법.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 연통 구멍의 구멍 직경이, 상기 다공 필름에 파종되는 세포의 긴 직경에 대하여 50%~500%의 범위인, 세포 조직의 제조 방법.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 연통 구멍의 구멍 직경이 5μm~50μm의 범위인, 세포 조직의 제조 방법.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 연통 구멍의 구멍 직경의 변동 계수가 30% 이하인, 세포 조직의 제조 방법.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개공의, 상기 다공 필름의 면 방향에 있어서의 긴 직경이 10μm~100μm의 범위인, 세포 조직의 제조 방법.
  12. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개공의 깊이가 10μm~100μm의 범위인, 세포 조직의 제조 방법.
  13. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개공의 개구 직경이 5μm~90μm의 범위인, 세포 조직의 제조 방법.
  14. 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개공의 개구 직경의 변동 계수가 20% 이하인, 세포 조직의 제조 방법.
  15. 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배양 공정 전에,
    상기 다공 필름의 상기 복수의 개공이 개구한 측의 면에 세포를 파종한 후, 상기 세포를 파종한 측의 면으로부터 반대면을 향하는 방향으로 원심력을 가하여 상기 세포를 상기 복수의 개공의 내부로 이동시키는 원심 처리 공정을 포함하는, 세포 조직의 제조 방법.
  16. 표면에 마련된 복수의 개공과, 서로 인접하는 상기 개공끼리를 연통하는 연통 구멍을 갖는 다공 필름으로서,
    상기 개공의, 상기 다공 필름의 면 방향에 있어서의 긴 직경이 20μm~100μm의 범위인, 다공 필름.
  17. 표면에 마련된 복수의 개공과, 서로 인접하는 상기 개공끼리를 연통하는 연통 구멍을 갖는 다공 필름으로서,
    상기 개공의 깊이가 20μm~100μm의 범위인, 다공 필름.
  18. 청구항 16 또는 청구항 17에 있어서,
    상기 개공의 개구 직경이 5μm~90μm의 범위인, 다공 필름.
  19. 청구항 16 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 연통 구멍의 구멍 직경이 5μm~50μm의 범위인, 다공 필름.
  20. 청구항 16 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 복수의 개공이, 상기 다공 필름의 표면에 허니콤 형상으로 배치되어 있는, 다공 필름.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020116254A1 (ja) * 2018-12-06 2020-06-11 富士フイルム株式会社 細胞培養デバイス
JP2020115754A (ja) * 2019-01-18 2020-08-06 富士フイルム株式会社 血管形成促進剤のスクリーニング方法、及び、製剤
US11492581B2 (en) 2019-04-17 2022-11-08 Academia Sinica Microwell device and method of manufacturing the same
JPWO2020262062A1 (ko) * 2019-06-27 2020-12-30
SG11202112524SA (en) 2019-08-23 2021-12-30 Yangtze Memory Technologies Co Ltd Vertical memory devices
CN115433679B (zh) * 2022-06-17 2023-06-09 成都诺医德医学检验实验室有限公司 一种类器官培养装置及制造方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06284883A (ja) * 1992-07-10 1994-10-11 Sanyo Chem Ind Ltd 肝細胞培養方法
WO2007094929A2 (en) * 2006-02-10 2007-08-23 The Regents Of The University Of Michigan Cell culture well-plates having inverted colloidal crystal scaffolds

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2221195A1 (en) 1997-11-14 1999-05-14 Chantal E. Holy Biodegradable polymer matrix
US6479064B1 (en) * 1999-12-29 2002-11-12 Children's Medical Center Corporation Culturing different cell populations on a decellularized natural biostructure for organ reconstruction
US20020155594A1 (en) * 2001-03-27 2002-10-24 Hsieh Helen V. Method and apparatus for culturing cells
JP4353510B2 (ja) * 2002-09-09 2009-10-28 株式会社カネカ 組織再生用支持体及びその製造方法
US8999167B2 (en) 2003-08-07 2015-04-07 Asahi Kasei Medical Co., Ltd. Composite porous membrane and process for producing the same
JP2005110709A (ja) 2003-10-02 2005-04-28 Olympus Corp 生体組織補填材
WO2006093207A1 (ja) * 2005-03-02 2006-09-08 National University Corporation Hokkaido University 細胞の分化／増殖を制御するための基材
JP4437227B2 (ja) 2005-09-28 2010-03-24 国立大学法人北海道大学 人工血管
US20090041825A1 (en) * 2006-02-10 2009-02-12 Kotov Nicholas A Cell culture well-plates having inverted colloidal crystal scaffolds
JP4945281B2 (ja) 2006-03-28 2012-06-06 国立大学法人北海道大学 多孔フィルムの製造方法
JP5583312B2 (ja) * 2007-02-20 2014-09-03 富士フイルム株式会社 組織体形成用基材、組織体形成キット、それを用いた組織体形成法、及び該組織体形成法により形成された三次元組織体
JP2008307180A (ja) 2007-06-13 2008-12-25 Kobe Univ 積層構造三次元スカフォールドとその作製方法
JP2009213421A (ja) * 2008-03-11 2009-09-24 Fujifilm Corp 細胞培養方法及び細胞培養装置
JP5422230B2 (ja) 2008-03-17 2014-02-19 富士フイルム株式会社 多孔フィルムの製造方法及び装置
JP2009254271A (ja) * 2008-04-16 2009-11-05 Asahi Kasei Corp 心筋細胞の誘導方法
JP2009273444A (ja) * 2008-05-19 2009-11-26 Univ Of Tsukuba 細胞培養支持体、その製造方法及び該支持体を用いた細胞培養方法
JP2011074140A (ja) 2009-09-29 2011-04-14 Fujifilm Corp 多孔フィルム及びその製造方法
JP5405374B2 (ja) 2010-03-26 2014-02-05 富士フイルム株式会社 ハニカム構造フィルムの製造方法
US10954489B2 (en) * 2013-06-04 2021-03-23 The Regents Of The University Of California Liver-mimetic device and method for simulation of hepatic function using such device
EP3050580B1 (en) * 2013-09-25 2020-02-19 FUJIFILM Corporation Method for producing biocompatible macromolecular porous body, biocompatible macromolecular porous body, biocompatible macromolecular block and cell structure
JP2016188627A (ja) 2015-03-30 2016-11-04 いすゞ自動車株式会社 エンジンのｅｇｒ装置

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06284883A (ja) * 1992-07-10 1994-10-11 Sanyo Chem Ind Ltd 肝細胞培養方法
WO2007094929A2 (en) * 2006-02-10 2007-08-23 The Regents Of The University Of Michigan Cell culture well-plates having inverted colloidal crystal scaffolds

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