KR101885470B1 - 3차원 세포 배양 스캐폴드 및 이를 이용한 공배양 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 O 자형 루프에 표면장력을 이용하여 세포를 포함하는 하이드로 젤을 막 형태로 형성한 3차원 세포 배양용 스캐폴드와 이를 이용하여 세포를 공배양하는 방법 및 이를 통한 혈관 모듈의 제조 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 3차원 세포 배양용 스캐폴드 및 이를 이용한 공배양 방법, 및 혈관 모듈의 제조 방법에 관한 것이다.
인 비트로 (In vitro) 세포 배양 방법은 잠재적 약물을 빠르고 효율적으로 스크리닝하기 위해 광범위하게 이용되어 왔다. 3차원 세포 배양 방법 및 장기-칩 (organ-on-a-chip) 장치가 인 비보 (in vivo) 조건에서 더 잘 시뮬레이션되도록 개발되어 왔다. 종래의 2차원 인 비트로 분석 한계를 극복하기 위하여, 미세 유체 (microfluidics)가 약물 스크리닝에 새로운 접근 방식을 제공하기 위해 사용되어 왔다 (Chung, B. G.; Lee, K. H.; Khademhosseini, A.; et al., Lab on a chip 2012, 12 (1), 45-59. 2. Huang, C. P.; Lu, J.; Seon, H.; et al., Lab on a chip 2009, 9 (12), 1740-8.). 물리적 및 화학적으로 정확하게 세포의 미세 환경을 제어함으로써, 미세유체소자(microfluidic devices)는 내장, 폐, 신장, 및 다른 장기와 같은 정교한 단일 장기-칩 시스템으로 진화되어 왔다 (Huh, D.; Matthews, B. D.; Mammoto, A.; et al., Science 2010, 328 (5986), 1662-1668. 4. Jang, K. J.; Suh, K. Y., Lab on a chip 2010, 10 (1), 36-42. 5. Kim, H. J.; Huh, D.; Hamilton, G.; et al., Lab on a chip 2012, 12 (12), 2165-74.). 또한, 바디-온-어-칩 (body-on-a-chip) 플랫폼이 독성 분석 방법으로서 제안되어 왔다.
장기에서 가장 중요한 도관인 혈관이 최근 미세유체 플랫폼에서 설계되었다 (Barkefors, I.; Thorslund, S.; Nikolajeff, F.; et al., Lab on a chip 2009, 9, 529-535.). Kim, S.; Lee, H.; Chung, M.; et al., Lab on a chip 2013, 13 (8), 1489-500에서는 폐 섬유아세포 (lung fibroblasts, LF) 및 상피 세포 (epithelial cells, ECs)를 공-배양하여 관류 가능한 혈관 네트워크를 인 비트로로 생성할 수 있음을 보고한 바 있다. 생체 외 혈관 구성을 위한 미세유체소자 모델의 경우, 허파 섬유아세포, 진피 섬유아세포, 암세포 등 혈관 형성을 유도하는 성장인자를 배출하는 세포가 혈관내피세포의 조립을 돕도록 정의된 영역에 공동 배양한다.
기존의 다세포 공배양 인 비트로 어세이에서는 실험의 시작부터 끝까지 두 세포가 공존하기 때문에 특정 상황에서 필요 이상의 상호작용을 발생시키며 실험결과를 저해한다. 또한 세포들 사이에 물리적인 간섭이 이루어 질 수 있으며 이 또한 실험결과의 신뢰성을 떨어트린다. 따라서 공배양을 하지 않고 비슷한 효과를 볼 수 있는 방법으로 성장인자가 담긴 조정배지 (conditioned medium)를 이용하여 대체하지만, 실제 배양 보조 세포의 부재는 관심세포의 기능을 떨어트리기 때문에 큰 실효를 거두지 못하였다.
기존의 장기-칩 (Organ-on a chip) 등, 미세유체소자 기반 인 비트로 모델의 경우, 측분비 효과(paracrine effect)를 나타내는 세포를 영구 배치하여 공배양하므로 초기에 세포들에게 주어진 환경이 실험 종료 시점까지 유지되어 세포의 배열 및 구성을 바꾸거나 제거할 수 없는 비가역적 설계였다. 그러나, 분석시에 관심 세포 외의 측분비인자 (paracrine factor)를 분비하는 배양 보조 세포는 약물 등에 대한 반응을 잘못 유도할 수 있는 요인이 된다. 따라서, 발생상에 필요한 세포 미세 환경을 조직안정화에 적합한 형태로 바꿔야 할 필요가 있으므로, 변형 가능한 공동 배양 기술이 요구되고 있다.
이에, 본 발명에서는 O 자형 루프에 표면장력을 이용하여 세포를 포함하는 하이드로 젤을 막 형태로 가둔 3차원 세포 배양용 스캐폴드를 제공하며, 이를 다른 세포를 배양하는 세포 배양 접시 (플레이트) 또는 미세유체소자에 침지 (dipping)하여 공배양하는 방법 및 이를 통한 혈관 모듈의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 3차원 세포 배양용 스캐폴드는 세포가 하이드로젤에 3차원적으로 포함되어 있어 생체와 유사한 환경에서 배양되므로 장기간 높은 생존율을 보이며, 조성하며 필요에 따라 배지를 제공하여 형태를 장기간 유지할 수 있다. 세포배양기술을 이용하는 경우, 루프에 고립된 하이드로젤이 세포에게 물리적 장벽으로 작용하며, 세포가 제공하는 성장인자 등의 미세환경을 간섭 없이 조성할 수 있다는 큰 장점을 가지고 있다. 또한, 본 발명의 3차원 세포 배양용 스캐폴드를 이용한 공배양 방법은 하이드로젤 구조체 상에서 배양 가능한 모든 세포에 대하여 구현할 수 있으며, 루프를 단순히 침지했다가 꺼내는 (dipping in and out) 방식은 미세유체소자 안에 동적인 미세환경을 조성할 수 있어 보다 생체 혹은 질병과 유사한 시스템 설계를 가능하게 한다. 따라서 향후 장기-칩에 적용하여 동물실험 및 임상실험을 대체하기 위한 방법으로 활용 가능한 효과가 있다.
도 1은 루프형 스캐폴드의 내부에 표면장력을 이용하여 LF(lung fibroblasts) 세포를 포함하는 하이드로젤을 막 형태로 형성하는 과정을 나타낸 도식이다.
도 2는 루프형 스캐폴드의 내부에 형성된 하이드로젤 막에 포함된 세포의 배양 1일차 및 10일차의 세포 생존율을 Live-dead 분석으로 확인한 도이다.
도 3은 미세유체소자의 마이크로-채널 내부에 μBVM (micro-scale blood vessel module) 형성을 유도하는 과정을 나타낸 도식이다.
도 4는 마이크로-채널 내부에 모세혈관을 형성한 HUVEC (Human umbilical vein endothelial cells)의 명시야상 (Bright field image)을 LF와의 공배양 날짜별로 나타낸 도이다.
도 5는 면역-염색한 μBVM와 마이크로비드를 공초점 현미경으로 촬영한 후 3차원 영상으로 디콘볼루션하여 마이크로비드가 혈관 내부에 유입된 것을 확인한 도이다 (스캐일바: 50μm).
도 6은 본 발명을 이용하여 형성된 μBVM을 확장하여, 혈관으로 연결된 다양한 기관의 조직 모델을 각각 다른 세포를 포함한 하이드로젤 루프로 배양하는 것을 나타낸 도식이다.
도 2는 루프형 스캐폴드의 내부에 형성된 하이드로젤 막에 포함된 세포의 배양 1일차 및 10일차의 세포 생존율을 Live-dead 분석으로 확인한 도이다.
도 3은 미세유체소자의 마이크로-채널 내부에 μBVM (micro-scale blood vessel module) 형성을 유도하는 과정을 나타낸 도식이다.
도 4는 마이크로-채널 내부에 모세혈관을 형성한 HUVEC (Human umbilical vein endothelial cells)의 명시야상 (Bright field image)을 LF와의 공배양 날짜별로 나타낸 도이다.
도 5는 면역-염색한 μBVM와 마이크로비드를 공초점 현미경으로 촬영한 후 3차원 영상으로 디콘볼루션하여 마이크로비드가 혈관 내부에 유입된 것을 확인한 도이다 (스캐일바: 50μm).
도 6은 본 발명을 이용하여 형성된 μBVM을 확장하여, 혈관으로 연결된 다양한 기관의 조직 모델을 각각 다른 세포를 포함한 하이드로젤 루프로 배양하는 것을 나타낸 도식이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명은 다양한 형태로 변경되어 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 구현예에 한정되는 것은 아니다.
일 측면에서, 본 발명은 단일폐곡선 형태의 스캐폴드; 및 상기 스캐폴드의 내부 단일폐곡선 표면을 따라 형성된 막 형태의 하이드로젤을 포함하는 3차원 세포 배양용 스캐폴드에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 스캐폴드는 루프형일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 막 형태의 하이드로젤에 세포가 3차원적으로 포함될 수 있다.
일 구현예에서, 하이드로젤-세포 혼합물이 루프의 직경 크기에 의존적이기 때문에 세포의 수는 조절될 수 있으며, 상기 스캐폴드의 내부 단일폐곡선의 직경이 3.5 mm 내지 4.0 mm일 때 하이드로젤에 포함된 세포의 수는 2×104개 이상 6×104개 미만일 수 있다. 본 발명의 스캐폴드의 내부 단일폐곡선의 직경이 3.5 mm 내지 4.0 mm일 때, 내부 하이드로젤 막에 포함되는 세포의 수는 2×104개 미만일 때는 측분비인자의 분비가 너무 적어 바람직하지 않고, 6×104개 이상일 때는 하이드로젤이 고화될 때 젤이 수축되어 루프에 고정되지 않아 바람직하지 않다.
또한, 본 발명의 스캐폴드의 내부 단일폐곡선의 직경이 3.5 mm 내지 4.0 mm일 때, 내부의 하이드로젤은 10 ㎕ 내지 30 ㎕가 포집될 수 있으며, 10 ㎕ 미만은 표면장력에 따른 하이드로젤 막을 형성할 수 없고, 30 ㎕ 초과는 막 외로 흘러나와 하이드로젤 막 형성에 바람직하지 않다.
본 발명의 루프의 사이즈 및 부피 (volume)는 LF를 측분비인자 (혈관내피세포 생장인자) 분비 세포로 이용한 HUVEC의 혈관 형성 실험에 대해 최적화되었으며, 다른 배열을 특정 적용을 위해 택할 수 있다. 측분비인자를 분비하는 LF를 루프 내에 위치시키는 것의 주요한 장점은 세포들이 종래에 미세유체소자 내에 실험 내내 영구히 위치했던 LF와 달리 손쉽게 제거 가능하다는 점이다. 이로써, 두 종류의 세포를 공배양하면서도 서로의 물리적 간섭, 오염 등을 배제할 수 있는 효과가 있으며, 원하는 때에 두 종류의 세포간의 영향을 차단할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서 LF를 루프 내의 하이드로젤에 포집함으로써, 미세유체소자의 마이크로-채널에 존재하는 HUVEC의 생장을 촉진하여 혈관을 형성한 뒤 루프를 제거하여 형성된 혈관이 LF가 분비하는 측분비인자의 영향을 즉시 벗어나게 할 수 있다.
본 발명에서 용어, "하이드로젤 (hydrogel)"은 졸-젤 상변이를 통해 물을 분산매로 하는 액체가 굳어 유동성을 상실하고 다공성 구조를 이루는 물질을 말하며, 세포 부착 및 배양에 적합한 하이드로젤이라면 특별히 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 상기 하이드로젤은 배지 및 공기의 투과가 가능한 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 하이드로젤은 피브린, 피브리노겐 또는 콜라겐일 수 있으며, 생분해성 합성 바이오젤이 사용될 수 있다. 상기 생분해성 합성 바이오젤은 폴리에스터 중합체, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리카프로락톤, 폴리락트산-글리콜산의 공중합체, 폴리하이드로옥시부티르산, 폴리하이드로옥시발레르산 및 폴리하이드로옥시부티르산-발레르산의 공중 합체를 1종 이상 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 생분해성 합성 바이오젤 외에 세포가 부착할 수 있는 다공성 젤이 사용될 수 있다. 이의 예로, sigma-aldrich사에서 제조한 HydroMatrixTM Peptide Cell Culture Scaffold, D.A. Narmoneva, et al. / Biomaterials 26 (2005) 4837-4846에 개시된 올리고펩타이드로 이루어진 젤, 국제공개특허 WO2007/029003에 개시된 하이드로젤 미국 특허 US20070099840에 개시된 하이드로젤, M. Zhou et.,al. Biomaterials, 2009, in press에 개시된 세포 부착용 올리고펩타이드 매트릭스, 4 V. Jayawarna, et al.. Acta Biomaterialia, 2009, in press에 개시된 펩타이드 젤 등이 사용될 수 있으며, 세포를 부착 또는 지지하면서 공기 및 배지 투과성인 젤이라면 제한되지 않는다.
일 측면에서, 본 발명은 1) 세포와 하이드로젤을 혼합하고; 2) 단일폐곡선 형태의 스캐폴드의 내부 단일폐곡선에 표면장력을 이용하여 세포 및 하이드로젤 혼합물을 막 형태로 형성하며; 3) 스캐폴드 내부에 형성된 세포 포함 하이드로젤 막을 고화 (solidify)시키는 것을 포함하는 3차원 세포 배양용 스캐폴드의 제조방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 제 1 세포를 하이드로젤에 포함하는 제 1항의 3차원 세포 배양용 스캐폴드를 제 2 세포가 배양되고 있는 세포 접시 또는 미세유체소자의 배지에 침지하여 (dipping) 제 1 세포 및 제 2 세포를 공배양하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 용어 "측분비인자 (paracrine factor)"는 자기세포에서 분비되어 주변 세포에 외래성 신호로 작용하여 자신과 다른 주변 세포의 성장에 영향을 주는 물질을 말하며, 그 예로, 혈관형성인자 (angiogenesis factor), 혈관내피세포생장인자 (vascularendothelial cell growth factor), 신경전달물질, 세포증식인자, 시토키닌(cytokinin), 성장인자, 분화인자, 오타코이드 (autacoid) 등이 해당된다.
일 구현예에서, 제 1 세포는 측분비인자를 공여하는 보조세포일 수 있으며, 제 2 세포는 제 1 세포로부터 측분비인자를 수여받는 세포일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 제 1 세포인 LF가 분비하는 측분비인자 (예를 들어, 혈관내피세포 생장인자)가 제 2 세포인 HUVEC의 생장을 촉진하여 혈관을 형성하였다.
일 구현예에서, 제 1 세포에서 분비되는 측분비인자가 3차원 세포 배양용 스캐폴드가 담긴 배지를 통해 제 2 세포로 전달될 수 있다.
루프 안쪽에 하이드로젤 막 형태로 세포를 포집함으로써 세포 공배양시 제 1 세포가 분비하는 측분비인자를 제 2 세포로 전달 가능하면서 물리적으로 분리되어 공배양으로 인한 세포간 오염을 방지할 수 있고 루프를 미세유체소자의 레저버에 침지했다 꺼내는 것이 용이하여 언제든지 두 종류의 세포를 분리할 수 있는 큰 장점이 있다.
일 측면에서, 본 발명은 1) 미세유체소자의 마이크로-채널에 혈관 내피 세포를 포함하는 하이드로젤을 주입하여 고화시키는 단계; 및 2) 미세유체 소자의 마이크로-채널과 배지로 연결된 웰 또는 레저버 (reservoirs)에 혈관 형성을 촉진하는 측분비인자 분비 세포를 포함하는 제 1항의 3차원 세포 배양용 스캐폴드를 침지하는 단계를 포함하는 혈관 모듈의 제조 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 혈관 모듈 (blood vessel module)은 마이크로 스캐일일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 방법으로 형성된 혈관 모듈의 혈관은 관류 가능할 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
[
실시예
]
실시예
1. 마이크로-채널 제조
Xia, Y.; Whitesides, G. M., SOFT LITHOGRAPHY. Annual Review of Materials Science 1998, 28, 153-184.를 참고하여 소프트리소그래피 (soft lithography) 방법으로 미세유체소자 (Microfluidic device)를 제조하였다. 구체적으로, 플라즈마 처리한 실리콘 웨이퍼를 150μm 두께의 네거티브 포토레지스트 (negative photoresist) SU-8 100 (Microchem, USA)로 스핀-코팅하였다. 65℃에서 10분 동안, 95℃에서 30분 동안 프리-베이킹 (pre-baking)한 뒤, 웨이퍼를 405nm의 UV (Shinu MST, Korea)에 500mJ 동안 노출시켰다. 노출 후에, 웨이퍼를 65℃에서 1분 동안, 95℃에서 10분 동안 베이킹하였다. SU-8 디벨로퍼 (developer) (Microchem, USA)를 사용하여 포토레지스트의 노출되지 않은 부분을 제거하였다. 상기 웨이퍼를 마스터 몰드 (master mold)로 이용하여, PDMS 전구체, Sylgard 184 (Dow Corning, USA)를 붓고, 베이킹하고 복제하였다 (replicated). 주입구 (inlets) 및 레저버 (reservoirs)를 펀칭한 뒤, 플라즈마 (Femto Science, Korea)를 처리하여 PDMS 블록을 커버슬립 위에 부착하였다. 부착된 기기는 80℃의 건조 오븐에서 하룻밤 동안 가열되어 표면이 소수성이 되었다.
실시예
2. 세포 배양
인간 제대정맥 내피세포 (Human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) (Lonza, Switzerland)를 EGM-2 (endothelial growth medium, Lonza, Switzerland) 배지에서 배양되었으며, 계대수 (passage) 4 내지 5의 세포가 사용되었다. 일차 인간 폐 섬유아세포 (human lung fibroblasts, LF) (Lonza, Switzerland)는 FGM-2 (Fibroblast growth medium, Lonza, Switzerland) 배지에서 배양되었으며, 계대수 6 내지 10의 세포가 실험에 이용되었다. 세포를 수득하기 위해, PBS로 헹구고 0.25% Trypsin-EDTA (Gibco, USA)를 처리한 뒤 2분 후에 우태아혈청을 10% 함유하고 있는 M199 (Lonza, Switzerland)를 첨가하여 효소 작용을 중화하였다. 세포를 뗀 후에 수집하여 1,100 rpm에서 2분 동안 원심분리하고 EGM-2를 첨가하여 원하는 세포 수에 도달하도록 희석하고 부유시켰다.
실시예
3. LF-
하이드로젤
루프 제조
도 1에 나타낸 바와 같이 LF (lung fibroblasts)를 포함하는 하이드로젤을 표면장력을 이용하여 루프 형태의 스캐폴더의 내부 표면에 막 형태로 형성하였다. 구체적으로, 외측 직경 6.5 mm 및 내측 직경 약 3.8 mm의 멸균된 루프 형태의 플라스틱 막대 (Loop and Needle, SPL, Korea)를 다듬어 LF 및 피브린 혼합물을 포집하는데 이용하였다. 측분비인자 (paracrine factor)를 분비하는 세포로서 LF를 조직 배양 접시에서 배양하고 수득하여 EGM-2 배지에 4x106 cells/ml가 되도록 부유시켰다. 소 피브리노겐 용액 (0.15 U/ml의 아프로티닌이 함유된 2.5 mg/ml 피브리노겐)을 세포 부유액에 첨가한 뒤 루프 부분의 안쪽에 로딩하기 바로 전에 트롬빈 (0.5 U/ml)과 혼합하였다. 총 20 ㎕의 LF를 포함하는 피브린 (LF 포함 하이드로젤)을 플라스틱 루프의 안쪽 표면에 부드럽게 둘러주었다. 젤이 로딩된 루프를 96 웰에 놓고, 젤이 굳도록 5분 동안 두었다. 젤이 굳었을 때, 배지 200 ㎕을 웰에 채우고 하루 동안 인큐베이션 하였다. 본 실시예에서는 안쪽 직경 3.8 mm의 루프를 사용하여 3x106 cells/ml의 세포가 포함된 하이드로젤 혼합물을 20 ㎕ 포집하였으며, 하이드로젤-세포 혼합물이 루프의 직경 크기에 의존적이기 때문에 세포의 수는 조절될 수 있다. 그렇지만 루프 내에 30,000개 또는 60,000개의 LF 세포를 포함하는 하이드로젤을 포집하여 확인해 본 결과, 60,000개의 세포를 포함하는 하이드로젤을 포집한 경우 30,000개의 세포에 비해 젤이 더 수축되어 루프에서 젤이 떨어져 나왔다.
실시예
4.
Live/dead 분석
LF가 성장인자를 지속적으로 분비하도록, 루프에서 배양되는 LF의 장기간 생존이 필수적이다. 따라서, LF 포함 피브린을 포집한 루프 샘플들을 이용하여 Live/dead 분석을 수행하여 배양 1일째와 10일째의 세포 생존을 확인 및 비교하였다. 구체적으로, Live/dead 분석 키트 (Molecular Probes® L3224, USA)로 배양될 때의 LF-하이드로젤 루프에서의 LF 생존을 정량하였다. LF-하이드로젤 루프를 PBS로 부드럽게 헹구고 항체에 30분 동안 담궈두었다. Hoechst 33342는 핵을 염색하기 위해 사용되었다. 그 후, LF-하이드로젤 루프를 PBS로 헹구었다. 공초점 현미경 (confocal microscopy) FV1000 (Olympus, Japan)을 이용하여 3μm 간격으로 형광 이미지를 촬영하였다. 촬영한 이미지들을 IMARIS (Bitplane, Switzerland)를 이용하여 디콘볼루션 (deconvolution)하여 3차원 이미지를 만들어냈다.
그 결과, 모든 루프에 포집된 젤 내의 세포들이 생존한 것을 알 수 있었으며, 배양 10일 뒤 (DIV 10)에도 95%의 세포들이 생존하여 DIV 1과 차이가 거의 없는 것을 확인할 수 있었다 (도 2).
실시예
5. 마이크로
스캐일의
혈관 모듈(
μBVM
) 제작
LF-하이드로젤 루프에서 LF로부터 분비되는 측분비인자가 공배양하는 미세유체소자의 HUVEC의 생장을 촉진시켜 관류 가능한 혈관을 형성할 수 있는지 확인하기 위하여, HUVEC (Human umbilical vein endothelial cells)을 피브리노겐과 혼합하고 마이크로-채널에 주입하였다. 소수성 마이크로-채널의 모서리에서의 표면장력에 의해 HUVEC 포함 젤이 더 진행하지 않고 마이크로-채널 영역에만 채워졌다. 하이드로젤을 고체화하기 위해 5분 동안 상온에서 인큐베이션한 뒤, 배지를 추가하였다. 상기 실시예 3에서 제조한 LF-하이드로젤 루프를 도 3과 같이 각각의 레저버에 위치시키고 새 배지로 2일마다 바꿔주면서 HUVEC의 혈관 형성을 5일 동안 유도하면서 명시야 상을 얻었다.
그 결과, 루프의 내부에 포집된 하이드로젤에 포함된 LF 세포들과의 공배양에 의해서 HUVEC가 마이크로-채널의 내부에 모세혈관을 형성한 것을 확인할 수 있었다 (도 4).
실시예
6. 면역 염색 및
이미징을
통한 모세혈관의 관류 특성 확인
상기 실시예 5에서 형성된 모세혈관들을 4% 파라포름알데하이드와 혼합하였다. 그 후 이를 0.15%의 Triton X-100으로 15분 동안 투과성 처리를 하고 3% 우혈청 (BSA; Sigma)을 포함하는 PBS 용액을 처리하였다. 혈관의 루멘을 보이게 하기 위하여, FITC-콘쥬게이션된 Phalloidin (Molecular Probes, USA)을 사용하였다. 핵은 Hoechst 33342 (Molecular Probes, USA)로 염색하였다. 모세혈관의 형광 이미지를 Olympus FV-1000 공초점 현미경으로 촬영하였으며, IMARIS를 이용하여 촬영한 이미지들을 3차원 이미지로 디콘볼루션하였다. 또한, 붉은색 형광을 나타내는 7 μm의 마이크로비드를 레저버에 도입하여 μBVM (micro-scale blood vessel module)의 관류능 (perfusability)를 확인하였다.
그 결과, 배양 5일 이내에, 2 mm 내지 4.5 mm 길이의 마이크로 채널에서 형성된 모세혈관들을 확인할 수 있었으며, μBVM의 디콘볼루션 이미지를 통해 모세혈관 내부에 마이크로비드가 존재하는 것을 확인함으로써 μBVM의 관류능 (perfusability)도 확인할 수 있었다 (도 5).
상기와 같은 모세혈관 형성이 LF가 분비하는 측분비인자 때문인지 확인하기 위하여 LF-하이드로젤 루프를 레저버에서 분리한 결과, 혈관 성숙 관련 성장인자가 공급되지 않아 하루 만에 루멘의 분해를 초래하였다 (데이터 미도시).
상기의 결과를 통해, 세포-하이드로젤 루프와 미세유체소자 내의 세포를 물리적으로 분리시킨 상태로 공배양이 가능함을 알 수 있으며, LF-하이드로젤 루프로 인해 형성된 미세유체소자의 마이크로-채널 내의 혈관과 특정 조직을 이룰 수 있는 세포를 포함하는 하이드로젤이 막 형태로 포집된 루프를 이용하여 바디-온-어 칩 (body-on-a chip) 플랫폼을 구성할 수 있음을 알 수 있다. 본 발명의 하이드로젤 루프에 포집한 세포 종류를 바꿈으로써, 혈관에 노출된 측분비인자들도 변경될 수 있다. 따라서, 이를 이용하면 혈관과 다른 특정 세포 또는 조직과의 상호작용을 연구할 수 있고, 특정 세포-하이드로젤 루프는 측분비인자 효과가 필요한 다른 종류의 세포들을 물리적으로 분리된 상태로 공배양하는데 이용될 수 있어 미세유체 연구에서의 조직 및 기관 모델에 유용하게 이용될 수 있다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 특정 세포-하이드로젤 루프와 이를 이용하여 관류 가능한 혈관이 형성된 미세유체소자를 이용하면, 생물학적으로 유도된 모세혈관을 포함하는 μBVM가 다수의 인 비트로 인간 조직 또는 기관 모델 (연속적으로 연결된 다수의 배양 접시)을 연결할 수 있으므로 바디-온-어 칩 플랫폼으로 유용하게 사용될 수 있다.
Claims (20)
- 세포배양용 스캐폴드, 및 세포배양 플레이트 또는 미세유체소자를 포함하는 3차원 세포 공배양 장치로서,
(i) 상기 세포배양용 스캐폴드는, (a) 단일폐곡선 형태의 스캐폴드; 및 (b) 상기 스캐폴드의 내부 단일폐곡선 표면을 따라 막 형태로 형성되고, 제 1 세포를 포함하며, 배지 및 공기의 이동을 허용하나 세포이동을 허용하지 않는 다공성 하이드로젤로 구성되고;
(ii) 상기 세포배양 플레이트 또는 미세유체소자는 제 2 세포를 포함하며; 및
(iii) 상기 세포배양용 스캐폴드가 상기 세포배양 플레이트 또는 미세유체소자에 침지, 또는 침지 및 제거 가능하도록 구비되어, 상기 제 1 세포 및 제 2 세포의 배양 중에 이들 세포의 배양환경에 변화를 제공 하는 것인,
3차원 세포 공배양 장치. - 제 1항에 있어서, 상기 스캐폴드는 상기 제 1 세포 배양을 위한 배지를 더 포함하는 것인, 3차원 세포 공배양 장치.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 제 1 세포와 제 2 세포가 물리적으로 분리되어 배양되는 것인, 3차원 세포 공배양 장치.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 하이드로젤은 피브린, 피브리노겐, 콜라겐, 또는 폴리에스터 중합체, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리카프로락톤, 폴리락트산-글리콜산의 공중합체, 폴리하이드로옥시부티르산, 폴리하이드로옥시발레르산 및 폴리하이드로옥시부티르산-발레르산으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 공중합체를 포함하는 생분해성 합성 바이오젤인 것인, 3차원 세포 공배양 장치.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 제 1 세포는 상기 하이드로젤 전체 부피를 기준으로 500 cells/㎕ 내지 6,000 cells/㎕ 포함되는 것인, 3차원 세포 공배양 장치.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 제 1 세포는 측분비인자 (paracrine factor)를 상기 제 2 세포에 공여하는 측분비인자 분비 세포인 것인, 3차원 세포 공배양 장치.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 제 1 세포 및 제 2 세포를 공배양 하는 동안, 상기 세포배양용 스캐폴드를 상기 세포배양 플레이트 또는 미세유체소자에 침지 및 제거하는 것을 반복 수행하는 것인, 3차원 세포 공배양 장치.
- 제 7항에 있어서, 상기 세포배양용 스캐폴드를 상기 세포배양 플레이트 또는 미세유체소자에 침지 및 제거하는 것을 반복 수행하는 동안, 제 1 세포의 종류가 변경되는 것인, 3차원 세포 공배양 장치.
- 삭제
- 삭제
- 제 1 세포를 포함하는 세포배양용 스캐폴드를 제 2 세포를 포함하는 세포배양 플레이트 또는 미세유체소자에 침지, 또는 침지 및 제거하는 것을 포함하는, 3차원 세포 공배양 방법으로서,
상기 세포배양용 스캐폴드는 (a) 단일폐곡선 형태의 스캐폴드; 및 (b) 상기 스캐폴드의 내부 단일폐곡선 표면을 따라 막 형태로 형성되고, 상기 제 1 세포를 포함하며, 배지 및 공기의 이동을 허용하나 세포이동을 허용하지 않는 다공성 하이드로젤로 구성된 것인,
3차원 세포 공배양 방법. - 제 11항에 있어서, 상기 스캐폴드는 상기 제 1 세포 배양을 위한 배지를 더 포함하는 것인, 3차원 세포 공배양 방법.
- 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 제 1 세포와 제 2 세포가 물리적으로 분리되어 배양되는 것인, 3차원 세포 공배양 방법.
- 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 하이드로젤은 피브린, 피브리노겐, 콜라겐, 또는 폴리에스터 중합체, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리카프로락톤, 폴리락트산-글리콜산의 공중합체, 폴리하이드로옥시부티르산, 폴리하이드로옥시발레르산 및 폴리하이드로옥시부티르산-발레르산으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 공중합체를 포함하는 생분해성 합성 바이오젤인 것인, 3차원 세포 공배양 방법.
- 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 제 1 세포는 상기 하이드로젤 전체 부피를 기준으로 500 cells/㎕ 내지 6,000 cells/㎕ 포함되는 것인, 3차원 세포 공배양 방법.
- 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 제 1 세포는 측분비인자 (paracrine factor)를 상기 제 2 세포에 공여하는 측분비인자 분비 세포인 것인, 3차원 세포 공배양 방법.
- 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 세포배양용 스캐폴드를 상기 세포배양 플레이트 또는 미세유체소자에 침지 및 제거하는 것을 반복 수행하는 것인, 3차원 세포 공배양 방법.
- 제 17항에 있어서, 상기 세포배양용 스캐폴드를 상기 세포배양 플레이트 또는 미세유체소자에 침지 및 제거하는 것을 반복 수행하는 동안, 제 1 세포의 종류가 변경되는 것인, 3차원 세포 공배양 방법.
- 제 16항에 있어서, 상기 제 1 세포에 의해 공여되는 측분비인자는 상기 세포배양용 스캐폴드가 담긴 배지를 통해 상기 제 2 세포로 전달되는 것인, 3차원 세포공배양 방법.
- 삭제
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