KR102219063B1 - 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법 및 다중 장기 미세유체 칩 구조체 - Google Patents
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Abstract
다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법이 개시되며, 상기 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법은, (a) 복수의 인서트 모듈을 준비하고, 상기 복수의 인서트 모듈의 삽입 배치가 가능한 칩을 준비하는 단계; (b) 상기 복수의 인서트 모듈 각각에서 세포를 배양하는 단계; (c) 상기 (b) 단계 이후에 상기 복수의 인서트 모듈을 상기 칩에 삽입 배치하여 모듈 결합 칩을 형성하는 단계; 및 (d) 장기가 다중으로 모사된 다중 장기 미세유체 칩 구조체를 형성하도록 상기 모듈 결합 칩에 대해 공 배양을 진행하는 단계를 포함한다.
Description
본원은 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법 및 다중 장기 미세유체 칩 구조체에 관한 것이다.
일반적으로, 세포 배양 및 분화 기술, 생체 모사 Organ on a chip 기술(이하 '장기 온어 칩 기술'이라 함), 반도체 미세공정 및 미세유체 기술이 있더. 세포 배양 및 분화 기술은 In vitro(실험실 환경)에서 세포를 배양하고 분화시켜 특정 인체 조직의 구조와 기능을 구현하는 기술이고, 장기 온어 칩 기술은 미세유체 칩 안에 특정 장기를 구성하는 세포를 배양하여 해당 장기의 생리적 기능과 약물에 대한 반응을 모방하는 기술이며, 반도체 미세 공정 및 미세 유체 기술은 Photolithography 등을 이용하여 미세구조물을 만들고 유체를 흘려보내면서 세포를 배양하거나 화학반응을 통해 원하는 생성물을 얻는 기술이다.
이러한 기술 중 장기 온어 칩 기술은 미세 공정 기술로 제작한 미세 유체 채널이 구현된 칩에 특정 장기를 구성하는 세포를 배양함으로써, 해당 장기의 기능과 특성뿐만 아니라, 세포운동이나 물리 화학적 반응의 기전을 상세하게 연구할 수 있는 기술이다. 또한 다종의 조직 또는 장기 세포를 다중 장기 온어 칩 기술을 이용하여 동시에 배양하면 다종의 세포 또는 조직 간의 물리 화학적 세포 환경과 상호작용을 구현할 수 있어 보다 인체와 유사한 모델로서 주목되고 있다. 또한, 장기 온어 칩 기술에 의하면, 각 장기의 역할이나 기능에 대하여 타 장기나 조직이 어떠한 영향을 미치는지, 더 고차원적인 연구가 가능하며, 신약개발이나 독성평가에 대한 모델로서 이용 가능하다. 이러한 종래의 온 칩 세포 배양 기술로는 국제공개공보 WO2013-086502(발명의 명칭 "ORGAN CHIPS AND USES THEREOF"), 국제공개공보 WO2013-086486(발명의 명칭 "INTEGRATED HUMAN ORGAN-ON-CHIP MICROPHYSIOLOGICAL SYSTEMS") 등이 개시되어 있다.
그런데, 종래에는 장과 간, 면역 세포등을 배양할 경우, 해당 장기에서 유래한 세포주를 사용하여 세포배양 배지와 배양접시 또는 플레이트에서 배양하고, 일정 시간 배양 후 배양된 세포를 칩으로 옮겨서 배양하였다.
또한, 인체의 다양한 질병의 발생 및 진행, 그리고 약물이 투여되었을 때 인체의 반응은 한 개의 장기에서 일어나는 현상이 아니라 인체를 구성하는 다양한 장기들 사이에서 복합적인 상호작용으로 인해 발생하는 것이 보통인데, 예를 들어 비만, 당뇨, 고혈압과 같은 대사질환의 경우 식습관, 운동, 스트레스와 같은 다양한 요인들로 인해 발생하고, 그 과정에서 장, 간, 면역, 지방조직 등 다양한 장기 조직이 관여하는 것으로 알려져 있다.
그런데, 이러한 장기들 사이의 상호작용을 구현할 수 있는 실험모델의 개발은 질병의 기전 연구 및 치료제 개발에 큰 도움이 될 수 있지만, 장기를 구성하는 세포들마다 배양조건이 다른 경우가 많기 때문에 기존의 일반적인 실험기법으로는 구현이 불가능하다.
이에 따라, 이러한 문제를 해결하기 위해, 다양한 장기를 구성하는 세포의 분화 상태를 유지하면서 각 장기들 사이의 상호작용이 가능하도록 연결해줄 수 있는 장치의 개발이 필요하다(인체를 구성하는 장기와 이를 연결하는 혈관시스템과 유사한 시스템).
본원은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 종래 대비 용이한 세포 배양과 효율적인 제조가 가능한 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법 및 다중 장기 미세유체 칩 구조체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
다만, 본원의 실시예가 이루고자 하는 기술적 과제는 상기된 바와 같은 기술적 과제들로 한정되지 않으며, 또 다른 기술적 과제들이 존재할 수 있다.
상기한 기술적 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서, 본원의 제 1 측면에 따른 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법은, (a) 복수의 인서트 모듈을 준비하고, 상기 복수의 인서트 모듈의 삽입 배치가 가능한 칩을 준비하는 단계; (b) 상기 복수의 인서트 모듈 각각에서 세포를 배양하는 단계; (c) 상기 (b) 단계 이후에 상기 복수의 인서트 모듈을 상기 칩에 삽입 배치하여 모듈 결합 칩을 형성하는 단계; 및 (d) 장기가 다중으로 모사된 다중 장기 미세유체 칩 구조체를 형성하도록 상기 모듈 결합 칩에 대해 공 배양을 진행하는 단계를 포함할 수 있다.
본원의 제2 측면에 따른 다중 장기 미세유체 칩 구조체는, 각각에서 세포가 배양된 복수의 인서트 모듈; 및 상기 복수의 인서트 모듈의 삽입 배치가 가능한 칩을 포함하되, 상기 칩에 상기 복수의 인서트 모듈이 삽입되어 모듈 결합 칩을 형성하고, 장기가 다중으로 모사된 다중 장기 미세유체 칩 구조체를 형성하도록 상기 모듈 결합 칩에 대해 공 배양을 진행하여 상기 다중 장기 미세유체 칩 구조체가 형성될 수 있다.
상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본원을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 실시예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 추가적인 실시예가 존재할 수 있다.
전술한 본원의 과제 해결 수단에 의하면, 서로 다른 세포가 복수의 인서트 모듈 각각에서 개별적으로 배양 또는 분화된 후 칩에 배치되어 공배양될 수 있으므로, 종래 대비 용이하게 다중 장기 미세유체 칩 구조체를 제조할 수 있는 제조 방법이 구현될 수 있다.
도 1은 본원의 일 실시예에 따른 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법의 개략적인 순서도이다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따른 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법의 인서트 모듈의 개략적인 사시도이다.
도 3은 도 2의 A-A 방향으로 절개한 단면도이다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따른 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법의 인서트 모듈의 분해도이다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따른 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법의 칩의 사시도이다.
도 6은 본원의 일 실시예에 따른 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법의 인서트 모듈이 조립된 칩의 사시도이다.
도 7은 본원의 일 실시예에 따른 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법의 조립된 인서트 모듈과 칩의 분해도이다.
도 8은 본원의 일 실시예에 따른 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법의 인서트 모듈이 조립된 칩을 도 7의 A-A 선을 따라 절개한 단면도이다.
도 9는 본원의 일 실시예에 따른 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법의 세포가 배양되는 인서트 모듈이 조립되고, 배지가 주입된 칩을 도 7의 A-A 선을 따라 절개한 단면도이다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따른 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법의 인서트 모듈의 개략적인 사시도이다.
도 3은 도 2의 A-A 방향으로 절개한 단면도이다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따른 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법의 인서트 모듈의 분해도이다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따른 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법의 칩의 사시도이다.
도 6은 본원의 일 실시예에 따른 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법의 인서트 모듈이 조립된 칩의 사시도이다.
도 7은 본원의 일 실시예에 따른 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법의 조립된 인서트 모듈과 칩의 분해도이다.
도 8은 본원의 일 실시예에 따른 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법의 인서트 모듈이 조립된 칩을 도 7의 A-A 선을 따라 절개한 단면도이다.
도 9는 본원의 일 실시예에 따른 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법의 세포가 배양되는 인서트 모듈이 조립되고, 배지가 주입된 칩을 도 7의 A-A 선을 따라 절개한 단면도이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 "전기적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에", "상부에", "상단에", "하에", "하부에", "하단에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
참고로, 본원의 실시예에 관한 설명 중 방향이나 위치와 관련된 용어(상측, 상면, 하측, 하면 등)는 도면에 나타나 있는 각 구성의 배치 상태를 기준으로 설정한 것이다. 예를 들면, 도 2 내지 도 9에서 보았을 때 전반적으로 12시 방향이 상측, 전반적으로 12시 방향을 향하는 면이 상면, 전반적으로 6시 방향이 하측, 전반적으로 6시 방향을 향하는 면이 하면 등이 될 수 있다.
본원은 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법 및 다중 장기 미세유체 칩 구조체에 관한 것이다.
먼저, 본원의 일 실시예에 따른 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법(이하 '본 방법'이라 함)에 대해 설명한다.
도 1은 본원의 일 실시예에 따른 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법의 개략적인 순서도이고, 도 2는 본원의 일 실시예에 따른 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법의 인서트 모듈의 개략적인 사시도이며, 도 3은 도 2의 A-A 방향으로 절개한 단면도이고, 도 4는 본원의 일 실시예에 따른 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법의 인서트 모듈의 분해도이다.
도 1을 참조하면, 본 방법은, 복수의 인서트 모듈(1)을 준비하고, 복수의 인서트 모듈(1)의 삽입 배치가 가능한 칩(2)을 준비하는 단계(S100)를 포함한다.
도 2를 참조하면, 인서트 모듈(1)은 하부 링(11)을 포함할 수 있다. 도 3 및 도 4를 참조하면, 하부 링(11)의 내측에 중공부(111)가 형성될 수 있다. 하부 링(11)은 폴리카본에이트를 포함하는 재질로 이루어질 수 있다. 또한, 도 2 내지 도 4를 참조하면, 인서트 모듈(1)은 중공부(121)가 하부 링(11)의 중공부(111)와 통하도록 하부 링(11)의 상측에 배치되는 상부 링(12)을 포함할 수 있다. 상부 링(12)은 폴리카본에이트를 포함하는 재질로 이루어질 수 있다. 또한, 도 2 내지 도 4를 참조하면, 인서트 모듈(1)은 하부 링(11)과 상부 링(12) 사이에 개재되는 다공성 멤브레인(13)을 포함할 수 있다. 상술한 바에 따르면, 인서트 모듈(1)은 다공성 멤브레인(13) 막이 가운데 고정되어 2개의 층으로 분리되어 있는 원형의 링(하부 링(11), 상부 링(12)을 포함할 수 있다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따른 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법의 칩의 사시도이고, 도 6은 본원의 일 실시예에 따른 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법의 인서트 모듈이 조립된 칩의 사시도이며, 도 7은 본원의 일 실시예에 따른 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법의 조립된 인서트 모듈과 칩의 분해도이고, 도 8은 본원의 일 실시예에 따른 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법의 인서트 모듈이 조립된 칩을 도 7의 A-A 선을 따라 절개한 단면도이다. 참고로, 본원의 도면(특히, 도 7 및 도 8)에서 일부 구성은 보다 용이한 이해를 위해 과장되어 도시되어 있을 수 있다.
도 5 및 도 6을 참조하면, 칩(2)은 제1 리저버(24)를 포함할 수 있다.
예를 들어, 도 5 내지 도 8을 참조하면, 칩(2)은 베이스판(23), 베이스판(23) 상에 배치되는 하판(22) 및 하판(22) 상에 배치되는 상판(21)을 포함할 수 있다. 이를 테면, 상판(21)은 폴리카본에이트를 포함하는 재질로 이루어질 수 있다. 또한, 하판(22)은 PDMS를 포함하는 재질로 이루어질 수 있다. 또한, 베이스판(23)은 유리를 포함하는 재질로 이루어질 수 있다. 또한, 베이스판(23)과 하판(22)은 플라즈마 접합될 수 있고, 하판(22)과 상판(21)은 나사 조립될 수 있다.
또한, 하판(22)에는 제1 리저버(24)의 하부공간에 대응하는 제1 하부 홀(221)이 형성될 수 있고, 상판(21)에는 제1 리저버(24)의 상부공간에 대응하여 제1 하부 홀(221)과 통과하는 제1 상부 홀(231)이 형성될 수 있다. 제1 리저버(24)는 제1 하부 홀(221)(하부 공간) 및 제1 상부 홀(231)(상부공간)을 포함할 수 있다.
또한, 도 5 내지 도 8을 참조하면, 칩(2)은 복수의 챔버(25)를 포함할 수 있다. 도 7 및 도 8을 참조하면, 복수의 챔버(25)는 복수의 인서트 모듈(1) 각각을 삽입 배치 가능하도록 상측이 개구된 상태로 하향 함몰 형성될 수 있다. 예를 들어, 챔버(25)에는 삽입되는 인서트 모듈(1)의 하부 링(11)이 안착되는 안착면(2121) 및 삽입되는 인서트 모듈(1)의 하부 링(11)의 중공부(111)와 통하는 바닥공간(222)을 형성하도록 안착면(2121)보다 하향 함몰되는 바닥면(231)이 형성될 수 있다.
구체적으로, 도 8을 참조하면, 하판(22)에는 복수의 챔버(25)의 바닥공간(222)에 대응하는 복수의 바닥 홀(222)이 형성될 수 있고, 상판(21)에는 안착면(2121)이 형성되도록 함몰되되 안착면(2121)의 중간에 복수의 바닥 홀(222)과 통하는 연통 홀(2122)이 형성되는 모듈 안착부(212)가 형성될 수 있다.
또한, 도 5 내지 도 8을 참조하면, 칩(2)은 제2 리저버(26)를 포함할 수 있다. 도 7 및 도 8을 참조하면, 하판(22)에는 제2 리저버(26)의 하부공간에 대응하는 제2 하부 홀(223)이 형성되고, 상판(21)에는 제2 리저버(26)의 상부공간에 대응하여 제2 하부 홀(223)과 통하는 제2 상부 홀(213)이 형성될 수 있다.
또한, 도 7 및 도 8을 참조하면, 칩(2)은 채널(224)을 포함할 수 있다. 채널(224)은 제1 리저버(24)와 복수의 챔버(25)와 제2 리저버(26)를 연결할 수 있다. 또한, 채널(224)은 복수의 챔버(25) 각각의 바닥공간(222)에 대하여 연결될 수 있다. 예를 들어, 하판(22)에는 제1 하부 홀(221)과 바닥 홀(222)과 제2 하부 홀(223)을 연결하는 채널(224)에 대응하는 홈 또는 홀이 형성될 수 있다. 또한, 채널(224)이 홈일 경우, 채널(224)은 하판(22)의 하면으로부터 상측 방향으로 함몰 형성되는 홈일 수 있다. 이를 테면, 하판(22)이 2mm의 두께를 갖는 경우, 채널(224)의 함몰 깊이는 0.25mm일 수 있다. 참고로, 도 7 및 도 8을 참조하면, 본원의 도면에는 채널(224)이 홈 형태로 형성된 것이 도시되었다.
참고로, 이하에서 후술하는 S300 단계는 S1300 단계의 일부 과정과 동시에 수행되거나, 또는, S100 단계 이후에 수행될 수 있다. 예를 들어, S300 단계는 S100 단계의 복수의 인서트 모듈(1)이 준비된 후 수행될 수 있는데, 이때, S100 단계의 칩(2)의 준비는 S300 단계와 동시에 수행되거나, S300 단계 이후에 수행될 수 있다.
또한, S100 단계는, 세척된 인서트 모듈(1)을 준비할 수 있다. 또한, S100 단계는 세척된 칩(2)을 준비할 수 있다. 예를 들어, S100 단계는 칩(2)의 채널(224)에 에탄올을 주입해서 유체가 잘 흐를 수 있도록 세척할 수 있다. 또한, 칩(2)을 기울여 놓고 칩(2)이 기울어진 방향으로 에탄올이 잘 흐르는지 확인할 수 있다. 또한, 채널(224)의 일단에 에탄올을 흘려 에탄올이 채널(224)을 따라 흐르게 할 수 있다. 에탄올이 어느 정도 흐르는 것이 확인되면, 유체를 PBS로 교체하고 칩(2)을 기울여서 PBS가 채널(224)을 따라 흐르게 할 수 있다. PBS가 잘 흐르면 유체를 배치로 교체하여 칩(2)을 기울여서 유체(배지)가 채널(224)을 따라 흐르는지 확인할 수 있다.
또한, 참고로, S100 단계는 인서트 모듈(1) 또는 칩(2)을 제조할 수 있는데, 인서트 모듈(1) 또는 칩(2)을 실리콘 고분자 물질(PDMS), 두랄루민 금속, 폴리카보네이트 고분자 등을 이용하여 제조할 수 있다. 이에 따라, 여러 조직세포를 동시에 구현하여 연결할 수 있는 인서트 모듈(1) 또는 칩(2)이 제조될 수 있다.
보다 구체적으로, S100 단계는 칩(2)을 제조하기 위해, PDMS 층을 제작할 수 있다. 구체적으로, S100 단계는 PDMS 층을 만들기 위해 Polydimethylsiloxane(PDMS) - Sylgard A: Sylgard B = 10:1의 비율로 섞은 후, 진공펌프를 사용하여 기포를 제거해줄 수 있고, PDMS의 기포가 모두 제거되면 채널층 틀에 부은 뒤에 60℃ 오븐에서 2시간 이상 굳힌 뒤 떼어낼 수 있다. PDMS 층은 하판(22)을 이룰 수 있다. 이때, PDMS 층에는 하판(22)에 형성되는 제1 하부 홀(221) 바닥 홀(222), 제2 하부 홀(223), 채널(224) 등이 형성될 수 있다.
또한, S100 단계는 칩(2)을 제조하기 위해, PDMS 층을 접합할 수 있다. 구체적으로, S100 단계는, 가교된 PDMS층을 채널(224)이 하측을 향하도록(베이스판(23)을 향하도록) 베이스판(23) 상에 놓을 수 있고, PDMS 층과 베이스판(23)을 공기 플라즈마 처리하여 접합할 수 있다(Plasma 조건: Power - 70 W, Generation time - 30 sec, Base pressure - 1.00 x 10-1 torr, MFC #1- 33 sccm). 참고로, 베이스판(23)은 유리일 수 있으며, 또는 다른 예로 플라스틱일 수 있다.
또한, S100 단계는 베이스판(23)과 접합된 PDMS 층을 폴리카본에이트를 포함하는 재질로 이루어진 상판(21)과 나사로 조립하여 상호 고정시킬 수 있다.
또한, S100 단계는 인서트 모듈(1)을 준비하기 위해, 상부 링(12)과 하부 링(11) 사이에 다공성 멤브레인(3470, corning, costar, NY)(13)을 개재한 후 상부 링(12) 및 하부 링(11) 각각에 형성된 나사 구멍(112, 122)에 나사를 삽입하여 나사를 조여서 조립할 수 있다. 이때, 나사와 이웃하는 나사 사이에 빈 나사 구멍이 위치하도록 삽입되어 조이는 나사들은 삼각형을 이루며 나사 구멍(112, 122)에 체결될 수 있다. 체결되는 나사는 다공성 멤브레인(13)을 통과하며 상부 링(12) 및 하부 링(11) 각각에 형성된 나사 구멍(112, 122)에 삽입될 수 있다. 또한, 참고로, 상부 링(12) 및 하부 링(11) 각각은 폴리카본에이트를 포함하는 재질로 이루어질 수 있다.
또한, S100 단계는 인서트 모듈(1) 또는 칩(2)을 멸균할 수 있다. 세균의 내생포자를 파괴하기 위해서는 100℃ 이상에서 높은 증기압으로 멸균해야 하므로 칩(2)(또는 인서트 모듈(1))을 멸균시키려면 고압멸균(autoclave)이 필요하다. 고압멸균(autoclave)은 121℃의 온도와 15lb psi의 압력이 적용된 공간에서 최소 15분 간 진행될 수 있다.
또한, 본 방법은 서로 다른 종류의 세포를 각각 배양하는데 인서트 모듈 (insert module)(1)을 이용할 수 있다. 이하에서 구체적으로 설명한다.
또한, 도 1을 참조하면, 본 방법은, 복수의 인서트 모듈(1) 각각에서 세포를 배양하는 단계(S300)를 포함한다.
구체적으로, S300 단계에서, 외부환경과 맞닿는 장벽 기능을 하는 세포의 배양에 대응하는 제1 인서트 모듈(1)의 경우, 배양된 세포가 다공성 멤브레인(13) 상에 적어도 한 층의 막을 형성하도록 세포 배양이 수행될 수 있다. 예를 들어, 외부환경과 맞닿는 장벽 기능을 하는 세포는 소장 또는 폐 세포일 수 있다. 이러한 경우, S300 단계는 제1 인서트 모듈(1)의 다공성 멤브레인(13) 막 위에서 외부환경과 맞닿는 장벽 기능을 하는 세포를 배양하여 한층의 막을 형성할 수 있고, 본 방법은 후술할 S500 단계에서, 내벽이 완성된 후 분화된 세포가 포함된 인서트 모듈(1)을 칩(2)에 삽입할 수 있다. 이에 따라, S300 단계는, 제1 인서트 모듈(1)에 장벽을 재현할 수 있다.
구체적으로, 제1 인서트 모듈(1)에서 배양되는 세포가 장 세포인 경우, Caco-2 세포가 부유된 배지를 사용하여 제1 인서트 모듈(1)의 다공성 멤브레인(13)에 Caco-2 세포를 시딩하고 배지를 채우는 단계를 포함할 수 있다. 여기서, Caco-2 세포는 인체 대장암 유래 세포주일 수 있다. 또한, Caco-2 세포를 시딩하고 배지를 채우는 단계는, Caco-2 세포를 플라스크로부터 trypsin을 사용하여 떼어내고 원심분리기를 사용하여 1500rpm에서 5분 동안 돌려줄 수 있다. 또한, Caco-2 세포를 시딩하고 배지를 채우는 단계는 원심분리기를 사용하여 돌려준 용액의 상층액을 제거하고 DMEM 배지에 재부유 시킬 수 있으며, 세포수를 측정하여 3 x 105 cells/ml의 농도로 만들어주고 0.1ml의 배지를 사용하여 미리 적셔둔 제1 인서트 모듈(1)의 다공성 멤브레인(13) 위에 시딩할 수 있다. 이에 따르면, S100 단계의 Caco-2 세포를 시딩하고 배지를 채우는 단계는 Caco-2 세포가 부유된 3 x 105 cells/ml 농도의 배지를 사용하여 상기 제1 인서트 모듈의 멤브레인의 상면에 Caco-2 세포를 시딩하고 배지를 채울 수 있다.
또한, S300 단계에서, 외부환경과 맞닿는 장벽 기능을 하는 세포의 배양에 대응하는 제1 인서트 모듈(1)의 경우, S300 단계는, 제1 인서트 모듈(1)을 소정의 시간 동안 인큐베이터(incubator)에 보관한 후 제1 인서트 모듈(1)의 다공성 멤브레인(13) 상의 배지를 적어도 일부 교환하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 인큐베이터에 보관후 배지를 교환하는 단계는, 제1 인서트 모듈(1)에 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium, Gibco, 10 (v/v)% Fetal bovine serum, Welgene, 1(v/v)% Penicilin&streptomycin, Sigma) 배지를 채워 소정 시간(이를 테면, 6시간 동안) 인큐베이터에 넣어둔 후 붙지 않은 cells을 제거하기 위해 Apical 부분(다공성 멤브레인(13)상의 부분)의 적어도 일부의 배지를 교환할 수 있다.
또한, S300 단계에서, 외부환경과 맞닿는 장벽 기능을 하는 세포의 배양에 대응하는 제1 인서트 모듈(1)의 경우, S300 단계는 배지를 채운6 well cell culture plate 에서 제1 인서트 모듈(1)을 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 인서트 모듈(1)을 배양하는 단계는, 상술한 과정에 따라 시딩된 제1 인서트 모듈(1)을 1ml의 배지를 채운 6 well cell culture plate에 7일 간 배양할 수 있다.
또한, 후술할겠지만, 제1 인서트 모듈(1)에서 배양되는 세포가 장 세포인 경우, 본 방법은 제1 인서트 모듈(1)을 6 well cell culture plate에 7일 간 배양한 후 8일 째에 칩(2)에 삽입할 수 있다. 이후, 2일마다 배지를 교환해주며 총 14일동안 배양할 수 있다.
또한, S300 단계에서, 3차원 구조를 갖는 조직세포 또는 다른 조직과 섞여 존재하는 세포의 배양에 대응하는 제2 인서트 모듈의 경우, 배양된 세포가 다공성 멤브레인(13) 위를 적어도 70% 이상을 채우도록 세포 배양이 수행될 수 있다.
예를 들어, 3차원 구조를 갖는 조직세포 또는 다른 조직과 섞여 존재하는 세포는 대식세포일 수 있다. 이러한 경우, 본 방법은 S300 단계에서 제2 인서트 모듈(1)에 상기 세포를 배양할 수 있는데, 제2 인서트 모듈(1)에 상기 세포를 주입한 후 제2 인서트 모듈(1)의 다공성 멤브레인(13) 상에서 충분히 자랄 때까지 배양될 수 있고(배양 기간은 약 1주 정도 소요될 수 있음), 다공성 멤브레인(13)의 70% 이상을 채울 정도로 세포가 자라면, 본 방법은 후술할 S500 단계에서, 제2 인서트 모듈(1)을 칩(2)에 삽입할 수 있다.
예를 들어, S300 단계는, 제2 인서트 모듈(1)에 간 세포를 배양할 수 있다.
구체적으로, S300 단계는, 제2 인서트 모듈(1)에서 배양되는 세포가 간 세포인 경우, HepG2 세포가 부유된 배지를 사용하여 상기 제2 인서트 모듈(1)의 다공성 멤브레인(13)의 상면에 HepG2 세포를 시딩하고 배지를 채우는 단계를 포함할 수 있다. 이를 테면, HepG2 세포를 시딩하고 배지를 채우는 단계는, Human colon carcinoma cell line인 HepG2 세포를 flask로부터 trypsinize를 사용하여 떼어내고 원심분리기를 사용하여 1500rpm에서 5분 동안 돌려줄 수 있고, 상층액을 제거하고 DMEM 배지에 재부유 시킬 수 있으며, cell counting을 하여 1 x 105 cells/ml의 농도로 만들어주고 0.1ml의 배지를 사용하여 미리 적셔둔 제1 인서트 모듈(Trans-well insert(3470, corning, costar, NY))(1)의 다공성 멤브레인(13) 위에 시딩할 수 있다.
또한, S300 단계는, 제2 인서트 모듈(1)에서 배양되는 세포가 간 세포인 경우, 제2 인서트 모듈(1)을 소정의 시간 동안 인큐베이터에 보관한 후 제2 인서트 모듈(1)의 다공성 멤브레인(13) 상의 배지를 적어도 일부 교환하는 단계를 포함할 수 있다. 이를 테면, 인큐베이터에 보관한 후 배지를 교환하는 단계는, 제2 인서트 모듈(1)에 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium, Gibco, 10 (v/v)% Fetal bovine serum, Welgene, 1(v/v)% Penicilin&streptomycin, Sigma) 배지를 채워 소정 시간(이를 테면6시간 동안) 인큐베이터에 넣어둔 후 붙지 않은 cells을 제거하기 위해 Apical 부분(다공성 멤브레인(13)의 상측)의 적어도 일부의 배지를 교환할 수 있다.
또한, S300 단계는, 제2 인서트 모듈(1)에서 배양되는 세포가 간 세포인 경우, 배지를 채운 6 well cell culture plate에서 제2 인서트 모듈(1)을 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제2 인서트 모듈(1)을 배양하는 단계는 상술한 과정에 따라 시딩된 제2 인서트 모듈(1)을 1ml의 배지를 채운 6 well cell culture plate에 1일 간 배양?l 수 있다.
또한, 후술할겠지만, 제2 인서트 모듈(1)에서 배양되는 세포가 간 세포인 경우, 본 방법은 제2 인서트 모듈(1)을 6 well cell culture plate에 1일 간 배양한 후 2일 째에 칩(2)에 삽입할 수 있다. 이후, 2일마다 배지를 교환해주며 총 3일동안 배양할 수 있다.
또한, S300 단계는, 상기 제2 인서트 모듈(1)에서 배양되는 세포가 대식 세포인 경우, raw264.7 세포가 부유된 배지를 사용하여 상기 제3 인서트 모듈의 다공성 멤브레인의 상면에 raw264.7 세포를 시딩하고 배지를 채우는 단계를 포함할 수 있다. 이를테면, raw264.7 세포를 시딩하고 배지를 채우는 단계는, Mouse monocyte-macrophage (대식세포)세포주인 raw264.7 세포를 플라스크로부터 cell scraper를 사용하여 떼어내고 원심분리기를 사용하여 1500rpm에서 5분 동안 돌려줄 수 있으며, 상층액을 제거하고 DMEM 배지에 재부유 시킬 수 있으며, 세포수를 측정하여 1 x 105 cells/ml의 농도로 만들어주고 0.1ml의 배지를 사용하여 미리 적셔둔 제2 인서트 모듈(Trans-well insert(3470, corning, costar, NY))(2)의 다공성 멤브레인(13) 위에 시딩할 수 있다.
또한, S300 단계는, 상기 제2 인서트 모듈(1)에서 배양되는 세포가 대식 세포인 경우, 제2 인서트 모듈(1)을 소정의 시간 동안 인큐베이터에 보관한 후 제2 인서트 모듈(1)의 다공성 멤브레인(13) 상의 배지를 적어도 일부 교환하는 단계를 포함할 수 있다. 이를테면, 인큐베이터에 보관후 배지를 교환하는 단계는, 제2 인스터 모듈(1)에 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium, Gibco, 10 (v/v)% Fetal bovine serum, Welgene, 1(v/v)% Penicilin&streptomycin, Sigma) 배지를 채워 소정 시간(이를 테면, 6시간 동안) 인큐베이터에 넣어둔 후 붙지 않은 세포(cells)를 제거하기 위해 Apical 부분(다공성 멤브레인(13)의 상측)의 적어도 일부의 배지를 교환할 수 있다.
또한, S300 단계는, 상기 제2 인서트 모듈(1)에서 배양되는 세포가 대식 세포인 경우, 배지를 채운 6 well cell culture plate에서 제2 인서트 모듈(1)을 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제2 인서트 모듈(1)을 배양하는 단계는, 상술한 과정에 따라 시딩된 제2 인서트 모듈(1)을 1ml의 배지를 채운 6 well cell culture plate에 1일 간 배양?l 수 있다.
또한, 후술할겠지만, 제2 인서트 모듈(1)에서 배양되는 세포가 대식 세포인 경우, 본 방법은 제2 인서트 모듈(1)을 6 well cell culture plate에 1일 간 배양한 후 2일 째에 칩(2)에 삽입할 수 있다. 이후, 2일마다 배지를 교환해주며 총 3일동안 배양할 수 있다.
또한, S300 단계에서, 별도의 분화과정이 필요한 세포의 배양에 대응하는 제3 인서트 모듈(1)의 경우, 배양된 세포가 미리 설정된 분화 과정을 거쳐 분화된 세포를 형성하도록 세포 배양이 수행될 수 있다.
예를 들어, 별도의 분화과정이 필요한 세포는 지방조직세포(지방 세포)일 수 있다. 이러한 경우, 본 방법은 S300 단계에서 제3 인서트 모듈(1)에 세포를 주입하고 배양한 후, 필요한 만큼의 분화 과정을 거친 후 후술할 S500 단계에서 분화된 세포가 들어있는 제3 인서트 모듈(1)을 칩(2)에 삽입할 수 있다.
구체적으로, S300 단계는, 제3 인서트 모듈(1)에서 배양되는 세포가 지방 세포인 경우, 3T3-L1 세포가 부유된 배지를 사용하여 제3 인서트 모듈(1)의 다공성 멤브레인(13)의 상면에 3T3-L1 세포를 시딩하고 배지를 채우는 단계를 포함할 수 있다. 이를 테면, 3T3-L1 세포를 시딩하고 배지를 채우는 단계는 Mus musculus embryo(지방세포)인 3T3-L1을 flask로부터 trypsin을 사용하여 떼어내고 원심분리기를 사용하여 1500rpm에서 5분 동안 돌려줄 수 있고, 상층액을 제거하고 DMEM 배지에 재부유 시킬 수 있으며, cell counting을 하여 3 x 105 cells/ml의 농도로 만들어주고 0.1ml의 배지를 사용하여 미리 적셔둔 제3 인서트 모듈(1)의 멤브레인(13) 상에 시딩할 수 있다.
또한, S300 단계는, 제3 인서트 모듈(1)에서 배양되는 세포가 지방 세포인 경우, 제3 인서트 모듈(1)을 소정의 시간 동안 인큐베이터에 보관한 후 제3 인서트 모듈(1)의 다공성 멤브레인(13) 상의 배지를 적어도 일부 교환하는 단계를 포함할 수 있다. 이를 테면, 인큐베이터에 보관한 후 배지를 교환하는 단계는, 제3 인서트 모듈(1)에 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium, Gibco, 10 (v/v)% Newborn Calf serum, Gibco, 1(v/v)% Penicilin&streptomycin, Sigma) 배지를 채워 소정 시간(이를 테면, 6시간 동안) 인큐베이터에 넣어둔 후 붙지 않은 cells을 제거하기 위해 Apical 부분(다공성 멤브레인(13)의 상측)의 적어도 일부의 배지를 교환할 수 있다.
또한, S300 단계는, 제3 인서트 모듈(1)에서 배양되는 세포가 지방 세포인 경우, 배지를 채운 6 well cell culture plate에서 제3 인서트 모듈(1)을 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제3 인서트 모듈(1)을 배양하는 단계는 상술한 과정에 따라 시딩된 제3 인서트 모듈(1)을 1ml의 배지를 채운 6 well cell culture plate에 배양할 수 있다. 이때, 제3 인서트 모듈(1)을 배양하는 단계는 1ml의 배지를 채운 6 well cell culture plate에 cell confluency 가 80%이상 될 때까지 제3 인서트 모듈(1)을 배양할 수 있다.
또한, S300 단계는, 제3 인서트 모듈(1)에서 배양되는 세포가 지방 세포인 경우, 제3 인서트 모듈(1)의 배치를 교체하며 분화를 진행하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, 배지를 교체하며 분화를 진행하는 단계는, 제3 인서트 모듈의 배지를 DMI로 교체하여 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 단계는 지방 세포의 분화 진행을 위해 DMI (10% FBS DMEM, IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine) 500uM, Insulin 5ug/ml, Dexamethasone 250nM)에서 2일 간 배지를 교체하여 배양할 수 있다.
또한, 배지를 교체하며 분화를 진행하는 단계는, 제3 인서트 모듈(1)에서 배양되는 세포가 지방 세포인 경우, 제3 인서트 모듈의 배지를 Insulin media 로 교체하여 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 단계는 Insulin media (Insulin 1ug/ml, 10% FBS DMEM)로 배지를 교체하여 2일 간 배양할 수 있다.
또한, 배지를 교체하며 분화를 진행하는 단계는, 제3 인서트 모듈(1)에서 배양되는 세포가 지방 세포인 경우, 제3 인서트 모듈(1)의 배지를 Growth media로 교체하여 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 단계는, G0rowth media(10% FBS DMEM)으로 배지를 교체하여 5일 간 배양하여 분화를 확인할 수 있다.
또한, 이하에서 후술할겠지만, 제3 인서트 모듈(1)에서 배양되는 세포가 지방 세포인 경우, 본 방법은 제3 인서트 모듈(1)에서의 지방 세포의 분화가 완료되면, 분화가 완료된 지방 세포가 위치한 제3 인서트 모듈(1)을 칩(2)에 삽입할 수 있다. 또한, 분화가 완료된 지방 세포(제3 인서트 모듈(1))을 칩(2)에 삽입하여 2일마다 배지를 교환해주며 총 3일동안 배양할 수 있다.
도 9는 본원의 일 실시예에 따른 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법의 세포가 배양되는 인서트 모듈이 조립되고, 배지가 주입된 칩을 도 7의 A-A 선을 따라 절개한 단면도이다.
도 9를 참조하면, 본 방법은, S300 단계 이후에, 복수의 인서트 모듈(1)을 칩(2)에 삽입 배치하여 모듈 결합 칩을 형성하는 단계(S500)를 포함한다. 예를 들어, 장 세포 배양 8일 째와 간 세포, 대식 세포 배양 2일째와 지방 세포의 분화가 완료되면(이를 테면, 지방 세포 배양 5일째)에 장 세포, 간 세포, 대식 세포, 지방 세포 각각이 배양되는 인서트 모듈(1)을 칩(2)의 챔버(25)에 삽입할 수 있다. 이때, 칩(2)은 워싱된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, S500 단계는, 워싱된 칩(2)의 제1 및 제2 리저버(24, 26) 중 하나 이상에 1ml의 배지를 채워 채널(224), 제1 리저버(24) 및 제2 리저버(26)에 배지가 흐르게 할 수 있다. 또한, S500 단계는 인서트 모듈(1)이 삽입될 챔버(25)에 기포가 생기지 않도록 유의하며 각 인서트 모듈(1)을 칩(2)에 맞추어 넣은 후 나사로 조립할 수 있다.
또한, 본 방법은 장기가 다중으로 모사된 다중 장기 미세유체 칩 구조체를 형성하도록, 모듈 결합 칩에 대해 공 배양을 진행하는 단계(S700)를 포함할 수 있다. 예를 들어, S700 단계는 2일 마다 제1 리저버(24), 제2 리저버(25) 및 채널(224) 중 하나 이상의 배지를 교체해 주며 칩(2)에 합쳐진 세포들을 배양할 수 있다. 또한, S700 단계는, 공 배양을 시작한 당일에 칩(2)을 플로머신에 올려 중력을 기반으로 한 채널 속 배지의 흐름을 유도할 수 있다.
또한, 도 9를 참조하면, 별도의 인서트 모듈(1) 각각에서 배양 또는 분화 중인 세포 1(93), 세포 2(92) 및 세포 3(91) 각각은 서로 다른 장기를 의미할 수 있다. 이에 따라, 본 방법은 다중 장기가 모사된 미세유체 칩 구조체를 구현할 수 있다. 참고로, 제1 인서트 모듈(1)에 배양되는 세포가 장 세포 인경우, 본 방법에 의한 다중 장기 미세유체 칩 구조체에서 제1 인서트 모듈(1) 내에서 배양 또는 분화된 장 세포는 장 역할을 할 수 있다. 이에 따라, 본 방법에 의해 제조된 다중 장기 미세유체 칩 구조체 내에서 장 세포(또는 장 세포가 배양되는 제1 인서트 모듈(1))은 인체의 흡수를 모사할 수 있다. 또한, 제2 인서트 모듈(1)에 배양되는 세포가 간 세포인 경우, 본 방법에 의한 다중 장기 미세유체 칩 구조체에서 제2 인서트 모듈1) 내에서 배양 또는 분화된 간 세포는 간 역할을 할 수 있다. 이에 따라, 본 방법에 의해 제조된 다중 장기 미세유체 칩 구조체 내에서 간 세포(또는 간 세포가 배양되는 제2 인서트 모듈(1))은 인체의 대사를 모사할 수 있다. 또한, 제2 인서트 모듈(1)에 배양되는 세포가 대식 세포인 경우, 본 방법에 의한 다중 장기 미세유체 칩 구조체에서 제2 인서트 모듈(1) 내에서 배양 또는 분화된 대식 세포는 면역 세포 역할을 할 수 있다. 또한, 제3 인서트 모듈(1)에 배양되는 세포가 지방 세포인 경우, 제3 인서트 모듈(1) 내에서 배양 또는 분화된 지방 세포는 지방 조직 역할을 할 수 있다.
또한, 바람직하게 본 방법은 장 세포 - 간 세포 - 면역 세포의 조합을 갖는 다중 장기 미세유체 칩 구조체를 제조할 수 있다. 이러한 경우, S300 단계는 복수의 인서트 모듈(1) 각각에 장 세포, 간 세포 및 대식 세포 각각을 배양 또는 분화하고, S500 단계는 장 세포가 배양 또는 분화되는 인서트 모듈(상술한 제1 인서트 모듈(1)), 간 세포가 배양 또는 분화되는 인서트 모듈(상술한 제2 인서트 모듈(1)) 및 대식 세포가 배양 또는 분화되는 인서트 모듈(상술한 제2 인서트 모듈(1))을 칩(2)에 삽입 배치하여 모듈 결합 칩을 형성하고, S700 단계에서 장 세포, 간 세포 및 대식 세포를 공배양할 수 있다. 이러한 장 세포 - 간 세포 - 면역 세포의 조합을 갖는 다중 장기 미세유체 칩 구조체에 따르면, 장 세포 - 간 세포 - 면역 세포의 조합에 의해, 장 세포를 통해 유입된 외부 물질에 의한 염증 반응 등이 확인될 수 있다. 예시적으로, 본원의 일 구현예에 따르면, 채널(224)을 통해 제1 리저버(24), 장 세포에 대응하는 제1 인서트, 간 세포에 대응하는 제2 인서트, 면역 세포에 대응하는 제3 인서트, 제2 리저버(26)의 순으로 각 구성들이 연결될 수 있다.
또한, 다른 예로서, 본 방법은 장 세포 - 간 세포 - 지방 세포의 조합을 갖는 다중 장기 미세유체 칩 구조체를 제조할 수 있다. 이러한 경우, S300 단계는 복수의 인서트 모듈(1) 각각에 장 세포, 간 세포 및 지방 세포 각각을 배양 또는 분화하고, S500 단계는 장 세포가 배양 또는 분화되는 인서트 모듈(상술한 제1 인서트 모듈(1)), 간 세포가 배양 또는 분화되는 인서트 모듈(상술한 제2 인서트 모듈(1)) 및 지방 세포가 배양 또는 분화되는 인서트 모듈(제3 인서트 모듈(1))을 칩(2)에 삽입 배치하여 모듈 결합 칩을 형성하고, S700 단계에서 장 세포, 간 세포 및 지방 세포를 공배양할 수 있다. 이러한 장 세포 - 간 세포 - 지방 세포의 조합을 갖는 다중 장기 미세유체 칩 구조체에 따르면, 장 세포 - 간 세포 - 지방 세포의 조합에 의해, 장 세포를 통해 유입된 외부 물질에 의한 지방 세포의 adipokine이 확인되거나 지방 축적량의 변화가 확인될 수 있다. 예시적으로, 본원의 일 구현예에 따르면, 채널(224)을 통해 제1 리저버(24), 장 세포에 대응하는 제1 인서트, 간 세포에 대응하는 제2 인서트, 지방 세포에 대응하는 제3 인서트, 제2 리저버(26)의 순으로 각 구성들이 연결될 수 있다.
또한, S700 단계에서, 복수의 인서트 모듈(1) 각각의 상부 링(12)의 중공부(121)에 공급되는 배지의 성분 및 양은, 복수의 인서트 모듈(1) 각각에서 배양되는 세포별 배양 요구조건을 고려하여 개별적으로 조절될 수 있다. 예를 들어, S700 단계에서, 배양되는 세포가 공기에 노출되는 조건을 충족해야 하는 세포 배양에 대응하는 인서트 모듈(1)의 경우, 상부 링(12)의 중공부(121)에 공급되는 배지의 양을 0으로 설정할 수 있다.
다시 말해, S700 단계는 여러 종류의 세포를 공 배양하는 과정에서, 각 세포의 배양 요구조건을 인서트 모듈(1)별로 각각 맞춰 조절해줄 수 있다. 예를 들어, 인서트 모듈(1)에 배양한 각 세포가 필요로 하는 배지 성분이 다를 경우, 해당 세포 배양 영역(해당 세포가 배양되는 인서트 모듈(1))에 필요로 하는 특정 배지 성분을 넣어줄 수 있다. 또는 세포 별로 필요로 하는 윗면 배지의 높이가 다를 수 있는데, 이러한 경우, 각 세포배양영역(인서트 모듈(1))에 첨가하는 배지 높이를 조절하여줄 수 있다. 이를 테면, 도 9에는, 3시 방향의 챔버(25)에 위치하는 인서트 모듈(1)에서 배양되는 세포 1(93) 및 9시 방향의 챔버(25)에 위치하는 인서트 모듈(1) 각각에는 세포 1(93)가 배지에서 배양 또는 분화되는 반면, 세포 1(93)이 배양되는 인서트 모듈(1)과 세포 3(91)이 배양되는 인서트 모듈(1) 사이의 인서트 모듈(1)의 세포 2(92)는 공기에 노출된 상태로 도시되었는데, 이는 세포 2(92)가 공기에 노출될 필요가 있을 수 있기 때문이다. 예를 들어, 피부 세포 중 표피세포의 경우, 인서트 상층부(상부 링의 중공부)의 배지가 0으로 설정되는 환경(공기와 접촉되는 환경)에서 분화가 가능할 수 있다. 이에 따라, 표피세포는 도 9에 도시된 세포 2(92)와 같이 공기에 노출된 상태로 공배양될 수 있다.
상술한 바에 따르면, 본 방법은 각기 다른 3가지(이상)의 세포를 한 공간 내에서 별도로 공동배양하되 배지가 교환될 수 있도록 연결하여 상호작용과 약물에 대한 반응을 모사하기 위한 미세 유체 칩의 설계와 제작을 위한 방법에 관한 것일 수 있다. 다른 종류의 세포는 별도의 배양 영역에서 배양될 수도 있고, 1개의 배양영역에 같이 배양될 수도 있다. 예를 들어 장세포와 간세포는 별도의 인서트 모듈(1)(공간)에 배양될 수 있고, 장세포와 혈관세포는 같은 인서트 모듈(1)(공간)에서 배양될 수 있다.
또한, 본 방법은 칩(2)과 분리된 별도의 인서트 모듈(1)에서 각기 다른 종류의 세포를 분주하고 배양하면서 분화를 유도하고, 이를 공동배양을 위해 칩(2)으로 이동하여 배양하면서 배지 등 배양 조건을 적절하게 조성하여 건강한 분화상태를 유지할 수 있다.
또한, 본 방법에 의하면, 각 장기에서 유래한 세포의 분화 상태를 유지하기 위해 각기 다른 배지의 종류와 양, 배지와 공기의 비율 등을 조절해서 유지할 수 있다.
상술한 과정에 의해 필요로 하는 모든 종류의 세포가 갖추어지면, 복수의 인서트 모듈(1)을 연결하는 채널(224)에 배지를 공급하며 필요한 실험이 수행될 수 있다. 예를 들어, 약물에 대한 반응 평가가 실험으로 수행될 수 있다.
정리하면, 본 방법은, 기존의 완성된 세포 배양방식 또는 이를 변형한 방식으로 인체 장기를 구성하는 다양한 세포를 각각의 인서트 모듈(1)에 배양하고, 각 조직이 완성된 후에 미세유체 칩(칩(2)에 인서트 모듈(1)을 삽입하여 공 배양할 수 있다. 칩(2)은 각각의 세포(각각의 세포가 배양된 인서트 모듈(1))를 고정함과 동시에 내부에 구성되어있는 유체 채널(224)을 통해 혈관과 유사하게 연결해주는 역할을 할 수 있다.
다시 말해, 본 방법은, 개별적으로 다른 장기에서 유래한 세포(상술한 내용에서는 장, 간, 대식세포, 지방세포를 예로 들었음)를 별도로 배양 및 분화한 후, 칩(2)에서 공배양(같이 배양)하면서 분화상태가 유지되도록 공 배양조건을 조성하여, 약물, 식품 성분 등 외부 물질의 투여 후 일어나는 반응을 관찰할 수 있다.
이를 위해, 본 방법은 분리된 모듈인 인서트 모듈(1)에서 개별적으로 조직을 배양 및 분화한 후, 각 인서트 모듈(1)을 합친 후에, 장기들 사이의 상호작용을 유지하면서 일정 기간 공 배양을 할 수 있는데, 이 기간 동안 (최소 1일에서 최대 1주일 정도) 각 조직의 분화상태를 유지할 수 있고, 이를 위해 각 조직별 배지 양과 종류가 적절하게 유지되도록 칩(2)이 설계할 수 있으며, 이를 위해 필요한 경우 각 장기의 인서트 모듈(1)별로 별도의 배지성분이 유지할 수 있고, 각 인서트 모듈(1)별로 적절한 배지의 공급양이 조절될 수 있다.
이에 따라, 본 방법에 의하면, 각 장기를 구현하는 인서트 모듈(1)을 연결하는 동시에, 각 세포의 분화상태를 유지할 수 있도록 배지의 공급과 유지를 가능하게 설계되는 다중 장기 미세유체 칩 구조체가 구현될 수 있다.
참고로, 본원은 장, 간세포, 면역세포를 이용한 구성을 예로 들어 본 방법을 설명하였으나, 본원은 장, 간, 심장, 신장, 뇌신경, 면역세포 등 인체를 구성하는 다양한 장기에서 유래한 모든 세포의 배양에 적용 가능하다.
이에 따라, 본원에 의한 다중 장기 미세유체 칩 구조체는 in vitro 실험 모델로서 여러 가지 종류의 세포 (예를 들어 장세포와 간세포, 대식세포)의 동시 공배양이 가능한 미세유체 칩이며, 모듈형 다중장기 칩(modular multi-organ chip)이라고 명해질 수 있다.
또한, 상술한 바에 따르면, 본 방법은, 두 가지 이상의 장기를 한 칩에 공동 배양하여 장기 사이의 상호작용을 구현할 수 있다. 예를 들어 본 방법에 따른 다중 장기 미세유체 칩 구조체는, 약물이나 음식물 성분이 구강을 통해 섭취되었을 때 장과 간에 미치는 영향을 확인하는 모델로 사용될 수 있다(예를 들어 지방간 또는 간 경변). 또한 본 방법에 따른 다중 장기 미세유체 칩 구조체는, 장과 간, 혈관에서의 염증 반응이 간 질환의 발병 과정에 미치는 영향을 평가하기 위한 모델로도 사용될 수 있다.
정리하면, 본 방법에 의하면, 실제 인체 조직의 3차원적인 구조와 장기간의 상호작용을 모사하는 다중 장기 미세유체 칩 구조체가 구현될 수 있으므로, 다양한 질환 모델을 통한 새로운 치료제 및 치료법의 개발 등이 가능해질 수 있다.
또한, 본 방법에 의한 다중 장기 미세유체 칩 구조체는 식생활 및 생활습관으로 인한 장기적인 장, 간의 염증 반응 등 기존 실험 모델로 구현이 불가능했던 장기 사이의 생리적인 현상을 인공적으로 구현할 수 있고, 기전을 연구하는데 활용이 가능하다.
또한, 본 방법에 의한 다중 장기 미세유체 칩 구조체는, 약물, 치료제 개발 시 개발 비용 감축과 동물실험에서 발생했던 윤리적 문제점들을 해결 또는 보완할 수 있다.
구체적으로, 지방간은 간에 지방이 과도하게 축적되는 질병으로, 과도한 알콜 또는 영양분의 섭취로 인해 일어나는 걸로 생각되며, 비만이나 당뇨와 같은 대사질환과 동반되어 일어나는 경우가 많고, 지방간의 발병 과정은 일반적으로 ‘two-hit process’로 설명되는데, 이때 간에 지방에 과다하게 쌓여 발생하는 지방간 (first hit)으로부터 간에 직접적인 손상을 입히는 간경변까지로의 진행 과정(second hit)에서 염증 반응이 중요하게 관여한다는 증거들이 보고되고 있다. 이러한 간 질환에 대한 구체적인 기전은 밝혀지지 않고 있으며 동물이나 인체를 이용한 임상 실험으로는 정확한 기전을 밝혀내기 힘들기 때문에 장-간 면역반응을 재현할 수 있는 in vitro 실험모델이 필요한데, 이러한 임상 실험의 in vitro 실험모델로 본 방법에 의한 다중 장기 미세유체 칩 구조체가 적용될 수 있다.
또한, 대표적인 대사질환인 2형 당뇨병의 경우, 췌장에서의 인슐린 분비 감소, 근육, 간, 지방조직 등에서의 인슐린 저항성, 여러 조직에서의 염증 반응 등 다양한 장기에서의 반응이 관여한다고 알려져 있는데, 이러한 전신질환은 연구하기 위한 실험모델이 존재하지 않기 때문에 기전 연구에 어려움이 있다. 이러한 연구의 실험모델로 본 방법에 의한 다중 장기 미세유체 칩 구조체가 적용될 수 있다.
또한, 최근 새롭게 각광받고 있는 항암 면역치료제의 경우, 암세포 또는 암조직에 직접적으로 작용하는 것이 아니고, 면역세포를 자극하여 암세포를 공격하는 방식으로, 암세포와 주변 조직, 혈관 및 림프관, 면역세포 들과의 상관관계가 중요한데, 이를 위한 연구의 실험모델로 본 방법에 의한 다중 장기 미세유체 칩 구조체가 적용될 수 있다.
한편 이하에서는, 전술한 본 방법에 의해 제조되는 본원의 일 실시예에 따른 다중 장기 미세유체 칩 구조체(이하 '본 칩 구조체'라 함)에 대해 설명한다. 다만, 앞서 살핀 본 방법에서 설명한 구성과 동일 또는 유사한 구성에 대해서는 동일한 도면부호를 사용하고, 중복되는 설명은 간략히 하거나 생략하기로 한다.
본 칩 구조체는, 각각에서 세포가 배양된 복수의 인서트 모듈(1)을 포함한다.
인서트 모듈(1)은 하부 링(11)을 포함할 수 있다. 하부 링(11)의 내측에 중공부(111)가 형성될 수 있다. 또한, 인서트 모듈(1)은 중공부(121)가 하부 링(11)의 중공부(111)와 통하도록 하부 링(11)의 상측에 배치되는 상부 링(12)을 포함할 수 있다. 또한, 인서트 모듈(1)은 하부 링(11)과 상부 링(12) 사이에 개재되는 다공성 멤브레인(13)을 포함할 수 있다.
또한, 본 칩 구조체는, 복수의 인서트 모듈(1)의 삽입 배치가 가능한 칩(2)을 포함한다.
칩(2)은 제1 리저버(24)를 포함할 수 있다. 또한, 칩(2)은 복수의 챔버(25)를 포함할 수 있다. 복수의 챔버(25)는 복수의 인서트 모듈(1) 각각을 삽입 배치 가능하도록 상측이 개구된 상태로 하향 함몰 형성될 수 있다. 예를 들어, 챔버(25)에는 삽입되는 인서트 모듈(1)의 하부 링(11)이 안착되는 안착면(2121) 및 삽입되는 인서트 모듈(1)의 하부 링(11)의 중공부(111)와 통하는 바닥공간(222)을 형성하도록 안착면(2121)보다 하향 함몰되는 바닥면(231)이 형성될 수 있다. 또한, 칩(2)은 제2 리저버(26)를 포함할 수 있다. 또한, 칩(2)은 채널(224)을 포함할 수 있다. 채널(224)은 제1 리저버(24)와 복수의 챔버(25)와 제2 리저버(26)를 연결할 수 있다. 또한, 채널(224)은 복수의 챔버(25) 각각의 바닥공간(222)에 대하여 연결될 수 있다.
예를 들어, 칩(2)은 베이스판(23), 베이스판(23) 상에 배치되는 하판(22) 및 하판(22) 상에 배치되는 상판(21)을 포함할 수 있다. 하판(22)에는 제1 리저버(24)의 하부공간에 대응하는 제1 하부 홀(221)이 형성될 수 있고, 상판(21)에는 제1 리저버(24)의 상부공간에 대응하여 제1 하부 홀(221)과 통과하는 제1 상부 홀(231)이 형성될 수 있다. 또한, 하판(22)에는 복수의 챔버(25)의 바닥공간(222)에 대응하는 복수의 바닥 홀(222)이 형성될 수 있고, 상판(21)에는 안착면(2121)이 형성되도록 함몰되되 안착면(2121)의 중간에 복수의 바닥 홀(222)과 통하는 연통 홀(2122)이 형성되는 모듈 안착부(212)가 형성될 수 있다. 또한, 하판(22)에는 제2 리저버(26)의 하부공간에 대응하는 제2 하부 홀(223)이 형성되고, 상판(21)에는 제2 리저버(26)의 상부공간에 대응하여 제2 하부 홀(223)과 통하는 제2 상부 홀(213)이 형성될 수 있다. 또한, 하판(22)에는 제1 하부 홀(221)과 바닥 홀(222)과 제2 하부 홀(223)을 연결하는 채널(224)에 대응하는 홈 또는 홀이 형성될 수 있다.
이하에서는, 복수의 인서트 모듈(1)에서의 세포 배양과 관련하여 설명한다.
예를 들어, 외부환경과 맞닿는 장벽 기능을 하는 세포의 배양에 대응하는 제1 인서트 모듈(1)의 경우, 배양된 세포가 다공성 멤브레인(13) 상에 적어도 한 층의 막을 형성하도록 세포 배양이 수행될 수 있다.
구체적으로, 제1 인서트 모듈(1)에서 배양되는 세포가 장 세포인 경우, 제1 인서트 모듈(1)은, Caco-2 세포가 부유된 배지에 의해 다공성 멤브레인(13)에 Caco-2 세포가 시딩되고 배지가 채워지며, 소정의 시간 동안 인큐베이터(incubator)에 보관된 후 다공성 멤브레인(13) 상의 배지가 적어도 일부 교환되어 배지를 채운6 well cell culture plate 에서 배양된 것일 수 있다.
또한, 3차원 구조를 갖는 조직세포 또는 다른 조직과 섞여 존재하는 세포의 배양에 대응하는 제2 인서트 모듈의 경우, 배양된 세포가 다공성 멤브레인(13) 위를 적어도 70% 이상을 채우도록 세포 배양이 수행될 수 있다.
구체적으로, 제2 인서트 모듈(1)에서 배양되는 세포가 간 세포인 경우, 제2 인서트 모듈(1)은, HepG2세포가 부유된 배지에 의해 다공성 멤브레인(13)에 HepG2 세포가 시딩되고 배지가 채워지며, 소정의 시간 동안 인큐베이터(incubator)에 보관된 후 다공성 멤브레인(13) 상의 배지가 적어도 일부 교환되어 배지를 채운6 well cell culture plate 에서 배양된 것일 수 있다.
또한, 제2 인서트 모듈(1)에서 배양되는 세포가 대식 세포인 경우, 제2 인서트 모듈(1)은, raw264.7 세포가 부유된 배지에 의해 다공성 멤브레인(13)에 raw264.7 세포가 시딩되고 배지가 채워지며, 소정의 시간 동안 인큐베이터(incubator)에 보관된 후 다공성 멤브레인(13) 상의 배지가 적어도 일부 교환되어 배지를 채운6 well cell culture plate 에서 배양된 것일 수 있다.
또한, 별도의 분화과정이 필요한 세포의 배양에 대응하는 제3 인서트 모듈(1)의 경우, 배양된 세포가 미리 설정된 분화 과정을 거쳐 분화된 세포를 형성하도록 세포 배양이 수행될 수 있다.
제3 인서트 모듈(1)에서 배양되는 세포가 지방 세포인 경우, 3T3-L1 세포가 부유된 배지에 의해 제3 인서트 모듈(1)의 다공성 멤브레인(13)의 상면에 3T3-L1 세포가 시딩되고 배지를 채워진 제3 인서트 모듈(1)이 소정의 시간 동안 인큐베이터에 보관된 후, 제3 인서트 모듈(1)의 다공성 멤브레인(13) 상의 배지가 적어도 일부 교환되어, 배지를 채운 6 well cell culture plate 에서 배양되고, 그의 배지가 교체되며 분화가 진행된 것일 수 있다.
또한, 본 칩 구조체는, 칩(2)에 복수의 인서트 모듈(1)이 삽입되어 모듈 결합 칩이 형성되고, 장기가 다중으로 모사된 다중 장기 미세유체 칩 구조체를 형성하도록 모듈 결합 칩에 대해 공 배양이 진행되어 형성된다.
공 배양시, 복수의 인서트 모듈(1) 각각의 상부 링(12)의 중공부(121)에 공급되는 배지의 성분 및 양은, 복수의 인서트 모듈(1) 각각에서 배양되는 세포별 배양 요구조건을 고려하여 개별적으로 조절될 수 있다. 예를 들어, S700 단계에서, 배양되는 세포가 공기에 노출되는 조건을 충족해야 하는 세포 배양에 대응하는 인서트 모듈(1)의 경우, 상부 링(12)의 중공부(121)에 공급되는 배지의 양을 0으로 설정될 수 있다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
1: 인서트 모듈
11: 하부 링
111: 중공부
112: 나사 구멍
12: 상부 링
121: 중공부
122: 나사 구멍
13: 멤브레인
2: 칩
21: 상판
212: 모듈 안착부
2121: 안착면
22: 하판
221: 제1 하부 홀
222: 바닥 홀
223: 제2 하부 홀
224: 채널
23: 베이스판
24: 제1 리저버
25: 챔버
26: 제2 리저버
91: 세포 1
92: 세포 2
93: 세포 3
11: 하부 링
111: 중공부
112: 나사 구멍
12: 상부 링
121: 중공부
122: 나사 구멍
13: 멤브레인
2: 칩
21: 상판
212: 모듈 안착부
2121: 안착면
22: 하판
221: 제1 하부 홀
222: 바닥 홀
223: 제2 하부 홀
224: 채널
23: 베이스판
24: 제1 리저버
25: 챔버
26: 제2 리저버
91: 세포 1
92: 세포 2
93: 세포 3
Claims (24)
- 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법으로서,
(a) 복수의 인서트 모듈을 준비하고, 상기 복수의 인서트 모듈의 삽입 배치가 가능한 칩을 준비하는 단계;
(b) 상기 복수의 인서트 모듈 각각에서 세포를 배양하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계 이후에 상기 복수의 인서트 모듈을 상기 칩에 삽입 배치하여 모듈 결합 칩을 형성하는 단계; 및
(d) 장기가 다중으로 모사된 다중 장기 미세유체 칩 구조체를 형성하도록 상기 모듈 결합 칩에 대해 공 배양을 진행하는 단계를 포함하되,
상기 인서트 모듈은,
내측에 중공부가 형성되는 하부 링;
중공부가 상기 하부 링의 중공부와 통하도록 상기 하부 링의 상측에 배치되는 상부 링; 및
상기 하부 링과 상기 상부 링 사이에 개재되는 다공성 멤브레인을 포함하고,
상기 (b) 단계에서의 세포 배양은 상기 다공성 멤브레인 상에서 진행되며,
상기 (d) 단계에서,
상기 복수의 인서트 모듈 각각의 상부 링의 중공부에 공급되는 배지의 성분 및 양은, 상기 복수의 인서트 모듈 각각에서 배양되는 세포별 배양 요구조건을 고려하여 개별적으로 조절되는 것인, 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 칩은,
제1 리저버;
상기 복수의 인서트 모듈 각각을 삽입 배치 가능하도록 상측이 개구된 상태로 하향 함몰 형성되는 복수의 챔버;
제2 리저버; 및
상기 제1 리저버와 상기 복수의 챔버와 상기 제2 리저버 사이에서 유체의 이동이 가능하도록 상기 제1 리저버와 상기 복수의 챔버와 상기 제2 리저버를 연결하는 채널을 포함하는 것인, 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법. - 제3항에 있어서,
상기 챔버에는, 삽입되는 인서트 모듈의 하부 링이 안착되는 안착면(2121) 및 상기 삽입되는 인서트 모듈의 하부 링의 중공부와 통하는 바닥공간(222)을 형성하도록 상기 안착면보다 하향 함몰되는 바닥면이 형성되고,
상기 채널은 상기 복수의 챔버 각각의 바닥공간에 대하여 연결되는 것인, 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법. - 제4항에 있어서,
상기 칩은 베이스판, 상기 베이스판 상에 배치되는 하판, 및 상기 하판 상에 배치되는 상판을 포함하고,
상기 하판에는, 상기 제1 리저버의 하부공간에 대응하는 제1 하부 홀, 상기 복수의 챔버의 바닥공간에 대응하는 복수의 바닥 홀, 상기 제2 리저버의 하부공간에 대응하는 제2 하부 홀, 및 상기 제1 하부 홀과 상기 복수의 바닥 홀과 상기 제2 하부 홀을 연결하는 채널에 대응하는 홈 또는 홀이 형성되고,
상기 상판에는, 상기 제1 리저버의 상부공간에 대응하여 상기 제1 하부 홀과 통하는 제1 상부 홀, 상기 안착면이 형성되도록 함몰되되 상기 안착면의 중간에 상기 복수의 바닥 홀과 통하는 연통 홀이 형성되는 모듈 안착부 및 상기 제2 리저버의 상부공간에 대응하여 상기 제2 하부 홀과 통하는 제2 상부 홀이 형성되는 것인, 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법. - 제1항에 있어서,
상기 (b) 단계에서,
외부환경과 맞닿는 장벽 기능을 하는 세포의 배양에 대응하는 제1 인서트 모듈에서는, 배양된 세포가 상기 다공성 멤브레인 상에 적어도 한 층의 막을 형성하도록 세포 배양이 수행되고,
3차원 구조를 갖는 조직세포 또는 다른 조직과 섞여 존재하는 세포의 배양에 대응하는 제2 인서트 모듈의 경우, 배양된 세포가 상기 다공성 멤브레인 위를 적어도 70% 이상을 채우도록 세포 배양이 수행되고,
별도의 분화과정이 필요한 세포의 배양에 대응하는 제3 인서트 모듈의 경우, 배양된 세포가 미리 설정된 분화 과정을 거쳐 분화된 세포를 형성하도록 세포 배양이 수행되는 것인, 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법. - 제6항에 있어서,
상기 제1 인서트 모듈에서 배양되는 세포는 장 세포이고,
상기 (b) 단계는,
Caco-2 세포가 부유된 배지를 사용하여 상기 제1 인서트 모듈의 다공성 멤브레인의 상면에 Caco-2 세포를 시딩하고 배지를 채우는 단계;
상기 제1 인서트 모듈을 소정의 시간 동안 인큐베이터에 보관한 후 상기 제1 인서트 모듈의 다공성 멤브레인 상의 배지를 적어도 일부 교환하는 단계; 및
배지를 채운 6 well cell culture plate에서 상기 제1 인서트 모듈을 배양하는 단계를 포함하는 것인, 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법. - 제6항에 있어서,
상기 제2 인서트 모듈에서 배양되는 세포는 간 세포이고,
상기 (b) 단계는,
HepG2 세포가 부유된 배지를 사용하여 상기 제2 인서트 모듈의 다공성 멤브레인의 상면에 HepG2 세포를 시딩하고 배지를 채우는 단계;
상기 제2 인서트 모듈을 소정의 시간 동안 인큐베이터에 보관한 후 상기 제2 인서트 모듈의 다공성 멤브레인 상의 배지를 적어도 일부 교환하는 단계; 및
배지를 채운 6 well cell culture plate에서 상기 제2 인서트 모듈을 배양하는 단계를 포함하는 것인, 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법. - 제6항에 있어서,
상기 제2 인서트 모듈에서 배양되는 세포는 대식 세포이고,
상기 (b) 단계는,
raw264.7 세포가 부유된 배지를 사용하여 상기 제2 인서트 모듈의 다공성 멤브레인의 상면에 raw264.7 세포를 시딩하고 배지를 채우는 단계;
상기 제2 인서트 모듈을 소정의 시간 동안 인큐베이터에 보관한 후 상기 제2 인서트 모듈의 다공성 멤브레인 상의 배지를 적어도 일부 교환하는 단계; 및
배지를 채운 6 well cell culture plate에서 상기 제2 인서트 모듈을 배양하는 단계를 포함하는 것인, 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법. - 제6항에 있어서,
상기 제3 인서트 모듈에서 배양되는 세포는 지방 세포이고,
상기 (b) 단계는,
3T3-L1 세포가 부유된 배지를 사용하여 상기 제3 인서트 모듈의 다공성 멤브레인의 상면에 3T3-L1 세포를 시딩하고 배지를 채우는 단계;
상기 제3 인서트 모듈을 소정의 시간 동안 인큐베이터에 보관한 후 상기 제3 인서트 모듈의 다공성 멤브레인 상의 배지를 적어도 일부 교환하는 단계;
배지를 채운 6 well cell culture plate에서 상기 제3 인서트 모듈을 배양하는 단계; 및
상기 제3 인서트 모듈의 배치를 교체하며 분화를 진행하는 단계를 포함하는 것인, 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 (d) 단계에서,
배양되는 세포가 공기에 노출되는 조건을 충족해야 하는 세포 배양에 대응하는 인서트 모듈의 경우, 상부 링의 중공부에 공급되는 배지의 양을 0으로 설정하는 것인, 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법. - 다중 장기 미세유체 칩 구조체로서,
각각에서 세포가 배양된 복수의 인서트 모듈; 및
상기 복수의 인서트 모듈의 삽입 배치가 가능한 칩을 포함하되,
상기 칩에 상기 복수의 인서트 모듈이 삽입되어 모듈 결합 칩을 형성하고,
장기가 다중으로 모사된 다중 장기 미세유체 칩 구조체를 형성하도록 상기 모듈 결합 칩에 대해 공 배양을 진행하여 상기 다중 장기 미세유체 칩 구조체가 형성되고,
상기 인서트 모듈은,
내측에 중공부가 형성되는 하부 링;
중공부가 상기 하부 링의 중공부와 통하도록 상기 하부 링의 상측에 배치되는 상부 링; 및
상기 하부 링과 상기 상부 링 사이에 개재되는 다공성 멤브레인을 포함하고,
상기 다공성 멤브레인 상에서 세포가 배양되며,
상기 복수의 인서트 모듈 각각의 상부 링의 중공부에 공급되는 배지의 성분 및 양은, 상기 복수의 인서트 모듈 각각에서 배양되는 세포별 배양 요구조건을 고려하여 개별적으로 조절되며 상기 모듈 결합 칩에 대해 공 배양이 진행되는 것인, 다중 장기 미세유체 칩 구조체. - 삭제
- 제13항에 있어서,
상기 칩은,
제1 리저버;
상기 복수의 인서트 모듈 각각을 삽입 배치 가능하도록 상측이 개구된 상태로 하향 함몰 형성되는 복수의 챔버;
제2 리저버; 및
상기 제1 리저버와 상기 복수의 챔버와 상기 제2 리저버 사이에서 유체의 이동이 가능하도록 상기 제1 리저버와 상기 복수의 챔버와 상기 제2 리저버를 연결하는 채널을 포함하는 것인, 다중 장기 미세유체 칩 구조체. - 제15항에 있어서,
상기 챔버에는, 삽입되는 인서트 모듈의 하부 링이 안착되는 안착면 및 상기 삽입되는 인서트 모듈의 하부 링의 중공부와 통하는 바닥공간을 형성하도록 상기 안착면보다 하향 함몰되는 바닥면이 형성되고,
상기 채널은 상기 복수의 챔버 각각의 바닥공간에 대하여 연결되는 것인, 다중 장기 미세유체 칩 구조체. - 제16항에 있어서,
상기 챔버는 베이스판, 상기 베이스판 상에 배치되는 하판, 및 상기 하판 상에 배치되는 상판을 포함하고,
상기 하판에는, 상기 제1 리저버의 하부공간에 대응하는 제1 하부 홀, 상기 복수의 챔버의 바닥공간에 대응하는 복수의 바닥 홀, 상기 제2 리저버의 하부공간에 대응하는 제2 하부 홀, 및 상기 제1 하부 홀과 상기 복수의 바닥 홀과 상기 제2 하부 홀을 연결하는 채널에 대응하는 홈 또는 홀이 형성되고,
상기 상판에는, 상기 제1 리저버의 상부공간에 대응하여 상기 제1 하부 홀과 통하는 제1 상부 홀, 상기 안착면이 형성되도록 함몰되되 상기 안착면의 중간에 상기 복수의 바닥 홀과 통하는 연통 홀이 형성되는 모듈 안착부. 및 상기 제2 리저버의 상부공간에 대응하여 상기 제2 하부 홀과 통하는 제2 상부 홀이 형성되는 것인, 다중 장기 미세유체 칩 구조체. - 제13항에 있어서,
외부환경과 맞닿는 장벽 기능을 하는 세포의 배양에 대응하는 제1 인서트 모듈에서는, 배양된 세포가 상기 다공성 멤브레인 상에 적어도 한 층의 막을 형성하도록 세포 배양이 수행되고,
3차원 구조를 갖는 조직세포 또는 다른 조직과 섞여 존재하는 세포의 배양에 대응하는 제2 인서트 모듈의 경우, 배양된 세포가 상기 다공성 멤브레인 위를 적어도 70% 이상을 채우도록 세포 배양이 수행되고,
별도의 분화과정이 필요한 세포의 배양에 대응하는 제3 인서트 모듈의 경우, 배양된 세포가 미리 설정된 분화 과정을 거쳐 분화된 세포를 형성하도록 세포 배양이 수행되는 것인, 다중 장기 미세유체 칩 구조체. - 제18항에 있어서,
상기 제1 인서트 모듈에서 배양되는 세포는 장 세포이고,
상기 제1 인서트 모듈은, Caco-2 세포가 부유된 배지에 의해 상기 제1 인서트 모듈의 다공성 멤브레인의 상면에 Caco-2 세포가 시딩되고 배지가 채워지며, 소정의 시간 동안 인큐베이터에 보관된 후, 상기 제1 인서트 모듈의 다공성 멤브레인 상의 배지가 적어도 일부 교환되어, 배지를 채운 6 well cell culture plate에서 배양된 것인, 다중 장기 미세유체 칩 구조체. - 제18항에 있어서,
상기 제2 인서트 모듈에서 배양되는 세포는 간 세포이고,
상기 제2 인서트 모듈은, HepG2 세포가 부유된 배지에 의해 상기 제2 인서트 모듈의 다공성 멤브레인의 상면에 HepG2 세포가 시딩되고 배지가 채워지며, 소정의 시간 동안 인큐베이터에 보관된 후 상기 제2 인서트 모듈의 다공성 멤브레인 상의 배지가 적어도 일부 교환되어, 배지를 채운 6 well cell culture plate에서 배양된 것인, 다중 장기 미세유체 칩 구조체. - 제18항에 있어서,
상기 제2 인서트 모듈에서 배양되는 세포는 대식 세포이고,
상기 제2 인서트 모듈은, raw264.7 세포가 부유된 배지에 의해 상기 제2 인서트 모듈의 다공성 멤브레인의 상면에 raw264.7 세포가 시딩되고 배지가 채워진 상기 제2 인서트 모듈이 소정의 시간 동안 인큐베이터에 보관된 후 상기 제2 인서트 모듈의 다공성 멤브레인 상의 배지가 적어도 일부 교환되어, 배지를 채운 6 well cell culture plate에서 배양된 것인, 다중 장기 미세유체 칩 구조체. - 제18항에 있어서,
상기 제3 인서트 모듈에서 배양되는 세포는 지방 세포이고,
상기 제3 인서트 모듈은, 3T3-L1 세포가 부유된 배지에 의해 상기 제3 인서트 모듈의 다공성 멤브레인의 상면에 3T3-L1 세포가 시딩되고 배지가 채워진 상기 제3 인서트 모듈이 소정의 시간 동안 인큐베이터에 보관된 후 상기 제3 인서트 모듈의 다공성 멤브레인 상의 배지가 적어도 일부 교환되어, 배지를 채운 6 well cell culture plate에서 배양되고, 상기 제3 인서트 모듈의 배치가 교체되며 분화가 진행된 것인, 다중 장기 미세유체 칩 구조체. - 삭제
- 제13항에 있어서,
배양되는 세포가 공기에 노출되는 조건을 충족해야 하는 세포 배양에 대응하는 인서트 모듈의 경우, 상부 링의 중공부에 공급되는 배지의 양이 0으로 설정되어 상기 모듈 결합 칩에 대해 공 배양이 진행되는 것인, 다중 장기 미세유체 칩 구조체.
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