CN114525208A - 一种肠器官仿生芯片 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肠器官仿生芯片，包括三层依次叠放的基片固定成的整体，其中底层基片、中层基片和上层基片均为聚二甲基硅氧烷材质，上层基片两侧分别开设有注液孔和排液孔，注液孔和排液孔对应中层基片与上层基片之间开设有多条微流通道，中层基片对应各个微流通道均开设有用于培养肠器官的培养室，底层基片对应培养室的位置通过刻蚀作用形成磨砂层。具有便携性的特点，尺寸比较小，高通量，用于多组检测数据，模拟体内的生理学微环境环境，便于肠细胞三维培养、显微观察和生化分子检测，一次性获得多组数据。

Description

一种肠器官仿生芯片

技术领域

本发明属于器官芯片的技术领域，特别是涉及一种肠器官仿生芯片。

背景技术

临床试验数据证实，直肠癌类器官(RCO)密切再现了相应肿瘤的病理生理学和遗传变化。患者的放化疗反应与RCO反应高度匹配，准确率为84.43％，敏感性为78.01％，特异性为91.97％。这些数据表明，患者延伸类器官可以预测临床上晚期直肠癌患者的反应，并可能代表直肠癌治疗中的辅助诊断工具。所以可以通过器官芯片对直肠癌细胞进行培养，得到人体类环境条件下的直肠癌器官，用于药物的检测，通过体外器官的培养，实现高通量药物实验，找到患者最佳的用药方式。

过程首先是获得原发性直肠癌组织，组织小于3mm的活检组织用于直肠癌类器官的生成，置于冷PBS中，加入常霉素和庆大霉素/两性素B，并在冰箱中运输至实验室进行肿瘤细胞分离和培养。用青霉素/链霉素在冷PBS中洗涤5分钟，然后在冰上无菌盘中切碎成小碎片，将组织碎片置于含有7mL DMEM培养基、500U/mL胶原酶IV、1.5mg/mL胶原酶II、20mg/mL透明质酸酶、0.1mg/mL二型dispase、10mM RHOK抑制剂ly27632的8mL消化培养基中进行酶消化和1％胎牛血清在37摄氏度的眼窝摇瓶上放置30-60分钟。在300-500g离心5分钟后收集肿瘤细胞，在37℃和5％CO₂培养箱中培养5-8分钟后，通过溶液的形式转移至器官仿生芯片中，进行分化成为微器官，最后用于药物的药效检测。

针对于肠癌细胞，其对应的培养基每三天更新一次，在适当的时间观察和拍摄。通常，类有机物每1-2周传代一次。使用冷PBS轻轻地将RCOs从基质凝胶中机械移液传代。

现有肠器官仿生芯片，使用的材质基本是聚二甲基硅氧烷(PDMS)，其组分包括预聚体和固化剂，将两者按照一定比例混合后，在加热或常温条件下即可固化成具有一定弹性的固体，其优点是无毒，具有化学惰性、光学透性和成本低。其缺点也很明显，PDMS材料表面疏水，粘附性能低，肠细胞在培养腔中很难附着。

而且现有常规的器官仿生芯片，多是培养在多孔PDMS薄膜上形成了二维平面组织，随着生物材料的发展和加工技术的进步，人们开始在器官芯片上培育三维微组织，科研工作者将癌细胞收集在微流控芯片小室中，使其成形为三维癌细胞球，或采用悬挂液滴法制备三维细胞球，体内器官单元多为三维形貌，在器官芯片上构建三维微组织，其功能上与人体情况更为接近。

因此，本发明主要是根据肠癌细胞的培养特点，结合现有器官仿生芯片，制备出一种专门用于肠器官仿生的芯片，解决现有肠器官仿生芯片对于细胞附着力低，细胞很难在指定的培养室中培养的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肠器官仿生芯片，解决现有肠器官仿生芯片对于细胞附着力低，细胞很难在指定的培养室中培养的问题。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种肠器官仿生芯片，包括三层依次叠放的基片固定成的整体，其中底层基片为玻璃材质，中层基片和上层基片均为聚二甲基硅氧烷材质；

所述上层基片的平面侧，其对应的两侧分别开设有注液孔和排液孔，所述注液孔和排液孔均贯穿上层基片并延伸至中层基片，所述注液孔和排液孔对应中层基片与上层基片之间开设有多条微流通道，所述微流通道由上层基片和下层基片对应侧开设的槽体合拼而成，槽体截面为半圆形，所述微流通道用于连通排液孔和注液孔；

所述微流通道相互平行，并且由注液孔向排液孔方向延伸，所述中层基片对应各个微流通道均开设有用于培养肠器官的培养室，所述培养室贯穿中层基片，所述培养室成排设置，所述培养室的底部为底层基片，所述底层基片对应培养室的位置通过刻蚀作用形成磨砂层。

进一步地，芯片为矩形，所述底层基片对应的拐角处垂直固定有限位杆，所述中层基片和上层基片对应设置有供限位杆穿过的限位孔。

进一步地，包括用于检测的加药部件，所述加药部件呈条状，安装于芯片对应注液孔的一侧，所述加药部件对应注液孔的一侧开设有加药孔，所述加药孔与微流通道一一对应，所述加药孔连通有加药管，芯片对应注液孔的一侧开设有用于加药管插接的插槽，所述插槽开设于上层基片和中层基片之间，加药管插接插槽后延伸至微流通道中。

进一步地，所述插槽由上层基片和中层基片开设的槽体合拼而成，插槽的开口侧位于芯片的边侧。

进一步地，还包括封条，所述封条为条状，所述封条对应插槽的一侧具有密封塞，所述密封塞用于封堵插槽，使注液孔中营养液不会从插槽溢出，所述密封塞为柱状，垂直固定于封条。

进一步地，所述加药部件由上层板条和下层板条相互键合而成，上层板条和下层板条均为聚二甲基硅氧烷材质，采用激光刻蚀的方式形成加药孔和槽体，上层板条和下层板条对应的槽体合并后用于固定加药管。

培养过程是在人工条件下进行的，所以细胞所处的环境可以调控，如pH、温度、氧气浓度、二氧化碳浓度等，便于研究不同条件对细胞行为的影响。

至于传统的细胞体外培养，通常是将细胞培养在培养皿中，控制培养条件，随后观察细胞的生长、分化等行为。采用培养皿进行细胞培养操作简单，因此被广泛使用，但该方法的主要缺点在于无法提供细胞生长、分化所需的整体微环境，导致细胞和在体情况下的形态和功能具有较大的差异。

在体环境下，细胞通常会承受一些力、电等物理刺激，如人体呼吸过程中，肺泡会承受周期性的拉应力，神经细胞则会受到电刺激，而体外培养难以施加这些物理刺激。另外，体外培养的细胞在形态和结构上与在体也有较大差异。大多数细胞在体内会形成三维结构，而培养皿培养的细胞缺乏由细胞基质构成的立体支架，导致细胞只能贴壁生长形成二维结构，丧失了其在体内生长时的立体形态。

器官芯片的另一重要用途是进行人体的生理学研究，如可将多种细胞进行共培养，研究人体内多器官的相互作用，另外还可采用微纳技术在芯片上制造执行器，用来研究力、电等外界刺激对细胞的生长分化及功能的影响。利用器官芯片进行生理学研究和药物筛选的不同之处在于，需要构建正常生理状态的微组织模型。器官芯片可以认为是在微流控芯片上制备人类器官微缩模型。

本发明具有以下有益效果：

其具有便携性的特点，尺寸比较小，芯片上的孔和微流通道都在微米级，整个芯片的大小也就毫米或厘米级，节省材料、试剂并且降低功耗。高通量，器官芯片上开设有多条微流通道，每条微流通道均对应有培养室，对于同一个样品，同时可以培养多个器官，用于多组检测数据，相比传统的方法省时省力。本发明对应的微流通道是4个。模拟体内的物理环境，细胞所处的物理环境对细胞的生长分化有着重要的影响。本发明配备有单独的培养室，用于形成空间立体三维结构，细胞在培养室中吸附后悬浮培养，有利于产生拉压应力、流体剪切应力对细胞进行力学刺激，更好的模拟体内细胞微环境。便于观察和数字化处理，芯片为透明材质，可以通过拍照并通过图像处理的方式进行，一次性获得多组数据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍。

图1：本发明整体结构图。

图2：本发明拆解结构图。

图3：本发明底层基片结构图。

图4：本发明加药部件与芯片配合结构图。

图5：本发明加药部件与芯片配合结构图。

图6：本发明封条与芯片配合结构图。

图7：本发明加药部件拆解结构图。

附图中，各标号所代表的部件列表如下：

底层基片1、中层基片2、上层基片3、注液孔4、排液孔5、微流通道21、培养室22、磨砂层11、限位杆12、限位孔23、加药部件6、加药孔61、加药管62、插槽24、封条7、密封塞71、上层板条63、下层板条64。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

本发明中，需要理解的是：“开孔”、“上”、“下”、“厚度”、“顶”、“中”、“长度”、“内”、“四周”等指示方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的组件必须具有特定的方位。

如图1-3所示：一种肠器官仿生芯片，包括三层依次叠放的基片固定成的整体，其中底层基片1为玻璃材质，中层基片2和上层基片3均为聚二甲基硅氧烷材质；

所述上层基片3的平面侧，其对应的两侧分别开设有注液孔4和排液孔5，注液孔和排液孔均为圆柱状，所述注液孔4和排液孔5均贯穿上层基片3并延伸至中层基片2，并未贯穿中层基片，所述注液孔4和排液孔5对应中层基片2与上层基片3之间开设有多条微流通道21，所述微流通道21由上层基片3和下层基片2对应侧开设的槽体合拼而成，槽体截面为半圆形，所述微流通道21用于连通排液孔4和注液孔5；

所述微流通道21相互平行，并且由注液孔4向排液孔5方向延伸，类似阵列的方式并排。所述中层基片2对应各个微流通道21均开设有用于培养肠器官的培养室22，培养室为截面为方形，所述培养室22贯穿中层基片2，所述培养室22成排设置，所述培养室22的底部为底层基片1，所述底层基片1对应培养室22的位置通过刻蚀作用形成磨砂层11。

培养室用于种植并培养肠细胞，注液孔和排液孔起始阶段是注入含有肠细胞的培养液，让细胞液流入培养室，后续的作用主要是用于更换培养室中的营养液，营养液为细胞提供氧气和营养物质，排出代谢产物，经过一段时间的培养，细胞会形成具有功能的组织单元，该芯片就成为器官芯片。器官芯片的设计目的是模仿器官的结构和功能，成为一个体外模拟平台，最终构建正常模型进行生理学和药理学的研究。

关于本发明芯片的材质，其底层为普通的二氧化硅玻璃，中层和上层为聚二甲基硅氧烷，聚二甲基硅氧烷的组分又包括预聚体和固化剂，按照一定的比例混合，在加热或常温条件下即可固化形成有一定弹性的固定透明材质。其优点在于无毒，具有化学惰性、光学透性，同时可以根据原料配比调节刚性需求，其表面为疏水材质，在用于营养液输送的时候，不会受到内壁的吸附作用导致微流通道堵塞，减小泵的功率压力，但是不利于细胞的吸附作用，在起始阶段注入带有细胞的培养液的时候，细胞容易随着营养液的更换导致细胞流失。为了防止细胞流失导致的不利于细胞贴壁种植，在底层为玻璃材质的基片，玻璃的表面为亲水材质，有助于起始阶段细胞的贴壁种植，解决细胞流失的问题，很好的解决了聚二甲基硅氧烷材料生物兼容性的问题。同时为了更好的提高细胞的吸附性培养，在培养室中形成三维结构，在培养室底部对应的玻璃基片上，通过刻蚀的方式磨砂，形成不光滑的表面，表面积增大，同时在使用起始阶段，注入纤连蛋白或水凝胶材料，促进细胞的贴壁生长。

制备方式：中层基片和上层基片对应的槽体和培养室等，主要是通过激光刻蚀法进行加工，然后通过粘结剂将三层基片胶黏的方式键合封装在一起。其他的还可以通过热键合的方式，将芯片加热到一定温度，同时施加外力，使基片之间紧密接触，形成分子间的键合，但是没有粘结牢固。本发明的粘结剂主要是丙酮。

本发明芯片的使用过程：在使用前，通过注液孔向培养室中注入一定量的纤连蛋白比如I型胶原蛋白或水凝胶，静置5-10min，然后注入清水冲洗掉多余的纤连蛋白或水凝胶，保持微流通道畅通。然后注入带有肠细胞的培养液，注满培养室并且在排液孔有多余溶液溢出，放入培养箱中培养2天左右，然后往后每隔2-3天更换培养液，培养约三周左右，得到肠组织器官，可用于生理学试验和用药检测试验。由于更换营养液频繁，普通的器官仿生芯片容易在更换营养液的时候，由于细胞附着力差导致细胞流失，而本发明培养室为亲水性玻璃，同时玻璃表面磨砂处理，有助于细胞的附着并吸附。

如图3所示：芯片为矩形，所述底层基片1对应的拐角处垂直固定有限位杆12，所述中层基片2和上层基片3对应设置有供限位杆12穿过的限位孔23。用于定位叠加安装隔层基片，放置发生错位。

如图4-5所示：包括用于检测的加药部件6，所述加药部件6呈条状，安装于芯片对应注液孔4的一侧，所述加药部件6对应注液孔4的一侧开设有加药孔61，所述加药孔61与微流通道21一一对应，所述加药孔61连通有加药管62，芯片对应注液孔4的一侧开设有用于加药管62插接的插槽24，所述插槽24开设于上层基片3和中层基片2之间，加药管62插接插槽24后延伸至微流通道21中。加药部件为配套使用部件，用于针对不同的药剂检测，单独加药的需求，每个培养孔中的器官在同等培养条件下，可认为具有相同的理化性质，检测过程中涉及药物的添加比例和浓度，需要不同的加药孔。加药管一一对应微流通道，加药管的孔径微小于微流通道，匹配插接。

如图5所示：所述插槽24由上层基片3和中层基片2开设的槽体合拼而成，插槽24的开口侧位于芯片的边侧。插槽为微流通道的口径一致，在中层基片和上层基片制备的时候，统一通过激光进行刻蚀。

如图6所示：还包括封条7，所述封条7为条状，所述封条7对应插槽24的一侧具有密封塞71，所述密封塞71用于封堵插槽24，使注液孔4中营养液不会从插槽24溢出，所述密封塞71为柱状，垂直固定于封条7。封条与加药部件的安装方式相似，只不过用于封堵插槽，芯片正常使用情况下，为了防止注液孔溶液从插槽溢出，通过密封塞封堵，安装加药部件的时候，进行更换。

如图7所示：所述加药部件6由上层板条63和下层板条64相互键合而成，上层板条63和下层板条64均为聚二甲基硅氧烷材质，采用激光刻蚀的方式形成加药孔61和槽体，上层板条63和下层板条64对应的槽体合并后用于固定加药管62。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。

Claims (6)

1.一种肠器官仿生芯片，其特征在于：

包括三层依次叠放的基片固定成的整体，其中底层基片(1)、中层基片(2)和上层基片(3)均为聚二甲基硅氧烷材质；

所述上层基片(3)的平面侧，其对应的两侧分别开设有注液孔(4)和排液孔(5)，所述注液孔(4)和排液孔(5)均贯穿上层基片(3)并延伸至中层基片(2)，所述注液孔(4)和排液孔(5)对应中层基片(2)与上层基片(3)之间开设有多条微流通道(21)，所述微流通道(21)由上层基片(3)和下层基片(2)对应侧开设的槽体合拼而成，槽体截面为半圆形，所述微流通道(21)用于连通排液孔(4)和注液孔(5)；

所述微流通道(21)相互平行，并且由注液孔(4)向排液孔(5)方向延伸，所述中层基片(2)对应各个微流通道(21)均开设有用于培养肠器官的培养室(22)，所述培养室(22)贯穿中层基片(2)，所述培养室(22)成排设置，所述培养室(22)的底部为底层基片(1)，所述底层基片(1)对应培养室(22)的位置通过刻蚀作用形成磨砂层(11)。

2.根据权利要求1所述一种肠器官仿生芯片，其特征在于：芯片为矩形，所述底层基片(1)对应的拐角处垂直固定有限位杆(12)，所述中层基片(2)和上层基片(3)对应设置有供限位杆(12)穿过的限位孔(23)。

3.根据权利要求1所述一种肠器官仿生芯片，其特征在于：包括用于检测的加药部件(6)，所述加药部件(6)呈条状，安装于芯片对应注液孔(4)的一侧，所述加药部件(6)对应注液孔(4)的一侧开设有加药孔(61)，所述加药孔(61)与微流通道(21)一一对应，所述加药孔(61)连通有加药管(62)，芯片对应注液孔(4)的一侧开设有用于加药管(62)插接的插槽(24)，所述插槽(24)开设于上层基片(3)和中层基片(2)之间，加药管(62)插接插槽(24)后延伸至微流通道(21)中。

4.根据权利要求3所述一种肠器官仿生芯片，其特征在于：所述插槽(24)由上层基片(3)和中层基片(2)开设的槽体合拼而成，插槽(24)的开口侧位于芯片的边侧。

5.根据权利要求3所述一种肠器官仿生芯片，其特征在于：还包括封条(7)，所述封条(7)为条状，所述封条(7)对应插槽(24)的一侧具有密封塞(71)，所述密封塞(71)用于封堵插槽(24)，使注液孔(4)中营养液不会从插槽(24)溢出，所述密封塞(71)为柱状，垂直固定于封条(7)。

6.根据权利要求3所述一种肠器官仿生芯片，其特征在于：所述加药部件(6)由上层板条(63)和下层板条(64)相互键合而成，上层板条(63)和下层板条(64)均为聚二甲基硅氧烷材质，采用激光刻蚀的方式形成加药孔(61)和槽体，上层板条(63)和下层板条(64)对应的槽体合并后用于固定加药管(62)。

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