CN112608841A - 一种肿瘤类器官培养和药物实验的微流控系统及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肿瘤类器官培养和药物实验的微流控系统及使用方法，系统包括第一外部泵、第一外部泵，用于产生药物浓度梯度的第一微流控芯片，用于进行类器官培养的第二微流控芯片和用于收集废液的离心管，所述第一外部泵、第一外部泵分别通过软管连接第一微流控芯片输入端，所述第一微流控芯片、第二微流控芯片、离心管依次通过软管连接。本发明的微流控系统能够可控地向肿瘤类器官灌注培养基或者药物，同时调节药物的浓度以及其对肿瘤类器官的作用时间，实时调控肿瘤类器官所处的液体环境，实现肿瘤类器官的批量培养及进行药物效用测试实验，并且通过配合显微镜能够实时、持续地对于肿瘤类器官的生长、药物响应等进行观察。

Description

一种肿瘤类器官培养和药物实验的微流控系统及使用方法

技术领域

本发明涉及微流控芯片技术领域，特别涉及一种肿瘤类器官培养和药物实验的微流控系统及使用方法。

背景技术

随着细胞生物学和类器官技术的发展，对来源于癌症病人病灶的肿瘤细胞进行培养而得到的肿瘤类器官成为了评估肿瘤精准治疗和个性化用药的有力的体外模型。这些肿瘤类器官较好地保持了原本的肿瘤病灶处的生理和结构特征，可自我更新和长时间培养扩增，并且保持遗传性质的稳定等传统基于二维平面的培养系统无法实现的优势。

目前对于肿瘤类器官的培养和药物实验基本都是在培养皿或者孔板之中进行的，因其不是多种细胞共同培养的体系，无法模仿细胞在人体内生存的微环境；其次，无法模拟在体内的供血环境中的连续自然流动的药物递送条件，同时也缺乏对于肿瘤类器官所处的液体环境(例如药物浓度、营养物的供给等)进行实时地、持续地调节，从而观测肿瘤类器官相关响应的能力。

申请号CN201611107680.2的专利公开了一种用于细胞共培养的微流控芯片及其细胞培养方法，由下至上依次包括基底层、细胞培养腔室层、上盖板层，细胞培养腔室层中设有筛绢将细胞培养腔室分为上下两层，上层为培养基交换层、下层为细胞培养层；相邻的细胞培养腔室之间设有微孔滤膜；在上盖板层对应每个细胞培养腔室位置至少设有一个上盖板通孔，与筛绢通孔位置相互对应，对应上盖板通孔位置设有接头，接头内设有管道，用于培养基交换、细胞接种或检测。本发明的细胞共培养微流控芯片可有效地截留悬浮细胞，从而实现贴壁细胞、悬浮细胞或悬浮细胞与贴壁细胞的微流控细胞共培养。但是，其仍然不能模拟在体内的供血环境中的连续自然流动的药物递送条件，缺乏对培养器官所处的液体环境进行实时地、持续地调节从而观测器官相关响应的能力。

发明内容

(一)解决的技术问题

本发明的目的在于提供一种肿瘤类器官培养和药物实验的微流控系统及使用方法，以解决现有的微流控芯片应用在细胞培养中，不能模拟在体内的供血环境中的连续自然流动的药物递送条件，缺乏对培养器官所处的液体环境进行实时地、持续地调节从而观测器官相关响应的能力的问题。

(二)技术方案

为实现上述肿瘤类器官培养和药物实验的微流控系统及使用方法解决现有的微流控芯片应用在细胞培养中，不能模拟在体内的供血环境中的连续自然流动的药物递送条件，缺乏对培养器官所处的液体环境进行实时地、持续地调节从而观测器官相关响应的能力的问题，本发明提供如下技术方案：

一种肿瘤类器官培养和药物实验的微流控系统，包括第一外部泵、第一外部泵，用于产生药物浓度梯度的第一微流控芯片，用于进行类器官培养的第二微流控芯片和用于收集废液的离心管，所述第一外部泵、第一外部泵分别通过软管连接第一微流控芯片输入端，所述第一微流控芯片、第二微流控芯片、离心管依次通过软管连接。

优选的，所述第一微流控芯片包括有具有微流通道的上层基片以及与所述上层基片封合的下层载玻片；所述第一微流控芯片根据制作的上层基片流出口的不同产生多种药物浓度梯度。

优选的，所述上层基片的微流通道由两个液体流入口、蛇形通道单元以及设置的多个液体流出口连接组成；所述蛇形通道单元包括前后多列蛇形通道，且每一列蛇形通道在横向的数量从前到后逐步递增，所述每一列蛇形通道前后连通。

优选的，所述液体流出口的数量与第一微流控芯片需要产生的药物浓度梯度的数量相同，所述液体流出口分别位于每一列所述蛇形通道的输出端。

优选的，所述第二微流控芯片包括具有大小相等微流通道的上层基片、具有培养腔室的中间层基片以及与中间层基片封合的下层基片组成；所述第二微流控芯片的上层基片、中间层基片和下层基片通过夹具进行固定和封装。

优选的，所述第二微流控芯片的上层基片中的微流通道由多个平行排列的直线型通道组成，所述直线型通道与第一微流控芯片产生的药物浓度梯度数量相同，所述每个直线型通道两端分别设置液体流入口与液体流出口；所述中间层基片上分布有共多列、每列多个圆形培养腔室，每一列培养腔室的位置与上层基片的每一条直线型通道相互对应，每一列的多个培养腔室均匀分布在每一条直线型通道上，所述培养腔室的深度与中间层基片的厚度一致。

优选的，所述上层基片有微流通道的一面与中间层基片贴合后通过夹具进行固定和封装，所述中间层基片通过氧等离子体处理与下层基片进行封合。

优选的，所述夹具由上夹板和下夹板以及6对螺丝、螺母组成；所述上夹板和下夹板相对的一面分别有凹槽，所述上夹板和下夹板结合后两个凹槽大小与第二微流控芯片大小一致；所述上夹板和下夹板的四角及上下边缘的中间共设有6个固定孔，螺丝穿过固定孔并通过拧紧螺母使得所述上夹板和下夹板相互夹紧，从而固定并封装所述第二微流控芯片；所述夹具的上夹板设有多个孔，位置分别对应于所述第二微流控芯片中微流通道的液体流入孔和液体流出孔。

本发明还提供一种肿瘤类器官培养和药物实验的微流控系统的使用方法，包括以下步骤：

在进行肿瘤类器官培养和药物实验之前，对用于灌装培养基、药物或者缓冲溶液的注射器，对所述第一微流控芯片、所述第二微流控芯片以及连接用软管利用高压进行消毒灭菌；对所述第一外部泵、第一外部泵、所述夹具利用紫外线辐照进行消毒灭菌；

在灭菌后的生物安全柜中，将培养基或药物灌注至一个注射器，缓冲溶液灌注至另外一个注射器，两个注射器分别固定在第一外部泵、第一外部泵上，通过连接用软管将两个注射器与所述第一微流控芯片的两个液体流入口进行连接；

将与新鲜的癌症病人肿瘤细胞混合均匀的基质胶填充进所述第二微流控芯片的中间层基片的培养腔室，然后将所述第二微流控芯片放置于细胞培养箱，待基质胶形成水凝胶结构取出；

将所述第二微流控芯片的上层基片与中间层基片根据直线型通道和培养腔室的对应位置进行贴合封闭，之后将所述第二微流控芯片置于所述夹具的上夹板的凹槽之中，所述第二微流控芯片的上层基片的液体流入口与液体流出口与所述夹具的上夹板的通孔相对应；

通过连接用软管将所述第一微流控芯片的液体流出口与所述第二微流控芯片的液体流入口进行连接，通过连接用软管将所述第二微流控芯片的液体流出口与收集废液的离心管进行连接；

将上述连接好的用于肿瘤类器官培养和药物实验的微流控芯片系统放置于细胞培养箱中，设置好第一外部泵、第一外部泵的工作流速及工作时间，运行注射泵，系统开始工作。

(三)有益效果

与现有技术相比，本发明提供了一种肿瘤类器官培养和药物实验的微流控系统及使用方法，具备以下有益效果：

1、本发明的微流控芯片选用聚二甲基硅氧烷高分子材料，具有良好的生物兼容性、热稳定性和气体通透性，适宜对于肿瘤类器官进行处理；透明、自发荧光微弱，适宜采用显微镜技术和染色技术，实时动态观察细胞。

2、本发明所述微流控芯片，可以通过调节液体流入口的液体流速调节液体流出口的培养基或者药物的浓度梯度分布。

3、本发明能够可控地向肿瘤类器官灌注培养基或者药物，同时调节药物的浓度以及其对肿瘤类器官的作用时间，实时调控肿瘤类器官所处的液体环境，实现肿瘤类器官的批量培养及进行药物效用测试实验，并且通过配合显微镜能够实时、持续地对于肿瘤类器官的生长、药物响应等进行观察。

附图说明

图1为本发明一种用于肿瘤类器官培养和药物实验的微流控系统的示意图。

图2为本发明混合药物溶液和缓冲溶液产生药物浓度梯度的第一微流控芯片结构示意图。

图3为本发明用于肿瘤类器官培养的第二微流控芯片结构示意图。

图4为本发明用于固定和封装第二微流控芯片的夹具俯视结构示意图。

图5为本发明用于固定和封装第二微流控芯片的夹具侧视结构示意图。

图6为本发明一种用于肿瘤类器官培养和药物实验的微流控系统的实物图和利用该系统培养的肿瘤类器官显微图片。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

如图1所示，本发明提供一种肿瘤类器官培养和药物实验的微流控系统，包括第一外部泵101、第一外部泵102，用于产生药物浓度梯度的第一微流控芯片200，用于进行类器官培养的第二微流控芯片300和用于收集废液的离心管500，第一外部泵101、第一外部泵102分别通过软管连接第一微流控芯片200输入端，第一微流控芯片200、第二微流控芯片300、离心管500依次通过软管连接。

微流控芯片200可以通过在芯片中混合药物溶液和缓冲溶液产生药物浓度梯度，微流控芯片200包括具有微流通道的上层基片201以及与该上层基片封合的下层载玻片202。如图2的b部分所示，微流控芯片200根据制作上层基片201时液体流出口205的不同选择产生3到8种药物浓度梯度。

如图2的b部分所示，上层基片201的微流通道由两个液体流入口203、蛇形通道单元以及设置的多个液体流出口205连接组成；蛇形通道单元包括前后多列蛇形通道204，且每一列蛇形通道204在横向的数量从前到后逐步递增，每一列蛇形通道204前后连通。

本实施例中，蛇形通道204宽度为50-200μm，高度为100-300μm。蛇形通道单元204呈逐步递增式分布，一共6列，从靠近流入口203的3个平行分布的蛇形通道204开始，以每列增加1个蛇形通道204的方式递增至8个平行分布的蛇形通道204。如图2所示，液体流出口205的数量与第一微流控芯片200需要产生的药物浓度梯度的数量相同(为3-8个)，液体流出口205分别位于每一列所述蛇形通道204的输出端，液体流出口205位于所选定蛇形通道的远离液体流入口203的一侧。液体流入口203与流出口205直径在500μm-1mm，微流控芯片200的上层基片201由聚二甲基硅氧烷材料PDMS制作而成。

第二微流控芯片300可以用于肿瘤类器官培养，第二微流控芯片300包括具有大小相等微流通道的上层基片301、具有培养腔室307的中间层基片302以及与中间层基片302封合的下层基片303组成；上层基片301厚度为3-7mm，中间层基片302厚度为2-4mm，下层基片303厚度在3-7mm，微流控芯片300的上层基片301、中间层基片302和下层基片303通过夹具400进行固定和封装。

如图3所示，本实施例中第二微流控芯片300的上层基片301中的微流通道由8个平行排列的直线型通道304组成，通道宽度为100-400μm，高度为100-300μm，每个直线型通道304两端分别设置液体流入口305与液体流出口306，直径在500μm-1mm。使用的微流通道的数目可根据微流控芯片200产生的药物浓度梯度数量进行选用。

中间层基片302上分布有共8列、每列3个圆形培养腔室307，每一列培养腔室307的位置与上层基片301的每一条微流通道相互对应一致，每一列的3个培养腔室307均匀分布在直线型通道304上，培养腔室307的直径为2-5mm，深度与中间层基片302的厚度一致。

中间层基片302通过氧等离子体处理与下层基片303进行封合，上层基片301有微流通道的一面与中间层基片302紧密贴合后通过夹具400进行固定和封装，其中微流控芯片300的上层基片301、中间层基片302和下层基片303均由聚二甲基硅氧烷材料制作而成。

如图4、5所示，夹具400由上夹板401和下夹板402以及6对螺丝405、螺母406组成；上夹板401和下夹板402相对的一面分别有凹槽407，上夹板401和下夹板402结合后两个凹槽407大小与第二微流控芯片300大小一致，本实施例中凹槽深度为2-4mm；上夹板401和下夹板402的四角及上下边缘的中间共设有6个固定孔403，螺丝405穿过固定孔403并通过拧紧螺母406使得上夹板401和下夹板402相互夹紧，从而固定并封装第二微流控芯片300；夹具400的上夹板401设有16个孔404，位置分别对应于第二微流控芯片300中微流通道的液体流入孔305和液体流出孔306，孔404的直径为2-4mm。夹板的制作材料为3D打印专用透明树脂。

本发明的一种用于肿瘤类器官培养和药物实验的微流控系统，通过外部泵101和102提供驱动力向系统中输入培养基、缓冲液或者药物溶液，实现对培养基、缓冲液和药物的输入时间和空间的控制。外部注射泵101和102、微流控芯片200、微流控芯片300、收集废液的离心管500通过软管相互连接，根据液体流动方向的连接顺序为外部注射泵101和102、微流控芯片200、微流控芯片300、收集废液的离心管500。

实施例2

本发明还提供一种肿瘤类器官培养和药物实验的微流控系统的使用方法，包括以下步骤：

在进行肿瘤类器官培养和药物实验之前，对用于灌装培养基、药物或者缓冲溶液的注射器，对第一微流控芯片200、第二微流控芯片300以及连接用软管利用高压进行消毒灭菌；对第一外部泵101、第一外部泵102、夹具400利用紫外线辐照进行消毒灭菌；

在灭菌后的生物安全柜中，将培养基或药物灌注至一个注射器，缓冲溶液灌注至另外一个注射器，两个注射器分别固定在第一外部泵101、第一外部泵102上，通过连接用软管将两个注射器与第一微流控芯片200的两个液体流入口203进行连接，第一微流控芯片200可以通过在芯片中混合药物溶液和缓冲溶液产生药物浓度梯度；

将与新鲜的癌症病人肿瘤细胞混合均匀的基质胶填充进第二微流控芯片300的中间层基片302的培养腔室307，然后将第二微流控芯片300放置于细胞培养箱，待基质胶形成水凝胶结构取出；

将第二微流控芯片300的上层基片301与中间层基片302根据直线型通道304和培养腔室307的对应位置进行贴合封闭，之后将第二微流控芯片300置于夹具400的上夹板401的凹槽之中，第二微流控芯片300的上层基片301的液体流入口305与液体流出口306与夹具400的上夹板401的通孔404相对应；

通过连接用软管将第一微流控芯片200的液体流出口205与第二微流控芯片300的液体流入口305进行连接，通过连接用软管将第二微流控芯片300的液体流出口306与收集废液的离心管500进行连接；

将上述连接好的用于肿瘤类器官培养和药物实验的微流控芯片系统放置于细胞培养箱中，设置好第一外部泵101、第一外部泵102的工作流速及工作时间，运行注射泵，系统开始工作。

实施例3

本发明还提供了上述第一微流控芯片200的制备方法，包括如下步骤：

第一步，利用计算机绘图软件设计好芯片结构，通过激光照排机制作对应的光刻掩膜版；

第二步，将光刻胶涂覆于硅片表面，进行紫外曝光和显影，将掩膜版上的图样转移到光刻胶上，得到上层基片201的模板；

第三步，将聚二甲基硅氧烷材料浇铸到模板表面，经过除气泡、烘焙、打孔得到上层基片201；

第四步，利用氧等离子体处理将有微流控通道的上层基片201与下层载玻片202进行封合。

实施例4

本发明还提供了上述第二微流控芯片300的制备方法，包括如下步骤：

第一步，利用计算机绘图软件设计好芯片结构，通过激光照排机制作对应的光刻掩膜版；

第二步，将光刻胶涂覆于硅片表面，进行紫外曝光和显影，将掩膜版上的图样转移到光刻胶上，得到上层基片301的模板；

第三步，将聚二甲基硅氧烷材料浇铸到模板表面，经过除气泡、烘焙、打孔得到上层基片301；

第四步，将聚二甲基硅氧烷材料浇铸到两个底面光滑的容器之中，经过除气泡、烘焙、切块得到两块平整的聚二甲基硅氧烷基片。

第五步，根据所述上层基片301上的微流通道结构，利用打孔器在一块聚二甲基硅氧烷基片上制作圆形通孔作为培养腔室307，得到中间层基片302。

第六步，利用氧等离子体处理将中间层基片302与下层基片303进行封合。

实施例5

本发明还提供了上述用于固定和封装第二微流控芯片300的夹具400的制备方法，包括如下步骤：

第一步，利用计算机绘图软件设计好所述夹具400的形状和结构，通过3D打印机制作对应的上夹板401和下夹板402；

第二步，利用打孔器在上夹板401和下夹板402的四角及上下边缘的中间制作固定孔403，固定孔403大小与选用的螺丝大小一致。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种肿瘤类器官培养和药物实验的微流控系统，其特征在于：包括第一外部泵(101)、第一外部泵(102)，用于产生药物浓度梯度的第一微流控芯片(200)，用于进行类器官培养的第二微流控芯片(300)和用于收集废液的离心管(500)，所述第一外部泵(101)、第一外部泵(102)分别通过软管连接第一微流控芯片(200)输入端，所述第一微流控芯片(200)、第二微流控芯片(300)、离心管(500)依次通过软管连接。

2.根据权利要求1所述的一种肿瘤类器官培养和药物实验的微流控系统，其特征在于：所述第一微流控芯片(200)包括有具有微流通道的上层基片(201)以及与所述上层基片(201)封合的下层载玻片(202)；所述第一微流控芯片(200)根据制作的上层基片(201)流出口的不同产生多种药物浓度梯度。

3.根据权利要求2所述的一种肿瘤类器官培养和药物实验的微流控系统，其特征在于：所述上层基片(201)的微流通道由两个液体流入口(203)、蛇形通道单元以及设置的多个液体流出口(205)连接组成；所述蛇形通道单元包括前后多列蛇形通道(204)，且每一列蛇形通道(204)在横向的数量从前到后逐步递增，所述每一列蛇形通道(204)前后连通。

4.根据权利要求3所述的一种肿瘤类器官培养和药物实验的微流控系统，其特征在于：所述液体流出口(205)的数量与第一微流控芯片(200)需要产生的药物浓度梯度的数量相同，所述液体流出口(205)分别位于每一列所述蛇形通道(204)的输出端。

5.根据权利要求1所述的一种肿瘤类器官培养和药物实验的微流控系统，其特征在于：所述第二微流控芯片(300)包括具有大小相等微流通道的上层基片(301)、具有培养腔室的中间层基片(302)以及与中间层基片(302)封合的下层基片(303)组成；所述第二微流控芯片(300)的上层基片(301)、中间层基片(302)和下层基片(303)通过夹具(400)进行固定和封装。

6.根据权利要求5所述的一种肿瘤类器官培养和药物实验的微流控系统，其特征在于：所述第二微流控芯片(300)的上层基片(301)中的微流通道由多个平行排列的直线型通道(304)组成，所述直线型通道(304)与第一微流控芯片(200)产生的药物浓度梯度数量相同，所述每个直线型通道(304)两端分别设置液体流入口(305)与液体流出口(306)；所述中间层基片(302)上分布有共多列、每列多个圆形培养腔室(307)，每一列培养腔室(307)的位置与上层基片(301)的每一条直线型通道(304)相互对应，每一列的多个培养腔室(307)均匀分布在每一条直线型通道(304)上，所述培养腔室(307)的深度与中间层基片(302)的厚度一致。

7.根据权利要求5所述的一种肿瘤类器官培养和药物实验的微流控系统，其特征在于：所述上层基片(301)有微流通道的一面与中间层基片(302)贴合后通过夹具(400)进行固定和封装，所述中间层基片(302)通过氧等离子体处理与下层基片(303)进行封合。

8.根据权利要求5所述的一种肿瘤类器官培养和药物实验的微流控系统，其特征在于：所述夹具(400)由上夹板(401)和下夹板(402)以及6对螺丝(405)、螺母(406)组成；所述上夹板(401)和下夹板(402)相对的一面分别有凹槽(407)，所述上夹板(401)和下夹板(402)结合后两个凹槽(407)大小与第二微流控芯片(300)大小一致；所述上夹板(401)和下夹板(402)的四角及上下边缘的中间共设有6个固定孔(403)，螺丝(405)穿过固定孔(403)并通过拧紧螺母(406)使得所述上夹板(401)和下夹板(402)相互夹紧，从而固定并封装所述第二微流控芯片(300)；所述夹具(400)的上夹板(401)设有多个孔(404)，位置分别对应于所述第二微流控芯片(300)中微流通道的液体流入孔(305)和液体流出孔(306)。

9.一种如权利要求1-8任一所述的一种肿瘤类器官培养和药物实验的微流控系统的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

在进行肿瘤类器官培养和药物实验之前，对用于灌装培养基、药物或者缓冲溶液的注射器，对所述第一微流控芯片(200)、所述第二微流控芯片(300)以及连接用软管利用高压进行消毒灭菌；对所述第一外部泵(101)、第一外部泵(102)、所述夹具(400)利用紫外线辐照进行消毒灭菌；

在灭菌后的生物安全柜中，将培养基或药物灌注至一个注射器，缓冲溶液灌注至另外一个注射器，两个注射器分别固定在第一外部泵(101)、第一外部泵(102)上，通过连接用软管将两个注射器与所述第一微流控芯片(200)的两个液体流入口(203)进行连接；

将与新鲜的癌症病人肿瘤细胞混合均匀的基质胶填充进所述第二微流控芯片(300)的中间层基片(302)的培养腔室(307)，然后将所述第二微流控芯片(300)放置于细胞培养箱，待基质胶形成水凝胶结构取出；

将所述第二微流控芯片(300)的上层基片(301)与中间层基片(302)根据直线型通道(304)和培养腔室(307)的对应位置进行贴合封闭，之后将所述第二微流控芯片(300)置于所述夹具(400)的上夹板(401)的凹槽之中，所述第二微流控芯片(300)的上层基片(301)的液体流入口(305)与液体流出口(306)与所述夹具(400)的上夹板(401)的通孔(404)相对应；

通过连接用软管将所述第一微流控芯片(200)的液体流出口(205)与所述第二微流控芯片(300)的液体流入口(305)进行连接，通过连接用软管将所述第二微流控芯片(300)的液体流出口(306)与收集废液的离心管(500)进行连接；

将上述连接好的用于肿瘤类器官培养和药物实验的微流控芯片系统放置于细胞培养箱中，设置好第一外部泵(101)、第一外部泵(102)的工作流速及工作时间，运行注射泵，系统开始工作。

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