CN212316139U - 一种仿生多器官芯片 - Google Patents

Abstract

本实用新型属于生物微流控技术领域，具体为一种仿生多器官芯片。本实用新型芯片由四层组成，包括上层培养区和下层培养区，每层细胞培养区内均有微结构促进三维组织细胞形成。上层细胞培养区与下层培养区通过多孔膜联通，可以进行物质交换和药物渗透。下层每个培养区均有液体进口和出口，用于接种细胞和更换培养基。该多器官芯片可以培养三种以上不同的组织细胞，实现药物等外界施加物质对不用器官的作用和影响，以及上层组织细胞与下层组织细胞之间相互作用。本多器官芯片可以模拟药物或其他物质对人体不同器官作用的复杂过程，也可以模拟人体多器官累及的疾病模型。

Description

一种仿生多器官芯片

技术领域

本实用新型属于生物微流控技术领域，具体涉及一种仿生多器官芯片。

背景技术

药物安全性评价的体外模型主要以细胞为主。采用静态二维孔板培养方式为主，这种培养方式经济、便利、易操作。 但由于无法模拟体内血液循环维持的细胞新陈代谢和营养物质供给的动态稳定性， 以及缺乏不同来源组织器官之间的相互作用（如药物代谢器官和毒性器官属于不同脏器），使得整个培养体系与体内生理微环境相差甚远， 特别是在药物利用度、毒性反应及代谢研究方面与体内实际的三维实体组织差异较大，导致大量的实验结果对预期的毒副作用缺乏可靠的指导作用，且传统的细胞实验无法实现不同脏器对药物响应的交互作用。现有的药物毒性和安全性评价在方法学与技术手段等方面存在一定的缺陷，传统体外静态评估与人体整体动态变化间的不匹配方面尚存在技术难题，在很大程度上制约了新药研发的进程，也是严重制约新药研发领域的瓶颈问题。

器官芯片技术为体外药物分析和毒性评价提供了一种重要的平台。该技术是一种利用微加工方法，在微流控芯片上制作出能够模拟人体器官主要结构和功能单元的仿生微生理系统。 具有微流控技术的微型化、集成化、低消耗的特点，能够精确控制多个系统参数，如浓度梯度、流体剪切力、 多细胞共培养、组织-组织界面形成、器官-器官相互作用等。从多个角度来模拟人体器官的复杂结构、生理微环境和功能，弥补了传统二维细胞培养模式难以体现人体组织器官复杂生理功能的缺陷。目前，国际范围内利用器官芯片技术已经实现了多种单一器官功能的模拟，如肺芯片、肝芯片、心脏芯片、肠芯片、肾芯片和模拟月经周期的女性生殖芯片等， 并尝试用于疾病模型建立、药物毒性预测，显示了巨大的应用潜力。

单个器官芯片模型的成功建立为疾病研究、毒性测试、药物反应等提供新的技术手段。但是，人体是一个由血液和淋巴循环将多个组织和器官联系起来的复杂系统。药物经过循环系统到达各个组织器官，药物在不同脏器中发生的反应、药效、毒性均存在一定的差异性。因此，构建多器官芯片模型大势所趋。器官芯片技术设计灵活多变，具有时空分辨特性，可以采用集成、多模块等方式实现不同组织器官来源细胞共培养，利用微通道和可控流体将不同培养区域的微组织（类器官）联通，模拟人体不同器官的相互作用，以及药物在体内不同组织器官的分布情况。

尽管目前已经有不同功能的多器官芯片报道，但是大多细胞培养方式为二维或者部分为三维形式形式。多层结构的器官芯片存在上下层细胞重叠，不利于观察等问题。且上下两层培养的芯片大多只能培养两种器官。

针对上述不足，本实用新型设计的四层芯片，包括上层组织细胞培养层，培养区域含有多孔结构，用于组织细胞的三维培养。下层的培养区域也含有微坑结构，促进细胞的三维培养。下层不同器官间独立，有利于上层器官与下层不同器官间相互作用的独立研究。

实用新型内容

本实用新型是为了解决现有技术存在的上述不足，提供了一种可以培养多种组织细胞的仿生多器官芯片，该仿生多器官芯片可以用于药物的药效、药物代谢、药物毒性评价等应用领域。

本实用新型提供仿生多器官芯片，由四层组成，从上至下依次为：流体通道层100，3D组织细胞培养层200，多孔膜层300，下层为含有细胞培养区域的流体通道层400；其中：

所述的流体通道层，其底部有流体通道和与下层细胞培养层对应的长方形几何结构101，流体通道中间为六边形结构，两侧由窄通道连接；两侧的窄通道分别为流体入口103、流体出口102；

所述的3D组织细胞培养层，中间设有凹陷的长方形组织细胞培养区域，培养区包括阵列排列的直径为50-400微米圆形孔201，各圆形孔间距为50-100微米；

所述的多孔膜层，其厚度尺寸10-200微米，孔径大小在0.22-20微米之间，为透明或半透明微孔膜，联通上下层，用于物质交换；

所述的含有细胞培养区域的流体通道层，其中间设有细胞培养区域；该流体通道层中，设有依次联通的流体入口401、细胞培养区域405、液体扩散区域407、流体出口403，构成一流体通道；液体扩散区域407与上一层（多孔膜层）联通；这样的流体通道可以有2-20个，实现2-20个组织细胞培养；附图中给出了两个通道，即还设有：依次联通的流体入口402、细胞培养区域406、液体扩散区域408、流体出口402；液体扩散区域407与上一层（多孔膜层）联通。

本实用新型中，第四层细胞培养区域405,406的底部设有微坑结构，用于捕获3D细胞球和微小组织；微坑直径为100-300微米，形状可以为圆形、方形或多边形；微坑深度为50-300微米，可以容纳100-300微米的细胞球或微组织。

本实用新型中，四个层的材料可以是PDMS、玻璃或PC等透明材质，

层与层之间粘合方式为离子键合，可采用与各层材质相适应的粘合剂。

整个芯片设计可以在同一张芯片或载体上同时复制多个，形成高通量的多器官芯片。

本实用新型提供的上述仿生多器官芯片的制备方法，具体步骤如下：

（1）通过计算机模拟设计图案，利用3D打印或光刻等技术等制备第一、二、四层模板；

（2）将模板材料（比如为PDMS）和引发剂按照1:（10-15）质量比例混合均匀，倒入模板内除泡，70℃凝固，冷却后取下模板材料（PDMS）；

（3）利用等离子封接技术将第一、二层不可逆封接；

（4）将封接好的第一、二层蘸取（PDMS）胶水，与第三层多孔膜封接，常温放置30-60分钟，70℃固化15-25分钟；

（5）将第四层芯片蘸取（PMDS）胶水，与封接好的第一、二、三层粘合。常温放置30-60分钟，70℃固化15-25分钟；

（6）四层芯片封接后，戊二醛消毒30-60分钟后紫外线消毒30-60分钟；

（7）接种细胞前，所有通道用PBS冲洗三次以上，所有通道灌注PBS，4℃冰箱内保存备用。

本实用新型提供的上述仿生多器官芯片，可以在一种芯片上进行多器官细胞的三维培养。具体流程如下：

（1）芯片内接种细胞前，芯片置于培养箱内复温，所有通道用预热的（37℃）培养基冲洗3次去除气泡，必要时抽真空除泡；

（2）下层（即第四层含有细胞培养区域的流体通道层）中一个通道内接种一种细胞溶液（比如，为肝细胞，将原代鼠肝细胞提取后，制备成悬液，按照1x10的7次方计数），待细胞在三维培养区域静止沉降后，施加缓慢流体，将微通道内细胞冲走，仅仅保留三维培养区内细胞；以同样方式和过程，在下层中另外一个通道内接种另一种细胞溶液（比如，为人诱导性多潜能干细胞来源的心肌细胞）；然后培养12-24小时，促进两种细胞（肝、心肌细胞）形成三维细胞球；

（3）待下层细胞球形成后，在上层（即第一层流体通道层）接种细胞（比如为卵巢癌的SKOV3卵巢癌细胞），接种方式同下层。细胞接种入流体通道后，主要沉降在第二层3D组织细胞培养层中间的阵列微孔内，用流体将微通道中细胞冲走，仅保留小坑内细胞。待12-24小时，小坑内细胞聚集成三维细胞球；

（4）上、下层细胞通过第三层微孔膜进行培养基和物质交换；上层持续灌注流体，上层培养基的营养成分通过微孔膜渗透入下层。下层入口封住，上层流体渗入下层后从下层出口流出，下层细胞接受到上层来源的培养基和药物刺激。

本实用新型提供的上述仿生多器官芯片可以用于药物研发领域对药物的不同评价，包括药效、药物毒性、药物代谢等，也可以同时实现药物代谢、药物毒性、药效的评价。组织器官的三维培养可以近生理的模拟人体组织器官，增强药物评价的可靠性。

在这里示出和描述的所有示例中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

另外，在本实用新型实施例的描述中，除非另有明确的规定和限定，术语“封接”、“ 联接”、“ 连接”应做广义理解，对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本实用新型中的具体含义。

在本实用新型的描述中，需要说明的是，术语“ 中心”、“ 上”、“ 下”、等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本实用新型和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本实用新型的限制。此外，术语“ 第一”、“ 第二”、“ 第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

附图说明

图1为本实用新型的器官芯片结构图示。

图2为本实用新型器官芯片的剖面。

具体实施方式

结合附图进一步说明本实用新型的具体实施过程，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本实用新型，并不用于限定本实用新型。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本实用新型保护的范围。

实施例1.多器官芯片的制备

通过计算机设计芯片示意图，如图1和图2所示，第二层200与第三层300构成上层细胞三维培养区域。第二层中间区域为正方形结构，排列有多孔结构，尺寸为50-400微米圆形孔201，间距为50-100微米。第三层为多孔膜，尺寸在0.22-20微米之间，材料为PC，PET，PDMS等多种透明或半透明微孔膜。滤膜用于物质交换。第四层包含相互独立的组织器官培养通道。分别包括流体入口401,402，两个流体出口403,404，上层与下层有联通区域407，408，该区域为长方形结构，宽度大于流体通路，有利于上下层物质交换充分。左右两个组织器官培养区域405,406，该区域为圆形培养区，底部由阵列排列的小坑结构组成，坑直径为100-300微米，形状可以为圆形，方形，多边形。深度为50-300微米，可以容纳直径100-300微米的细胞球或微组织。本实施例仅列出2个通道，具体可以实现2-20个通道，用于模拟2-20个组织器官。

以PDMS材料为例，材料选择不限于PDMS。利用SU8或PMMA，玻璃等为模板，通过光刻，打印，刻蚀等方法，按照设计要求制作相应微结构。配制PDMS和引发剂，混匀后加入到模板中，80度烘箱固化后，收集PDMS芯片。用打孔器将每个流体通道的入口和出口打通，所有芯片用无水乙醇清洗后，烤箱烘干6小时以上，去除乙醇。在无菌干净的超净工作间，利用离子封接或者PDMS胶水依次封接四层芯片，保证四层对其。

芯片接种细胞前，需要无菌处理。本实施例中采用戊二醛结合紫外线消毒，戊二醛消毒1小时，紫外线消毒1小时。

实施例2. 仿生多器官芯片的构建

接种细胞前，芯片通道内需要用PBS清洗3-5次。首先在下层两个独立的培养区分别接种两种细胞。本实施例以肝细胞为例，将原代鼠肝细胞提取后，制备成悬液，按照1x10的7次方计数，接种到下层其中一个通道内，待细胞在三维培养区域静止沉降后，施加缓慢流体，将微通道内细胞冲走，仅仅保留三维培养区内细胞。同样方式，在另外一个通道内接种人诱导性多潜能干细胞来源的心肌细胞。静止培养12-24小时，促进肝，心肌细胞形成三维细胞球。

待下层细胞球形成后，接种上层细胞，接种方式同下层。本实施例中以卵巢癌为例，将SKOV3卵巢癌细胞灌入流体通道后，细胞主要沉降在中间的阵列微孔内，用流体将微通道中细胞冲走，仅保留小坑内细胞。待12-24小时，小坑内细胞聚集成三维细胞球。

对三种器官长期培养（3个月以内）后，进行功能评价。主要包括三种组织大小，细胞活性，标志物表达，肝合成和分泌等功能，心肌细胞跳动频率和幅度。

实施例3. 利用仿生多器官芯片进行药物测试

本实施例实现了肝-心-卵巢癌的三种组织器官的共培养。为了模拟临床抗癌药物对肿瘤的杀伤作用，对心肌毒性作用，以及对肝的毒性和肝代谢药物的作用，本实施例以阿霉素为例。在上层卵巢癌入口加入含有阿霉素的培养基。上层培养基经过卵巢癌层后通过多孔膜渗透到下层，分别由肝，心通道接收，在下层施加缓慢流体，促进上层扩散下来的培养基流入到下层的肝，心培养区域。

本实施的药物评价可以模拟临床多个周期的化疗过程，以及药物对心，肝的慢性毒性作用。

三种器官药物响应的评价。药物作用3个周期后，考察药物的效果，心肌毒性，肝毒性，肝代谢药物的能力。

药物的抗肿瘤作用：卵巢癌细胞活性，凋亡，组织大小改变；

心肌毒性作用：心肌细胞活性，凋亡，跳动频率，跳动次数，对心率失常药物的响应；

肝毒性：肝细胞的活性，肝代谢酶，合成和分泌功能；

肝代谢药物的作用：药物经过肝代谢后代谢产物的比例。

依据人体组织器官间相互作用，以及对药物的不同评价方式，上述实施例可以更改不同的组织器官以及检测不同的药物作用。例如：上层培养肠细胞，在小坑内形成三维的肠粘膜层。下层培养肝和神经球。考察药物经过肠吸收后对肝，神经的作用。

本实施例仅以药物为例，也可以用于检测其他毒性物质，化合物等。此外也可以用于多器官系统的累及的疾病模型，比如全身性炎症反应，肿瘤的多器官转移等。

本实施例选择的卵巢癌细胞，也可以使用其他肿瘤细胞。细胞选择不仅仅是细胞系，也可以选择原代肿瘤细胞。

最后应说明的是：以上所述实施例，仅为本实用新型的具体实施方式，用以说明本实用新型的技术方案，而非对其限制，本实用新型的保护范围并不局限于此，尽管参照前述实施例对本实用新型进行了详细的说明，本领域的技术人员应当理解：任何熟悉本技术领域的技术人员在本实用新型揭露的技术范围内，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改或可轻易想到变化，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改、变化或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本实用新型实施例技术方案的精神和范围，都应涵盖在本实用新型的保护范围之内。因此，本实用新型的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

Claims (3)

1.一种仿生多器官芯片，其特征在于，由四层组成，从上至下依次为：流体通道层（100），3D组织细胞培养层（200），多孔膜层（300），下层为含有细胞培养区域的流体通道层（400）；其中：

所述的流体通道层，其底部有流体通道和与下层细胞培养层对应的长方形几何结构（101），流体通道的中间为六边形结构，两侧由窄通道连接；两侧的窄通道分别为流体入口（103）、流体出口（102）；

所述的3D组织细胞培养层，中间设有凹陷的长方形组织细胞培养区域，培养区包括阵列排列的直径为50-400微米圆形孔（201），各圆形孔间距为50-100微米；

所述的多孔膜层，其厚度尺寸10-200微米，孔径大小在0.22-20微米之间，为透明或半透明微孔膜，联通上下层，用于物质交换；

所述的含有细胞培养区域的流体通道层，其中间设有细胞培养区域；该流体通道层中，设有依次联通的流体入口（401）、细胞培养区域（405）、液体扩散区域（407）、流体出口（403），构成一流体通道；液体扩散区域（407）与上一层联通；这样的流体通道有2-20个，实现2-20个组织细胞培养。

2.根据权利要求1所述的仿生多器官芯片，其特征在于，所述细胞培养区域（405）的底部设有微坑结构，用于捕获3D细胞球和微小组织；微坑直径为100-300微米，形状为圆形、方形或多边形；微坑深度为50-300微米，可以容纳100-300微米的细胞球或微组织。

3.根据权利要求1所述的仿生多器官芯片，其特征在于，层与层之间粘合方式为离子键合，采用与各层材质相适应的粘合剂。

Images