CN110331096A - 模拟肿瘤微环境的微流控芯片及肿瘤微环境的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微流控芯片领域，尤其涉及模拟肿瘤微环境的微流控芯片及肿瘤微环境的构建方法，其中，微流控芯片包括上下叠置的盖片和基片，自基片的上表面向下凹设有依次平行且连通的细胞培养通道、细胞外基质通道和血管通道，细胞培养通道设于细胞外基质通道的一侧，血管通道设于细胞外基质通道的另一侧，在细胞外基质通道内设有多个间隔设置的支柱。该芯片结构简单，集成度高，并且帮助模拟血管壁与细胞外基质形成，能够实现肿瘤生理病理屏障的构建，为肿瘤细胞提供了一个更为接近体内的微环境，为现有药物载体在肿瘤生理病理屏障中的扩散研究提供更真实便捷的平台，从而提高靶向治疗试验结果的准确性。

Description

模拟肿瘤微环境的微流控芯片及肿瘤微环境的构建方法
技术领域
本发明属于微流控芯片领域，尤其涉及一种模拟肿瘤微环境的微流控芯片及肿瘤微环境的构建方法。
背景技术
由于传统肿瘤治疗手段复发率高、患者生存率低，研究人员逐渐将目光聚焦于靶向治疗领域。与其他靶向治疗的给药方式相比，纳米药物载体可以实现药物的高效精确传递和可控释放。近年来，这种新型的给药方式在改善肿瘤治疗中已经取得了突破性的研究成果。然而，纳米药物载体在到达靶组织和靶细胞之前需要克服生物体内的多重生理病理屏障，为实现药物的疗效最大化，需要研究肿瘤微环境中多重生理屏障的力学性能及其阻滞机制。
在肿瘤药物开发中，为检验药物的药性及其毒性，一般首先进行二维平面的细胞培养的模式。然而，传统的细胞试验结果并不能体现其在人体内的所有特性，因为传统的细胞试验中细胞所处环境较为单一，并不能完全模拟复杂的肿瘤微环境。基于微流控芯片的肿瘤微环境模型有巨大的研究潜力，但目前仍存在一些不足。
现有技术中，Yuan等人开发了一种基于微流控芯片的3D乳腺癌模型，通过在3D胶原基质中共培养单分散多细胞肿瘤细胞球体与单核细胞，研究巨噬细胞和细胞外基质对肿瘤细胞迁移的影响，但未考虑血管壁的屏障作用。Wang等人构建了一个基于水凝胶的三维微流体芯片来模拟肿瘤-血管微环境，以及癌症药物的有效细胞代谢和不同类型细胞之间的细胞-细胞相互作用，从而评价肿瘤体内不同部位的耐药性，但该芯片结构复杂，试验结果重复性较差。
发明内容
(一)要解决的技术问题
针对现有存在的技术问题，本发明提供一种模拟肿瘤微环境的微流控芯片，解决了现有技术中存在的结构复杂，未考虑血管壁的屏障而导致靶向治疗试验结果不准确的问题。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
本发明一方面提供一种模拟肿瘤微环境的微流控芯片，包括上下叠置的盖片和基片；
自基片的上表面向下凹设有依次平行且连通的细胞培养通道、细胞外基质通道和血管通道，细胞培养通道设于细胞外基质通道的一侧，血管通道设于细胞外基质通道的另一侧，在细胞外基质通道内设有多个间隔设置的支柱。
根据本发明，沿所述细胞外基质通道的长度方向对称设置有两排所述支柱，其中一排支柱邻近细胞培养通道的边缘设置，另一排支柱邻近血管通道的边缘设置，且每排的多个支柱之间等间隔分布且间隔大于单个内皮细胞直径。
根据本发明，支柱的横截面为多边形。
根据本发明，在细胞培养通道的两侧共对称设有两条细胞外基质通道，并均与细胞培养通道连通，在两条细胞外基质通道的外侧还分别设有一条血管通道，两条血管通道相对于细胞培养通道对称设置，且分别与两条细胞外基质通道连通。
根据本发明，在细胞培养通道上设置有细胞培养区以及与细胞培养区的两端分别连通的第一入口通道和第一出口通道，盖片上设有与第一入口通道和第一出口通道分别连通的细胞悬浮液入口和第一废液出口，细胞外基质通道上设置有基质直通道以及与基质直通道的两端分别连通的第二入口通道和第二出口通道，盖片上设有与第二入口通道和第二出口通道分别连通的基质入口和第二废液出口，血管通道上设置有血管直通道以及与血管直通道的两端分别连通的第三入口通道和第三出口通道，盖片上设有与第三入口通道和第三出口通道分别连通的试剂入口和第三废液出口。
根据本发明，细胞培养区的两端分别靠近第一入口通道和第一出口通道处渐缩成锥形。
根据本发明，细胞培养通道与血管通道的深度均为H1，细胞外基质通道的深度为H2，且满足H1<H2，细胞培养区的宽度为H4，基质直通道的宽度为H5，血管直通道的宽度为H6，满足H4>H5>H6。
根据本发明，自细胞培养区的底面向下凹设有多个细胞培养腔，以细胞培养通道的底面为基准面，细胞培养腔深度为H3，满足100μm<H3<300μm。
根据本发明，盖片和基片通过等离子体封装键合。
本发明另一方面提供一种肿瘤微环境的构建方法，构建方法包括以下步骤：
S1、将表面活性剂注入到所述细胞培养通道内，静置12h-24h；
S2、将基底膜提取液注入到所述细胞外基质通道内，放置1h直至所述基底膜提取液凝胶化形成凝胶基质；
S3、将内皮细胞悬浮液注入到所述血管通道内，沿所述微流控芯片的血管长度与水平面平行的方向竖直放置4h，直至所述内皮细胞悬浮液中的内皮细胞在重力作用下在所述凝胶基质上贴壁并生长；
S4、将肿瘤细胞悬液注入所述细胞培养通道内，培养24h-36h后形成肿瘤细胞球体，形成肿瘤微环境。
(三)有益效果
本发明的有益效果是：
本发明提供的微流控芯片以及构建方法，通过在细胞外基质通道内设有多个间隔设置的支柱，支柱与支柱之间的间隔形成了孔隙，当血管通道内通入内皮细胞悬浮液时，其中的内皮细胞通过孔隙与通入到细胞外基质通道中的基质接触，并在基质上贴壁生长，帮助模拟血管壁形成，有助于实现肿瘤生理病理屏障的构建，为肿瘤细胞提供了一个更为接近体内的微环境，帮助解决现有药物载体在肿瘤生理病理屏障中的扩散研究，从而使靶向治疗试验结果更加准确，并且该芯片结构简单，集成度高。
附图说明
图1为本发明的肿瘤微环境的微流控芯片的结构示意图；
图2为图1中细胞培养通道的结构示意图；
图3为图1中的微流控芯片沿A-A方向的截面图；
图4为本发明的肿瘤微环境构建后的截面图。
【附图标记说明】
1：盖片；11：细胞悬浮液入口；12：第一废液出口；13：基质入口；14：第二废液出口；15：试剂入口；16：第三废液出口；
2：基片；21：细胞培养通道；22：细胞外基质通道；23：血管通道；211：细胞培养区；2111：细胞培养腔；212：第一入口通道；213：第一出口通道；221：支柱；222：基质直通道；223：第二入口通道；224：第二出口通道；231：血管直通道；232：第三入口通道；233：第三出口通道；
3：内皮细胞(这里的内皮细胞是指内皮细胞悬浮液中的内皮细胞在凝胶基质上贴壁并生长后所形成的内皮细胞)；
4：肿瘤细胞球体。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
参照图1至图3，本实施例一方面提供一种模拟肿瘤微环境的微流控芯片，包括上下叠置的盖片1和基片2。
具体地，自基片2的上表面向下凹设有细胞培养通道21、细胞外基质通道22和血管通道23，细胞培养通道21设于细胞外基质通道22的一侧，血管通道23设于细胞外基质通道22的另一侧，且细胞外基质通道22的两侧分别与细胞培养通道21和血管通道23相连通，在细胞外基质通道22内设有多个间隔设置的支柱221。一般上述的盖片1和基片2通过等离子体封装键合，当然也可以采用其他的封装方式进行封装，本实施例仅为举例说明。
具体地，通过在细胞外基质通道22内设有多个间隔设置的支柱221，支柱221与支柱221之间的间隔形成了孔隙，内皮细胞通过孔隙与基质接触，在基质上贴壁生长，帮助模拟血管壁形成，有助于实现肿瘤生理病理屏障的构建。
在具体实现方式中，沿细胞外基质通道22的长度方向对称设置有两排支柱221，其中一排支柱221邻近细胞培养通道21的边缘设置，另一排支柱221邻近血管通道23的边缘设置，且每排的多个支柱221之间等间隔分布且间隔大于单个细胞直径。
需要说明的是，这里所指的单个细胞直径为培养时通入到血管通道23内的内皮细胞悬浮液中内皮细胞的直径。一般支柱221的横截面为多边形，当通入基底膜提取液后不容易在支柱间隙中留有空气层。
这样，设置两排支柱221一方面是帮助模拟血管壁的形成，另一方面是为了在细胞外基质通道22通入基底膜提取液时，阻挡部分基底膜提取液流到细胞外基质通道22两侧的血管通道23和细胞培养通道21中。
进一步地，在细胞培养通道21的两侧共对称设有两条细胞外基质通道22，并均与细胞培养通道21连通，在两条细胞外基质通道22的外侧还分别设有一条血管通道23，且两条血管通道23分别与两条细胞外基质通道22连通。在模拟肿瘤细胞微环境中，分别设置两条细胞外基质通道22和血管通道23可以使肿瘤细胞的培养更为接近体内的微环境。
在实际应用中，在细胞培养通道21上设置有细胞培养区211以及与细胞培养区211的两端分别连通的第一入口通道212和第一出口通道213，盖片上设有与第一入口通道212和第一出口通道213分别连通的细胞悬浮液入口11和第一废液出口12。细胞外基质通道22上设置有基质直通道222以及与基质直通道222的两端分别连通的第二入口通道223和第二出口通道224，盖片上设有与第二入口通道223和第二出口通道224分别连通的基质入口13和第二废液出口14。血管通道23上设置有血管直通道231以及与血管直通道231的两端分别连通的第三入口通道232和第三出口通道233，盖片上设有与第三入口通道232和第三出口通道233分别连通的试剂入口15和第三废液出口16。
进一步地，细胞培养区211的两端分别靠近第一入口通道212和第一出口通道213处渐缩成锥形，形成了V字形流速过渡结构，肿瘤细胞悬液通过第一入口通道212流入细胞培养区211，过渡结构可以使在第一入口通道212中高速运动的肿瘤细胞悬液降低流速，便于肿瘤细胞悬液进入细胞培养区211。
实际应用中，细胞培养通道21与血管通道23的深度均为H1取100μm，细胞外基质通道22的深度为H2取150μm；细胞培养区211的宽度为H4取1300μm，基质直通道222的宽度为H5取600μm，血管直通道231的宽度为H6取400μm。
其中，细胞培养通道21与血管通道23的深度相同是为了使芯片的制备过程更简便，细胞外基质通道22比细胞培养通道21和血管通道23的深度深，主要是为了减少在细胞外基质通道22通入基底膜提取液时流入细胞外基质通道22两侧的血管通道23和细胞培养通道21中。
为了便于对肿瘤细胞进行培养，自细胞培养区211的底面向下凹设有多个细胞培养腔2111，以细胞培养通道21的底面为基准面，细胞培养腔2111深度为H3取150μm。
一般细胞培养区211的长度为H7取7200μm，细胞外基质通道22的长度为H8取5600μm，血管通道23的长度为H9取5000μm。
如图1所示，本实施例中多个细胞培养腔2111优选在细胞培养通道21的中心区域按照矩形阵列排布，且细胞培养腔2111的大小均相同，即细胞培养腔2111的直径和深度均相同，细胞培养腔2111列数不大于4列，细胞培养腔2111之间的横向与纵向间隔都为100μm，可以培养高通量、均一性高的肿瘤细胞球体4。当然，在实际应用中，为了便于培养不同大小的肿瘤细胞球体4，上述的细胞培养腔2111也可以根据需要设计成不同大小的腔室，本实施例仅为举例说明。
本实施例另一方面提供上述模拟肿瘤微环境的微流控芯片的制备方法如下：
步骤1：将硅片清洗并烘干，修饰1-2滴HMDS(Hexamethyldisilazane，六甲基二硅胺)。
步骤2：将处理后的硅片均匀甩上一层SU-8光刻胶，可以根据通道深度设置甩胶机转速。
步骤3：由于本发明中的微流控芯片的结构有三种不同的深度，因此需要制作三个不同图案的掩模，用紫外光透过第一层掩模照射涂胶后的硅片，待第一层SU-8光刻胶固化后，再涂一层粘度不同的SU-8光刻胶，透过第二层掩模进行曝光，第二层SU-8光刻胶固化后，重复涂胶操作，透过第三层掩模曝光，直到第三层SU-8光刻胶固化。
步骤4：去除未固化部分的SU-8光刻胶，烘干得到三层图形结构的微流控芯片的SU-8模具。其中SU-8模具的结构参照上述微流控芯片的结构以及如图1-2所示，在此不再赘述。
步骤5：将上述微流控芯片的SU-8模具用1-2滴的甲基氯硅烷进行表面修饰，倒入PDMS(polydimethylsiloxane，聚二甲基硅氧烷)胶溶液，放入真空烘箱中在70℃下烘烤100min。
步骤6：待PDMS固化后，将PDMS从模具上揭下。用等离子机将带结构的PDMS芯片和同样大小的另一块无结构的纯PDMS盖片1封接在一起，放入烘箱6℃烘烤24h，得到用于模拟肿瘤微环境的微流控芯片如图1所示。
当然，在实际应用中，上述模拟肿瘤微环境的微流控芯片也可以采用其他的方法进行制备形成，本实施例仅为举例说明，对此不进行限定。
本实施例再一方面提供一种肿瘤微环境的构建方法，采用上述的模拟肿瘤微环境的微流控芯片进行构建，该构建方法包括以下步骤：
S1、将表面活性剂注入到细胞培养通道21内，静置24h。其中，表面活性剂在这里主要起到防止肿瘤细胞贴壁的作用，一般可以采用Pluronic F-127(聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物)溶液，在本实施例中Pluronic F-127溶液是由Pluronic F-127与去离子水按1:100的比例在40℃下搅拌溶解而得。当然，也可以根据需要采用其他类型的表面活性剂，只要能够具有防止肿瘤细胞贴壁的作用均可。
S2、将基底膜提取液注入到细胞外基质通道22内，放置1h直至基底膜提取液凝胶化形成凝胶基质。
其中，这里采用基底膜提取液主要是为了模拟细胞外基质。
S3、将内皮细胞悬浮液注入到血管通道23内，将微流控芯片竖直放置4h，以使微流控芯片所在的平面垂直于水平面同时血管通道23的长度方向平行于水平面，直至内皮细胞悬浮液中的内皮细胞在重力作用下在所述凝胶基质上贴壁并生长。
需要说明的是，当只设置一条血管通道23和细胞外基质通道22时，按照上述步骤S3的步骤，将微流控芯片竖直放置4h即可。
但是当按照图1中示出的，设置两条血管通道23和细胞外基质通道22时，按照上述步骤S3的方法，应该先将内皮细胞悬浮液注入到第一条血管通道内，按照上述方式将微流控芯片竖直放置4h，此时第一条通道位于第二条血管通道的正上方且均平行于水平面；
待第一条血管通道内的内皮细胞悬浮液中的内皮细胞在重力作用下在凝胶基质上贴壁并生长后，再将内皮细胞悬浮液注入到第二条血管通道23内，按照相同的方式将微流控芯片竖直放置4h，此时第二条血管通道23位于第一条血管通道23的正上方且均平行于水平面，以使第二条血管通道23内的内皮细胞悬浮液中的内皮细胞在重力作用下在凝胶基质上贴壁并生长。
S4、将宫颈癌细胞(HeLa)悬液注入细胞培养通道21内，培养24h后形成肿瘤细胞球体4，最终形成肿瘤微环境。
图4所示为构建完成后的肿瘤微环境，其中，血管通道23模拟该肿瘤微环境中的肿瘤血管，细胞外基质通道22模拟该肿瘤微环境中的细胞外基质，细胞培养腔2111中为已培养的肿瘤细胞球体4，肿瘤血管与细胞外基质之间为生长后的内皮细胞3。
进一步地，对上述构建方法最终得到的肿瘤细胞球体4进行药物筛选，以便于筛选对肿瘤细胞球体4有抑制作用的药物。具体筛选过程如下：
应用上述方法构建的肿瘤微环境，为表征药物溶液在屏障中的扩散渗透效果，先在未通入HeLa细胞悬液时，微流控芯片内仅有血管屏障与细胞外基质的情况下，通入FITC溶液，观察记录荧光扩散过程。在细胞培养通道21内通入HeLa细胞悬液，在HeLa细胞培养24h成形后，用生理盐水配置不同浓度的顺铂药剂注入血管通道23，培养12h小时后用台盼蓝染剂染色3min后观察，计算肿瘤细胞球体4的细胞存活率以表征药物作用效果。
进一步地，对上述构建方法最终得到的肿瘤细胞球体4进行肿瘤细胞迁移过程的研究，以便于观察肿瘤细胞迁移的速度。具体研究过程如下：
应用上述方法构建的肿瘤微环境，通过向血管通道23灌注化学引诱剂来启动细胞迁移测定。每隔5小时测定记录HeLa肿瘤细胞球体4的细胞迁移情况，迁移率计算为45个小时后肿瘤细胞球体4的半径与原半径之比。
综上所述，本发明提供的微流控芯片，能够形成均一的肿瘤细胞球体4与细胞外基质和血管内的内皮细胞3共培养，模拟体内肿瘤微环境中的相互作用，构建体外的肿瘤生理病理屏障，该芯片的成本消耗量与肿瘤组织生理结构相似度优于传统生物实验平台，且具有良好的生物兼容性和透气性，能够支撑芯片内肿瘤微环境的在线培养与气体交换基本需求。该芯片加工流程操作简单、实验成本低、集成度高，可用于研究肿瘤生理病理屏障对于纳米药物载体的阻滞作用，有助于设计具备高效细胞摄入量的药物载体。该芯片还可应用于肿瘤细胞迁移与侵袭过程的相关研究，以及抗癌药物的毒性测试等。
以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理，这些描述只是为了解释本发明的原理，不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处解释，本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种模拟肿瘤微环境的微流控芯片，其特征在于，包括上下叠置的盖片(1)和基片(2)；
自所述基片(2)的上表面向下凹设有依次平行且连通的细胞培养通道(21)、细胞外基质通道(22)和血管通道(23)；
所述细胞培养通道(21)设于所述细胞外基质通道(22)的一侧，所述血管通道(23)设于所述细胞外基质通道(22)的另一侧；
在所述细胞外基质通道(22)内设有多个间隔设置的支柱(221)。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，沿所述细胞外基质通道(22)的长度方向对称设置有两排所述支柱(221)，其中一排所述支柱(221)邻近所述细胞培养通道(21)的边缘设置，另一排所述支柱(221)邻近所述血管通道(23)的边缘设置，且每排的多个所述支柱(221)之间等间隔分布且间隔大于单个内皮细胞直径。
3.根据权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，所述支柱(221)的横截面为多边形。
4.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，
在所述细胞培养通道(21)的两侧共对称设有两条所述细胞外基质通道(22)，并均与所述细胞培养通道(21)连通；
在两条所述细胞外基质通道(22)的外侧还分别设有一条所述血管通道(23)，两条所述血管通道(23)相对于细胞培养通道(21)对称设置，且分别与两条所述细胞外基质通道(22)连通。
5.根据权利要求3所述的微流控芯片，其特征在于，
在所述细胞培养通道(21)上设置有细胞培养区(211)以及与所述细胞培养区(211)的两端分别连通的第一入口通道(212)和第一出口通道(213)，所述盖片(1)上设有与所述第一入口通道(212)和第一出口通道(213)分别连通的细胞悬浮液入口(11)和第一废液出口(12)；
所述细胞外基质通道(22)上设置有基质直通道(222)以及与所述基质直通道(222)的两端分别连通的第二入口通道(223)和第二出口通道(224)，所述盖片(1)上设有与所述第二入口通道(223)和第二出口通道(224)分别连通的基质入口(13)和第二废液出口(14)；
所述血管通道(23)上设置有血管直通道(231)以及与所述血管直通道(231)的两端分别连通的第三入口通道(232)和第三出口通道(233)，所述盖片(1)上设有与第三入口通道(232)和第三出口通道(233)分别连通的试剂入口(15)和第三废液出口(16)。
6.根据权利要求5所述的微流控芯片，其特征在于，所述细胞培养区(211)的两端分别靠近所述第一入口通道(212)和第一出口通道(213)处渐缩成锥形。
7.根据权利要求6所述的微流控芯片，其特征在于，所述细胞培养通道(21)与所述血管通道(23)的深度均为H1，所述细胞外基质通道(22)的深度为H2，且满足H1<H2；
所述细胞培养区(211)的宽度为H4，所述基质直通道(222)的宽度为H5，所述血管直通道(231)的宽度为H6，满足H4>H5>H6。
8.根据权利要求7所述的微流控芯片，其特征在于，自所述细胞培养区(211)的底面向下凹设有多个细胞培养腔(2111)，以所述细胞培养通道(21)的底面为基准面，所述细胞培养腔(2111)的深度为H3，满足100μm<H3<300μm。
9.根据权利要求8所述的微流控芯片，其特征在于，所述盖片(1)和基片(2)通过等离子体封装键合。
10.一种肿瘤微环境的构建方法，其特征在于，采用如权利要求1-9任一项所述的微流控芯片进行构建，所述构建方法包括以下步骤：
S1、将表面活性剂注入到所述细胞培养通道(21)内，静置12h-24h；
S2、将基底膜提取液注入到所述细胞外基质通道(22)内，放置1h直至所述基底膜提取液凝胶化形成凝胶基质；
S3、将内皮细胞悬浮液注入到所述血管通道(23)内，将所述微流控芯片竖直放置4h，直至所述内皮细胞悬浮液中的内皮细胞在重力作用下在所述凝胶基质上贴壁并生长；
S4、将肿瘤细胞悬液注入所述细胞培养通道(21)内，培养24h-36h后形成肿瘤细胞球体(4)，形成肿瘤微环境。
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